JP2002517193A - 子宮内膜症関連遺伝子 - Google Patents

子宮内膜症関連遺伝子

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Abstract

(57)【要約】 本発明は浸潤性プロセス、例えば子宮内膜症に関連する遺伝子、それによってコードされるポリペプチド、該ポリペプチドに対する抗体ならびに核酸、ポリペプチドおよび抗体の医薬品的使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は浸潤性プロセス（invasiver Prozess）、例えば子宮内膜症に関連す
る遺伝子、それにコードされるポリペプチド、そのポリペプチドに対する抗体な
らびに核酸、ポリペプチドおよび抗体の製薬学的使用に関する。
【０００２】 子宮内膜症は２番目に多い婦人病であり、子宮外部に子宮粘膜細胞が発生する
こととして定義されている。生殖能力のある年齢において約５人に１人の女性が
、それどころか多産の問題を抱える女性においては２人に１人が子宮内膜症に見
舞われる。
【０００３】 正常な状況下では子宮粘膜（子宮内膜）は専ら子宮内に存在する。子宮内膜症
の発病に際し、子宮外部に組織学的に子宮粘膜と見なされる組織が、例えば子宮
外部の腸または膵臓もしくは肺においても見いだされる。これらの子宮内膜症の
病巣が子宮外部に局在しているにもかかわらず、病巣は同様に月経の間に出血し
、従って女性周期のホルモンによって影響される。子宮粘膜と同じように子宮内
膜症の病巣は月経周期において体積変化が進行するので、局在に応じてその体積
変化によって疼痛が引き起こされる。更に身体は炎症反応を伴って子宮内膜症細
胞に反応し、再び疼痛が引き起こされる。更に炎症は卵巣および卵管の領域内で
癒合を引き起こし、かつこれは羅患した女性の、いわゆる機械的不妊化の原因と
なる。しかしながら子宮内膜症の際には伝達物質（例えばサイトカイン、プロス
タグランジン）が遊離され、これらは癒合が存在しない場合でさえ羅患した女性
の妊性を低下させることがある。
【０００４】 その病態生物学的特性に基づいて、子宮内膜症の細胞は正常細胞と腫瘍細胞の
間に分類でき；一方では該細胞は腫瘍性の挙動を示さないが、他方では転移性腫
瘍細胞のように、生物中で器官境界を超えて移動し、かつ別の器官に広がる能力
を有する、すなわち子宮内膜症の細胞は浸潤性を示す。これらに基づいて、子宮
内膜症の細胞は文献において“良性腫瘍細胞”と定義されているが、このような
細胞においては今までのところ癌原遺伝子において腫瘍特異的な突然変異が見い
だされていない。
【０００５】 今日まで子宮内膜症の病因はまだ完全に明らかになっていなかったので、今ま
でのところ子宮内膜症関連の疾患の有効な治療または予防は不可能であった。
【０００６】 本発明の課題は、浸潤性プロセスにおいて重要であり、かつ子宮内膜症の病態
生理学的表現型に関連があることがある新規の遺伝子を同定することである。
【０００７】 前記課題は、本発明により子宮内膜症関連遺伝子として表され、かつポリペプ
チドをコードする遺伝子を同定、クローニングおよび特徴付けすることによって
解決される。これらの遺伝子配列はディファレンシャルディスプレーＲＴ−ＰＣ
Ｒ（Differential-Display-RT-PCR）（Liang und Pardee, Science 257(1992),
967-971）を使用して見いだされた。更に子宮内膜症細胞系統の浸潤性および非
浸潤性の変異体が互いに比較された。その際に子宮内膜症の細胞の浸潤性変異体
に特異的なｃＤＮＡ配列が見いだされた。４ｋｂ長の関連のＲＮＡが見いだされ
た。ｃＤＮＡ−ファージバンクから単離された相応のｃＤＮＡは３０２アミノ酸
の１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。
【０００８】 本発明の対象は、 （ａ）配列番号１、３および／または５に示されるヌクレオチド配列、その組合
せまたはタンパク質をコードする断片、 （ｂ）（ａ）からの配列に遺伝コードの縮重の範囲で相応するヌクレオチド配列
、または （ｃ）（ａ）および／または（ｂ）からの配列とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするヌクレオチド配列 を含む核酸である。
【０００９】 これらの核酸は、有利には浸潤性プロセスに関連するポリペプチドまたはその
断片をコードする。
【００１０】 ＥＭＢＬ−ＥＳＴ−データバンクには以下のアクセッション番号：Ｚ９８８８
６、Ａｃ００３０１７、ＡＬ０２３５８６、Ａａ４５２９９３、Ａａ４５２８５
６を有する以下のヌクレオチド配列が登録されている。これらの配列は本発明に
よる核酸を示していない。第一の両者の配列はヒトの脳から単離され、かつそれ
ぞれヌクレオチド９７０〜約２０００およびヌクレオチド７６０〜約１４５０の
断片と９０％を上回る塩基同一性を示し、５’−末端に８４個の付加的な塩基を
有する配列番号３に関しては配列番号１もしくはヌクレオチド１０５４〜２０８
４およびヌクレオチド８４４〜約１５３４の断片と９０％を上回る塩基同一性を
示す。ＡＬ０２３５８９は同様にＺ９８８８５と非常に類似しており、かつ同様
に配列番号１と９７０〜約２０００の範囲内でホモロジーを有するヒトの配列で
ある。
【００１１】 配列Ａａ４５２９９３およびＡａ４５２８５６はマウスの胚に由来し、かつ配
列番号１の約１０６０〜約１４５０もしくは約２４〜４４０のヌクレオチド（ｎ
ｔ）もしくは配列番号３のヌクレオチド位置による約１１４４〜約１５３４もし
くは約１０８〜約５２４のヌクレオチドと塩基同一性を示す。４種の配列は今ま
で読み枠または機能が割り当てられていなかった。
【００１２】 配列番号１に示されるヌクレオチド配列は３０２アミノ酸長を有するポリペプ
チドに相当するオープンリーディングフレームを有する。このポリペプチドは配
列番号２に示されるアミノ酸配列が挙げられる。配列番号は配列番号１における
ようなヌクレオチド配列を示すが、５’−末端に８４個の付加的なヌクレオチド
を有する。これによって、互いに相応するヌクレオチドの位置はそれぞれ８４ヌ
クレオチドだけ異なる。配列番号３によってコードされるポリペプチドは従って
Ｎ−末端に２８個の付加的なアミノ酸を有し、その全部で３３０個のアミノ酸を
配列番号４において示す。配列番号２および４はネイティブのポリペプチドのＣ
−末端の断片を表している。
【００１３】 評価のために、本発明による子宮内膜症関連遺伝子のｃＤＮＡの略図である図
１を示す。５個のエキソンＥ１〜Ｅ５ならびにＤＤＲＴ−ＰＣＲにおいてプロー
ブとして使用される断片１（３９４ｎｔ）の位置が見いだせる。同様にＲＴ−Ｐ
ＣＲのために使用されるＰＣＲプライマー（例４の第１表参照）の位置も示され
ている。
【００１４】 図１には他のエキソン４ａが示されておらず、このヌクレオチド配列は配列番
号５に示されている。このエキソン４ａが存在してもよい。存在するならば、エ
キソン４とエキソン５との間にある。これは配列番号３のｎｔ１０５４〜１０５
５の間に相当する。従って配列番号１／３の配列と配列番号５の配列の組合せは
、例えば前記の位置にエキソン４ａの配列を有する配列である。
【００１５】 配列番号１、３および５に示されるヌクレオチド配列ならびにその組合せ、例
えばｎｔ１０５４と１０５５との間に配列番号５の配列を有する配列番号３の配
列およびこれらの配列に遺伝コードの縮重の範囲内で相応するヌクレオチド配列
の他に、本発明は前記の配列の１つにハイブリダイズするヌクレオチド配列も含
む。本発明による概念“ハイブリダイゼーション”はサンブローク他（Sambrook
et al）（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab
oratory Press(1989), 1.101-1.104）で使用される。有利には１×ＳＳＣおよび
０．１％ＳＤＳで５０℃、有利には５５℃、特に有利には６２℃、より有利には
６８℃で１時間の洗浄、殊に０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで５５℃、有
利には５５℃、特に有利には６２℃、最も有利には６８℃での１時間の洗浄後に
なおもポジティブなハイブリダイゼーションシグナルが観察される場合にストリ
ンジェントなハイブリダイゼーションとする。このような洗浄条件下で１種以上
の配列番号１、３および５に示されるヌクレオチド配列またはこれらの配列に遺
伝コードの縮重の範囲内で相応するヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌク
レオチド配列が本発明によるヌクレオチド配列である。
【００１６】 有利には本発明によるヌクレオチド配列はＤＮＡである。しかしながら本発明
によるヌクレオチド配列はＲＮＡまたはペプチド性核酸のような核酸類似体を含
む。特に有利には本発明による核酸は配列番号１、３および／または５に示され
るヌクレオチド配列または配列番号１、３または５に示されるヌクレオチド配列
もしくは、有利にはその少なくとも２０ヌクレオチド（ｎｔ）、特に有利には少
なくとも５０ｎｔ長の断片に８０％より高い、有利には９０％より高い、特に有
利には９５％より高いホモロジーを有する配列のタンパク質コード断片を含む。
また前記のように配列番号１または３の配列の他に配列番号５の配列を有する核
酸に関しても同様のことが当てはまる。ホモロジーは２つの核酸（もしくはペプ
チド鎖）の比較における同一の位置のパーセントで示され、その際、１００％の
ホモロジーは比較される鎖分子の完全な同一性を表す（Herder: Lexikon der Bi
ochemie und Molekularbiologie, Spektrum Akademischer Verlag 1995）。
【００１７】 本発明による核酸は、有利にはホニュウ類および、特にヒトから得ることがで
きる。該核酸は、公知の技術によって配列番号１、３および／または５に示され
るヌクレオチド配列の短い断片をハイブリダイゼーションプローブおよび／また
は増幅プライマーとして使用して単離することができる。更にまた本発明による
核酸は化学合成によっても製造でき、その際、通常のヌクレオチド成分の代わり
に、場合により修飾ヌクレオチド成分、例えば２’−Ｏ−アルキル化ヌクレオチ
ド成分が使用されてもよい。
【００１８】 従って本発明による核酸またはその断片はプライマーおよび、有利にはマーカ
ーもしくは標識基を有するプローブの製造のために使用できる。また種々のｍＲ
ＮＡ種の同定のために特に適当であるイントロンにまで及ぶオリゴヌクレオチド
プライマーが有利である。
【００１９】 本発明の更なる対象は前記のように定義された核酸によってコードされるポリ
ペプチドである。該ポリペプチドは、有利には （ａ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列または （ｂ）（ａ）によるアミノ酸配列に対して７０％より高い、有利には８０％より
高い、特に９０％より高いホモロジー を有する。
【００２０】 配列番号２または４に示されるポリペプチドの他に、本発明はまた突然変異タ
ンパク質、変異体およびその断片に関する。これらは配列番号２または４に示さ
れるアミノ酸配列の個々のアミノ酸または短いアミノ酸断片の置換、欠失および
／または挿入によって異なる配列であると解される。
【００２１】 概念“変異体”には子宮内膜症タンパク質もしくは組み換えＤＮＡ技術（特に
化学合成されたオリゴヌクレオチドを使用するインビトロ突然変異誘発）によっ
て作成され、その生物学的活性および／または免疫学的活性に関しては基本的に
配列番号２または４に示されるタンパク質に相当するタンパク質の自然発生的な
対立遺伝子の変異またはスプライス変異が包含される。同様に前記の概念には化
学的に修飾したポリペプチドも包含される。更に末端および／または反応性アミ
ノ酸側基にアシル化、例えばアセチル化またはアミド化によって修飾されたポリ
ペプチドが包含される。本発明によるアミノ酸配列には配列番号２または４に示
されるアミノ酸配列の少なくとも１０アミノ酸長の断片を表すポリペプチド断片
（ペプチド）が包含される。
【００２２】 本発明の更なる対象は、本発明による核酸の少なくとも１コピーを有するベク
ターである。該ベクターは、本発明によるＤＮＡ配列が、有利には発現シグナル
、例えばプロモーター、オペレーター、エンハンサー等と結合状態にある任意の
原核性または真核性のベクターであってよい。原核性ベクターのための例は染色
体ベクター、例えばバクテリオファージおよび染色体外ベクター、例えばプラス
ミドであり、その際、環状プラスミドベクターが特に有利である。適当な真核性
ベクターは、例えばサンブローク他のｓｕｐｒａ、チャプター１〜４に記載され
ている。特に有利には本発明によるベクターは真核性ベクター、例えば酵母ベク
ターまたは高等生物細胞に適当なベクター、例えばプラスミドベクター、ウイル
ス性ベクターまたは植物ベクターである。このようなベクターは当業者に分子生
物学の分野でよく知られているので、このことは本明細書ではより詳細に検討す
る必要はない。特にこの点に関してはサンブローク他のｓｕｐｒａ、チャプター
１６に教示されている。
【００２３】 また本発明は配列番号１、３および／または５に示される配列の２１ヌクレオ
チド長の断片またはその組合せを有するベクターに関する。有利には該断片は、
前記の配列のタンパク質コード領域またはタンパク質もしくはポリペプチドの発
現のために重要な領域に由来するヌクレオチド配列を有する。該核酸は、特に治
療的に使用可能な、有利には５０ヌクレオチド長までであるアンチセンス核酸の
製造のために適当である。
【００２４】 本発明の更なる対象は、本発明による核酸または本発明によるベクターで形質
転換されている細胞である。該細胞は真核細胞であっても、原核細胞であっても
よい。核酸での細胞の形質転換のための方法は一般的な技術水準であり、かつ従
ってより詳細に説明する必要はない。有利な細胞のための例は真核細胞、特に動
物細胞、特に有利にはホニュウ類細胞である。
【００２５】 本発明の更なる対象は子宮内膜症遺伝子によってコードされるポリペプチドま
たはその変異体に対する抗体またはそのような抗体の断片である。特に有利には
そのような抗体は、前記遺伝子によってコードされる全てのポリペプチドまたは
配列番号４に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１〜３３０に相当するペプチド配
列に対する。
【００２６】 本発明による、浸潤性プロセスおよび、特に子宮内膜症に関連する遺伝子の同
定、単離および発現は、前記の障害を原因とする疾患の診断、治療および予防の
ための必要条件を提供する。
【００２７】 本発明によるポリペプチドまたは該ポリペプチドの断片の免疫原としての使用
によって、そのようなポリペプチドに対する抗体を製造することができる。その
際、抗体の製造は慣用の方法で試験動物を全ポリペプチドもしくはその断片で免
役し、引き続き生成するポリクローナル血清を得ることによって実施する。ケー
ラーおよびミルシュタイン（Koehler und Milstein）の方法およびその発展によ
って、試験動物の抗体産生細胞から公知の方法で細胞融合によってモノクローナ
ル抗体を得ることができる。同様に、公知の方法によってヒトのモノクローナル
抗体を製造することができる。これらのような抗体は、特に子宮内膜症細胞組織
の診断的試験のためにも、治療のためにも使用することができる。
【００２８】 例えばＥＬＩＳＡ技術を使用して試料、例えば体液、特にヒトの体液（例えば
血液、リンパ液または髄液）を、一方では子宮内膜症遺伝子によってコードされ
るポリペプチドの存在、他方ではそのようなポリペプチドに対する自己抗体の存
在において試験することができる。子宮内膜症遺伝子によってコードされるポリ
ペプチドまたはその断片を、かかる試料中で特異抗体、例えば本発明による抗体
を使用して検出することができる。自己抗体の検出のために、有利には一部もし
くはドメインまたは子宮内膜症遺伝子によってコードされる全ポリペプチドを有
し、かつ検出を可能にするタンパク質ドメイン、例えばマルトース−結合タンパ
ク質（ＭＢＰ）と融合された組み換え融合タンパク質を使用してよい。
【００２９】 診断的検査は核酸レベル、例えば遺伝子レベルまたは転写レベルでの検出のた
めに特異的な核酸プローブを使用して実施できる。
【００３０】 更に本発明によるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列および抗体の調製はポ
リペプチド／タンパク質のエフェクターによる集中的な調査を可能にする。エフ
ェクターは、本発明によるポリペプチドに対して阻害作用または活性化作用があ
り、かつポリペプチドによって制御される細胞機能に選択的に影響を与える物質
である。更にこれらを相応の病因、例えば浸潤性プロセスの原因となるものの治
療において使用できる。従って本発明の対象は子宮内膜症タンパク質のエフェク
ターの同定のための方法であり、その際、タンパク質を発現する細胞と種々の潜
在的なエフェクター物質、例えば低分子物質とを接触させ、かつ該細胞を変化、
例えば細胞活性、細胞阻害、細胞増殖および／または細胞遺伝の変化において分
析する。前記のように子宮内膜症タンパク質の結合ターゲットも同定することが
できる。
【００３１】 多くの腫瘍疾患は浸潤性プロセスと併発するので、本発明による遺伝子の発見
は更に癌性疾患の診断、予防および治療を可能にする。
【００３２】 浸潤性プロセスの原因でもある遺伝子の発見は、かかる細胞変化を原因とする
疾患の治療可能性が開けるだけでなく、本発明による配列を使用して、かかるプ
ロセスを有効にさせることができる。これは、例えば胚の着床において重要であ
る。
【００３３】 従って本発明は、同様に活性成分として前記のような核酸、ベクター、細胞、
ポリペプチド、ペプチドおよび／または抗体を含む医薬品組成物に関する。
【００３４】 本発明による医薬品組成物は更に医薬品に慣用の賦形剤物質、助剤物質および
／または添加剤物質、ならびに場合により他の活性成分を含有していてよい。該
医薬品組成物は、特に浸潤性プロセスに関連する疾患の診断、治療または予防の
ために使用できる。また更に本発明による組成物は、特に子宮内膜症のリスクの
診断においてかかる疾患に関する素因の診断のために使用できる。
【００３５】 本発明を以下の図、配列表および実施例によってより詳細に説明する。
【００３６】 図１は子宮内膜症関連遺伝子のｃＤＮＡの概略図を示し、その際、単にエキソ
ンＥ１〜Ｅ５が示されているにすぎない。
【００３７】 配列番号１は子宮内膜症関連遺伝子をコードする遺伝情報を有するヌクレオチ
ド配列を示し、その際、オープンリーディングフレームはヌクレオチド３から９
１１に及ぶ。
【００３８】 配列番号２は配列番号１に示されるヌクレオチド配列のオープンリーディング
フレームのアミノ酸配列を示し、その際、オープンリーディングフレームのアミ
ノ酸配列はアミノ酸１から３０２に及ぶ。
【００３９】 配列番号３は配列番号１のようであるが、５’−末端に付加的な８４ヌクレオ
チドを有するヌクレオチド配列を示し、そのオープンリーディングフレームはヌ
クレオチド３から９９５に及ぶ。
【００４０】 配列番号４は配列番号３に示されるヌクレオチド配列のオープンリーディング
フレームのアミノ酸配列を示し、その際、該アミノ酸は３２０アミノ酸を有し、
その内でＣ−末端の３０２個は配列番号２の配列と同一である。
【００４１】 配列番号５は、場合により存在する、示された２１８ｎｔからなる付加的なエ
キソン４ａのヌクレオチド配列を示し、その際、エキソン４ａは存在するならば
ヌクレオチド１０５４と１０５５（配列番号３に関して）との間に存在する。
【００４２】 実施例 例１ 細胞の培養 子宮内膜症関連遺伝子の同定のために、上皮性の子宮内膜症細胞系統ＥＥＣ１
４５Ｔ+の浸潤性および非浸潤性の細胞を使用した。該細胞を１０％仔ウシ血清
を有するダルベッコ培地（ＤＭＥＭ）中で培養し、１週間に２回、１：５に希釈
した（継代）。ＤＤＲＴ−ＰＣＲ（以下参照）による発現パターンの比較のため
に、継代１７の浸潤性細胞および継代３３の非浸潤性細胞を使用した。これらの
細胞をＳＶ４０で形質転換し、かつディファレンシャルディスプレー逆転写ポリ
メラーゼ連鎖反応（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）によって分析した。
【００４３】 例２ ＤＤＲＴ−ＰＣＲ リアングおよびパルデー（Liang und Pardee）によって開発された方法は種々
の細胞種の発現パターンまたは種々の生存条件下または可変の発生段階の間の１
つの細胞種の可変の発現パターンの調査のための方法である（Liang und Pardee
(1992), Science 257, 967-971）。ＤＤＲＴ−ＰＣＲ技術の基礎は、それぞれの
細胞において約１５０００個の遺伝子が発現され、かつ原則的にそれぞれの個々
のｍＲＮＡ分子が逆転写および予期せぬプライマーによる増幅によって形成され
るという考えを基礎としている。
【００４４】 この例において細胞のポリＡ+−ＲＮＡをまず複数の種々のｄＴ11ＶＸ−プラ
イマー（ダウンストリームプライマー、アンカープライマー）を使用してｃＤＮ
Ａに転写する。得られたｃＤＮＡポピュレーションをゲンフンター社（Firma Ge
nhunter）（Nashville(1994)）のＲＮＡ−ＭａｐTM−キットからの４個のダウン
ストリームプライマーおよび２０個のアップストリームプライマーを使用して放
射性標識されたヌクレオチドの添加下にＰＣＲ増幅した。増幅後に、反応バッチ
を真空中に圧縮し、かつ得られたｃＤＮＡ断片を６％のネイティブなＰＡＡゲル
（ポリアクリルアミド）中で分離した。ＤＮＡ検出をオートラジオグラフィーで
実施した。調査すべき両者の細胞変異体に関して明らかなバンド型の差異を示す
ＰＣＲバッチを２回繰り返し、生殖能力を調べた。事前に明らかにされている差
異が確認されたら、バンドを公知の方法によってゲルから溶出させ、再増幅させ
、クローニングし、かつ配列決定した。
【００４５】 該方法によって、浸潤性の細胞変異体に特異的な３９４ｂｐ長の断片（断片１
、配列番号１に示される核酸配列のヌクレオチド１２３５〜１６２８、図１も参
照のこと）が見いだされた。この断片１はノーザンブロット分析（以下参照）に
おいてプローブとして使用した。
【００４６】 例３ ヒトのノーザンブロット分析における断片１−発現プロフィールの分析 ＤＤＲＴ−ＰＣＲ−断片１に関する発現パターンの調査のために、ノーザンブ
ロット分析を実施した。そのために２０μｇの全ＲＮＡもしくは４μｇのポリＡ
+−ＲＮＡを１％の変性アガロースゲル中で分離し、ナイロンメンブレン上に一
晩移した。ＲＮＡをＵＶ光のメンブレン上への照射によって固定した。32Ｐ−標
識されたプローブ（アマシャム社のＲＰＬ−キットによる標識）でのハイブリダ
イゼーションをホルムアミド含有のハイブリダイゼーション溶液中で４２℃で一
晩実施した。引き続きメンブレンを高度にストリンジェントな条件で、個々の点
についての放射線強度が測定できるまで洗浄した。ハイブリダイゼーション型を
Ｘ線フィルム（ＮＥＦ−ＮＥＮ：デュポン社）の載置および複数日に亘る暴露に
よって現像した。ＤＤＲＴ−ＰＣＲ−断片１に関する発現パターンの決定のため
に、以下の細胞もしくは組織からのＲＮＡでのノーザンブロット分析を実施した
。
【００４７】 − 上皮性の子宮内膜症細胞系統ＥＥＣ１４５Ｔ+の浸潤性細胞（継代１７） − 上皮性の子宮内膜症細胞系統ＥＥＣ１４５Ｔ+の非浸潤性細胞（継代３３） − 腹腔内の細胞系統ＥＥＣ１４３Ｔ+の細胞 − 子宮内膜症組織 − 浸潤性のヒトの膀胱癌細胞系統ＥＪ２８の細胞 − 非浸潤性のヒトの膀胱癌細胞系統ＲＴ１１２の細胞 ＤＤＲＴ−ＰＣＲ−断片１のためのプローブでのハイブリダイゼーションの後
に、主に子宮内膜症細胞系統ＥＥＣ１４５Ｔ+の浸潤性変異体において検出でき
る約４ｋｂ長のｍＲＮＡが検出できた。
【００４８】 他のヒト組織を試験した。脾臓においては断片１と明らかにハイブリダイズす
る４ｋｂ長のｍＲＮＡが見いだされ、かつ脳においてはそれぞれ４ｋｂおよび＞
９ｋｂ長のｍＲＮＡが見いだされた。
【００４９】 ノーザンブロット分析は、クロンテック社（Fa. Clontech）の２種のヒトの多
種組織ノーザン（Multiple Tissue Northern）（ＭＴＮ）ブロットを使用して製
造者のプロトコールに従い実施した。その際、以下の組織における発現を調査し
た：大腸、小腸、心臓、脳、睾丸、肝臓、肺、脾臓、腎臓、卵巣、膵臓、末梢血
液白血球、胎盤、前立腺、骨格筋、胸腺。放射性標識した３’−プロープ“ＤＤ
ＲＴ−ＰＣＲ−断片１”で得られる発現パターンは以下のように示される： ４ｋｂのｍＲＮＡ（期待される大きさ）：脳 脾臓 膵臓 ９．５ｋｂのｍＲＮＡ ：脳 残りの組織には、特異的なハイブリダイゼーションは検出できなかった。
【００５０】 インサイチューハイブリダイゼーション 細胞の発現パターンの解明のために、ｍＲＮＡを種々の組織の１０μｍのパラ
フィン切片にインサイチューハイブリダイゼーションさせた。そのために、“Ｄ
ＤＲＴ−ＰＣＲ−断片１”をジゴキシゲニン標識されたＲＮＡプローブとして使
用した。検出反応をジゴキシゲニン特異的な、アルカリホスファターゼ（Ａ）に
カップリングさせた抗体によって実施した。ＡＰの基質としてＢＭパープル（BM
Purple）が使用され、これは脱リン酸化の後に青色の沈殿物を生ずる。結果を
以下の表に挙げ、かつ浸潤性／移動性細胞（migrienden Zell）において大部分
が発現を示している。
【００５１】
【表１】
【００５２】 例４ ＲＴ−ＰＣＲ 発現パターンの調査のための感度の高い方法はＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）
を提供する。
【００５３】 そのために、それぞれのポリＡ+−ＲＮＡ１μｇを４００ＵのＭ−ＭＬＶリバ
ーストランスクリプターゼ（ギブコ−ＢＲＬ社）を使用して３０μｌの全容量に
おいてｃＤＮＡに転写した。その１μｌを引き続いての種々のプライマー組合せ
を使用するＰＣＲのために使用した。
【００５４】 使用されるＰＣＲ−プライマーＰ１〜Ｐ７を第１表に示す（図１参照）。
【００５５】
【表２】
【００５６】 種々の細胞系統および組織からのポリＡ+−ＲＮＡを使用してＲＴ−ＰＣＲ試
験を種々のプライマーの組合せの使用下に実施した。結果を以下の第２表に示す
。
【００５７】
【表３】
【００５８】 ＰＫ＝プライマーの組合せ Ｐ１７＝子宮内膜症細胞系統ＥＥＣ１４５Ｔ、継代１７、浸潤性 Ｐ３３＝子宮内膜症ＥＥＣ１４５Ｔ、継代３３、非浸潤性 Ｐｅｒ＝腹膜細胞系統Ｐｅｒ１４３Ｔ ＥＭ＝子宮内膜組織 ＥＪ２８＝浸潤性膀胱癌細胞系統 ＲＴ１１２＝非浸潤性膀胱細胞系統 Ｅ＝子宮内膜組織 ＥＥ＝子宮内膜症患者の子宮内膜組織 ＰＥＥ＝腹腔内子宮内膜症生検 ｎ．ｇ．＝試験せず ＲＴ−ＰＣＲの結果によって子宮内膜症細胞系統ＥＥＣ１４５Ｔ+の早期の継
代（継代１７，継代２０）において断片１に特異的な発現が確認された。ノーザ
ンブロット分析とは異なり、付加的に子宮内膜において弱い発現が現れた。
【００５９】 イントロンにまで及ぶプライマー（intronueberspannen Primer）でのＲＴ−
ＰＣＲ分析 場合により選択的なエキソンの調査のために、イントロンにまで及ぶプライマ
ーを使用してＲＴ−ＰＣＲ試験を実施した。その際、前記のｍＲＮＡの他に４エ
キソンと５エキソンとの間に２１８ｂｐ長の他のエキソン（４ａ）を有するｍＲ
ＮＡ種が存在することを示すことができた。該エキソンは３’−ＵＴＲ（非翻訳
領域）中、すなわちコーディング領域に引き続き存在する。エキソン４ａの配列
を以下に記載する。
【００６０】
【外１】
【００６１】 選択的なエキソン４ａのヌクレオチド配列 例５ ｃＤＮＡファージバンクＥＥＣ１４の作成 ｃＤＮＡファージバンクＥＥＣ１４をショート，Ｊ．Ｍ他（Short, J.M.et al
）の方法（(1988) Nucleic Acid Res. 16:7583-7600）によって作成した。
【００６２】 まず上皮性の子宮内膜症細胞系統ＥＥＣ１４５Ｔ+の浸潤性細胞（継代１７）
のポリＡ+−ＲＮＡの逆転写を実施した。そのために使用されるプライマーはＸ
ｈｏＩ切断部位ならびに１８ヌクレオチド長のポリ（ｄＴ）配列からなる。Ｅｃ
ｏＲＩ切断部位を有するアダプターを、生成したｃＤＮＡ断片にライゲーション
した。両方の制限切断部位は、ＺＡＰ ＥｘｐｒｅｓｓTMベクター中でのｃＤＮ
Ａ断片の一方向性の挿入を可能にした。インサートはカナマイシン耐性ｐＢＫ
ＣＭＶファージミドの形でファージから切り出すことができた。
【００６３】 例６ ファージバンクスクリーニング ＤＤＲＴ−ＰＣＲ−断片１（３９４ｂｐ）をプローブとして使用して、１０6
ｐｆｕ（プラーク形成単位）のｃＤＮＡ−ファージバンクＥＥＣ１４を製造者（
ストラタジーン社）のプロトコールに従って詳しく調査した。ジゴキシゲニン（
ベーリンガーマンハイム社）でのプローブの標識をＰＣＲを使用して実施した。
細菌株ＸＬ１ｂｌｕｅＭＲＦ’の感染後に生じるプラークをナイロンメンブレン
上に移し、かつその上に前記のプローブでハイブリダイゼーションさせた。ハイ
ブリダイズしたジゴキシゲニン標識したプローブの検出をベーリンガーマンハイ
ム社の化学発光プロトコールによって実施した。
【００６４】 ポジティブなプローブを選択し、かつ再クリーニングを施した。再クリーニン
グにおいてポジティブなプラークを切り出しのために使用した。ＥｘＡｓｓｉｓ
ｔヘルパーファージを使用するファージからのベクター部分の切り出しによって
、細菌株ＸＬＯＬＲTM中での増大後に単離し、配列決定できるカナマイシン耐性
ｐＢＫ ＣＭＶファージミドが生じた。単離したファージミドクローンＱ２Ａは
、規定されかつ配列番号１に示された配列を有する２．３ｋｂ長の最も長いイン
サートを有する。ＤＤＲＴ−ＰＣＲ−断片１の配列は配列番号１に関連するヌク
レオチド１２３５〜１６２８に見いだせる。
【００６５】 例７ サザンブロット分析 女性および男性のヒトのゲノムＤＮＡ１０μｇを種々の制限エンドヌクレアー
ゼで切断した。これらの断片をアガロースゲル中で分離し、ナイロンメンブレン
上に移した。該メンブレン上で、ジゴキシゲニン標識したＤＤＲＴ−ＰＣＲ−断
片１でのハイブリダイゼーションを実施した。
【００６６】 ハイブリダイゼーションはベーリンガー社のプロトコールに従って化学発光に
よって検出できた。種々の制限エンドヌクレアーゼを使用する場合に、女性のＤ
ＮＡプローブを使用しても、男性のＤＮＡプローブを使用しても、その都度に一
本のバンドが検出されるだけであった。この結果によって断片１の基礎を置く遺
伝子が一本鎖の性特異的遺伝子であると判明した。その間にＤＤＲＴ−ＰＣＲ−
断片１を使用して２種のゲノムクローンＰＡＣ Ｊ１４７２およびＰＡＣ Ｎ１９
７７を単離した。
【００６７】 例８ 蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ） 例７で得られるゲノムクローンを蛍光インサイチューハイブリダイゼーション
によって染色体１（１ｐ３６）上に局在させた（Lichter et al. (1990), Scien
ce 247:64-69）。
【００６８】 例９ 特異抗体の製造 前記のｃＤＮＡ配列のヌクレオチド５８４〜９０９を適当な制限切断部位を介
して発現ベクターｐＭＡＬ ｃＲＩ中にクローニングした。配列の発現のために
、該構築物をＥ．コリＤＨ５α細胞に形質転換した。翻訳されたタンパク質断片
をＳＤＳポリアクリルアミドゲルから切り出し、かつ仔ウサギの免疫のために使
用した。
【００６９】 例１０ ＲＡＣＥ（rapid amplification of cDNA ends） ｃＤＮＡクローンＱ２Ａ（例６参照）の長さが検出されたｍＲＮＡ（約４ｋｂ
）の大きさとは異なるので、更なる配列情報を得るためにＲＡＣＥ試験を実施し
た。この方法を使用して、ｃＤＮＡ配列をｍＲＮＡ鋳型から、定義された内部配
列と未知の配列との間で５’末端もしくは３’末端に得ることができる。３’−
ＲＡＣＥ実験によって５エキソンからクローンＱ２Ａの３’末端を確認できる。
【００７０】 ５’ＲＡＣＥのためにｃＤＮＡ−一本鎖合成を１エキソンにハイブリダイズす
る遺伝子特異的プライマーを使用して実施し、引き続きターミナルトランスフェ
ラーゼ酵素を使用してホモポリマーのヌクレオチドテールを付加した。この付加
された配列は、遺伝子特異的プライマーとホモポリマーのヌクレオチドテールと
の間に見られる配列範囲の増幅を可能にする。その際、Ｑ２Ａ配列の５’であり
かつ第１のエキソンに見られる以下の付加的な配列を有してよい：
【００７１】
【外２】
【００７２】 下線部の配列はＱ２Ａ配列の最初のヌクレオチドを示し、その前の配列は５’
ＲＡＣＥによって得られた新規の配列に相当する。オープンリーディングフレー
ムは既に断片に関し得推定されたオープンリーディングフレームに適合し、かつ
２つの推定される開始コドン（下線部）を有する。
【００７３】 前記で得られ、かつ配列番号１に示される配列ならびに付加的な８４ｎｔを５
’末端に有するヌクレオチド配列を配列番号３に示す。 配列表
【００７４】
【外３】
【００７５】
【外４】
【００７６】
【外５】
【００７７】
【外６】
【００７８】
【外７】
【００７９】
【外８】
【００８０】
【外９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は本発明による子宮内膜症関連遺伝子のｃＤＮＡの略図を示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年５月１５日（２０００．５．１５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１２】 配列番号１に示されるヌクレオチド配列は３０２アミノ酸長を有するポリペプ
チドに相当するオープンリーディングフレームを有する。このポリペプチドは配
列番号２に示されるアミノ酸配列が挙げられる。配列番号３は配列番号１におけ
るようなヌクレオチド配列を示すが、５’−末端に８４個の付加的なヌクレオチ
ドを有する。これによって、互いに相応するヌクレオチドの位置はそれぞれ８４
ヌクレオチドだけ異なる。配列番号３によってコードされるポリペプチドは従っ
てＮ−末端に２８個の付加的なアミノ酸を有し、その全部で３３０個のアミノ酸
を配列番号４において示す。配列番号２および４はネイティブのポリペプチドの
Ｃ−末端の断片を表している。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ ４Ｃ０８６ Ｃ１２Ｎ 5/10 33/574 Ａ ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 33/574 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 ハイケ ハンドロウ−メッツマッハー ドイツ連邦共和国 フランクフルト アム マイン アルト エッシェルスハイム 45 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA44 CA04 CA09 CA11 DA02 EA02 EA04 GA11 HA01 HA03 HA12 4B063 QA01 QA19 QQ01 QQ03 QQ42 QQ52 QR08 QR42 QR56 QR62 QS25 QS36 QX02 4B065 AA90X AA90Y AB01 BA02 CA24 CA25 CA45 CA46 4C084 AA02 AA07 BA01 BA08 BA22 BA23 MA01 NA14 ZA812 ZB262 4C085 AA13 CC32 EE01 GG01 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA81 ZB26 ZC78 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (28)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 核酸において、 （ａ）配列番号１、３および／または５に示されるヌクレオチド配列、その組合
    せまたはタンパク質をコードする断片、 （ｂ）（ａ）からの配列に遺伝コードの縮重の範囲内で相応するヌクレオチド配
    列、または （ｃ）（ａ）および／または（ｂ）からの配列とストリンジェントな条件下でハ
    イブリダイズするヌクレオチド配列 を含むが、但しデータバンクＥＭＢＬ ＥＳＴにおいてアクセッション番号Ｚ９
    ８８８６、Ａｃ００３０１７、Ａａ４５２９９３、ＡＬ０２３５８６およびＡａ
    ４５２８５６で挙げられる配列とは異なる核酸。
  2. 【請求項２】 配列番号１、３および／または５に示されるヌクレオチド配
    列のタンパク質をコードする断片を含む、請求項１記載の核酸。
  3. 【請求項３】 配列番号１、３および／または５に示されるヌクレオチド配
    列またはその断片に８０％より高いホモロジーを有する、請求項１記載の核酸。
  4. 【請求項４】 浸潤性プロセスに関連するポリペプチドまたはその断片をコ
    ードする、請求項１から３までのいずれか１項記載の核酸。
  5. 【請求項５】 請求項１から４までのいずれか１項記載のヌクレオチド配列
    を含む、修飾された核酸または核酸類似体。
  6. 【請求項６】 請求項１から４までのいずれか１項記載の核酸によってコー
    ドされ、その際、請求項１の但し書きを考慮しなくてよいポリペプチド。
  7. 【請求項７】 ポリペプチドにおいて、 （ａ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列、または （ｂ）（ａ）によるアミノ酸配列に７０％より高いホモロジー を有する請求項６記載のポリペプチド。
  8. 【請求項８】 請求項６または７記載のアミノ酸配列を含む、修飾されたポ
    リペプチド。
  9. 【請求項９】 配列番号２または４に示されるアミノ酸配列の少なくとも１
    ０アミノ酸長の断片を示すペプチド。
  10. 【請求項１０】 請求項１から４までのいずれか１項記載の核酸またはその
    断片の少なくとも１コピーを有するベクター。
  11. 【請求項１１】 核酸の発現を適当な宿主細胞において可能にする、請求項
    １０記載のベクター。
  12. 【請求項１２】 請求項１から４までのいずれか１項記載の核酸または請求
    項１０または１１記載のベクターで形質転換されている細胞。
  13. 【請求項１３】 請求項６から８までのいずれか１項記載のポリペプチドま
    たは請求項９記載のペプチドに対する抗体。
  14. 【請求項１４】 全ポリペプチドまたは配列番号４からのアミノ酸１〜３３
    ０の断片から選択されるその断片に対する、請求項１３記載の抗体。
  15. 【請求項１５】 医薬品組成物において、活性成分として （ａ）請求項１の但し書きを考慮しなくてよい、請求項１から５までのいずれか
    １項記載の核酸、 （ｂ）請求項１０または１１記載のベクター、 （ｃ）請求項１２記載の細胞、 （ｄ）請求項６から８までのいずれか１項記載のポリペプチド （ｅ）請求項９記載のペプチドおよび／または （ｆ）請求項１３または１４記載の抗体 を含む医薬品組成物。
  16. 【請求項１６】 更に医薬品に慣用の賦形剤物質、助剤物質および／または
    添加剤物質を含有する、請求項１５記載の組成物。
  17. 【請求項１７】 抗体の製造のための免疫原としての、請求項６から８まで
    のいずれか１項記載のポリペプチドまたはこれらのポリペプチドの断片の使用。
  18. 【請求項１８】 浸潤性プロセスに関連がある疾患の診断のための、請求項
    １５または１６記載の組成物の使用。
  19. 【請求項１９】 浸潤性プロセスに関連がある疾患素因の診断のための、請
    求項１５または１６記載の組成物の使用。
  20. 【請求項２０】 浸潤性プロセスに関連がある疾患の治療または予防のため
    の、請求項１５または１６記載の組成物の使用。
  21. 【請求項２１】 子宮内膜症の診断、治療または予防のための、請求項１５
    または１６記載の組成物の使用。
  22. 【請求項２２】 腫瘍疾患の診断、治療または予防のための、請求項１５ま
    たは１６記載の組成物の使用。
  23. 【請求項２３】 遺伝子治療のための薬剤としての、請求項１５または１６
    記載の組成物の使用。
  24. 【請求項２４】 アンチセンス−インヒビターとしての、請求項１５または
    １６記載の組成物の使用。
  25. 【請求項２５】 胚の着床における、請求項１５または１６記載の組成物の
    使用。
  26. 【請求項２６】 請求項６から８までのいずれか１項記載のポリペプチドの
    インヒビターおよび／またはポリペプチドに結合できる分子のインヒビターの同
    定のための、請求項１５または１６記載の組成物の使用。
  27. 【請求項２７】 試料での子宮内膜症関連タンパク質またはその断片に対す
    る抗体の検出のための、請求項６から８までのいずれか１項記載のポリペプチド
    またはこれらのポリペプチドの断片の使用。
  28. 【請求項２８】 子宮内膜症関連タンパク質またはその断片の検出のための
    、請求項１３または１４記載の抗体またはこれらの抗体の断片の使用。
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