JP2002514302A

JP2002514302A - フッ素ベースの化学反応を追跡しながら連続的に同位体比を監視する装置

Info

Publication number: JP2002514302A
Application number: JP54058698A
Authority: JP
Inventors: ピーアブラムソンフレッド
Original assignee: ジョージワシントン大学医学、健康科学部
Priority date: 1997-03-14
Filing date: 1998-03-11
Publication date: 2002-05-14
Also published as: CN1127118C; CN1253660A; AU745912B2; AU6696298A; CA2283177A1; IL131798A0; US6031228A; WO1998042006A1; IL131798A; EP1008167A4; EP1008167A1

Abstract

(57)【要約】炭素及び窒素化合物を含む試料の同位体比を測定する質量分析計又は方法は、炭素及び窒素化合物を含む試料を、被検体の混合物が分子に分離される試料導入要素に加えることを実行する。試料導入は、無傷の炭素及び窒素被検体をフッ素を含む化合物へ転化するための化学反応インターフェースに連続的に導入される。

Description

【発明の詳細な説明】フッ素ベースの化学反応を追跡しながら連続的に同位体比を監視する装置技術分野本発明は、水素、酸素、及び硫黄同位体を含む化合物と共に炭素及び窒素化合物を含む試料の同位体比を測定する装置及び方法に関する。背景技術質量分析装置は当業界では公知である。例えば、米国特許第５,４６８,４５２号は高速液体クロマトグラフと質量分析法を組み合わせた定量分析を開示している。この発明によると、銀又は白金合金、ステンレススチール又は錫もしくは非メッキ鉄から成るコロナ放電電極を持つイオン化チャンバーを含む大気圧化学イオン化インターフェースによって質量分析計に結合された高速液体クロマトグラフを使って、有機化合物の定量分析を行なう。しかしながら、Ｈａｇｉｗａｒａはフッ素を含む反応ガスを使用することを開示していない。米国特許第４,９３３,５４８号は、質量分析計に試料を導入する方法及び装置を開示している。Ｂｏｙｅｒ等は、微量試料を加熱してガス状化合物に転化するための調節可能な流量の試薬を供給する質量分析計のイオン源に微量試料を導入する方法及び装置を開示している。開示されたシステムは、基本的には、化学反応インターフェース（ＣＲＩ）を実行する。反応ガスはフッ素を含んでよい。温度が金属酸化物の昇華点を超えて六フッ素の昇華点に達すると、質量分析計のイオン源１８を供給するバルブを開けることによって、イオン源の供給は開始される。同位体比測定値は、質量分析計へ導入される標準ウラン、六フッ素の測定値と比較される。しかしながら、Ｂｏｙｅｒはマイクロ波加熱を開示しておらず、従って試料の連続的フローについては何等の教示もしていない。また、ＢｏｙｅｒはＩＲＭＳを利用しておらず、従って本発明では得ることが出来る結果の品質を得ることが出来ていない。米国特許第４,６３３,０８２号は高電圧装置で六弗化硫黄の劣化を測定するプロセスを開示している。Ｓａｕｅｒｓはキャリヤーガスとしてフッ素を使用することを開示している。米国特許第５,０８６,２２５号は、同位体精製用の熱サイクル式再循環ポンプを開示している。この特許はキャリヤーガスとしてフッ素を使用することを開示している。ＳｏｎｇとＡｂｒａｍｓｏｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．１９９５年、第６号、４２１−４２７頁、はリン、重水素、塩素及び硫黄を検出するめの化学反応インターフェース質量分析において新規の反応ガスとして三弗化窒素を使用することを開示している。この報文は、炭素及び窒素を含む試料間の質量分析計の分解能を得るためにフッ素ガスの使用の開示も、示唆もしていない。炭素及び窒素化合物間の質量分析計の分解能をもたらす高感度の質量分析計及び検定のニーズが業界にはある。質量分析法が、酸素の存在で大抵の分光計の場合と同じように行なわれると、炭素及び窒素を含む化合物の質量は両方とも約２８、２９ｍ／ｚでオーバーラップする。本発明は、フッ素ガスを使用してこのオーバーラップ信号を分離することが可能であることから先行技術の装置と方法の欠陥を解消する。発明の開示本発明は、次の事項から成り、フッ素を含む環境の中で各元素を新規の化学種に転化する連続式インラインプロセスによって試料の元素の同位体比を高感度で検出するための質量分析計装置を提供する：即ち、（ａ）被検体の混合物が特定の分子に分離される試料導入要素であって、前記試料導入は化学反応インターフェースに試料を連続的に導入する手段から成ること；（ｂ）化学反応インターフェース（ＣＲＩ）であって、前記ＣＲＩはフッ素を含む環境の中で無傷の被検体を新規の元素特定化合物に転化すること；及び（ｃ）精密な同位体測定が出来る質量分析計。試料導入要素は、ガスクロマトグラフ又は高速液体クロマトグラフが好ましい。化学反応インターフェースは、マイクロ波駆動型ヘリウムプラズマインターフェースが好ましく、質量分析計はマルチコレクター同位体比質量分析計である。好ましい実施態様では、試料導入要素は高速液体クロマトグラフであり、この装置では噴霧も向流も使ってユニバーサルインターフェースによって液相を取り除く。別の実施態様では、試料導入要素は高速液体クロマトグラフであり、輸送装置を使って液相を取り除く。追加の実施態様では、本発明は、炭素及び窒素化合物を含む試料の質量を測定する方法を提供することを長所とするものであり、次の事項から成る：（ａ）炭素又は窒素化合物を含む試料を、被検体の混合物が特定の分子に分離される試料導入要素に加えることであって、前記試料導入要素は化学反応インターフェース（ＣＲＩ）に試料を連続的に導入する手段から成り；前記ＣＲＩは無傷の炭素及び窒素被検体を、前記化合物を分割するフッ素から成る環境の中で新規の元素特定化合物に転化すること；及び（ｂ）精密な同位体測定が出来る質量分析計を用いて前記試料の化合物の同位体比を計算すること。好ましい実施態様では、使用される質量分析計は、化学反応インターフェース質量分析計（ＣＲＩＭＳ）又は同位体比質量分析計システム（ＩＲＭＳ）である。好ましい実施態様では、フッ素反応ガスはＮＦ３又はＦ２である。別の実施態様では、試験対象の試料は、酸素、リン、重水素、塩素、及び硫黄から選ばれる化合物も含む。本発明の前記及びその他の目的は、本発明の実施の最良の形態を単に説明する積もりで本発明の好ましい実施態様だけを示して、説明する次の詳細な説明及び図面から関連の当業者には容易に明らかになるだろう。容易に理解されるように、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、本発明は当業者の技術の範囲内で修正することが出来る。図面の簡単な説明第１図は、本発明の好ましい実施態様で使用されるクロマトグラフィー／質量分析装置のスキームを示している。第２図は、ＶｅｓｔｅｃＵｎｉｖｅｒｓａｌＩｎｔｅｒｆａｃｅを用いたＨＰＬＣ導入用のＣＲＩ-ＭＳプローブの略図である。第３図は計器組立体の構成図である。第４（ａ）−（ｃ）図は、反応ガスとしてＮＦ₃を使った試料Ｇ４０のＨＰＬＣ／ＣＲＩＭＳクロマトグラムを示している。第４（ａ）図は炭素の検出を示し、第４（ｂ）図は硫黄の検出を示し、そして第４（ｃ）図は塩素の検出を示している。発明の説明本発明は、フッ素ベースの化学を使って、連続フロー分析において種々の被検体に含まれる炭素及び窒素元素のフッ素化した誘導体を発生させることを含む。フッ素を使用することにより同位体比質量分析計（ＩＲＭＳ）を使って同位体存在比の測定がよりスムースで、より広い適応性も合わせて揃えることが出来る。フッ素ベースの反応ガスを加えると、所与の被検体に当初含まれる炭素及び窒素元素から新しい分子へ完全に化学的に転換させることが出来る。酸化や還元よりむしろ当初のフッ素化の元素含量及び同位体含量によって新しい分子が発生する。フッ素、即ちＦベースの化学の長所は次の通りである：（１）フッ素は単一同位体（¹⁹Ｆ＝１００％）であり、一方、酸素同位体の分布は¹⁶Ｏ＝９９．７６％、¹⁷Ｏ＝０．０４％,そして¹⁸Ｏ＝０．２％である。連続フロー（ＣＦ）／ＩＲＭＳによって行なわれる最も普通の測定は、測定種がＣＯ₂では¹³Ｃである。４５の質量単位であるイオンの測定チャンネルは所望の種である¹³Ｃ¹⁶Ｏ¹⁶Ｏばかりでなく、¹²Ｃ¹⁶Ｏ¹⁷Ｏも含まれるので、校正が必要である。対照的に、フッ素生成物、¹³ＣＦ₄、は直接測定出来る。（２）質量分析計では、ＣＯ₂は分裂してＣＯとなるが、これは質量単位２８であり、Ｎ₂と同じ質量単位である。更に、Ｎ₂の同位体比を測定することになると、ＣＯ₂はＩＲＭＳに入る前に捕捉しなければならない。このことは、同じ実験設備を使って¹³Ｃの濃縮物も¹⁵Ｎの濃縮物も両方とも測定出来るとは限らないことを意味している。ＣＯ₂ではなくてＣＦ₄が生成するとこの問題は解消される。（３）水素の同位体を分析するには、従来の方法では化学も分析も完全に変えなければならない。酸化よりもむしろ還元プロセスを使用するので生成物はＨ₂ である。問題の質量は、２（¹Ｈ¹Ｈ）と３（¹Ｈ²Ｈ）である。このような小さい質量を使用すると、Ｎ₂（２８及び２９）やＣＯ₂（４５、４５及び４６）用に使用されるのとは異なるアナライザーの設計が必要である。フッ素ベースの化学では、普通のアナライザーの配置を利用出来る質量２０及び２１のＨＦが測定される。（４）Ｈ₂を分析する場合、Ｈ₃ ⁺＋Ｈ₂ ⁺−Ｈ₃ ⁺＋Ｈの反応が起こる。Ｈ₃ ⁺ は質量３の信号質量となり、¹Ｈ²Ｈの質量と一致する。これにより²Ｈを測定する精度と正確さが限られる。（５）２種類の別の元素、即ちＳ及びＯ、の同位体組成物を同じ化学スキームを使って検討出来る。従って、炭素及び窒素化合物の測定及び分解能に関するフッ素ベースの化学は、先行技術の方法よりも遥かに判り易い。ＣＦ−ＩＲＭＳ計器は、炭素及び窒素化合物を含む試料の同位体比の測定方法を使用出来る。ＣＦ−ＩＲＭＳ計器は、基礎と臨床の両方の地球化学植物生理学、食物、や風味、及び海洋学で使用される。最近、この主題につての総説が出された（Ｗ．Ｂｒａｎｄ、Ｊ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．３１巻、２２５−２３５頁（１９９６年））。第１図では、試料は高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）を使って導入される。個々の成分はカラムの中で分離され、次に（必要に応じて）紫外検出計を通るが、これはＨＰＬＣ計器の標準装置である。試料が移動する液体流は、次に、ＵｎｉｖｅｒｓａｌＩｎｔｅｒｆａｃｅ（ＵＩ）で蒸発されたのち、”乾燥”粒子は運動量分離器（ｍｏｍｅｎｔｕｍｓｅｐａｒａｔｏｒ）により移送されるが、その分離器では高流量そのもののヘリウムは、この化学反応インターフェース（ＣＲＩ）に入ったのち、質量分析計に入るのに適する極めて低い流量に落とされる。ＣＲＩでは、マイクロ波電源を集束するキャビティーを通るアルミナチューブ内部に保持されたマイクロ波誘導型ヘリウムプラズマによって、全ての化学種はその元素に分解される。このプラズマから遊離された元素は再結合して１組の小さい分子状生成物を生成するが、その性状は、被検体の組成及び使用される反応ガスの選択によって決まる。ガスクロマトグラフからの導入を利用する場合、カラムから出る成分は直接ＣＲＩに入る。運動量分離器からＨＰＬＣポンプ及び制御部への装置はこの形式の装置では使用されない。反応ガスがフッ素を含む場合、このガスは今日まではＮＦ₃であり、同位体比質量分析計（ＩＲＭＳ）で使用するのに特に適用可能な、特異な一連の小さい分子状生成物が発生する。フッ素を含む新規の一連の反応は、化学反応インターフェース質量分析法（ＣＲＩＭＳ）で検討されてきた。このようなフッ素に富む環境により、酸素、炭素、窒素、リン、水素同位体、塩素及び硫黄を選択的にかつ同時に検出する新規の方法が得られる。反応ガスとしてのＮＦ₃によって、最も判り易い一連の元素及び同位体検出が可能であり、ＣＲＩＭＳにも利用出来る。化学反応インターフェース質量分析法（ＣＲＩＭＳ）は、元素及びその同位体の選択的検出と、従来の質量分析法とを単一に組み合わせる技術である。既存の質量分析システムに対して殆ど修正することはなく、ＣＲＩＭＳは、２Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、Ｓ、Ｃｌ、ＳＥ、Ｏ及びＢｒを含めて、元素及び同位体の選択的検出が出来ることが判った。放射性標識を使用することなく、しかも分子がＣｌ及びＳのような“固有標識（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃｌａｂｅｌ）”を含む場合、安定な同位体標識さえ使用することなく、代謝作用を検討するには特に有用である。炭素及び窒素を含む化合物は、生化学、医薬品及び環境科学で極めて重要である。有用であること、使い勝手に欠けること、そして代替方法には制約があるので、方法を開発することによってＣＲＩＭＳ又はＩＲＭＳを使ってＣ、Ｎ及びＰを含む生成物は選択的に検出することが出来る。実験本発明の方法は、ＨＰＬＣ及び連続フロー同位体比質量分析計を使用するのが好ましい。各要素は：１．高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）；２．ＶｅｓｔｅｃＵｎｉｖｅｒｓａｌＨＰＬＣ／ＭＳインターフェース；３．化学反応インターフェース（ＣＲＩ）；及び４．同位体比質量分析計システム（ＩＲＭＳ）である。従来の質量分析計に結合されたキャピラリーガスクロマトグラフィーを使ったＣＲＩＭＳからは、ＣＲＩ−ＭＳの広範な用途が得られ；そしてこのアプローチを可能にする、ＨＰＬＣに対するＣＲＩへのインターフェースが最近開発された。ＣＲＩの特異な化学によって、古典的燃焼方法と比較して１５Ｎの測定が改良されている。このタイプの計器は同位体やＩＲＭＳを利用する研究者に無傷の生物学的ポリマーを含む広範な目標分子を提供する。ＨＰＬＣ／従来型ＭＳ手法と比較すると、１３Ｃ及び１５Ｎは、大幅に少なくなった同位体存在比で選択的に検出される。更に、無傷の生物学的高分子は、同位体定量化のＣＦ−ＩＲＭＳによって直接分析出来る。このことにより、１４Ｃがトレーサーであるか、或いは加水分解とそれに続くクロマトグラフィーによる分離、及び選ばれるモノマーのＭＳ分析の面倒な手順が必要であるどちらかの生物学的系では分析が著しく進歩する。化学反応インターフェース本発明の検定で使用するのに好ましい装置は、マイクロ波駆動型化学反応インターフェース（ＣＲＩ）を使う。この装置は、被検体を分解したのち当初の被検体分子の構造に関係ない方法で、スペクトルによって有機分子の中で安定な同位体を選択的に検出出来るような小さい分子へ再配置する；そうでなければ、特性は放射能を必要とする。ＣＲＩの大抵の使用方法には、シングルコレクター式迅速走査型質量分析計（ＭＳ）によるクロマトグラフィー分離及び検出が含まれる。同位体比質量分析計同位体比質量分析計（ＩＲＭＳ）のコレクターの複数配置によって、従来の質量分析計で達成出来るよりも小さい濃縮度を検出出来る能力が付与される。ユニバーサルＨＰＬＣ／ＭＳインターフェースユニバーサルインターフェース（ＵＩ）は、分析試料流からＨＰＬＣ溶媒を本質的に完全に除去出来る。１／１００，０００の溶媒を保持することでさえＣＲＩの化学を圧倒することが出来たように、ＨＰＬＣをＣＲＩへ導入することが出来るのはユニークである。このことによってＩＲＭＳでのＣＯ２ベースラインが高まる。Ｖｅｓｔｅｃ社（現在はＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓの一つの部門）と共同で、本発明者は、以前の導入方法であったガスクロマトグラフィーよりもむしろ高速液体クロマトグラフィーを用いて混合物を分離するＣＲＩ−ＭＳ計器を作った。第１図に示す装置は、ヘリウム流の中でサーモスプレーによる噴霧化された流出物を先ず脱溶媒和したのち、向流のヘリウムで残留蒸気を取り除く（Ｖ１）。溶媒の百万分−１億分の１より少ない部分が残る。ヘリウムのＬ／分の流量をｍＬ／分の流量へ減らすために運動量分離器（第２図）によって試料流はヘリウムの中の被検体粒子の極端な“乾燥”状態によって特徴づけられる。移動ベルトを別にして、このことは別のＨＰＬＣ／ＭＳ／インターフェースよりも遥かに良いと思われる。ＵＩの流量は、被検体を１−２ｍＬ／分のＨｅ流の中で移動させながら運転するのが普通であるＣＲＩに導入するのに適している。今日まで、本発明者の研究は、ＨＰＬＣ、ＵＩ、及びＣＲＩを、扇形磁場ＭＳ、従来の四重極ＭＳ及びＩＲＭＳにも効果的に結合する設計を新たに行なった。この装置は、診断に役立つ検定、特に生物学的及び薬理学的重要事項の検定に対して新たな分析概念、即ちＨＰＬＣ／ＣＲＩ−ＩＲＭＳを提供する。尿素やアミノ酸のような単純な化合物、そしてＤＮＡのような複雑な化合物の中の安定な同位体を検出することは本装置で実施出来る。ＣＲＩは、ガスクロマトグラフ導入を利用するＩＲＭＳ計器用の“標準品（ｓｔａｎｄａｒｄ）”である燃焼系の代替物を提供する。ＣＲＩの長所は次の通りである：ＣｕＯ燃焼器又はその他の化学反応器の制約された容量と比較して酸化ガスの実質的に制約のない供給；ＮＯとしての窒素を検出するのでＣＯとＮ２の間の干渉の問題が避けられること；そして化学的性質を変えて、１８Ｏ又は３４Ｓのような広範囲の同位体種を監視出来る能力。生物学的化学でのＨＰＬＣの使用が益々増加することは、ＨＰＬＣ／ＩＲＭＳ／計器がＧＣに対して適さない物質の代謝作用研究を補佐することにより大きく進歩することを示している。分離を必要とする試料を導入するためにＰＬＣの能力を超えると、予め精製された試料のフローインジェクション法（即ち、ポストカラムによる溶媒流の直接導入）を使い極めて広範囲の物質、特に無傷の生物学的高分子、をＣＲＩインターフェースによって提供することが出来た。本装置は、生物学的に大きい分子の分析時間を大幅に減らす高精度の同位体決定が可能であり、現在は、モノマー（又は小さいオリゴマー）へ分割しなければならず、次いで、いかに多くの特定の標識を繰り入れるかを知る前に、更に精製、分離そして分析しなければならない。ＧＣの場合、頻繁に要求される炭素ベースの誘導体化手法の異常な同位体特性の煩雑さは、ＨＰＬＣを使った高精度のＩＲＭＳ測定で解消されるだろう。一般的に、安定な同位体は、放射性同位体に関連する危険はないので、この同位体はヒトに関する実験に向いている。窒素の放射性同位体は存在しないので、トレーサーとして１５Ｎを使用することは特に重要な意味を持つ。従来のＭＳに比較してＩＲＭＳの検出限界が高くなったことは、ヒト及びその他のトレーサー実験が更に容易に実施されることを意味している。生物学系のおける同位体比の測定方法生物学系における同位体比の質量分析は、Ｒｉｔｔｅｎｂｅｒｇの先駆的研究による１９３０年後半に由来する。一般的に、好適に調製された試料は、頻繁に封管の中で燃焼することにより、ＣＯ２、Ｎ２、及びＨ２Ｏのような小さい多原子種へオフラインで転化される。このガスは、４５／４４［即ち、（１３Ｃ１６Ｏ２＋１２Ｃ１７Ｏ１６Ｏ）／１２Ｃ１６Ｏ２の比が精密に決められるような長時間にわたり、制御された条件のもとでマルチコレクター質量分析計に導入される。この手法を、“オフライン式燃焼ＩＲＭＳ”と呼ぶことにする。特に適用出来るＩＲＭＳの態様は１９７６年に始まる。Ｓａｎｏ等（Ｓ１）は、ＧＣ、燃焼器、及びＩＲＭＳが一緒に結合された計器を最初に発表した。次の先例はＭａｔｔｅｗｓとＨｅｙｅｓによって行なわれた（Ｍ３）。マルチコレクターＩＲＭＳを使用することなく、彼等は、高い精度で１３Ｃ及び１５Ｎの低い存在比の検出を行なった。この手法により、彼等は、９ナノモル（ｎｍｏｌ）のオクタン酸メチルから１３Ｃに対する０．０２ＡＰＥ^*を測定出来た。比較では、オフライン式燃焼に続く、複式入口、複式コレクターＩＲＭＳ測定方法を含む技術は、５倍の高い精度であるが、この測定を行なうのに２３０ナノモルは必要であった。ＭａｔｔｅｗｓとＨｅｙｅｓは、この装置は、１０ナノモルの炭素を含む試料の中の０．２ピコモル（ｐｍｏｌ）を超える１３Ｃを検出出来ることを報告した。窒素の場合、彼等は、血漿アミノ酸を検討して１００ナノモルの窒素の中で４ピコモル超える１５Ｎを測定出来ると報告した。１９８４年、Ｂａｒｒｉｅ等（Ｂ１）は、ＭａｔｔｅｗｓとＨｅｙｅｓによく似た燃焼インターフェースを使って、ガスクロマトグラフとマルチコレクター安定型同位体比質量分析計を結合した。全体的に、彼等の結果を複式入口、複式コレクターＩＲＭＳと比較すると、１３Ｃ^*の２δ、即ち０．２％の誤差内で一致した。著者等は次に様に結論した： “我々は、標識化合物の必要量を少なくとも１０分の１で済ませること、及び標識化合物が、ＧＣ／ＭＳ／ＳＩＭ［選択イオン検出］監視を使って利用するのに極めて低い濃縮度でのみ利用出来る場合、新しい研究を実施するのにガスクロマトグラフィー／ＳＩＲＡ［安定同位体アナライザー］方法を期待する。” ２種類の市販のＧＣ／燃焼／ＩＲＭＳ計器がある；例えば、ＦｉｎｎｅｇａｎＭＡＴｔ社のＤｅｌｔａＣであり、この設計計画を追跡する。公表されたデータによると、この系は、オフライン式燃焼ＩＲＭＳ分析で得られる精度に匹敵する精度を得ることが出来ることを示している。連続フローＧＣ／同位体比測定の概念は明確に定義され、そして評価されてきた。ＧＣと燃焼器を結合して、質量間でピークを切り換えて電子増倍管で検出するシングルコレクター質量分析計^*とすると、直接選択イオン記録式ＧＣ／ＭＳ実験よりも実質的に優れた性能が得られる。質量分析計をＦａｒａｄａｙのマルチコレクターと結合すると、ＧＣ／燃焼器／ＭＳは、オフライン式燃焼ＩＲＭＳ方法とほぼ同じ優れた結果が得られるようであるが、物質はかなり少なくて澄む。明らかに、精製した試験片を得て、ＩＲＭＳ測定の前にそれを処理する必要性はインライン式ＧＣ及び燃焼器ではなくなる。別の１つのＩＲＭＳ方法は、基本的アナライザー、ＧＣ及びＩＲＭＳを結合することである。このことは、１９８５年に１３Ｃと１５Ｎの両方で初めて実現された（Ｐ２）。このような組み合わせにより、一定のガス燃焼生成物であるこれらのＮ２とＣＯ２が複式コレクターＩＲＭＳに入る前に充填カラム型ＧＣはＮ２とＣＯ２を分離する。この方法は、予め分離された物質にも分離されていない物質にも効果のあるシステムのようであるが、各分析が数分間を要するので別の分離装置（即ち、ＧＣ又はＨＰＬＣ）と連結させることは出来ない。原子率超過量（ＡｔｏｍＰｅｒｃｅｎｔＥｘｃｅｓｓ）（Ａ．Ｐ．Ｅ）は、未知の同位体比から基準の同位体比を引いた差［ＩＲ（未知（ｘ））−ＩＲ（基準）］を１００倍して［１＋ＩＲ（未知）−ＩＲ（基準）］で割算する。 ^* δ（パーミル（ｐｅｒｍｉｌ））表記は未知の同位体比と基準の同位体比の差の相対差を表す：δ＝［ＩＲ（未知）−ＩＲ（基準）］／ＩＲ（基準）］・１０００。ＣＲＩＭＳのバックグラウンドＭａｒｋｅｙ及びＡｂｒａｍｓｏｎ（Ｍ１、Ｍ２）は、化学反応インターフェースを開発した：即ち、ヘリウムの存在で複雑な分子をその元素に完全に分解するマイクロ波駆動型装置である。反応ガス、例えば酸素、を加えると、元の被検体の元素組成を反映し、シングルコレクター質量分析計によって検出される安定な酸化生成物を生成する。このプロセスの概略の特性は極めて簡略化されているけれども、次のスキームで示される。文字ＡＢＣ及びＤで表わされる元素から成る複雑な分子は、ヘリウム流の中で過剰の反応ガスＸと混合される。ＣＲＩＭＳ分析では、Ｂが問題の同位体又は元素の場合、どのＭＳを使ってもＢＸからの特性質量でＢを監視することが出来る。ＧＣ／ＣＲＩＭＳ装置の概要は、参考資料Ｃ１の第１図に示されている。キャピラリーガスクロマトグラフィーと化学反応インターフェース−質量分析計（ＧＣ／ＣＲＩＭＳ）の組み合わせにより安定な同位体標識物質が溶出する時に、 ^**シングルコレクター又は“従来型”質量分析計は、同時よりもむしろ逐次的に２個の質量をジャンプ、走査、又は検出するあらゆる計器を指す。本明細書では、大抵の四重極、扇形磁場、イオントラップ及び飛行時間型の各質量分析計はシングルコレクターである。分析者はこの物質を選択的に検出出来る。分子ＢＸが特定の同位体、即ちＭ＋１、を監視するように選択される場合、濃縮ＢＸだけを示すクロマトグラムは方程式１で表される。濃縮ＢＸ＝Ｍ＋１のＢＸ−ＭのＢＸから予測されるＭ＋１の天然存在比（方程式１）この方程式はＢＸ中の同位体の天然存在比からの寄与を差し引くので、Ｍ＋１だけはトレーサーから発生するＢＸから除かれている。このことにより、ＣＲＩＭＳの同位体の選択的検出が可能となる。ＩＲＭＳは、生物学的系の同位体又は元素を検出及び定量化するのに高感度で、選択的でそして信頼出来る方法である。ＩＲＭＳによる種々の実験では、尿、血漿、組織抽出物、培養中に分離された肝細胞、及びマトリックス問題のない細胞培養培地を使って成功した。本発明者は、ＩＲＭＳを使い天然発生源に由来する被検体の同位体存在比における酵素による差異を評価する。加水分解や誘導体化という時間のかかる段階が不要なので、無傷の生物学的高分子の同位体分析は価値がある。実施例１ ¹³ Ｃ／¹²Ｃ比に基づくヒトの成長ホルモン試料の分化生合成タンパク質を産出するのに使用される大腸菌は、種々の発生源である栄養素源の中で成長することがあるので、組み替えタンパク質の同位体シグネチャーはテストステロンと同じように、内因性産出分子とは異なる可能性がある。この仮説を検証するために、本発明者は、ヒト下垂体から出るＧＨと一緒に３種類のｒｈＧＨ試料を得た。各バイアルに付いて提供された指示書に従って、各組み替え試料を蒸留水に溶かした。下垂体ＧＨは、これと一緒に受け取った支持書に従って０．０３ＭのＮａＨＣＯ₃と０．１５ＭＮａＣｌに溶かした。同位体測定のために化学反応インターフェース（ＣＲＩ）を使って被検体をＣＯ₂に転換する、最近開発された高速液体クロマトグラフ／同位体比質量分析計（ＨＰＬＣ／ＩＲＭＳ）装置に２０μＬの試料を注入した。凝縮相内標準として、本発明者は、オフライン式燃焼、及び従来型ガスインレット式ＩＲＭＳ方法によって、−２１．０３ δの¹³Ｃ０／００と測定された同位体比のウマアルブミンを使った。各注入量は、２μｇのアルブミン（３０ピコモル）と２−３μｇ（１００−１５０ピコモル）のｒｈＧＨを含んでいた。移動相は、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及び０．１％のＴＦＡも含むアセトニトリルであった。３０％のアセトニトリルで２分間保持した後、ＩｓｃｏＭｏｄｅｌ２６０の複式シリンジポンプ装置を使って、溶媒組成物を１０分間で７０％のアセトニトリルに高めた。流量は１ｍＬ／分であった。分離は、ＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＰｏｒｏｓＲ２カラム（長さ３０ｍｍ、内径２．１ｍｍ）を使って実施した。Ｉｓｏｄａｔソフトウェア付きのＦｉｎｎｉｇａｎ／ＭＡＴ社のＤｅｌｔａＳＩＲＭＳを使って同位体比を測定した。酸素がＣＲＩ用の反応ガスであった。 δ ¹³Ｃ０／００については、これらの調製品の平均値及びＳＤ値は次の通りである：ヒト下垂体、−１１．３１±０．７１；ＧｅｎｅｎｔｅｃｈＮ −１８．４７±０．５０（ｎ＝７−８）。それぞれの場合、測定された同位体比は下垂体ＧＨとは違っていた。Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓの多重比較（ｍｕｌｔｉｐｌｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ）によるとｐ＜０．０５）。実際には、Ｌｉｌｌｙの製品だけが下垂体ＧＨとは著しく異なる炭素同位体比である。製造者が大腸菌成長培地の中の成分源を変えれば、生合成試料に基づいて測定された炭素同位体比シグネチャーは各ロット毎に大幅に変動することがあることも認識しなければならない。実施例２：物質収支の検討本発明は、放射性同位体の使用を減らすことが出来るように安定な同位体を使って性能を高める。放射能を利用する１つの特に“標準的”方法は、物質収支を検討することにある。標識された物質を或る生物学的系に投与して、その物質の標識含量についてこの系からの画分を調べる。一般的に、この標識物質は１４Ｃであり、シンチレーション分析法は、化学的形態に関係なく標識物質の量を効率的に計算する。動物を使う場合、尿、胆汁、大便、唾液、等のような生物学的試料を採取する。細胞系の場合、細胞の中に摂取されると見なすことが出来る。本発明者は、この目的のために直接導入式ＨＰＬＣ／ＣＲＩ−ＩＲＭＳ装置を評価した。本発明者は、新規のＨＰＬＣ／ＣＲＩ／ＩＲＭＳ計装の性能を評価して、尿の中の¹³Ｃ標識付き薬のトレース量を検出した。この手法は、マイクロ波駆動型化学反応インターフェースによる¹³ＣＯ₂への燃焼の前にフローインジェクションを使って尿試料を脱溶媒和系に送る。５０ｎｇ／ｍｌよい少ない過剰の¹³Ｃ（〜０．５μｇ／ｍｌの¹³Ｃ₂標識付きのアミノピリン）を定量出来るこの装置は、尿の中の¹³Ｃについてはオフライン式燃焼方法を使う従来型の検出限界よりも優れている。本発明では１ｍｇ／ｋｇ程の少量の線量を使ったが、これらの結果は、ＩＲＭＳを使って物質収支を行なった以前の検討結果を支持する。表１ＩＲＭＳ化学の一覧 ^a １個以上の同位体変種を使用する種だけは、複数個の質量を示している。^b 正確な質量が指示される場合、選択的結果を得るには高分解能が必要である。^c ＳＯ₂が反応ガスとして指示される場合、Ｏ₂のような別の酸化剤は同様な生成物を生成するが、収率は異なる。^d １３Ｃの選択的検出が可能であるが、そのことは未だ実証されていないと考えられる。^e Ｏ¹⁸の検出は本研究が最初である（未発表）。本発明者は、また、ＣＲＩＭＳへ試料を導入する手段として直接プローブ（ｄｉｒｅｃｔｐｒｏｂｅ）を使って、選択された元素又は同位体も分析した。最低２０ｎｇ量のポリメチオニンの酸化から産出されるＳＯ２の線形信号を観察した。種々の組成の１２種類のタンパク質の１μｇレベルでのＳ／Ｃの原子含量の理論値と実測値では良好な相関（ｒ＝０．８）があった。実施例３：ＩＲＭＳにおけるフッ素化学の評価次の実施例では、使用したＧＣ／ＩＲＭＳシステムは、３０ｍ×内径．２５ｍｍ×膜厚０．１μｍのＤＢ−５キャピラリーカラム付きのＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ５８９０II／５９７１ＡＭＳＤであった。マイクロ波駆動型化学反応インターフェース（ＣＲＩ）が、カラムとＭＳＤの入口との間のＧＣ炉に取り付けられている。ヘリウムの流量は、０．５ｍｌ／分であって、ＳｗａｇｅｌｏｋＴを使ってカラム、ＣＲＩ、及び反応ガスチューブを直結した。反応ガス流量は測定しなかったが、反応ガスの大部分の量がヘリウムプラズマを急冷するので、反応ガスは全ガス流量の極めて少量の分流として表されるに過ぎない（１７）。ＣＲＩは、外径１／４”×内径１／１６”×長さ５”のアルミナチューブ、及び１００Ｗ、２４５０ＭＨｚの発信機からのマイクロ波電力を送電するのに使用されるステンレススチール製空洞共振器から成る。ＴｅｋｎｉｖｅｎｔＶｅｃｔｏｒ２データシステムを使ってＭＳＤを制御し、そのデータを処理した。全ての実験では、１μｌの所定の溶液をスプリットレスモード（ｓｐｌｉｔｌｅｓｓｍｏｄｅ）で注入し、注入の５分後からデータ採取を開始すると、溶媒先端が通過出来るようになり、その後、ちＣＲＩでのマイクロ波誘導プラズマが発光した。分析の進行度合いに応じて、ＭＳは下記に示す任意の、又は全ての質量に対して選択イオン検出（ＳＩＭ）モードに設定することが出来た。次の反応は、種が検出される元素、生成物、フラグメントイオン、及び質量を示している：Ｃ→ＣＦ₄（ＣＦ₃ ⁺、ｍ／ｚ６９）Ｈ→ＨＦ（¹ＨＦ⁺、ｍ／ｚ２０；²ＨＦ⁺、ｍ／ｚ２１）Ｏ→Ｆ₂Ｏ（Ｆ₂Ｏ⁺、ｍ／ｚ５４）＋その他の酸素／フッ素化合物Ｐ→ＰＦ₅（ＰＦ₄ ⁺、ｍ／ｚ１０７）Ｃｌ→ＣｌＦ（³⁵ＣｌＦ⁺、ｍ／ｚ５４；³⁷ＣｌＦ⁺、ｍ／ｚ５６）Ｓ→ＳＦ₆（ＳＦ₅ ⁺、ｍ／ｚ１０７）。炭素の検出：選択された全ての化合物は炭素を含むので、この信号は選択的ではない。炭素をｍ／ｚ６９で監視した。窒素の検出：ＣＲＩでは、ＮＦ₃は全てが解離してＮ₂とＦ₂になる。従って、窒素を含む化合物は、バックグラウンドが高いので検出出来ない。比較的安定なＮＦ₂がこのように全て解離することはＮＦ₃ではなくＦ₂が反応ガスであり、ｍ／ｚ２８と２９を監視することにより窒素検出を行なうことが出来る場合、Ｎ₂ はあらゆる含窒素被検体の生成物であることを示している。リンの検出：Ｉｎｇ／μｌから１０００ｎｇ／μｌのＴＢＯＥＰの一連のトルエン溶液は内標準としてのＴＢＰを用いて調製した（１０ｎｇ／μｌ）。最初に、ＧＣカラム温度は２時間は９０℃であり、次で４０℃／分の速度で１４０℃まで、その次に１０℃／分で２７０℃まで、そして５分間保持するようにプログラム化した。ＳＩＭプログラムはｍ／ｚ２０、６９及び１０７を使った。重水素の検出：重水素で標識したアミノ酸を試料として使用した。６９ｐｇ／ μｌから６９ｎｇ／μｌの濃度のＬ−フェニルアラニン−ｄ₈、Ｌ−ロイシン− ｄ₁₀、及び標識していない一定濃度（６５ｎｇ／μｌ及び６３ｎｇ／μｌ）のＬ −フェニルアラニンを用いて水溶液グループを調製した。これらの溶液は、次の手順で誘導体化した：１００μｌの溶液を乾燥し、５０μｌのＭＳＴＦＡと５０μｌの乾燥アセトニトリルを加えて、密封した反応バイアルの中で１００℃で３０分間加熱した。ＧＣカラムを７０℃で２分間設定し、３０℃／分の速度で１００℃まで、そして１分間保持するプログラムを組み、次いで再び１５ ℃／分で２００℃まで、そして５分間保持するプログラムを組んだ。ＳＩＭモードはｍ／ｚ２０，２１及び６９を使った。硫黄の検出：内標準として（２４．５ｎｇ／μｌ）Ｌ−システィンを用いて６６ｐｇ／μｌから６６ｎｇ／μｌの濃度でＬ−メチオニン水溶液を調製した。これらの溶液を前述のように誘導体化した。ＧＣカラムを７０℃で２分間設定し、４０℃／分の速度で１３０℃までプログラムを組み、３分間保持し、再度２．５ ℃／分で１５０℃まで、次いで２０℃／分で２５０℃までプログラム化し、１分間保持した。ＭＳＤは、ｍ／ｚ６９と１２７を使うＳＩＭモードで行なった。塩素の検出：一連のジアゼパムトルエン溶液を、内標準（７．２ｎｇ／μｌ）としてＤＤＴを用いて、０．６８ｎｇ／μｌから６８０ｎｇ／μｌで調製した。当初のＧＣ温度は７０℃で２分間設定し、３０℃／分で２１０℃まで、次で１０ ℃／分で２５０までプログラムを組み、そして５分間保持した。ＭＳＤはｍ／ｚ２０、５４、５６及び６９のＳＩＭモードで行なった。次の８種類の化合物の混合物を使って、これらの全ての目標とする種の同時でかつ選択的検出を実証した：即ち、ニトロベンゼン−ｄ₅、ＴＢＰ、カフェイン、チオペンタール、パルミチン酸メチル、ステアリン酸メチル、ＴＢＯＥＰ及びジアゼパムである。これらの化合物の濃度は精密に測定しなかったが、各々、約１００、１０、１５０、１００、１５０、３００、５０及び５０ｎｇ／μｌであり、引き続いてこれらを蒸発させたのち、トルエンの中で再構成する。アミノ酸は試料の誘導体化が必要なこと及び複雑さが増すので使用しなかった。ＧＣ温度は７０℃で２分間設定し、３０℃／分で１２０℃まで、次に１０ ℃／分で２５０℃までプログラム化し、５分間保持した。ＭＳはｍ／ｚ２０、２１、５６、６９、１０７及び１２７でＳＩＭモードで設定した。シクロホスファミドを受けている患者からの血漿試料は次のスキーム従ってＦＤＡの研究所で処理された。アセトニトリル２ｍｌ、メタノール１ｍｌ、２Ｍの一塩基リン酸ナトリウム１ｍｌ（ｐＨ４．６）、並びにｏ−ペンタフルオロベンジルヒドロキシルアミンＨＣｌ塩（５０ｍｇ／ｍｌ）と²Ｈ₄−アルドホスファミドのｏ−ペンタフルオロベンジルオキシム誘導体（１６μｇ／ｍｌ）を含むメタノール溶液２５０μｌを含むチューブに血液試料を集めることにより反応代謝物をトラップした。少なくとも３時間の後、この試料を遠心分離して、上澄液を取り除き、ＣＨＣｌ₃ １ｍｌと混合した。回転撹はんの後、下側の有機層の１．６ｍｌを取り出し、蒸発させた後、アセトニトリル２５０μｌとＮ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−Ｎ−メチルトリフルオロアセトアミド６０μｌを残渣に加えて室温で１時間シリル化反応を行なった。クロマトグラフカラムからの被検体はヘリウムをキャリヤーガスとしてＣＲＩに入り、反応ガスと混合すると、被検体も反応ガスもマイクロ波駆動型プラズマによって原子に分解する。原子は反応室から出ると再結合して、原子の化学熱力学特性に従って小さい分子を生成する。選択イオン検出モードの質量分析計は、これらの新しく生成した分子を選択的に測定する検出器としての役割をする。質量分析計の応答は、定性的（元素又は同位体の存在を示す）と定量的（元素又は同位体比の存在量）と両方の情報を提供する。フッ素化学の検討の前に、検討されたＣＲＩＭＳの反応ガスは、化学的特性に基づいて２つのカテゴリー：即ち、酸化性又は還元性に分類することが出来る。酸化性反応ガスは、Ｏ₂、ＣＯ₂及びＳＯ₂であり、一方、還元性反応ガスは、Ｈ₂ 、ＨＣｌ、ＮＨ₃及びＮ₂である。リンを含む揮発性で安定なＣＲＩＭＳ生成物を発生させるために本発明者の当初の計画は、ＰＨ₃が還元性環境の中でリン酸塩から発生出来たというＭａｔｓｕｍｏｔｏ等（１８）の観察を根拠とした。リンを含む化合物を選択的に検出するために、これらのガスを使用しようと試みたが成功しなかった。化学反応インターフェースでは、フッ素に富む環境を利用する、新規の化学的方法を評価した。最初に、ＳＦ₆をフッ素源として使用した。反応ガスとしてＳＦ₆を用いてリンはＰＦ₅に転化させ、ＰＦ₅質量スペクトルの中の最大の存在比ピークであるｍ／ｚ１０７（ＰＦ₄ ⁺）で選択的に検出出来た。このことは、ＣＲＩＭＳによってリンを選択的に検出した最初に成功した実験であった。しかしながら、ＳＦ₆は幾つかの理由で優れた反応ガスではなかった。第１に、Ｐの選択的検出チャンネル、ｍ／ｚ１０７は、³⁴Ｓ¹⁶ＯＦ₃ ⁺、即ちＳＦ₆及びＯ₂のＣＲＩＭＳの生成物によって干渉されることがあった。更に、ＳＦ₆は本来、極めて安定であり、高い反応性のフッ素化環境を作り出さないようであった。しかしながら、このことは、フッ素を使うＣＲＩＭＳ化学はＰ−選択種を生成することが出来るという考えの証明となった。より反応性の高いＮＦ₃を使用すると成功した。ＮＦ₃の化学は、ＮＦ₃はそれ自体では簡単には変化しないとことを除いて、ＳＦ₆の化学と似ているが、かなりの程度まで生成物としてＮ₂とＦ₂を生成する。ＳＦ₆は優先的に再結合した。フッ素を多く使用すると、ＰＦ₅が簡単に生成するばかりでなく、前述の反応に従って別の種も無視出来なかった。このようなフッ素発生スキームによりリンの選択的検出が可能になるのみならず、ＣｌやＳのような数種の別の元素、及びそれの同位体の含量ばかりでなく、水素、炭素、及び恐らく窒素や酸素の同位体も同じように好ましい。ＣｌＦは、有機化合物からの塩素のＣＲＩＭＳ生成物である。ｍ／ｚ５４もｍ／ｚ５６も検出チャンネルとして使用出来る。しかしながら、ｍ／ｚ５４は、硫黄が存在すると、ＣＲＩＭＳ生成物であるＳＦ₆の質量スペクトルの一部であるＳＦ₄ ⁺⁺ によって干渉されることがあった。もう１つの問題は、ｍ／ｚ５４のＦ₂Ｏ⁺は、酸素のＣＲＩＭＳ生成物となることが出来るが、酸素を含む化合物を用いた実験ではｍ／ｚ５４のチャンネルにピークは現れなかった。硫黄を含む化合物が存在しない場合、ｍ／ｚ５６のチャンネルよりも３倍多い種を生成するので、ｍ／ｚ５４を使うことが出来るように思われた。硫黄を含む化合物の選択的検出チャンネルは、ＳＦ₆の質量スペクトルの基準ピークであるｍ／ｚ１２７（ＳＦ₅ ⁺）である。ＳＦ₆は、フッ素化環境の中で硫黄の主要なＣＲＩＭＳ生成物である。フッ化水素は、有機化合物から水素原子の主なＣＲＩＭＳ生成物して生成する。本発明者は、ｍ／ｚ２０と２１を使うとＨとＤを選択的に測定出来ることを見い出している。標識されていない有機化合物の一般的検出チャンネルはｍ／ｚ２０によって出来るのに対して、ｍ／ｚ２１は、重水素を含む化合物に対して選択的である。重水素を選択的に監視するための前述のスキームは反応ガスとしてＨ₂ を使い、２０００の分解能によってｍ／ｚ３，０２２でＨＤを監視した（２、１４）。この２つの短所は、重水素が高分解能質量スペクトル計を必要とすること、及び反応ガスとして使用されるＨ₂が大量なので水素も監視出来ず、Ｄ／Ｈ比も測定出来なかったことである。ここで説明した手順はこれら両方の問題とは無関係になる。ＣＦ₃ ⁺（ｍ／ｚ６９）を普通の炭素検出チャンネルとして使用出来る。ｍ／ｚ７０を監視することにより¹³Ｃの検出チャンネルが得られ、そしてｍ／ｚ７０／６９の比から炭素同位体比が得られる。リン：感度とダイナミックレンジを決めるために、一連のＴＢＯＥＰのトルエン溶液を使用した。ｍ／ｚ１０７のイオンを選択チャンネルとして使用した。３００ミリ秒の積分時間を使うと、ＴＢＯＥＰの１ｎｇの検出限界が、３を超える信号対雑音比で得られる。８秒の半値幅での検出限界は元素状リンの検出では、１０ｐｇ／秒に等しい。後述するように、このような感度レベルは、最良のＣＲＩＭＳ計装で期待されるよりも少なくとも１桁高い。線形ダイナミックレンジは少なくとも３桁大きく、０．９９７の相関係数（Ｒ²）が得られた。ＴＢＯＥＰもＴＢＰも１００ｎｇ／μｌを含む試料を繰り返し注入することにより再現性を決めた。２つの成分の面積比について、ｎ＝５で３．２％の相対標準偏差（ＲＳＤ）を得た。重水素：フェニルアラニン−ｄ₃とロイシン−ｄ₁₀を使って、感度と線形ダイナミックレンジを決めた。この結果によると、線形ダイナミックレンジは０．９９４の相関係数で２桁を超える大きさであることが判る。再現性実験によると、６ｎｇのロイシン−ｄ₁₀対フェニルアラニン−ｄ₈内標準の面積比では２．９％（ｎ＝５）のＲＳＤであった。別の実験では３００ミリ秒の積分時間及びｓ／ｎ＞５では検出限界は６０ｐｇのフェニルアラニンであることが判った。いろいろな量のＬ−フェニルアラニン−ｄ₈と、ジＴＭＳ誘導体として一定量の非標識Ｌ−フェニルアラニンを含む試料グループを使って重水素の濃縮を検討した。ＣＲＩＭＳ方法のＤ／Ｈ比は、ｍ／ｚ２１（Ｄ）とｍ／ｚ２０（Ｈ）のクロマトグラムのピーク面積から得た。“理論的データ”に対して実験上のＤ／Ｈ比をプロットすると、特にＬ−フェニルアラニン−ｄ₈の濃度が低いと、或る程度は非線形性であることを本発明者は見い出した。この問題を検討するために、ｍ／ｚ２００（−ｄ₈でのＭ−ＣＯＯＴＭＳ）及びｍ／ｚ１９８（−ｄ₀でのＭ− ＣＯＯＴＭＳ）のＳＩＭクロマトグラム、即ち標識済みと標識していないジＴＭＳフェニルアラニンの最大の存在比ＭＳピーク、から得られるピークの面積比を測定することにより、“正規（ｎｏｒｍａｌ）の” ＧＣ−ＭＳモード（ＣＲＩＭＳが電源を切られた状態）で別のＤ／Ｈ比を得た。次に、ジＴＭＳフェニルアラニン−ｄ₈のＨ原子の割合を考慮して２００／１９２比をＤ／Ｈ比に換算した。本発明者は、これらの２つの方法、即ちＣＲＩＭＳと正規のＧＣ−ＭＳは、重水素濃縮実験では互いによく一致することを見い出した。相関係数は０．９９６１であり、勾配は０．９４である。理論上のデータに回帰させると、相関係数は０．９８７１であり、勾配は０．８１であった。前記の非線形性は、試料の濃度又は純度の誤差、或いはイオン−分子反応（９）又は増幅器の非線形性のようなその他の計器上の問題によるかによるのかも知れないが、ＣＲＩＭＳ分析にはよらないのかも知れない。硫黄：硫黄を含むアミノ酸の溶液グループを本研究用に使用した。Ｌ−メチオニンを試料として使用し、Ｌ−システィンを内標準として使用した。検出は、２００ｐｇから６６ｎｇのメチオニンでは線形であった。６６ｎｇの数字は必ずしも線形ダイナミックレンジの上限とは限らないけれども、ＣＲＩにおけるクロマトグラフィーか化学のどちらかが表す変形したピークを描く２００ｎｇのＬ−メチオニンは正しくない。４００ミリ秒の積分時間で、信号対雑音比が３では、Ｌ −メチオニンの検出限界は２００ｐｇであった。２０ｎｇのＬ−メチオニンと２４ｎｇのＬ−システィンでは４．４％（ｎ＝５）のＲＳＤが得られた。以前、ＨＰ５９７１ＡＭＳＤは反応ガスとしてＳＯ₂が使われた時、検出限界はＩｎｇのジアゼパムであった（１７）。これは反応ガスとしてＮＦ₃を用いた本発明に匹敵し、本発明は同じ化合物で２ｎｇの検出限界であった。その報文（１７）には、また、幾つかの条件のもとでＥｘｔｒｅｌＣ５０／４００及びＨＰ５９７１ＡＭＳＤの性能比較も含まれていた。Ｃｌの場合の２ｎｇの検出限界は、反応ガスとしてＳＯ₂を用いた先の研究（９）から得られた５０ｐｇ値と同じ程度に良好とは思われないが、その結果は、低い質量領域において送信と分解能を最大にする特別の２．１ＭＨｚ電源を備えたＥｘｔｒｅｌ計器によって得られた。塩素：塩素を含む化合物も選択的に決めることが出来る。先に行なわれたように（９）、内標準としてｐ，ｐ’−ＤＤＴを用いて、ジアゼパムのトルエン溶液のグループを調製した。ｍ／ｚ５６又は³⁷ＣｌＦ⁺のイオンを選択的検出チャンネルとして使用した。検出限界は、信号対雑音比が３で、積分時間が３００ミリ秒では２ｎｇのジアゼパムである。０．９９９６の相関係数で３桁大きい線形ダイナミックレンジが得られた。１３０ｎｇのジアゼパムと５０ｎｇのＤＤＴの試料を用いた再現性試験では３．４％（ｎ＝４）のＲＳＤであった。炭素：炭素検出用に使用した質量は特異であり、これらの質量に対するそのような特異性には選択性が含まれる。炭素チャンネルは、注入された全ての物質に対して検出され、高い感度を示した。窒素：前述のように、ＮＦ₃を使用すると、ＣＲＩに溶出する物質中の窒素含量を監視する能力が失われる。選択性選択性を検討するために、種々の元素を含む８種類の化合物の混合物を調製した。ｍ／ｚ２０のイオンを使って、全ての有機化合物に含まれる水素を監視し、ｍ／ｚ２１、５６、１０７及び１２７を使って、各々、重水素−、塩素−、リン −、及び硫黄を含む化合物を同時に検出した。これらの結果は、これらのチャンネルのクロマトグラムを示していて、その全部が高い選択性を表している。リンを含む薬の検出への適用シクロホスファミドは、構造式の中に１個のリン原子と２個の塩素原子を含む抗ガン剤である。反応ガスとしてＮＦ₃を用いると、ＣＲＩＭは、ＳＰとＣｌとを同時に検出出来るので、このように選択することはこの薬及びその代謝生成物の分析には理想的であると思われる。シクロホスファミドを受けた患者からの血漿試料をＣＲＩＭＳを用いてリン含量も塩素含量も分析した。水素チャンネルは複雑なクロマトグラムを示したが、６個のピークだけがＰ−選択チャンネルの中に、そして５個のピークがＣｌ−選択チャンネルの中に現れた。リンのチャンネルの最初のピーク以外は全て塩素チャンネルで応答することからシクロホスファミド関連として確認された。リンのチャンネルの第１ピークは、質量スペクトルにより確認されるように、３個のｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基でシリル化されたリン酸塩であった。ＴＢＤＭＳで誘導体化されたシクロホスファミド標準溶液は３個のピークを示し、これらのピークは試料のクロマトグラムの中のピーク、２、３及び５の保持時間と合致した。ピーク５は、ＴＢＤＭＳ−シクロホスファミドであることが判った。ピーク３は、誘導体化されないシクロホスファミドであった。ピーク２はＣｌチャンネルとＰチャンネルの面積比が他の２個のピークの半分の値を示していて、このことは、シクロホスファミドの中の２個の塩素原子の１個が失われたことを表している。このピークの質量スペクトルは、２個のクロロエチル腕の１本がなくなっていることを示唆している。実験結果によると、複雑な、生物学的に誘導された試料の場合でさえ、ＮＦ₃ を用いたＣＲＩＭＳによってＰとＣｌを含む化合物の選択的検出が可能である。このような薬は、“本質的標識型”（１２）の定義にぴたりと当てはまり、従って薬の中に“非本質的”同位体標識を組み入れるための特別な合成は不必要なので、代謝作用の研究が簡素化出来る。ＮＦ₃は、ＣＲＩＭＳにとっては反応ガスの新しい考え方を意味している。フッ化反応の環境を整えることにより、リン、並びに窒素や酸素を含む可能性もある重水素、炭素、塩素及び硫黄も、選択的にかつ同時に検出出来る。この方法は、高感度で、線形でそして再現性がある。ＣＲＩＭＳの持つ、元素や同位体の一連の選択的検出能力が高まるにつれて、その適用も増える筈である。グルタチオン及びクロザピンの研究本発明者は、抗精神病薬クロザピンとトリペプチドグルタチオンとの間の共有結合の研究を行なった。最初に、放射性同位体を使った他の研究者は、クロザピンとグルタチオンの多くの付加物を発見した。本発明者は、ＨＰＬＣ導入付きの化学反応インターフェース質量分析計方法（ＨＰＬＣ／ＣＲＩＭＳ）を使った放射能標識の使用方法への代替方法としていかにしてクロザピンの中の塩素原子を活用することが出来るかを考えた。ペルオキシダーゼ／ペルオキシド系を用いた薬とグルタチオンを培養すると、エレクトロスプレー質量分析法によりクロザピンの新規接合体として特徴づけられる数種の代謝生成物を得た。２種類の接合体の同定はＣＲＩＭＳ反応ガスとしてＮＦ₃を用いて培養混合物を検討することにより確認した。ＣｌもＳも同時に現れることはクロザピンがグルタチオンへ共有結合することと符合する。１つのピークの中でＳとＣｌの比がほぼ２であることはジ−グルタチオン接合体が存在することを明確に示した。放射性同位体を使っては以前に入手出来なかったが、これらの実験は、ＣＲＩＭＳによってＨＰＬＣ溶出物の元素の選択的検出が追加の情報を提供出来るという出願人の提案を支持している。両方の元素種は１０〜１５分の間の範囲で溶出するピークの集合体の中に存在し、クロザピンの塩素及びＧＳＨの硫黄が両方とも存在することを示している。エレクトロスプレーデータに基づいて、１３．２分でのピークはヒドロキシクロザピンのモノ−ＧＳＨ付加体である。ＳチャンネルとＣｌチャンネルのもとでの面積は構造式に基づいて１：１であると校正され、次に、１３．２分よりすぐ前の１２．３分に溶出するピークのＳ／Ｃｌ比は１．８３である。このことは、ＥＳＩデータによって示唆されるジ＝ＧＳＨ（ｄｉ−＝ＧＳＨ）接合体の構造式で予測される２．００に近かった。これらの実験によって、元素の選択的検出は、薬の代謝作用研究では重要な道具となることが出来ることが判る。試験種がＣ、Ｈ、Ｏ又はＮ以外の元素を含む場合、このような元素は、親核種の行方を追跡する同位体標識として有効に役立つことが出来る標識である。未知の薬又は生化学的代謝分子が他の種をどれも含まないときでさえ、珍しい元素を加える化学修飾−硫酸化、リン酸化、及びチオエーテル結合−を検出出来る。そのような情報は、更に従来の分析手法を補って代謝物を同定することになる。本明細書では出願人は分子内の元素組成の測定を行なうことが出来ることを示している。出願人が、この目的にために設計された実験においてＧＣ／ＣＲＩＭＳを使って前もってＣ／Ｃｌ比を測定すると、出願人は１０％を超える精度と正確さを得ており（Ｓｏｎｇ及びＡｂｒａｍｓｏｎ，Ｆ．Ｐ．１９９３年）、そして充分に繰り返されると５〜１０％の変動係数は一般的であることが期待される。前記の説明及び実施例の目的は、何等の制限を意味することなく、本発明の数個の実施態様を説明したのもである。本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、本発明の構成物及び方法にいろいろな修正及び変更を行なえることは当業者には明かであろう。本明細書に引用されている全ての特許及び刊行物は、そのまま引用文献として組み入れられている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．フッ素を含む環境の中で各元素を新規の化学種に転化する連続式インラインプロセスによって試料の中の元素の同位体比を高感度で検出する質量分析計装置において：（ａ）被検体の混合物が特定の分子に分離される試料導入要素であって、前記試料導入は化学反応インターフェースに試料を連続的に導入する手段から成ること；（ｂ）化学反応インターフェース（ＣＲＩ）であって、前記ＣＲＩはフッ素を含む環境の中で無傷の被検体を新規の元素特定化合物に転化すること；及び（ｃ）精密な同位体測定が出来る質量分析計、から成ることを特徴とする前記質量分析計装置。２．前記試料導入要素が、ガスクロマトグラフ及び高速液体クロマトグラフから成る群から選ばれることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の装置。３．前記化学反応インターフェースが、マイクロ波駆動型ヘリウムプラズマインターフェースであることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の装置。４．前記質量分析計が、マルチコレクター同位体比質量分析計であることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の装置。５．前記試料導入要素が高速液体クロマトグラフであって、噴霧化も向流も使われてユニバーサルインターフェースによって液相を取り除くことを特徴とする、請求の範囲第２項に記載の装置。６．前記試料導入要素が高速液体クロマトグラフであり、輸送装置が使われて液相を取り除くことを特徴とする、請求の範囲第２項に記載の装置。７．炭素、窒素、水素、酸素、塩素及び硫黄化合物を含む試料の質量を測定する方法において、（ａ）炭素又は窒素化合物を含む試料を、被検体の混合物が特定の分子に分離される試料導入要素に加えることであって、前記試料導入要素は化学反応インターフェース（ＣＲＩ）に試料を連続的に導入する手段から成り；前記ＣＲＩは無傷の炭素及び窒素被検体を、前記化合物を分割するフッ素から成る環境の中で新規の元素特定化合物に転化すること；及び（ｂ）精密な同位体測定が出来る質量分析計を用いて前記試料の化合物の同位体比を計算すること、から成ることを特徴とする前記方法。８．前記質量分析計が、化学反応インターフェース質量分析計（ＣＲＩＭＳ）及び同位体比質量分析計システム（ＩＲＭＳ）から成る群から選ばれることを特徴とする、請求の範囲第７項に記載の方法。９．前記フッ素反応ガスがＮＦ₃であることを特徴とする、請求の範囲第７項に記載の方法。１０．前記フッ素反応ガスがＦ₂であることを特徴とする、請求の範囲第７項に記載の方法。１１．前記試料が、炭素、窒素、重水素、塩素、酸素及び硫黄から成る群から選ばれる化合物から成ることも特徴とする、請求の範囲第７項に記載の方法。１２．前記試料が炭素及び窒素を含む化合物から成ることを特徴とする、請求の範囲第１１項に記載の方法。１３．未知の薬又は生化学代謝生成物の元素及び同位体特性を評価する方法において、（ａ）含まれる未知の薬又は生化学代謝生成物試料を、被検体の混合物が特定の分子に分離される試料導入要素に加えることであって、前記試料導入要素は化学反応インターフェース（ＣＲＩ）に試料を連続的に導入する手段から成り；前記ＣＲＩは無傷の炭素及び窒素被検体を、前記化合物を分割するフッ素から成る環境の中で新規の元素特定化合物に転化すること；及び（ｂ）精密な同位体測定が出来る質量分析計を用いて前記試料の化合物の同位体比を計算すること、から成ることを特徴とする前記方法。１４．前記未知薬又は生化学代謝生成物試料が、炭素、窒素、重水素、塩素、酸素及び硫黄から成る群から選ばれる元素から成ることを特徴とする、請求の範囲第１３項に記載の方法。１５．前記方法が、前記未知薬又は生化学代謝生成物試料を、ＧＣ／ＣＲＩＭＳにより検出されることが出来る硫黄、リン又はチオエーテルを加えることにより化学的に修飾することから成ることも特徴とする、請求の範囲第１３項に記載の方法。１６．前記方法が、（ａ）被検体の混合物が特定の分子に分離される試料試料導入要素であって、前記試料導入は、化学反応インターフェースに試料を連続的に導入する手段から成ること；（ｂ）化学反応インターフェース（ＣＲＩ）であって、前記ＣＲＩはフッ素を含む環境の中で無傷の被検体を新規の元素特定化合物に転化すること；及び（ｃ）精密な同位体測定が出来る質量分析計、から成る装置で実施されることを特徴とする、請求の範囲第１３項に記載の方法。