JP2002514065A - 二成分植物細胞致死方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、生物、特に植物における細胞の増殖を阻害し、又はその細胞を殺害するための方法に向けられる。特殊化された細胞の殺害又はその細胞への有益な効果の提供を可能にする遺伝子的に構築された細胞がまた、供給される。

Description

【発明の詳細な説明】 二成分植物細胞致死方法及び組成物 発明の分野 本発明は一般的に、多細胞真核生物、特に植物細胞における特定の細胞の増殖 を妨げるための方法に関する。細胞毒性遺伝子の発現のための組換え的に修飾さ れた植物細胞もまた提供される。 発明の背景 植物遺伝子工学の１つの重要な目的は、導入された遺伝子の発現を通して、又 は内因性遺伝子のサイレンシング(silencing)により新規形質を創造することで ある。標的化された遺伝子発現の１つの用途は、細胞に対して致死性である酵素 の生成を通しての特定の植物細胞の排除である。特定組の細胞のみを排除するた めには、細胞−致死機能が排除のために標的化された細胞においてのみ発現され 、そして他において発現されないよう、潜在的に致死性機能の発現が正確に制御 されることが必要である。 いくつかの異なったアプローチが単一成分細胞致死系を用いて新規植物形質を 創造するために試みられて来た。一成分細胞致死系においては、特定細胞型が、 細胞毒性遺伝子生成物の発現を駆動する単一のプロモーターを用いての排除のた めに標的化される。それらのアプローチは、特定組織において又は特定条件下で 活性であるプロモーターの特徴化により開始される。たとえば、雄性不稔性が、 じゅうたん(tapetal)組織において活性なプロモーターを用いて示されている。 じゅうたん(tapetal)組織及び他の組織において発現される多くの異なったプロ モーターが同定されている。さらなる例 は、過敏性応答を通して耐病性を創造するための細胞致死性の使用である。病原 体感染に基づいて誘発される多くのプロモーターが異なった研究者により特徴づ けられて来た。さらなる例は、ジャイアント細胞、すなわちノウ胞（cyst）及び 根結節（rootknot）線虫が食する特定の根細胞を殺害することによって耐線虫性 を創造する試みである。ジャイアント細胞において誘発される多くのプロモータ ーが異なった研究者により特徴づけられて来たが、しかし対応して、十分なプロ モーター特異性を達成するのは困難であった。 １つの例（Strittmatterなど.，Bio/Technology 13:1085-90(1995)）において 、研究者は、菌類ファイトプソラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans ）による感染に基づいて誘発されたプロモーターの制御下でリボヌクレアーゼコ ード配列（バシラス・アミロリクイファシエンス（Bacillus amyloliquifaciens ）から得られる、バルナーゼ）を含む構造体を用いてのトランスジェニック植物 の創造の困難性を例証している。その困難性に対する彼らの解決法は、感染され ていない細胞を保護するが、しかし感染された細胞の殺害を可能にする構成プロ モーターの制御下で保護機能バースター(barstar)を発現することであった。さ らなる例は、WO 92／21757，WO 93／10251，WO 93／18170，WO 94／10320及びWO 94／17194に記載されるように、ノウ胞及び根結節線虫が食する特定の根細胞を 殺害することによって耐線虫性を創造する試みである。特殊化された線虫食料細 胞において誘発される多くのプロモーターが異なった研究者により特徴づけられ て来たが、しかし対応して、十分なプロモーター特異性は達成するのに困難であ った。 １つの事例(WO 93／10251)においては、十分なプロモーター特異性を得ること の困難性が、標的細胞以外の細胞における保護機能の発現を通して認識されてい る。バルナーゼ(barnase)の発現をプロ グラムするためにタバコからのじゅうたん(tapetal)組織特異的プロモーターTA2 9を用いての雄性不稔性の生成を記載するWO 96／26283に、保護アプローチのも う１つの例が記載されている。上記例におけるように、バルナーゼタンパク質の ための保護機能は、その発現が非標的組織において要求されるバースタータンパ ク質である。不運なことには、多くの潜在的に有用な細胞−致死機能のためには 、保護機能は利用できない。保護アプローチ研究を行なうためには、必要な“逆 ”特異性を有する第２プロモーターを同定することが必要である。 脊椎動物において、類似する細胞致死性アプローチは、実験道具として特定の 細胞型又は組織型を除去し、又は疾病状態に関与する細胞、たとえばHIV−感染 された細胞又は転移性癌細胞を殺害することが報告されている。細胞除去のため に選択された主要細胞致死機能は、延長因子EF-2をアデノリボシル化し、従って タンパク質合成をブロックするジフテリアトキシン（DT）Ａ鎖である(Herreraな ど.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 91:12999-13003(1994))。DT A鎖の極端な毒性 のために、正確な発現は必須である。治療情況において取られて来たアプローチ は、チミジンキナーゼ（tk）遺伝子の特異的導入及び／又は発現である。tk遺伝 子生成物は、ヌクレオシド類似体、たとえば致死のためのガンシクロビルの存在 を必要とする条件付きの細胞−致死機能物である。Bradyなど.，Proc.Natl.Acad .Sci.，USA 91;365-69（1994）は、その発現がTatタンパク質の制御下に存在す るtk遺伝子の導入及びガンシクロバーによる処理に続いてのヒト免疫欠損ウィル スTat−発現細胞の特定の除去のためへのこのアプローチの使用を記載する。 生物内の細胞の特定の副集団、たとえば哺乳類における転移性癌細胞を殺すた めの手段の開発においては、“２相特異性(twofold specificity)"の必要条件が認識されている(Panchalなど.，Nature Biotechnol ．14:852-56(1996))。Panchalなどにより取られるアプローチは、第１レベルの 特異性として癌細胞の表面の免疫認識、及び第２レベルの特異性として癌細胞の 特異的プロテアーゼ活性を使用することであった。 植物の場合、じゅうたん(tapetal)組織における細胞に対して発現を標的化す ることによって、雄性不稔性植物が生成され得る。雄性不稔性植物の生成は、Ｆ １ハイブリッドの生成において特に有用である。Ｆ１ハイブリッド植物は、それ らの改良された形質、たとえば高められた収率、耐病性又は低温耐性のために、 農業のほとんどの分野において広範囲に使用されている。Ｆ１ハイブリッドは、 しばしば、自家受粉を防ぐために、交雑の意図された雌性の除雄の手動工程、続 いて、交雑の雌性の柱頭への交雑の雄性から採取された花粉の適用により生成さ れる。そのようなハイブリッドの生成は、ハイブリッド種子の高められた費用に 非常に寄与する労働集約的である。 いくつかの異なったアプローチは、じゅうたん組織に対して致死タンパク質の 発現を標的化することによって雄性不稔系の生成に細胞致死性系を使用すること が試みられて来た。たとえば、WO 96／26283は、リボヌクレアーゼ、すなわちバ ルナーゼの発現をプログラムするためにタバコからのじゅうたん組織特異的プロ モーターTA29を用いての雄性不稔性の生成を記載する。アメリカ特許第5,409,82 3号は、花粉の形成を妨げる遺伝子生成物の発現を制御するためへのトランス活 性化因子の使用を開示する。雄性不稔性は雄性不稔系又はＦ１ハイブリッドのい づれかにおいて復帰されることがしばしば所望されるので、雄性不稔性が条件付 きで行なわれ得る植物を生成する試みが行なわれて来た。このアプローチの例は 、WO 93／ 25695及びWO 97／13401に包含される。 当業界において必要とされるものは、生物、たとえは植物における選択された 細胞型の増殖の選択的排除又は阻害を提供する組成物及び方法である。本発明は 、それらの及び他の利点を提供する。 発明の要約 １つの観点において、本発明は植物細胞に向けられる。前記植物細胞は、第１ ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結された第１非構成 植物プロモーターを含んで成る第１発現カセット、及び第２ポリペプチドをコー ドするポリヌクレオチドに作用可能に連結された第２非構成的植物プロモーター を含んで成る第２発現カセットを含んで成る。少なくとも前記第１又は第２発現 カセットは、前記細胞に対して異種である。さらに、前記第１及び第２プロモー ターは、前記第１及び第２ポリペプチドが同じ細胞において発現されるように、 異なっているが、しかしオーバーラップする特異性を有する。 いくつかの態様において、同じ細胞における第１及び第２ポリペプチドの存在 は細胞機能を害する。いくつかの態様において、前記第１及び第２ポリペプチド は、単一の機能的ポリペプチドの別の副配列をそれぞれ含んで成る。前記機能的 ポリペプチドは、リボヌクレアーゼ、たとえばバルナーゼ又はＴ１であり得る。 機能的ポリペプチドは、増強された安定性を有するように修飾される。１つの態 様において、その増強された安定性のバルナーゼは、bn3-2及びbn5-2である。植 物細胞のさらなる態様においては、前記第１ポリペプチドは、植物病原体に由来 する無毒性遺伝子生成物であり、そして前記第２ポリペプチドは、前記無毒性遺 伝子に関連する耐性遺伝子生成物である。 たとえば、第１ポリペプチドはavr9であり得、そして第２ポリペプチドはcfo9 であり得る。機能的ポリペプチドは、ヌクレアーゼ又はコリシンであり得る。い くつかの植物細胞態様においては、前記第１又は第２プロモーターは、たとえば 個々が種子又はじゅうたん組織細胞において機能的である場合、組織−特異的プ ロモーターである。いくつかの態様において、前記第１又は第２プロモーターは 、植物病原体又は害虫との相互作用に続いて誘発される。 もう１つの態様において、本発明は、第１ポリペプチドをコードするポリヌク レオチドに操作可能的に連結される第１植物プロモーターを含んで成る第１発現 カセット、及び第２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに操作可能的に 連結される第２植物プロモーターを含んで成る第２発現カセットを含んで成る植 物細胞に関する。前記第１及び第２ポリペプチドは、単一機能ポリペプチドの別 の副配列をそれぞれ含んで成る。 しばしば、前記機能的ポリペプチドは、細胞機能を害する。いくつかの態様に おいて、前記第１及び第２プロモーターは、前記第１及び第２ポリペプチドが同 じ細胞において発現されるように、異なっているが、しかしオーバーラップする 特異性を有する。 もう１つの観点において、本発明は、植物細胞の細胞機能を修飾するための方 法に関する。前記方法は、第１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作 用可能に連結された第１非構成植物プロモーターを含んで成る第１発現カセット 、及び第２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結された 第２非構成植物プロモーターを含んで成る第２発現カセットを、細胞中に導入す る段階を含んで成り、ここで前記第１及び第２プロモーターは、前記第１及び第 ２ポリペプチドが同じ細胞において発現されるように、異なっているが、しかし オーバーラップする特異性を有する。前 記第１及び第２発現カセットは、性的交雑を通して植物細胞中に導入され得る。 さらにもう１つの観点において、本発明は、植物細胞における細胞機能を修飾 するための方法に関する。前記方法は、第１非機能的ポリペプチドをコードする ポリヌクレオチドに作用可能に連結された第１植物プロモーターを含んで成る第 １発現カセット、及び第２非機能的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド に作用可能に連結された第２植物プロモーターを含んで成る発現カセットを植物 細胞中に導入する段階を含んで成り、ここで前記第１及び第２ポリペプチドは、 単一の機能的ポリペプチドの別の副配列をそれぞれ含んで成る。しばしば、前記 第１及び第２プロモーターは、前記第１及び第２ポリペプチドが同じ細胞におい て発現されるように、異なっているが、しかしオーバーラップする特異性を有す る。 さらなる観点において、本発明は真核細胞の増殖を妨げるための方法に向けら れる。前記方法は、第１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに操作可能 的に連結される第１の組織特異的植物プロモーターを含んで成る第１発現カセッ ト、及び第２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに操作可能的に連結さ れる第２の組織特異的植物プロモーターを含んで成る第２発現カセットを、細胞 中に導入する段階を含んで成り、ここで前記第１及び第２プロモーターは前記細 胞において機能的であり、そして細胞における前記第１及び第２ポリペプチドの 存在が細胞機能を害する。いくつかの態様においては、前記細胞は哺乳類細胞で ある。哺乳類細胞は、非ヒト動物において存在することができる。しばしば、前 記第１及び第２発現カセットは、レトロウィルスベクターを用いて細胞中に導入 される。 本発明はさらに、２種の相同染色体の個々上の同じ遺伝子座に位 置する第１及び第２発現カセットを含んで成る植物細胞を含む植物を供給する。 １つの発現カセットは、第１ポリペプチドをコードする第１ポリヌクレオチド配 列に操作可能的に連結される第１植物プロモーターを含んで成る。組換え部位（ たとえばlox部位）は、前記第１プロモーターと前記第１ポリヌクレオチド配列 との間に存在する。第２発現カセットは第１ポリヌクレオチド配列に作用可能に 連結された第１植物プロモーターを含んで成り、ここで介在発現カセットが２種 の組換え酵素部位を端に有し、そして前記第１プロモーターと前記第２発現カセ ットの第１ポリヌクレオチド配列との間に位置する。前記介在発現カセットは、 第２ポリペプチドをコードする第２ポリヌクレオチド配列に作用可能に連結され た第２植物プロモーターを含んで成る。細胞における前記第１及び第２ポリペプ チドの存在は、細胞に対して致死性である。 前記第１及び第２ポリペプチドは、一緒に存在する場合、細胞に対して致死性 である多くのタンパク質から選択され得る。たとえば、１つのポリペプチドは、 植物細胞に対して致死性であるポリペプチドをコードする他の発現カセットの発 現を活性化するトランス活性化因子タンパク質（たとえばリボヌクレアーゼ）で あり得る。他方では、前記ポリペプチドは、植物病原体に由来する非毒性遺伝子 生成物、及び非毒性遺伝子に関連する植物耐性遺伝子生成物（たとえばAVR9及び CF９）であり得る。 前記２種の発現カセットにおけるプロモーターは好ましくは、前記ポリペプチ ドの１つ又は両者の組織特異的発現を提供する。いくつかの態様において、標的 細胞は、じゅうたん組織細胞である。 本発明の植物を調製するための方法もまた提供される。たとえは、前記植物は 、上記発現カセットを植物中に導入することによって調製され得る。 図面の簡単な説明 図１は、p-Mon-Avr9又はTA29-Cf9含有系統(Ａ₁及びＡ₂)の対立遺伝子変異体が cre／lox組換え酵素システムを用いていかにして創造されるか、及び雄性不稔性 の生成へのそれらの使用を示す。ALS＝アセト乳酸シンターゼ。 図２は、cre／loxシステム及びAVR／CF９を用いての本発明の対立遺伝子変異 体の生成を示す。ALS＝アセト乳酸シンターゼ。 発明の特定の記載 本発明は、多細胞真核生物、特に植物における特定された真核細胞の増殖を阻 害し、又は前記細胞を殺害するための方法を提供する。より特定には、本発明は 、発現される場合、特定の組織又は細胞型に対して所望する効果を提供するポリ ヌクレオチドに作用可能に連結された少なくとも２種の発現カセットを含んで成 る植物細胞に関する。前記所望する効果は、細胞機能を害することができるか、 又は細胞に対して有益であり得る（たとえば、植物病原体又は害虫に対する耐性 ）。発現カセットは、染色体相同体の同じか又は異なった遺伝子座を占めること ができ、又は異なった染色体上に、又はゲノムの一部として他の場所に位置する ことができる。本発明は、本明細書に記載される複数成分システムを利用するこ とができる植物を生成するための新規方法を提供し、そしてそのようにして生成 された植物及びそれらの使用方法を包含する。 個々のプロモーターの使用が細胞毒性ポリペプチドの発現を駆動する一成分致 死系に比較して、本発明の複数成分致死／阻害方法は、オーバーラップするが、 しかし異なった組織特異的発現を有する複数のプロモーターを使用する。この系 は、一成分系よりも選択さ れた細胞に対して所望する機能を標的化することにおいて、高い程度の制御を提 供する。複数成分系は典型的には、次のことの考慮により最適化されるであろう ：１）所望する効果は細胞自律性であるべきであり；２）所望する効果はいづれ か他の細胞機能に依存するべきではなく；３）所望する効果はその関連する成分 のレベルの敏感な機能であるべきである。 本発明の方法は、いづれかの近交系において発現される阻害性又は致死性が存 在しないハイブリッドシステムにおいて近交系を維持するための手段を提供する 。しかしながら、それらの近交系の交雑は、阻害性又は致死表現型を有するハイ ブリッドを生成する。本発明はまた、必要な特異性を得るためにオーバーラップ する特異性を有する２種の異なったプロモーターを用いて、高い組織特異性、条 件特異性、又は発生段階特異性態様で、致死又は阻害効果を生成するための手段 も提供する。その得られる発現は、たとえば雄性不稔性及び雌性不稔性植物の創 造及び維持に利用される。定義 単位、接頭辞及び記号は、それらのSI許容形で示され得る。数値範囲は、その 範囲を定義する数字を包含する。本明細書に提供される見出しは、全体として本 明細書に関係がある本発明の種々の観点又は態様の制限ではない。従って、すぐ 下記に定義される用語は、本明細書に関して全体として、より十分に定義されて いる。 本明細書において使用される場合、用語“植物”とは、完全な植物、その植物 器官（たとえば、葉、茎、根、等）、種子及び植物細胞及び子孫を包含する。本 発明の方法に使用され得る植物の種類は一般的に、形質転換技法に対して敏感な 高等植物の種類ほど広く、単子葉植物及び双子葉植物の両者を包含する。 本明細書において使用される場合、“作用可能に連結された”と は、プロモーターと第２配列との間の機能的連鎖を包含し、ここで前記プロモー ター配列が、典型的にはポリペプチドに転写されるRNA配列に対応するDNA配列の 転写を開始し、そして介在する。一般的に、作用可能に連結されるとは、連結さ れる核酸配列が、隣接し、そして２種のタンパク質コード領域を連結する必要が ある場合、隣接し、そして同じ読取り枠と整合して存在することを意味する。 本明細書において使用される場合、“発現カセット”とは、標的細胞における 特定の核酸の転写を可能にする一連の特定核酸要素により、組換え的に又は合成 的に生成される核酸構造体である。発現カセットは、プラスミド、染色体、ミト コンドリアDNA、プラスチドDNA、ウィルス、又は核酸フラグメント中に組込まれ 得る。典型的には、発現ベクター中の発現カセット部分は、他の配列の中で、転 写されるべき核酸、及びプロモーターを包含する。 用語“染色体相同体”又は“相同染色体”とは、減数分裂の間、対合すること ができる複数の染色体を意味する。個々の相同体は、雄又は雌親により寄与され る染色体の重複体である。相同染色体は遺伝子の同じ線状配列を含み、個々の遺 伝子（又は対立遺伝子）は個々の相同体上の同じ遺伝子座に存在する。 ２種のポリヌクレオチド配列（たとえば、本発明の２種の発現カセット）は、 それらの２種の配列が、たとえば２種の遺伝子座間のクロスオーバー現象の頻度 により決定されるような同じ遺伝子座に遺伝子的にマッピングされる場合、その “同じ遺伝子座”で存在すると言われる。 本明細書において使用される場合、“致死”又は“細胞機能を害する”とは、 細胞を殺害し、又は細胞分裂又は分化を阻害する程度に細胞毒性であるポリヌク レオチド又はポリペプチドを包含する。従って、“致死”又は“細胞機能を害す る”とは、１）細胞のいく らかの機能の妨害を通しての又は細胞の成分の分解による細胞の破壊、又は２） 細胞のいくらかの機能の妨害又は細胞のいくらかの成分の分解による細胞の連続 した増殖の妨害のいづれかを包含する。限定的ではないが、例によれば、本発明 の情況下での典型的な細胞機能は、タンパク質合成、RNA合成、浸透受容能力の 維持、脂質合成、DNA合成である。本発明の情況下で分解を受けやすい典型的な 細胞成分は、タンパク質、炭水化物、膜、デオキシリボ核酸、リボ核酸である。 本明細書において使用される場合、“有益な”とは、細胞に保護効果を付与す るポリヌクレオチド又はポリペプチドを言及する。植物においては、有益な効果 は、環境ストレス、たとえば植物病原体、害虫、渇水、重金属、及び塩（但し、 それだけには限定されない）に対する耐性を包含する。 本明細書において使用される場合、“異種”とは、外来性種に起因するか、又 は同じ種からである場合、その元の形から実質的に変性されている核酸である。 たとえば、異種構造遺伝子に作用可能に連結されたプロモーターは、その構造遺 伝子が由来する種とは異なった種からであり、又は同じ種からである場合、１又 は両者はそれらの元の形から実質的に変性されている。従って、“異種発現カセ ット”とは、それが導入される種又は亜種に対して内因性でない少なくとも１つ の要素を含んで成るものである。 本明細書において使用される場合、“ポリヌクレオチド”又は“核酸”とは、 二本鎖及び一本鎖DNA又はRNAの両者を包含する。この用語はまた、非核酸汚染物 を実質的に有さない、合成的に又は組換え的に誘導された配列も言及する。ポリ ヌクレオチドは、遺伝子副配列又は十分な長さの遺伝子（cDNA又はゲノム）であ り得る。特にことわらない限り、この用語は、対照核酸と類似する結合特性を 有し、そして天然に存在するヌクレオチドに類似する態様で代謝される、天然ヌ クレオチドの既知類似体を含む核酸を包含する。特にことわらない限り、特定の 核酸配列はまた、暗黙のうちに、保存的に修飾されたその変異体（たとえば縮重 コドン置換）、及び相補的配列、並びに明白に示された前記配列を包含する。特 に、縮重コドン置換は、１又は複数の選択された（又はすべての）コドンの第３ 位置が混合された−塩基及び／又はデオキシイノシン残基により置換されている 配列を生成することによって達成され得る（Batzerなど.，Nucleic Acid Res．1 9:5081(1991);Ohtsukaなど.，J.Biol．Chem．260:2605-2608(1985);Rossoliniな ど.，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994)）。用語核酸は、遺伝子、cDNA、及び遺伝 子によりコードされるmRNAにより交換可能的に使用される。 用語“ポリペプチド”、“ペプチド”、及び“タンパク質”は、アミノ酸残基 のポリマーを言及するために、本明細書においては、交換可能的に使用される。 この用語は、１又は複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人 工化学的類似体であるアミノ酸ポリマー、及び天然に存在するアミノ酸ポリマー に適用される。 “保存的に修飾された変異体”は、アミノ酸及び核酸配列の両者に適用される 。特定の核酸配列に関しては、保存的に修飾された変異体は、同一の又は実質的 に同一のアミノ酸配列をコードするそれらの核酸、又は核酸がアミノ酸配列をコ ードしない場合、実質的に同一の配列を言及する。遺伝子コードの縮重のために 、多数の機能的に同一の核酸は、いづれかの所定のタンパク質をコードする。た とえは、コドンGCA，GCC，GCG及びGCUすべては、アミノ酸アラニンをコードする 。従って、アラニンがコドンにより特定されるあらゆる位置で、コドンがコード されたポリペプチドを変更しないで、 記載されるその対応するコドンのいづれかに変更され得る。そのような核酸変動 は、保存的に変性された変動の１つの種である“サイレント変動”である。ポリ ペプチドをコードする本明細書におけるあらゆる核酸配列はまた、核酸のあらゆ る可能なサイレント変動を描写する。当業者は、核酸における個々のコドン（但 し、通常、メチオニンのための唯一のコドンであるAUGを除く）が、機能的に同 一の分子を生成するために修飾され得ることを理解するであろう。従って、ポリ ペプチドをコードする核酸の個々のサイレント変動は、個々の記載される配列に 内在する。 アミノ酸配列に関しては、当業者は、コードされた配列における単一のアミノ 酸又は数％のアミノ酸を変更し、付加し、又は欠失する、核酸、ペプチド、ポリ ペプチド又はタンパク質配列に対する個々の置換、欠失又は付加が、変更が化学 的に類似するアミノ酸による一定のアミノ酸の置換をもたらす“保存的に修飾さ れた変動”であることを理解するであろう。機能的に類似するアミノ酸を供給す る保存性置換表は、当業界において良く知られている。 次の６グループは、お互いに対して保存性置換であるアミノ酸をそれぞれ含む ： １）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）； ２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）； ３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）； ４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）； ５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）； 及び ６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。 （たとえば、Creighton，Proteins(1984)を参照のこと）。 用語“増強された安定性”とは、１又は複数のアミノ酸が野生型ポリペプチド に対して変更されるよう修飾されているポリペプチドを言及する。そのような修 飾は、ポリペプチドに対して、単独で又はもう１つのポリペプチドと組合して、 増強された安定性を付与する。増強された安定性は、たとえば増強された熱安定 性、低濃度での増強された活性、増強された活性部位活性、及び同様のものを包 含する。 本明細書において使用される場合、“機能的”とは、所望する効果を生成する のに十分な活性の言及を包含する。従って、たとえば、特定された細胞において 機能的なプロモーターは、所望するレベルに発現を駆動するであろう。“機能的 ポリペプチド”は、所望する結果、たとえば細胞阻害又は死を達成するための活 性を有するであろう。他方では、機能的ポリペプチドは、有益な又は治療効果、 たとえば植物害虫又は疾病に対する耐性を細胞に供給するであろう。機能的ポリ ペプチド（たとえばリボヌクレアーゼ、たとえばバルナーゼ）が本発明の複数の 発現カセットを含んで成る細胞において生成されるいくつかの態様においては、 活性発現カセットは、本明細書において定義されるような“機能的ポリペプチド ”を生成する。従って、特定タンパク質又は“機能的ポリペプチド”に対する言 及は、天然において存在するタンパク質、又は天然において存在するタンパク質 と実質的に同じ活性を有する細胞において生成されるタンパク質を包含する。本 発明の“機能的ポリペプチド”はまた、野生型又は修飾されていないポリペプチ ドと同じ活性を有する修飾されたポリペプチド（保存性及び非保存性アミノ酸置 換を有する）も包含する。 本明細書において使用される場合、“プロモーター”とは、転写の開始から上 流の、及び転写を開始するためのRNAポリメラーゼ及 び他のタンパク質の認識及び結合に関与するDNAの領域を言及する。“植物プロ モーター”は、植物細胞において転写を開始することができるプロモーターであ る。発生制御下でのプロモーターの例は、一定の組織、たとえば葉、根、果物、 種子、じゅうたん組織、葯、柱頭又は花においてのみ転写を開始するプロモータ ーを包含する。そのようなプロモーターは“組織特異的”として言及される。“ 細胞型”特異的プロモーターは、１又は複数の器官における一定の細胞型、たと えば根又は葉における維管束細胞において発現を駆動する。“誘発性”プロモー ターは、環境制御下で存在するプロモーターである。誘発性プロモーターにより 転写をもたらすことができる環境条件の例は、嫌気性状態又は光の存在を包含す る。組織特異的、細胞型特異的、及び誘発性プロモーターは、“非構成”プロモ ーターの種類を構成する。“構成”プロモーターは、ほとんどの環境制御下で活 性的であるプロモーターである。植物組成物及び方法 本発明は、次の属からの種を包含する広範囲のタイプの植物にわたって使用さ れる：ククルビタ(Cucurbita)、ロザ（Rosa）、ビティス(Vitis)、ジュグランス (Juglans)、フラガリア(Fragaria)、ロッス(Lotus)、ミディカゴ（Medicago）、 オンブリチス(Onbrychis)、トリフォリウム(Trifolium)、トリゴネラ（Trigonel la）、ビグナ(Vigna)、シトルス（Citrus）、リヌム(Linum)、ゼラニウム（Gera nium）、マニホット(Manihot)、ダウクス（Daucus）、アラビドプシス(Arabidop sis)、ブラッシカ（Brassica）、ラフアヌス（Rophanus）、シナピス(Sinapis) 、アトロパ（Atropa）、カプシクム（Capsicum）、ダツラ（Datura）、ヒオシア ムス（Hyoscyamus）、リコペルシコン（Lycopersicon）、ニコチアナ(Nicotiana )、ソラヌム(Solanum)、ペチュニア(Petunia)、ジギタリス(Digit alis)、マジョラナ（Majorana）、シアホリウム(Ciahorium）、ヘリアンサス（H elianthus）、ラクツカ(Lactuca)、プロムス（Bromus）、アスパラガス(Asparag us)、アンチリヌム(Antirrhinum)、ヘテロカリス（Heterocallis）、ネメシス(N emesis)、ペラゴニウム（Pelagonium）、パニエウム(Panieum)、ペンニセツム（ Pennisetum）、ラヌンクルス（Ranunculus）、セネシオ(Senecio)、サルピグロ シス（Salpiglossis）、ククミス(Cucumis)、ブロワーリア（Browaalia）、グリ シン(Glycine)、ピスム(Pisum)、ファセロルス(Phaseolus)、ロリウム（Lolium ）、オリザ(Oryza)、ゼア(Zea)、アベナ(Avena)、ホルデウム(Hordeum)、セカレ （Secale）、トリチクム（Triticum）、ソルガム（Sorgum）及びダツラ（Datura ）。 本発明の複数成分細胞致死システムの発現カセットは、いづれかの標準技法に よりクローン化され、そして／又は合成され得るDNA又はRNA構造体である。発現 カセットは典型的には、形質転換された植物中の意図された組織において非致死 ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を方向づけるであろう転写及 び翻訳開始調節配列を含んで成るであろう。そのような核酸構造体は、種々の従 来の技法により所望する植物宿主のゲノム中に導入され得る。広範囲の種類の高 等植物種を形質転換するための技法は、良く知られており、そして技術及び科学 文献に記載されている。たとえば、Weisingなど.，Ann.Rev.Genet．22:421-477( 1988)を参照のこと。 たとえば、DNA又はRNA核酸構造体は、技法、たとえば植物細胞プロトプラスト のエレクトロポレーション及びマイクロインジェクションを用いて、植物細胞の ゲノムDNA中に直接的に導入され得、又は前記核酸構造体は、衝撃方法、たとえ ばDNA粒子衝撃法を用いて、植物組織に直接的に導入され得る。他方では、核酸 構造体は、 適切なT-DNAフランキング領域と組合され得、そして従来のアグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)宿主ベクター中に導入され得 る。アグロバクテリウム ツメファシエンス宿主の毒性機能が、細胞がその細菌 により感染される場合、植物細胞DNA中への構造体及び隣接するマーカーの挿入 を方向づけるであろう。武装解除(disarming)及び二元ベクターの使用を包含す るアグロバクテリウム ツメファシエンス−介在形質転換技法は、科学文献に十 分に記載されている。たとえば、Horschなど.，Science，233:496-498（1984） 及びFraleyなど.，Proc.Natl.Acad.Sci．USA 80:4803(1983)を参照のこと。 マイクロインジェクション技法は、当業界において知られており、そして科学 及び特許文献に十分に記載されている。ポリエチレングリコール沈殿を用いての DNA構造体の導入が、Paszkowskiなど.，EMBO J．3:2717-2722(1984)に記載され ている。エレクトロポレーション技法は、Frommなど.，Proc.Natl.Acad.Sci．US A 82:5824(1985)に記載されている。衝撃性形質転換技法は、Kleinなど.，Natur e 327:70-73（1987）に記載されている。 本発明の発現カセットは、植物細胞上に選択可能表現型を付与するマーカー遺 伝子を含んで成ることができる。たとえば、前記マーカーは、殺生物剤耐性、特 に抗生物質耐性、たとえばカナマイシン、G418、ブレオマイシン、ヒグロマイシ ンに対する耐性、又は除草剤耐性、たとえばクロロスルホロン又はBastaに対す る耐性をコードすることができる。二成分致死性 本発明の植物細胞は、複数の発現カセットを含んで成る。本発明の発現カセッ トがプロモーターが機能的である細胞に存在する場合、そのプロモーターは作用 可能に連結されたポリヌクレオチドの発 現を駆動せしめる。そのような発現は、機能的発現カセットによる。両発現カセ ットのプロモーターが細胞において機能的である場合、２種の“機能的転写体” が製造され、少なくともそれらの１つは典型的には、“機能的ポリペプチド”に 翻訳される。結果として、たとえば、細胞機能は、細胞が阻害され、又は殺害さ れるよう破壊される。個別的には、発現カセットのいづれも、所望する結果を引 き起こすことができない。いくつかの態様において、複数成分系中のすべての機 能的発現カセットの細胞における存在が、細胞に対する阻害又は細胞毒性効果を 生成する。いくつかの態様において、本発明の複数（多）成分系は、有益な効果 、たとえば植物病原体又は害虫に対する耐性を生成する。 いくつかの態様において、発現カセットの１つは、他の共同発現カセットの不 在下で、その作用可能に連結されたポリヌクレオチドを発現することができる。 その共同発現カセットは、機能的になるそのパートナー発現カセットにより発現 されるポリペプチドの存在を必要とし；典型的には、この誘発性発現カセットの 生成物は、単独で、致死性又は阻害性である。たとえば、ポリペプチドは、Wein mannなど.，The Plant Journal，5(4):559-569（1994）に論じられるように、te tリブレッサー／VP16活性化因子融合体におけるような活性化因子ポリペプチド であり得る。相同染色体上の同一の遺伝子座での挿入 本発明の致死系中の複数の成分は、植物ゲノム中にランダムに、又は相同対の 単一の遺伝子座でお互いの対立遺伝子として導入され得る。本発明のいくつかの 態様において、個々の発現カセットは、相同対の個々の染色体上の同じ遺伝子座 に位置する。同じ遺伝子座で個々の発現カセットを導入する特に好ましい手段は 、cre／lox組換え酵素系を使用する。Bayleyなど.，Plant Molecular Biology 18:353-361（1992）。そのcre／lox系は、前駆体カセットの副配列を除去する ためにcre組換え酵素により、続いて操作され得る前駆体発現カセットの導入を 可能にする。この場合、他の対立遺伝子が製造され得る。従って、その組換え酵 素は、本発明の二成分致死系に使用される２種の発現カセットの形成を可能にす る。他の組換え酵素系は、サッカロミセス・セレビシアエFLP／FRT，λatt／Int 、チゴサッカロミセス・ロウキシ（Zygosaccharomyces rouxii）のＲ組換え酵素 、及びMu Gin組換え酵素を包含する。他方では、本発明の非致死性ペプチドをコ ードするポリヌクレオチドの１つは、転移因子、たとえばトランスポザーゼを担 持する系に対する交雑により切り出され得る、トウモロコシからのDs上に位置す る（たとえば、Carrollなど.，Genetics 139:407-420（1995）を参照のこと）。 本発明の１つの態様において、発現カセットの介在性副配列を除去するために 組換え酵素を通して続いて操作され得る発現カセットが、植物中に導入される。 介在性発現カセットは、発現カセットのプロモーターがコード配列に操作不能的 に連結されるよう、組換え酵素部位間に同じ配向で位置する。適切な組換え酵素 の存在下で、その介在性発現カセットは、プロモーターがその対応するコード配 列に作用可能に連結されるよう、発現カセットから切り出される。他方では、組 換え酵素は、植物中に前もって導入されている発現カセットにおける組換え酵素 部位中に介在性発現カセットを挿入するために使用され得る。適切な組換え酵素 の存在下で、その介在性副配列は、プロモーターがその対応するコード配列に操 作不能的に連結されるよう、発現カセット中に挿入される。それらの方法を用い て、他の機能的カセットがゲノムにおける特定の遺伝子座に導入され得る。カセ ットの１つは、その内部に、非機能的発現カセットを 有し、そしてまた、その内部に、機能的介在性発現カセットを有するであろう。 カセットの他の１つは機能的発現カセット（介在性配列を有さない）であろう。 本発明においては、介在性配列はまた、第２ポリペプチドをコードする介在性 発現カセットを含む。両発現カセットからのポリペプチドの存在は、細胞に対し て致死性である。 本発明の植物を製造する１つの方法においては、同じ配向で組換え酵素部位（ たとえばlox部位）を端に有する介在性発現カセットにより中断される非機能的 発現カセットを含む初期植物系が創造される。次に、この初期系が、適切な組換 え酵素(たとえばcre)を含む第２植物により交雑される。Ｆ１世代における植物 は、機能的発現を含むであろう。次に、機能的カセットを含むＦ１植物は、第１ ポリペプチドをコードする機能的発現カセットを含むホモ接合系を生成するため に、標準の技法に従って自家受粉される。元の形質転換体がまた、第１の発現カ セットが非機能的のまま存続する第２系を生成するために自家受粉される。次に 、それらの２種の系が、その遺伝子座でホモ接合性の植物を生成するために交雑 される。両発現カセットが機能的である細胞が排除されるであろう。 もう１つの方法においては、プロモーターと構造遺伝子との間に組換え酵素部 位を（たとえばlox部位）を含む機能的発現カセットを含む初期植物系が創造さ れる。第２植物系を創造するために、介在性発現カセット及び第２組換え酵素部 位（たとえば、lox部位）を含むプラスミドが、適切な組換え酵素(たとえばcre) をコードする第２プラスミドと共に、前記初期植物からの組織又は細胞（たとえ ばプロトプラスト）中に導入される。次に、前記第２植物系が、形質転換された 組織又は細胞から再生される。介在性発現カセットを含むプラスミドDNAと第１ 発現カセットとの間の組換え現象は、 第１発現カセット中への介在性発現カセットを含むプラスミドDNAの挿入をもた らし、それにより、第１発現カセットを非機能的にし、そしてそれにより、第２ 発現カセットを生成する。次に、それらの２種の系が、遺伝子座でヘテロ接合性 の２種の相同染色体の個々上の同じ遺伝子で２種のカセットを含む植物を生成す るために交雑される。両発現カセットが機能的である細胞が除かれるであろう。 それらの態様においては、挿入現象又は切除の相対的効率を高めるために変異 体lox部位の組合せを使用することが所望される。変異体lox部位(たとえばlox₆₆ 及びlox₇₇)は、Albertなど.，Plant J．6:649-659（1995）により記載されてい る。 組換え酵素系を用いて、ホモ接合性である場合、副系統(たとえば副系統Ａ₁及 びＡ₂)を生成する本発明のポリペプチドのそれぞれ１つをコードする、１つの遺 伝子座での２種の選択すべき対立遺伝子が創造され得る。副系統Ａ₁及びＡ₂の交 雑は、ヘテロ接合系Ａを生成する。Ａ系の選択すべき対立遺伝子は同じ遺伝子座 で存在するので、それらは、Ａ系ヘテロ接合体とそれらの対立遺伝子のいづれも 欠いている系、すなわちＢ系との交雑に基づいて、お互いから分離するであろう 。得られるハイブリッドは、細胞当たり複数成分システムの１つの機能的発現カ セットのみを有し、そして従って、それらの細胞は所望する致死又は有益な結果 （たとえば、上記雄性不稔性系Ａは100％の雄性不稔性であろう）を生成しない であろう。 たとえば、二成分系中の１つの発現カセットをそれぞれ有する副系Ａ₁及びＡ₂ は、上記のような組換え酵素システム、好ましくはcre／lox系を用いて創造され 得る。初期形質転換体は、第１プロモーターに作用可能に連結され、そして第２ ポリペプチドの発現を駆動する第２プロモーター間に反対の配向で挿入される、 第１ポリ ペプチドをしはしはコードする第１ポリヌクレオチドを有するであろう。 Lox部位は、第２発現カセット挿入体の両側上に同じ配向で配置される。ホモ 接合性にされる場合（いづれかの数の標準繁殖を通して）、これは副系Ａ₁を生 成するであろう。このＡ₁構造体における第１ポリヌクレオチドは、挿入体が第 １プロモーターと第１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとの間に存在 するので、発現されない。 副系Ａ₂は、組換え部位（たとえばlox部位）を認識し、そして作用可能に連結 される第１ポリヌクレオチドの第１プロモーターによる発現を可能にする介在性 配列を切り出す組換え酵素を担持する系に系Ａ₁を交雑することによって創造さ れる。当業者に良く知られている繁殖方法によりホモ接合性にされる場合、これ は系Ａ₂として使用されるであろう。ハイブリッド系Ａは、本発明の機能的多成 分システムを含んで成る植物を生成するために、副系Ａ₁及びＡ₂を交雑すること によって形成される。 いくつかの態様において、tetオペレーター−Msポリヌクレオチドは、じゅう たん組織−特異的プロモーター、たとえばTA29とtetリプレッサー／VP16(Act)活 性化因子との間に反対配向に挿入される。Lox部位は、それらの第１プロモータ ー第１ポリヌクレオチド挿入体の両側上に同じ配向で配置される。この構造体の ホモ接合性副系Ａ₁においては、調節タンパク質Actは；tetオペレーター−Ms遺 伝子がTA29とAct(調節タンパク質)との間に存在するので、発現されない。creの 結果として挿入体を欠いている副系Ａ₂は、Act、すなわちtetオペレーターの活 性化因子を発現する。ホモ接合性副系Ａ₂に対するＡ₁の交雑は、Msの発現をもた らし、そして１00％雄性稔性ハイブリッドをもたらす。 他の態様においては、pMon-Avr9遺伝子がlox部位端に存在し、そしてじゅうた ん組織−特異的プロモーター、たとえばTA29及びCf９間に反対の配向で挿入され る。この構造体においては、pMon-Avr9遺伝子のみが発現されるであろう。挿入 体が組換え酵素により除去され、そしてTA29プロモーターがCf９の発現を駆動す るもう１つの副系が創造される。それらの２種の系の交雑は、じゅうたん組織細 胞におけるArv9及びCf９の共同発現のために、雄性不稔性であるハイブリッドを もたらす。プロモーター 本発明の発現カセットに使用されるプロモーターは、同一組の組織型において 同時に機能するよう、又は発生又は細胞周期の異なった段階で機能するよう選択 され得る。しかしながら、個々のプロモーターは、一般的に、それらが複数の、 異なった及びオーバーラップするサブセットの細胞において機能するよう選択さ れる。従って、本発明のプロモーターは典型的には、“異なっているが、しかし オーバーラップする特異性”を有する。それらの異なったサブセットのオーバー ラップ部分は、多成分システムのすべての発現カセットが存在し、そして機能的 である細胞のその収集物である。多成分システムのすべての完全な組の機能的発 現カセットの細胞における存在は、生物に対して所望する効果をもたらすであろ う。従って、たとえは、細胞内の単一の機能的発現カセットは、非致死性／非阻 害性表現型を生成する。しかしながら、同じ細胞における両機能的発現カセット の存在は、阻害性又は致死性表現型を生成する。 広範囲のプロモーターが、本発明の多成分系と共に使用され得る。たとえば組 織型、細胞型、発生の段階及び／又は環境条件の点から、特定の発現パターンに よりプロモーターを同定するための方法は、当業界において良く知られている。 プロモーター単離方法にお ける典型的な段階は、標的組織においていくらかの程度の特異性を伴って発現さ れる遺伝生成物の同定である。方法論の範囲の中で、次のものが存在する：cDNA ライブラリーに対する示差ハイブリダイゼーション；減法ハイブリダイゼーショ ン；示差表示；示差２−Ｄゲル電気泳動；標的組織においていくらかの特異性を 伴って発現されることが知られているタンパク質の単離。そのような方法は、当 業者に良く知られている。 タンパク質に基づく方法に関しては、同定されたタンパク質の少なくとも一部 についてのアミノ酸配列を得、そして次に、ゲノムDNAを直接的に同定するか、 又は好ましくは、標的組織から調製されたライブラリーからのcDNAクローンを同 定するために、プローブとして使用され得る核酸を調製するための基礎として前 記タンパク質配列を使用することが必要である。そのようなcDNAクローンが同定 されると、その配列は、示される遺伝子の転写物の５’末端での配列を同定する ために使用され得る。示差ハイブリダイゼーション、減法ハイブリダイゼーショ ン及び示差表示に関しては、標的組織において富化される場合に同定される核酸 配列が、示された遺伝子の転写体の５’末端での配列を同定するために使用され る。そのような配列が同定されると、タンパク質配列又は核酸配列のいづれかか ら出発して、遺伝子転写体からであるものとして同定されたそれらの配列のいづ れかが、標的生物から調製されたゲノムライブラリーをスクリーニングするため に使用され得る。転写開始部位を同定し、そして確かめるための方法は、当業界 において良く知られている。 特定の環境条件又はストレス下で、又は特定の組織において、又は特定の発生 段階で発現されるプロモーターを単離するための方法においては、所望する環境 下で、所望する組織において、又は所望 する段階で発現される多くの遺伝子が同定される。さらなる分析は、植物の１又 は複数の組織におけるそれぞれ特定の遺伝子の発現を示すであろう。細胞致死機 能が２種の異なった遺伝子生成物の会合に基づいて単に形成される場合、所望す る組織又は条件下で活性を有するが、しかしいづれか他の共通する組織において は活性を有さない２種のプロモーターを同定することが単に必要である。 プロモーター及び／又は遺伝子配列が知られると、適切なサイズの領域が、５ ’側の転写開始又は翻訳開始部位に存在するゲノムDNAから選択され、そして次 に、そのような配列が上記のようにして、部分コード配列に連結される。転写開 始部位が融合の点として使用される場合、多くの可能な５’側未翻訳領域のいづ れかが、転写開始部位と部分コード配列との間に使用され得る。特定のプロモー ターの３’末端での翻訳開始部位が使用される場合、それは部分コード配列のメ チオニン開始コドンに直接的に連結される。 プロモーターを同定するためには、ここに記載されるクローンの５’側部分が 、プロモーター配列の特徴を示す配列について分析される。たとえば、プロモー ター配列要素は、通常、転写開始部位の上流の20〜30個の塩基対であるTATAボッ クスコンセンサス配列（TATAAT）を含む。植物においては、さらに、TATAボック スの上流の位置−80〜−100で、典型的には、トリヌクレオチドＧ（又はＴ）NG を取り囲む一連のアデニンを有するプロモーター要素が存在する(J.Messingなど .，Genetic Engineering in Plants，pp.221-227(Kosage，Meredith and Hollae nder，eds．1983))。正しいポリペプチド発現が所望される場合、ポリアデニル 化領域が含まれるべきである。ポリアデニル化領域は、天然の遺伝子の３’末端 、種々の他の植物遺伝子、又はT-DNAに由来することができる。 本明細書に記載のようにして特徴づけられたプロモーターの修飾 は、当業界において良く知られている多くの方法のいづれかを用いて行なわれ得 る。たとえば、特定のエンハンサー配列が、発現レベルを増強し、又は発現パタ ーンを改良するために、プロモーターに付加され得る。さらに、イントロン配列 が、細胞質に蓄積する成熟メッセージの量を高めるために、５’側未翻訳領域、 又は部分コード配列のコード配列に付加され得る。 そのようなプロモーターの例は、タバコからのTA29(Marianiなど.，Nature，3 47:737-41，(1990))、トマトからの127a，108，92b，101B、及び5B(Chen and Sm ith，Plant Physiol.，101:1413(1993)，Smithなど.，Mol.Gen.Genet．222:9-16 ，(1990)，Aguirre and Smith，Plant Mol.Biol.，23:477-87，(1993))、アント リマム マジュス(Antirrhimum majus)からのtap1(Nackenなど.，Mol.Gen.Genet ．229:129-136(1991))、及びブラシカ（Brassica）からのＡ６及びＡ９（Paulな ど.，Plant Mol.Biol.，19:611-22，(1992)，Hirdなど.，Plant Journal 4:1023 -1033(1993)）を包含する。葯−特異的プロモーター、たとえばTwellなど．(Mol .Gen.Genet.，217:240-45，(1991))により単離されたプロモーターもまた使用さ れ得る。葯−特異的プロモーター、たとえばTwellなど.，Mol.Gen.Genet．217:2 40-45(1991)又はScottなど.，Plat Mol.Biol．17:195-207(1991)により単離され たプロモーターもまた使用され得る。種子被膜特異的プロモーター、たとえばpT 218プロモーター(Fobertなど.，The Plant Journal 6:567-77(1994))、又はpWM4 03プロモーターもまた、本発明に使用され得る。広範囲の異なった組織、たとえ ば根、萼、花弁及び維管束要素のための組織−特異的プロモーターが同定されて いる。さらに、病原体感染に基づいて誘発されたプロモーター、たとえばprp-1 プロモーターが同定されている（Strittmatterなど.，Bio/Technology 13:1085- 90（1995） ）。特定の線虫摂食構造体において誘発されたプロモーターが同定されている（ 特許出願WO 92／21757，WO 93／10251，WO 93／18170，WO 94／10320，WO 94／1 7194に開示されている）。 いくつかの態様において、１つの発現カセットにおけるプロモーターは、第２ 発現カセットの遺伝子生成物により誘発できるプロモーターである。それらの態 様においては、その誘導性発現カセットの遺伝子生成物は、単独で、植物細胞に 対して致死性である。遺伝子、たとえばリボヌクレアーゼ（たとえばバルナーゼ ）のじゅうたん組織−特異的発現、又はじゅうたん組織におけるβ−１，３グル カナーゼの早熟発現が、雄性不稔性を生成するために示されている。他の致死ポ リペプチド及び核酸の例は下記に示されている。それらの態様においては、第２ 発現カセットは、リプレッサー／活性化因子融合タンパク質をコードすることが できる。それらのタンパク質は、原核リプレッサードメインに融合される活性化 因子ドメインを使用し、従って、それらを転写活性化因子に変える（たとえば、 Brentなど.，Cell 43:729-736(1985)及びLabowなど.，Mol.Cell.Biol．10:3343- 3356(1990)を参照のこと）。リプレッサードメインは、標的プロモーターにおけ る特定の配列を認識し、そして活性化因子ドメインは転写活性化因子機能を提供 する。この目的のための典型的な融合タンパク質は、Tn10コードのtetリプレッ サーと単純ヘルペスタンパク質VP16の活性化ドメインとの間の融合体である（We inmannなど.，The Plant Journal 5:559(1994)）。それらの態様においては、プ ロモーターは、少なくとも１つのtetオペレーター及びTATA−ボックスを含んで 成るtet人工プロモーターであろう(Weinmanなど．により記載されるような)。 使用され得る他のオペレーター認識系は、lacR/O，GAL4、及び434R/Oを包含す る。トウモロコシSpmからのTnpA結合タンパク質は、 活性化因子ドメイン、たとえばVP16に融合される場合、Spmプロモーターをトラ ンス活性化するために使用され得る(Schlappiなど.，Plant Mol.Biol．32:717-7 25(1996))。本発明に使用され得る他の活性化因子ドメインは、Vp1，ABI3，PvAI f，HAP4及びGCN4からの酸性ドメインを包含する。非酸性活性化因子ドメイン、 たとえばプロリンに富むドメイン、セリン／トレオニンに富むドメイン、及びグ ルタミンに富むドメインがまた使用され得る。トランス活性化因子ポリペプチド は、リブレッサー／活性化因子融合体に限定されないが、しかし天然に存在する トランス活性化因子ポリペプチド、たとえばジェミニウィルスにより発現される 転写活性化因子ポリペプチドを包含する。それらは、TGMV被膜タンパク質及びBR １移動タンパク質遺伝子の発現をトランス活性化するTomato Golden Mosaic Vir us（TGMV）からのAL２遺伝子生成物(Sunterなど.，Virology 232:269-280(1997) )、及びACMV被膜タンパク質の発現をトランス活性化するAfrican Cassava Mosai c Virus（ACMV）のAC２遺伝子生成物を包含する。致死性及び有益な効果 本発明の個々の発現カセットは個々においては機能的であるが、しかし個々の カセット単独の生成物は所望する効果を付与しない。それは、所望する表現型を もたらすためには、個々の発現カセットからのすべての転写体（典型的には、ポ リペプチドに翻訳された）の組合せを取る。そのような転写体は個々においては 、非機能的である。たとえば、致死又は阻害転写体はセンス又はアンチセンス抑 制を提供することができ、又は致死又は阻害転写体は、他の発現カセットの生成 物である特定のプロテアーゼによるプロセッシングに基づいて活性化されるプロ 酵素(prozyme)に翻訳され得る。プロ酵素は、所望するプロテアーゼの認識配列 を含むリンカーを通して活 性酵素に所望する“プロ”領域を連結することによって、人工的に創造され得る 。本発明において有用なプロテアーゼの例は、ポチウィルス(potyvirus)からの プロテアーゼ、たとえばタバコ腐食ウィルス又はタバコ葉脈斑紋ウィルスからの NIaプロティナーゼを包含する（たとえば、Parks and Dougherty，Virology 182 :17-27（1991）を参照のこと）。 本発明の発現カセットはまた、細胞に有益な効果を共同で提供することができ る。従って、それぞれ個々の発現カセットは、非機能的である転写体をコードし 、又は非機能的ポリペプチドをコードする。しかしながら、細胞における両転写 体又はそれらのコードされた生成物（たとえばヘテロダイマータンパク質中の両 モノマー）の存在は、細胞に所望する機能を付与する。従って、本発明は所望す る細胞に致死効果、及び回復に役立つか又は治療効果を提供する。 Ａ．ポリペプチド 本発明のポリペプチドは、異なった遺伝子座からの別々な機能的タンパク質か ら成ることができ、又は前記ポリペプチドは細胞において同時発現される場合、 所望する表現型を提供する単一の機能的タンパク質のオーバーラッピング又は非 オーバーラッピング副配列に由来することができる。さらに本発明のポリペプチ ドは、致死性二量体タンパク質の別々のモノマーから成ることができる。いくつ かの態様において、前記ポリペプチドは、プロ酵素であり、そしてそのプロ酵素 をプロセッシングし、そしてそれを阻害性又は致死性にする特定のプロテアーゼ であろう。 いくつかの態様において、本発明の多成分系は、二成分システムである。２種 の成分が１成分（単一のタンパク質）に由来する二成分（２種のペプチド）系は 一般的に、細胞一致死性又は阻害性機能（初期タンパク質のタンパク質折りたた み強制にのみ依存する）を 有するいづれかの単一のタンパク質に由来することができる。典型的には、２種 のペプチドは、単一の阻害又は細胞毒性タンパク質からの非オーバーラッピング するか又は最少にオーバーラッピングする（たとえば、50，35，20，15，10，５ 又はそれ以下）副配列からである。生成されるペプチドは、２っの部分ペプチド が由来する単一のペプチドの機能を再構成する標的細胞において再会合する。 タンパク質の宿主の二次及び三次構造、及びタンパク質折りたたみの工程は、 当業者に知られており、そして単一タンパク質からの二成分ペプチド系の企画の ための基礎を提供する。前記二成分ペプチドは、１）前記二成分ペプチドの分離 の点でのメチオニンの付加、又はメチオニンによるアミノ酸の保存性置換を有す る、完全なオリジナルタンパク質を含んで成る修飾されていないペプチドとして ；２）ペプチド及び再会合されたペプチド複合体の安定性を高めるために企画さ れた他のアミノ酸によるいくつかのアミノ酸のさらなる置換を有する、（１）に おけるような修飾されたペプチドとして；３）全体として、完全なタンパク質よ りも少ないタンパク質を含んで成る修飾されたペプチドとして；４）適切な機能 をコードする、オリジナルタンパク質の一部のみに由来するペプチドとして、出 発タンパク質に関連するであろう。 非機能的ポリヌクレオチド又はそれらのコードされたポリペプチドの企画は、 当業者に良く知られている多くのアプローチにより達成され得る。本発明におい ては、それらのポリヌクレオチド又はポリペプチドは、細胞において同時発現さ れる場合、致死性又はいくつかの他の所望する機能を付与することができる。そ れらのペプチド副配列は、ひとまとめにして考えると、オリジナルの機能的タン パク質の全タンパク質配列を含んで成るものとして、又は全タンパク質配列のみ の一部を含んで成るものとして、オリジナルペプチド に関連することができる。十分な温度安定性が二量体活性タンパク質に保持され ていることを確かめるためには、部分コード配列中への特定のアミノ酸変化を組 込むことが必要である。前記アミノ酸変化は、広範囲の物理的技法を通して示さ れるようなタンパク質構造に基づいてオリジナルタンパク質及び既知のアミノ酸 相互作用の試験により決定され得る。さらに、アミノ酸変化は、タンパク質生成 物の組合せライブラリーのランダム突然変異誘発及びスクリーニングにより決定 され得る。他方では、アミノ酸変化は、化学的処理を用いての完全なランダム突 然変異誘発及び選択、PCR−誘発された突然変異誘発、又は当業者に知られてい る他の類似する突然変異誘発処理により決定され得る。 オリジナルタンパク質のコード配列に由来する部分コード配列は、再構成され たタンパク質の活性、及び環境変化、たとえば温度変化に対しての適切なレベル の安定性を保持するよう選択される。いくつかの一般的なルートが、効果的な部 分コード配列を決定するために取られ得る。 ポリペプチドの例は、過敏性応答及び細胞の死を導びく無毒性／耐性遺伝子の 組合せを包含する。このシステムの例は、クラドスポリウム・フルバム(Cladosp orium fulvum)からのAVR誘発体ポリペプチド及びその対応する耐性遺伝子、すな わちリコペルシコン（Lycopersicon）からのCf（たとえば、Cf２／Avr2，Cf４／ Avr4，Cf５／Avr5、及びCf９／Avr9；Jonesなど．Science 266:789-793（1994） 及びHammond-Kosack and Jones，Plant Cell 8:1773-1791(1996)を参照のこと） である。好ましい組合せは、Cf９／Avr9である。過敏性応答は、Avr9及びCf９の 両者を発現する細胞において誘発され、そして細胞の死をもたらす。好ましい態 様においては、AVRペプチドが、それをアポプラストに標的化する配列に連結さ れる（ たとえば、Hammond-Kosackなど.，Proc.Natl.Acad.Sci．USA 91:10445-10449を 参照のこと）。他の無毒性／耐性遺伝子の組合せは、トマトPto遺伝子及びプソ イドモナス シリンガエ（Pseudomonas syringae）avrPro無毒性遺伝子（Martin など、Science 262:1432(1993)、アラビドプシス タリアナ（Arabidopsis thal iana）のRPS2遺伝子はavrRpt2無毒性遺伝子を発現するＰ．シリンガエに耐性を 付与する(Bentなど．Science 265:1856-1860(1994))、及びタバコＮ遺伝子及びT MVレプリカーゼ(Padgettなど.，Molecular Plant Microbe Interactions 10709- 715(1997))を包含する。 本発明のポリベプチドは、また、細胞において同時発現される場合、所望する 表現型を提供する単一機能的タンパク質のオーバーラッピング又は非オーバーラ ッピング副配列にも由来することができる。さらに、本発明のポリペプチドは、 致死性二量体タンパク質の別々のモノマーから成ることができる。いくつかの態 様において、前記ポリペプチドは、プロ酵素、及びプロ酵素をプロセッシングし 、そしてそれを阻害性又は致死性にするプロテアーゼであろう。たとえば、“プ ロ−バルナーゼ”は、タバコ腐食ウィルスNIaプロティナーゼ（Glu-X-X-Tyr-X-G ln▼Ser／Gly、ここでＸ＝いづれかのアミノ酸）又はタバコ葉脈斑紋ウィルス(X -X-Val-Arg-／Lys-Phe／Thr-Gln▼Ser／Gly、ここでＸ＝いづれかのアミノ酸） のための認識配列を通して“プロ”部分を連結することによって構成され得る。 ｉ．部分タンパク質加水分解 多くのタンパク質が、部分タンパク質加水分解を通して明確な分解できるドメ インに分離されて来た。これは、本発明の２種の非機能的ポリヌクレオチド又は ポリペプチドについての適切なコード配列を決定するための急速な手段である。 たとえば、膵臓リボヌクレ アーゼＡは、残基20と21との間をスブチリシンにより除去され、必須の触媒残基 は個々のペプチドフラグメントに存在するので、いづれの活性も保持しない、大 きな及び小さなポリペプチドが生成される。２種のペプチドが混合される場合、 小さなペプチドは大きなフラグメントに結合し、そして活性が再構成される。も う１つの例においては、スタフィロコッカスのヌクレアーゼは、部分タンパク質 加水分解に続いて、３種のペプチドフラグメントに分解され得る。プロテアーゼ は始め、暴露された残基、しばしば、特定ドメインに関与しない暴露されたルー プの一部である残基で、損なわれていないタンパク質を分解する。部分タンパク 質加水分解、及び単純な消化がもたらされることを確かめるためにポリアクリル アミドゲル電気泳動による、その得られるペプチドフラグメントの分析に続いて 、残留活性が評価される。活性が保持される場合、ペプチドは、ペプチドが別々 に活性を保持するかどうか、及び続いて、活性が再粉砕に基づいて再構成され得 るかどうかを決定するために分解される。２種（又はそれ以上）のフラグメント のアミノ及びカルボキシ末端の配列決定は、本発明に従って、部分コード配列を いかにして構築するかを示す。 ii．配列保存に基づく企画 多くの配列が同じ機能を有するタンパク質（たとえばズブチリシンファミリー のタンパク質；コリシンファミリーのタンパク質；リボヌクレアーゼファミリー のタンパク質）のために利用できる情況においては、すべてのタンパク質に十分 に保持されない領域を同定することが可能である。二次構造の予測分析と組合し て、別々のペプチドへの分離のための良好な候補体である、タンパク質の領域を 同定することが可能である。そのような領域は、変更されていない主な二次構造 特徴、たとえばα−ヘリックス及びβ−シートを保持 する。そのような領域内で、多くの可能な置換及びコード配列変異体が、インビ トロでのタンパク質機能について、又はインビボ致死性について、アッセイを用 いて試験され得る。 iii．構造に基づく企画 三次元構造が利用できる場合、Ｘ−線結晶学、NMR分光学、等から、単一の機 能的タンパク質の部分ペプチドを含んで成る候補体領域のより正確な決定が可能 である。三次元構造における個々のアミノ酸間の相互作用の分析は、分離され、 そしてまだ、お互い結合する可能性を有する、オリジナルタンパク質の副ドメイ ンを示し、そしてその副ドメインは、別々に存在する場合、たぶん非機能的であ る。さらに、それらの相互作用の分析は、適切な副ドメイン間に位置するアミノ 酸が、メチオニン残基による置換を可能にする手段において、他のアミノ酸との 特異的な相互作用に関与しないことを示す。そのような分析は、出発タンパク質 との高い割合の配列関連性を有するタンパク質についてのさらなる配列データに より助けられる。これは、メチオニン残基により置換され得る残基に関する追加 の証拠を提供する。 本発明の典型的なポリペプチドは、リボヌクレアーゼ、たとえばバルナーゼ(M auguenなど.，Nature 297:162-64(1982))、ビナーゼ(Pavlovskyなど.，FEBS Let t．162:167-70(1983))、リボヌクレアーゼＴ１(Fujiiなど.，Biosci.Biotechnol .Blochem．59:1869-1874(1995))、ヌクレアーゼ、たとえばコリシンＥ９(Wallis など.，Eur.J.Biochem 220:447-54(1994))、又はBamHＩ(Newmanなど.，Science 269:656-63(1995))、及びプロテアーゼ、たとえばスブチリシンBPN’(Ederなど. ，J.Mol.Biol．233:293-304)又はスブチリシンファミリーの他のメンバーを包含 する。いくつかの態様においては、それらのポリペプチドは、じゅうたん組織に おいて 同時発現される場合、雄性不稔性を生成するために使用される。細胞毒性又は阻 害を創造するための他のポリペプチドは、毒性物質を生成し、細胞機能を破壊し 、細胞により必要とされる遺伝子を抑制し（たとえば、アンチセンス、センス抑 制、又はリボザイムを用いることにより）、そしてミトコンドリア機能を破壊す るそれらのポリペプチドを包含する。特に好ましい態様においては、ポリペプチ ドは、リボヌクレアーゼ、たとえばバルナーゼの別々の副配列に由来する。バル ナーゼに関しては、個々のポリペプチドの最小の長さは、少なくとも20個のアミ ノ酸である。一般的に、バルナーゼポリペプチドのオーバーラップの範囲は、５ 個よりも多くないアミノ酸であろう。 酵素バルナーゼは、他の細胞機能とは関係なく、細胞−自律性であり、そして 非常に感受性であることがすでに示されている十分に研究された細胞致死機能性 である。バルナーゼ発現は、特定植物組織における細胞増殖及び発生を阻害する ことが示されている。成熟バルナーゼタンパク質は、110個のアミノ酸のポリペ プチドから成る。成熟タンパク質のアミノ酸37が、リボヌクレアーゼ活性の良好 な保持を伴って、バリンからメチオニンに転換され得ることが、インビトロ研究 において示されている(Sancho & Fersht，J.Mol.Biol．224:741-47(1992))。臭 化シアン処理がタンパク質を、36個のアミノ酸のペプチド及び74個のアミノ酸の ペプチドに分解し、そしていづれのペプチドも活性を保持しないことがまた示さ れている。さらに、正常な活性の少なくとも30％は、２種のペプチドがインビト ロで混合される場合、再構成される(Sancho & Fersht，前掲)。 特に好ましい態様は、鋳型としてバルナーゼ遺伝子及び次のプライマーを用い てのPCR増幅を通して、次の２種の部分バルナーゼコード副配列を生成すること である：１）成熟タンパク質の位置１で メチオニンコドン、及び成熟タンパク質の位置36の後に停止コドンを導入するよ う企画されたプライマー、及び２）成熟タンパク質コード配列の末端を完全なま ま残しながら、成熟タンパク質コード配列の位置37でメチオニンコドンを導入す るよう企画されたプライマー。次に、２つの部分コード配列は、たとえばプロモ ーター、５’側未翻訳領域、３’側未翻訳領域、及びポリアデニル化シグナルを 用いて、発現カセットを生成するためにさらに操作され得る。２種の発現カセッ トは、広範囲の有用な形質を創造するために使用され得る２−成分致死系を創造 するよう企画され得る。もう１つの典型的な２−成分ポリペプチド系は、クラド スポリウム フルバムからのAvr9誘発体ポリペプチド、及びその対応する耐性遺 伝子、すなわちリコペルシコン・エスキュレンタム(Lycopersicon esculentum) からのCf９の使用である。過敏性応答が、細胞の死をもたらすAvr9及びCf９の両 者を発現する細胞において誘発される。 シグナルタンパク質の２つのペプチドフラグメントにより生成される真核細胞 の細胞毒性又は阻害性についてアッセイするための手段は、当業界において良く 知られている。たとえば、上記で示されたようにして企画された部分ペプチドは 、活性を伴わないで、別々に発現され得るが、しかし活性を付与するためには一 緒に発現され得るかどうかを決定するためには、酵素活性は、発現されたペプチ ドを含む細胞抽出物に対して、又は前記ペプチドの精製された調製物において直 接的にアッセイされ得る。さらに、真核細胞の細胞毒性又は阻害性は、細胞機能 のための広範囲のインジケーターを用いてアッセイされ得る。１つの好ましい方 法においては、発現カセットは、容易にアッセイされる機能を生成する発現カセ ット、たとえばβ−グルクロニダーゼタンパク質(Jeffersonなど.，EMBO J．6:3 901-3907(1987))、又はホタルルシフェラーゼ（De Wetなど.，M ol.Cell.Biol．7:725-37(1987)）と共に細胞に導入され得る。発現カセットの発 現が共に細胞毒性である場合、検出されるレポーター活性の量は、発現カセット が真核細胞中に別々に導入される場合に検出される活性に比較して、減じられる であろう。さらに、たとえば、単一の阻害性又は細胞毒性タンパク質、たとえば リボヌクレアーゼからのオーバーラップしないか又は最小にオーバーラップする 副配列に由来する２種のペプチドが、リボヌクレオチド分解活性についてインビ トロでアッセイされ得る。 本発明のペプチドはまた、たとえば増強された熱安定性、増強されたサブユニ ット会合性、低濃度での増強された活性及び同様のものを別々に又は組合して有 するポリペプチドを生成するために、標準の方法に従って修飾され得る。それら のペプチドはまた、保存的に修飾された変異体を生成するためにも修飾され得る 。ポリペプチドの修飾は、たとえば当業者に知られている技法、たとえばポリペ プチドをコードする核酸のランダム又は座位特異的突然変異誘発により達成され 得る。そのような突然変異誘発方法を用いれば、遺伝子的に修飾されたペプチド が活性の再構成についてインビボでアッセイされる。低い濃度で又は高い温度で の活性は、遺伝子的に修飾された及びオリジナルのペプチドを比較することによ って測定される。 たとえば、上記の２種のバルナーゼ成分は、損なわれていないバルナーゼタン パク質の安定性を増強することが示される手段で、別々に修飾される（例９を参 照のこと）。選択される修飾法は、Serranoなど.，J.Mol.Biol．233:305-12（19 93）の研究に基づかれており、ここで彼は、バシラス インテルメジウス（Baci llus intermedius）から得られる関連するタンパク質、すなわちビナーゼとバル ナーゼの熱力学的安定性を比較している。ビナーゼは、バルナー ゼとまったく同じアミノ酸配列を有するが、但し110のアミノ酸位置のうち18を 除く。Serranoなどは、バルナーゼの個々のアミノ酸を、タンパク質が異なる位 置での異なったアミノ酸により置換し、そしてアミノ酸変化により誘発される熱 力学的安定性の変化を測定した。酵素活性はまた、突然変異誘発されたバルナー ゼ形のサブセットについても測定された。この場合、安定性を増強するが、しか し酵素活性に対してはほとんど効果を有さない特定のアミノ酸変化が同定された 。特に、アミノ−末端ペプチドに関しては、成熟バルナーゼタンパク質の位置15 でのグルタミンがイソロイシンにより置換され、そして位置16でのトレオニンが アルギニンにより置換され；カルボキシ−末端ペプチドに関しては、位置65での グリシンがセリンにより置換され、そして位置108でのリシンがアルギニンによ り置換された。それらの変化は、２種の修飾されたペプチドがオリジナルペプチ ドの代わりに発現される場合、改良された機能を導びく。それらの特定の変化は 可能性あるアミノ酸変化のタイプを例示し；当業者は、他のそのようなアミノ酸 置換が２−成分システムの増強された機能を導びくことができることを認識する であろう。そのような変化は、二量体酵素の安定性よりもむしろ、二量体酵素の 全体の活性（Vmax）を増強する変化である。 Ｂ．転写体 ポリペプチドの他に、多くのDNA構造体の転写生成物が、内因性植物遺伝子の 発現を抑制し、そして細胞に対する有益な又は致死結果をもたらすために使用さ れ得る。それらは、センス又はアンチセンス抑制、又は第２発現カセットと組合 して、細胞を阻害し、又は殺害するリボザイムを提供するカセットを包含する。 遺伝子発現のアンチセンスRNA阻害はすでに示されており，たとえば、Sheehyな ど.，Proc.Nat.Acad.Sci．USA 85:8805-8809(1988)及びHiattな ど.，アメリカ特許第4,801,340号を参照のこと。内因性遺伝子の発現を調整する ためへのセンス抑制の使用の例については、Napoliなど.，The Plant Cell 2:27 9-289（1990）及びアメリカ特許第5,034,323号を参照のこと。 触媒性RNA分子又はリボザイムはまた、遺伝子発現を阻害するためにも使用さ れ得る。たとえば、いくつかの態様においては、有益な又は致死性のリボザイム が、第２発現カセット（たとえば、リプレッサー／VP16活性化因子融合ポリペプ チド）から発現されるポリペプチドによる誘発に基づいて転写され得る。実質的 にいづれかの標的RNAと特異的に対合し、そして特定の位置でホスホジエステル 主鎖を分解し、それにより、標的RNAを機能的に不活性化するリボザイムを企画 することは可能である。この分解を実施する場合、リボザイムはそれ自体、変更 されず、そして従って、再循環し、そして他の分子を分解し、それを真の酵素に することができる。アンチセンスRNA内へのリボザイム配列の包含は、それらに 対するRNA−分解活性を付与し、それにより、その構造体の活性を高める。標的R NA−特異的リボザイムの一般的な企画及び使用は、Haseloffなど.，Nature，334 :585-591(1988)に記載されている。 アンチセンス抑制又はセンス抑制に関しては、導入された配列はまた、一次転 写生成物又は十分にプロセッシングされたmRNAのいづれかに対して、十分な長さ である必要はない。一般的に、より高い相同性が、より短い配列の使用を補足す るために使用され得る。さらに、導入された配列は同じイントロン又はエキソン パターンを有する必要はなく、そして非コードセグメントの相同性は同等に効果 的であり得る。通常、約30又は40個のヌクレオチド〜約2000個のヌクレオチドの 間の配列が使用されるべきであり、但し少なくとも約100個のヌクレオチドの配 列が好ましく、少なくとも約200個のヌ クレオチドの配列がより好ましく、そして少なくとも約500個のヌクレオチドの 配列が特に好ましい，。 Ｃ．再生 いづれかの数の形質転換技法により誘導される形質転換された植物細胞は、形 質転換された遺伝子型及び従って、所望する発現カセットを有する完全な植物を 再生するために培養され得る。そのような再生技法は、組織培養物増殖培地にお ける一定の植物ホルモンの操作に依存し、典型的には、所望するポリペプチドを コードするポリヌクレオチドと共に導入されている殺生物剤及び／又は除草剤マ ーカーに依存する。培養されたプロトプラストからの植物再生は、Evansなど.， Protoplasts Isolation and Culture，Handbook of Plant Cell Culture，pp.12 4-176(1983);及びBinding，Regeneration of Plants，Plant Protoplasts，pp.2 1-73（1985）に記載されている。再生はまた、植物カルス、外植体、器官、又は それらの一部からも得られる。そのような再生技法は、一般的に、Kleeなど.，A nn.Rev．of Plant Phys．38:467-486（1987）に記載されている。 本発明のいくつかの態様において、複数成分系の個々の成分をコードする発現 カセットは、２種の発現カセットの個々による細胞の同時形質転換により、又は ２種の発現カセットによる細胞の連続的形質転換により、単一細胞中に導入され る。オーバーラップする特異性を有する２種のプロモーターが使用される場合、 細胞阻害性又は致死性は、両プロモーターが十分に活性的である標的組織のみに もたらすであろう。 他の態様においては、発現カセットは、形質転換により異なった細胞中に導入 される。完全な生物は、分離された、形質転換された細胞から再生され、そして 次に、ハイブリッド生物が個々の生物を 交雑することによって生成される。この場合、単一の発現カセットをそれぞれ担 持するオリジナルの完全な生物は、細胞阻害性又は致死性を示さない。しかしな がら、交雑に起因するハイブリッド生物は、同じ細胞に両発現カセットを有し、 そして選択されたプロモーターの発現パターンに依存する態様で、細胞阻害機能 又は致死性を発現するであろう。 当業者は、発現カセットがトランスジェニック植物に安定して組込まれ、そし て操作できることが確認された後、それは性的な交雑により他の植物中に導入さ れ得ることを理解するであろう。多くの標準の繁殖技法のいづれかが、交雑され るべき種に依存して、使用され得る。 Ｄ．標的細胞型 本発明は特定の細胞又は組織型を排除するために使用され得るので、多くの所 望する形質が植物中に導入され得る。たとえば、種子増殖された収穫物の種無し 果物を生成するためには、その連結発現が細胞の阻害又は死を誘導する２種の発 現カセットの１つをそれぞれ包含する近交系が製造される。たとえば、個々の発 現カセットは、種子−特異的プロモーターからの非致死性ポリペプチドを発現す ることができる。近交系が交雑される場合、種無し果物の商業的生産に使用され るその得られるハイブリッドは、ハイブリッド植物の果物における種子の発生を 阻止するために結合する両成分を担持する。近交系は機能的致死性遺伝子を担持 しないので、個々の系は発現カセットの１つのためのホモ接合性条件下で維持さ れ得る。 雄性不稔性を生成するためには、２種のポリヌクレオチドの個々が、個々のポ リヌクレオチドを有する同じプロモーター又は異なったプロモーターを用いて、 じゅうたん組織細胞又は花粉細胞において機能的なプロモーターに作用可能に連 結される。ホモ接合条件下 でポリヌクレオチドの１つをそれぞれ含む近交系が維持される。近交系が交雑さ れる場合、その得られるハイブリッドは両部分遺伝子を担持し、そして雄性−不 稔性になる。２種の近交系が同じ系である場合（但し、部分バルナーゼポリペプ チドの場合は除く）、その得られる“ハイブリッド”は、ハイブリッド繁殖方法 に使用され得る雄性−不稔性近交系である。 雌性不稔性を生成するためには、ポリヌクレオチド配列の個々が、柱頭組織、 伝達管の組織、胚珠組織、又は雌性不稔性のための必須の他の組織において発現 されるプロモーターにより作用可能に連結される。ホモ接合性条件下で２種のポ リヌクレオチドの１つをそれぞれ含む近交系が維持される。近交系が交雑される 場合、得られるハイブリッドは両ポリヌクレオチドを担持し、そして雌性不稔性 である。２種の近交系が同じ系である場合（但し、部分バルナーゼ遺伝子を除く ）、その得られる“ハイブリッド”はハイブリッド繁殖方法に使用され得る雌性 不稔性近交系である。 植物における耐病性は、病原体により感染された細胞がその病原体のさらなる 広がりを妨げるために殺害される過敏性応答により介在され得る。病原体攻撃及 び本発明の２−成分システムにより誘発されたプロモーターを用いて、合成過敏 性応答が創造され得る。たとえば、根結節又はノウ胞性線虫に対する耐性は、そ れらの害虫が植物の根における連続した成長及び繁殖のために必要である、巨細 胞又は特殊化された食用細胞を排除することによって介在され得る。本発明の２ −成分系と組合して、巨細胞又は特殊化された食用細胞において誘発されたプロ モーターを用いて、それらの特殊化された根細胞が排除され得る。 多成分系の両発現カセットを含んで成るハイブリッド種子は、典型的には、副 系Ａ₁及びＡ₂を用いて維持現場において生成される 。それらの副系は、同じ細胞において機能的である場合、細胞阻害又は細胞の死 を導ひく、２成分系の２種の発現カセットの１つ又は他の１つを含んで成る。両 副系Ａ₁及びＡ₂は、それぞれが本発明の２成分系の１つの発現カセットを担持す るので、稔性である。Ａ系を生成するための交雑に基づいて、細胞の死又は阻害 が、両発現カセットが機能的である細胞において開始される。いくつかの態様に おいて、１つの副系は、じゅうたん組織特異的プロモーター、たとえばpMonに作 用可能に連結されるクラドスポリウム フルバムAvr9無毒性遺伝子からのポリヌ クレオチドを含んで成る発現カセットを含むであろう。他の副系においては、ト マトCf９遺伝子（その対応するトマト耐性遺伝子）は、第２のじゅうたん組織− 特異的プロモーターTA29に作用可能に連結される。両副系は、Avr9及びCf９ポリ ペプチドがそれぞれ、細胞の死を付与しないので、雄性稔性である。しかしなが ら、それらの副系が交雑される場合、それらは、過敏応答が細胞の死をもたらす じゅうたん組織において開始される系を生成する。Hominid-Kosackなど.，PNAS 91:10445-10449(1994);Jonesなど.，Science 266:789-793(1994)。じゅうたん組 織細胞の死は、他の器官に悪影響与えないで、雄性−不稔性を付与するであろう 。ハイブリッド種子の生成現場において、雄性不稔性系Ａは、ハイブリッド種子 を生成するためにいづれかの系Ｂに交雑される。 いくつかの態様においては、１つの副系は、少なくとも１つのtetオペレータ ー及びTATA−ボックスを含んで成る人工プロモーターと共に、優性の雄性不稔性 遺伝子（Ms）を有する。この条件下で、雄性不稔性遺伝子は、転写されず、そし てその副系は雄性稔性である。その対応する副系は、キメラ転写活性化因子の発 現を駆動するじゅうたん組織−特異的プロモーターを有する。好ましくは、この キメラ転写活性化因子は、Actであろう。Weinmannなど.，The Plant Journal 5( 4):559-569(1994)。副系の交雑から生成される系は、それが、じゅうたん組織に おいて特異的に発現される転写活性化因子(Act)、及びtetオペレーター−Ms遺伝 子の両者を含むので、雄性不稔性であろう。Ms遺伝子、たとえばリボヌクレアー ゼ（たとえばバルナーゼ）のじゅうたん組織−特異的発現、又はじゅうたん組織 におけるβ−１，３−グルカナーゼの早熟発現が、雄性不稔性を生成するために 示された。ハイブリッド種子生成現場においては、雄性不稔性系Ａが、ハイブリ ッド種子を生成するためにいづれかの系Ｂに交雑され得る。哺乳類細胞トランスフェクション及び遺伝子療法 本発明はさらに、上記で十分に記載されたような多成分致死性又は阻害性系の ためのパッケージ可能なDNA又はRNA(核酸)構造体を提供する。遺伝子療法に使用 される種々の構造体は、始めの部分において記載された組成物及び方法に関係す る。従って、本発明の構造体は、特定の哺乳類細胞を標的化するために使用され 得る。パッケージ可能な核酸構造体は、インビボ又はエクスビボでの真核細胞の トランスフェクションを可能にする。一般的に、真核細胞は哺乳類宿主；たとえ ばマウス、ゲッ歯類、霊長類、及びヒトである。本発明のパッケージ可能な核酸 は、下記のようにして、標的細胞及び生物のトランスフェクションのために多く の良く知られたいづれかのベクター中に挿入され得る。細胞は、前記細胞又は後 期発生段階の細胞において機能的なプロモーターに作用可能に連結されるポリヌ クレオチドを含んで成る発現カセットによりトランスフェクトされる。多成分致 死性系中の機能的発現カセットの細胞トランスフェクトされたすべては、細胞増 殖を阻害し（すなわち、細胞が細胞周期に入らない）、又は細胞を殺害する。し かしながら、当業者は、 本発明の多成分系が、その多成分システム中のすべての機能的発現カセットによ るトランスフェクションに基づいて、治療効果を提供するよう修飾され得ること を認識し；そのような態様は所望する効果を生成するいづれかのポリペプチドを 使用することができる。 本発明の好ましい態様は、癌細胞の殺害を標的化される。哺乳類において癌増 殖を引き起こすことができる細胞は、癌増殖を引き起こすことができない哺乳類 細胞からの突然変異を通して複数の進路に変更される。細胞増殖制御ネットワー クの制御に、テロマーの長さの制御に、及び接触−介在された細胞増殖阻害の制 御に欠損が生じることは、当業者に知られている。特定の癌の因果関係下にある 共通するテーマ及び機構が存在するが、広範囲の遺伝子は、それらの発現が変更 され、又はそれらの機能が変更される場合、腫瘍遺伝子として同定されて来た。 損なわれていない生物の成熟細胞において通常発現されない一定の遺伝子が、癌 細胞においてしばしば発現される。そのような遺伝子のプロモーターは、癌細胞 において致死機能を形成するが、しかし細胞周期のための通常の制御、接触阻害 及びテロマー形成下での細胞においては形成しない２成分システムを創造するた めに本発明に使用され得る。典型的なプロモーターは、テロメラーゼプロモータ ー、又はmyc遺伝子の制御下でのプロモーター（但し、それらだけには限定され ない）を包含する群から選択される。２成分系のポリヌクレオチドは、武装解除 されたヒトウィルス、リポソーム融合、又は他の方法を通して癌細胞に供給され 得る。 用語“トランスフェクトされた”とは、真核細胞中への核酸の導入を包含し、 ここで前記核酸は、細胞のゲノム(すなわち染色体、プラスミド又はミトコンド リアDNA)中に組込まれ、自律性レプリコンに転換され、又は一時的に発現され得 る（たとえば、トランスフ ェクトされたmRNA）。前記核酸は、ベクター及び標的細胞の相互作用を通して、 エクスビボ又はインビボで細胞中にトランスフェクトされる。明確な細胞型を標 的化するベクターは、当業界において知られている。遺伝子療法に関しては、An derson，Science 256:808-813(1992);Nabel & Felgner，TIBTECH 11:211-217(19 93);Mitanl & Caskey，TIBTECH 11:162-166(1993);Mulligan，Science 926-932( 1993);Dillon，TIBTECH 11:167-175(1993);Miller，Nature 357:455-460(1992); Van Brunt，Biotechnology 6(10):1149-1154(1988);Vigne，Restorative Neurol ogy and Neuroscience 8:35-36(1995);Kremer & Perricaudet，British Medical Bulletin 51(1):31-44(1995);Haddadaなど、Current Topics in Microbiology and Immunology(Doerfler and Bohm eds.，1995);及びYuなど.，Gene Therapy 1 :13-26（1994）を参照のこと。 細胞中への遺伝子又は遺伝子材料の供給は、疾病の遺伝子療法処置における最 初の決定的な段階である。哺乳類細胞内に核酸を供給し、そして発現するための 種々の方法は、当業者に知られている。そのような方法は、たとえばリポソーム に基づく遺伝子供給を包含する(WO 93／24640;Mannino Gould-Fogerite，Bio Te chniques 6(7):682-691(1988);アメリカ特許第5,279,833号;WO 91／06309;Felgn erなど.，Proc.Natl.Acad.Sci．USA 84:7413-7414(1987);及びBudkerなど.，Nat ure Biotechnology，14(6):760-764(1996))。当業者に知られている他の方法は 、エレクトロポレーション（アメリカ特許第5,545,130号；第4,970,154号；第5, 098,843号；及び第5,128,257号）、直接的な遺伝子トランスファー、細胞融合、 沈殿方法、粒子衝撃、及び受容体−介在された摂取（アメリカ特許第5,547,932 号；第5,525,503号；第5,547,932号；及び第5,460,831号）を包含する。また、 アメリカ特許第5,399,346号 を参照のこと。 広く使用されるレトロウィルスベクターは、ネズミ白血病ウィルス（MuLV）、 テナガザル白血病ウィルス（GaLV）、サル免疫欠損ウィルス（SIV）、ヒト免疫 欠損ウィルス（HIV）及びそれらの組合せに基づくベクターを包含する。たとえ ば、Buchscherなど.，J.Virol．66(5):2731-2739(1992);Johannなど.，J.Virol ．66(5):1635-1640(1992);Sommerfeltなど.，Virol．176:58-59(1990):Wilsonな ど.，J.Virol．63:2374-2378(1989);Millerなど.，J.Virol．65:2220-2224(1991 );PCT／US94／05700、及びRosenburg & Fauci，Fundamental Immunology，Thir d Edition（Pauled.，1993）、及びそれらに引用される文献、並びにYuなど.， Gene Therapy(1994)前記を参照のこと。 AAV−に基づくベクターはまた、たとえば核酸及びポリペプチドのインビトロ 生成において、及びインビトロ及びエクスビボ遺伝子療法において、標的核酸に より細胞をトランスダクションするためにも使用される。AAVベクターの概観に ついては、Westなど.，Virology 160:38-47(1987);アメリカ特許第4,797,368号 ；WO 93／24641;Kotin，Human Gene Therapy 5:793-801(1994);Muzyczka，J.Cli n.Invst.94:1351(1994)及びSamulski（前記）を参照のこと。組換えAAVベクター の構成は、多くの出版物、たとえばLebkowski、アメリカ特許第5,173,414号；Tr atschinなど.，Mol.Cell.Biol．5(11):3251-3260(1985);Tratschinなど.，Mol.C ell.Biol．4:2072-2081(1984);Hermonat & Muzyczka，Proc.Natl.Acad.Sci．USA 81:6466-6470(1984);及びSomulskiなど.，J.Virol．63:3822-3828(1989)に記載 される。rAAVによりトランスフェクトされ得る細胞系は、Lebkowskiなど.，Mol. Cell.Biol．8:3988-3996（1988）に記載されるものを包含する。 Ａ．細胞のエクソビボトランスフェクション 診断、研究、又は遺伝子療法のためのエクソビボ細胞トランスフェクション（ たとえば宿主生物中へのトランスフェクトされた細胞の再注入による）は、当業 者に良く知られている。好ましい態様においては、細胞は対象生物から単離され 、本発明の発現カセット（遺伝子又はcDNA）によりトランスフェクトされ、そし て対象生物（たとえば患者）中に再注入される。エクソビボトランスフェクショ ンのために適切な種々の細胞型は、当業者に良く知られている（たとえば、Fres hneyなど.，Culture of Animal Cells，A Manual of Basic Technique，third e dltion（1994）、及び患者から細胞をいかにして単離し、そして培養するかにつ いての議論については、そこに引用される文献を参照のこと）。 １つの特に好ましい態様においては、幹細胞が、細胞トランスフェクション及 び遺伝子療法のためのエクス−ビボ方法に使用される。幹細胞を使用する利点は 、それらがインビトロで他の細胞型に分化され得、又はそれらが骨髄に移植する であろう哺乳類（たとえば、細胞のドナー）中に導入され得ることである。サイ トカイン、たとえばGM-CSF，IFN-γ及びTNF-αを用いて、臨床的に重要な免疫細 胞型にCD34⁺細胞をインビトロで分化するための方法は、知られている(Inabaな ど.，J.Exp.Med．176:1693-1702（1992）を参照のこと)。 マウスにおいては、幹細胞は、所望しない細胞、たとえばCD４⁺ 及びCD８⁺（Ｔ細胞）、CD45⁺（panB細胞）、GR-1（顆粒球）、及びIa^d（分化さ れた抗原付与細胞）を結合する抗体により骨髄細胞をパンニングすることによっ て、骨髄細胞から単離される。このプロトコールの例に関しては、Inabaなど.， J.Exp.Med．176:1693-1702（1992）を参照のこと。ヒト造血前駆体及び幹細胞は 、CD34表 面膜タンパク質の存在により特徴づけられる。この抗原は、たとえばCD34を結合 する親和性カラム上での精製のために使用される。Hoなど.，Stem Cells 13(sup pl．3):100-105（1995）を参照のこと。また、Brenner，Journal of Hematother apy 2:7-17(1993)も参照のこと。もう１つの態様においては、造血幹細胞は、胎 児臍血液から単離される。Yuなど.，Proc.Natl.Acad.Sci．USA 92:699-703（199 5）は、レトロウィルスベクターを用いて、ヒト胎児瞬血液からCD34⁺細胞をトラ ンスダクションするための好ましい方法を記載する。 Ｂ．インビボトランスフェクション 治療用核酸を含むベクター（たとえば、レトロウィルス、アデノウィルス、リ ポソーム、等）が、インビボでの細胞のトランスダクションのために生物に直接 的に投与され得る。投与は、血液又は組織細胞との分子の究極的な接触をもたら すよう分子を導入するために通常使用されるいづれかの経路によってである。パ ッケージされた核酸は、いづれかの適切な態様で、好ましくは医薬的に許容でき るキャリヤーと共に投与される。そのようなパッケージされた核酸を投与するた めの適切な方法が利用でき、そして当業者に良く知られており、そして１つより も多くの経路が特定の組成物を投与するために使用され得るが、特定の経路がし ばしば、他の経路よりも、より早く且つより効果的な反応を提供することができ る。 医薬的に許容できるキャリヤーは、投与される特定の組成物、及び前記組成物 を投与するために使用される特定の方法により主に決定される。従って、本発明 の医薬組成物の広範囲の種類の配合物が存在する。 経口投与のために適切な配合物は、（ａ）液体溶液、たとえば希釈剤、たとえ ば水、塩溶液又はPEG 400に懸濁された有効量のパッ ケージされた核酸；（ｂ）液体、固体、顆粒又はビラチンとして、予定された量 の活性成分をそれぞれ含む、カプセル、サケット又は錠剤；（ｃ）適切な液体に おける懸濁液；及び（ｄ）適切なエマルジョンから成ることができる。錠剤形は 、１又は複数のラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸 カルシウム、コーンスターチ、ポテトスターチ、トラガカントゴム、微結晶セル ロース、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化珪素、クロスカルメロースナト リウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、及び他の賦形剤、 着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、保湿剤、保存剤、風味剤、顔料、砕 解剤、及び医薬的に適合できるキャリヤーを包含することができる。トローチ形 は風味剤、通常スクロース及びアカシア、又はトラガカントゴムに活性成分を含 んで成り、そして錠剤は不活性基剤、たとえばゼラチン及びグリセリン、又はス クロース及びアカシアエマルジョン、ゲル及び活性成分の他に、当業界において 知られているキャリヤーを含む同様のものに活性成分を含んで成ることができる 。 パッケージされた核酸は、単独で又は他の適切な成分と組合して、吸入により 投与されるエアゾール配合物に製造され得る（すなわち、それらは“噴霧化”さ れ得る。エアゾール配合物は、加圧された許容できる推進剤、たとえばジクロロ ジフルオロメタン、プロパン、窒素及び同様のものに配置され得る。 直腸投与のための適切な配合物は、たとえば、坐剤基剤と共にパッケージされ た核酸から成る坐剤を包含する。適切な坐剤基剤は、天然又は合成のトリグリセ リド又はパラフィン炭化水素を包含する。さらに、基剤、たとえば液体トリグリ セリド、ポリエチレングリコール及びパラフィン炭化水素とパッケージされた核 酸との組合せから成るゼラチン直腸カプセルを使用することもまた可能である。 たとえば、関節内、静脈内、筋肉内、経皮内、腹腔内、及び皮下経路による非 経口投与のために適切な配合物は、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、及び意図され る受容体の血液と配合物とを等張性にする溶質を含むことができる、水性及び非 水性、等張無菌注射用溶液、及び沈殿防止剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤及び保 存剤を含む水性及び非水性無菌懸濁液を包含する。本発明の実施においては、組 成物は、静脈内注入、経口、局部的、腹腔内、膀胱内又は包膜内投与され得る。 パッケージされた核酸の配合物は、単一用量又は複数−用量の密封された容器、 たとえばアンプル及びバイアルに供給され得る。 注射溶液及び懸濁液は、前に記載された種類の無菌粉末、顆粒及び錠剤から調 製され得る。エクソ治療の情況下で上記のようなパッケージされた核酸によりト ランスダクトされた細胞はまた、上記のように静脈内又は非経口投与され得る。 本発明の情況において患者に投与される用量は、時間にわたって患者における 有益な治療応答をもたらすために十分であるべきである。その用量は、使用され る特定のベクターの効能及び患者の状態、並びに処理される患者の体重又は表面 積により決定されるであろう。用量のサイズはまた、特定のベクター、又は特定 の患者におけるトランスダクトされた細胞型の投与に付随するいづれかの悪い副 作用の存在、性質及び程度により決定されるであろう。 投与されるベクターの有効量を決定する場合、医者は、ベクターの循環血漿レ ベル、ベクター毒性、疾病の進行、及び抗−ベクター抗体の生成を評価する。一 般的に、ベクターからの裸核酸の用量が、典型的な70kgの患者当たり約１μｇ〜 100μｇであり、そしてレトロウィルス粒子に含まれるベクターの用量は、治療 用核酸の等量を生成するよう計算される。 投与に関しては、本発明のインヒビター及びトランスダクトされた細胞は、患 者の部分的及び全体的健康に適用される場合、トランスダクトされた細胞型のLD -50、及び種々の濃度での細胞壁の副作用により決定される速度で投与され得る 。投与は、一回の又は分割された用量により達成され得る。 トランスダクトされた細胞は、確立された方法に従って、再注入のために調製 される。Abrahamsenなど.，J.Clin.Apheresis，6:48-53(1991);Carterなど.，J. Clin.Arpheresis 4:113−117（1988）;Aebersoldなど.，J.Immunol.Meth．112:1 -7(1988);Muulなど.，J.Immunol.Methods 101:171-181(1987)及びCarterなど.， Transfusion 27:362-365（1987）を参照のこと。約２〜４週間の培養の後、細胞 は１×10⁸〜１×10¹²個の数になるべきである。これに関して、細胞の増殖特徴 は、患者から患者に、及び細胞型から細胞型に変化する。トランスダクトされた 細胞の再注入の約72時間前、アリコートが表現型の分析、及び治療剤を発現する 細胞の百分率の分析のために取られる。非哺乳類生物の処理 本発明の複数成分致死性系は好ましくは、多細胞真核生物、たとえは哺乳類又 は植物により使用されると共に、それはまた、細胞阻害又は致死性機能（たとえ ば、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、プロテアーゼ、トキシン） がすべてのタイプの細胞に効果があることが知られているので、いづれの生物へ も適用できる。タンパク質構造及びタンパク質折りたたみの原理は、生存する細 胞に普遍的に適用され、そして従って、多−成分システムはすべてのタイプの細 胞において機能するであろう。さらに、種々の発現パターンを有する広範囲のプ ロモーターは、原核及び非植物真核細胞に関して、当業界において知られている 。従って、二成分システム と特異的に発現されたプロモーターとの組合せは、一般的である。 従って、たとえば、二成分致死性系はまた、原核生物にも適用され得る。哺乳 類生物内で増殖する細菌細胞を殺害し、又はその増殖を阻害することが所望され る場合、複数成分系は、特殊化されたバクテリオファージを用いて、細菌細胞に 供給され得る。この場合、標的細菌細胞においては高く発現されるが、しかし宿 主生物又は他の有益な細菌細胞においては活性を有さない単一プロモーターが、 個々の部分コード配列と共に使用され得、そして前記２種の遺伝子が特殊化され たバクテリオファージのゲノムにおいて標的細菌細胞に供給される。当業者に明 確であろうように、前記システムは、２成分以上に利用するために拡張され得る 。 本発明は理解を明白にするために、例示的且つ例的にいくらか詳細に記載され て来たが、一定の変更及び修飾が本発明の範囲内で実施され得ることは明白であ ろう。 例 １ 例１は、構成プロモーターを用いての部分バルナーゼ遺伝子の合成を記載する 。 Ｂ．アミロリクイファシエンス（B．amyloliquifaciens）からの完全なバルナ ーゼコード配列は、受託番号M14442としてGenBankから入手できる。Paddon & Ha rtley，Gene 40:231-239(1986);Paddonなど.，J.Bacteriol．171:1185-1187（19 89）。プロＩバルナーゼを切断し、プロIIバルナーゼ(位置391〜735)を形成し、 この後、それを再び切断し、110個のアミノ酸から成る成熟ペプチドを形成する 。機能的バルナーゼを付与するために結合する完全な非機能的ペプチドをコード する２種のコード配列を生成するために、２対のPCRプライマーを合成した。PCR 増幅を、Taq DNAポリメラーゼ、個々の対のプライマー、及びバシラス アミロ リクイファシエ ンス株ATCC #23842から単離された染色体DNAを用いて、製造業者の推薦した条件 に従って実施した。細菌DNAを、標準方法を用いて単離した。 個々のフラグメントの５’側末端でNcoＩ部位及び３’側末端でXbaＩ部位を有 するよう合成された、５’側部分コード配列（bn５）及び３’側部分コード配列 （bn３）を含んで成るその得られるフラグメントを、ゲル精製した。NcoＩ及びX baＩによる消化の後、個々のフラグメントをプラスミドpNG5104中にクローン化 し、そしてβ−ガラクトニダーゼ（uidA）遺伝子のコード配列をNcoＩ−XbaＩ消 化により除去し、そして得られる大きなフラグメントをゲル精製した。得られる 遺伝子は、SpMasプロモーター(Gelvingなど.，1995)及びコクトピン シンター ゼ遺伝子の３’側ポリアデニル化領域に作用可能に連結される個々の部分コード 配列を有する。挿入されたフラグメントのサイズをゲル電気泳動により確かめ、 そして５’側遺伝子(SpMas-bn5)及び３’側遺伝子(SpMas-bn3)の個々についての 少なくとも２つのクローンを、配列分析のために選択した。その配列を個々の遺 伝子のために確かめ、そして得られるプラスミドをpER4013（SpMas-bn5）及びpE R4022（SpMas-bn3）と命名した。bn5コード配列は、成熟バルナーゼタンパク質 のアミノ−末端アラニンの前に付加されたメチオニン、及びカルボキシ−末端ト リプトファン（成熟タンパク質位置35）を有するペプチドをコードする。bn３コ ード配列は、バルナーゼ成熟タンパク質位置36のバリンの代わりの開始メチオニ ン、及び正しいカルボキシ−末端アルギニン(成熟タンパク質位置110)を有する ペプチドをコードする。 例 ２ 例２は、植物細胞における致死機能の再構成のためのバイオリスティク（Biol listic）アッセイを記載する。 細胞致死性の再構成を、SpMas-LUCキメラ遺伝子を含んで成るファージミドpLV C320のDNAと共に、pER4013及びpER4022ファージミドDNAの混合物により、植物の 葉に衝撃を与えることによってアッセイした。対照として、pER4013及びpLVC320 をバイオリスティク的に供給し、そしてpER4022及びpLVC320をバイオリスティク 的に供給した。プラスミドDNAを、それらのファージミドにおける複製のM13起点 を用いて、一本鎖環状分子として調製した。分光測定法によりDNA濃度を決定し た後、個々のプラスミドの濃度を、10mMのトリス−１mMのEDTA（pH8.0）におい て400μｇ／μｌに調節した。 プラスミドDNAを、標準方法に従って混合し、そして個々のDNA混合物80μｌと 、Ｍ17タングステン粒子（無菌水において100mg／ml）40μｌ、100mMのスペルミ ジン40μｌ、及び2.5ＭのCaCl₂ 100μｌとを、連続して混合することによって、 タングステン粒子上に被覆した。回転混合した後、粒子を氷上で５分間維持し、 その後、粒子を、20秒間の遠心分離により集めた。上清液を除去し、そして粒子 を70％エタノール100μｌに懸濁した。 衝撃を、Finer及び彼の同僚のParticle Inflow Gunに基づく装置を用いて実施 した。No.４コルク穿孔器により調製され、そしていづれの植物ホルモンも含ま ないMurashige and Skoog培地上の無菌GF／Aフィルターディスク上に置かれた無 菌トマトの葉ディスクを、粒子調製物６μｌにより衝撃を与えた。その粒子調製 物をSwinneyフィルターの底の表面にピペットで流しこんだ。次に、これを、バ イオリスティクチャンバーの上部でヘリウム線に達するまで、Swinneyフィルタ ーの上部半分に結合せしめた。ヘリウムタンクにおいて200psiの圧力を用いて、 プレチャンバーをヘリウムにより負荷した。バイオリスティクチャンバーにおい て29インチHgの圧力を下 げた後、プレチャンバー内のヘリウムガスを開放し、Swinneyユニットから12cm 離れた位置に置かれたペトリ皿における寒天の表面上に粒子を発射した。葉ディ スクを、ルシフェラーゼアッセイを実施する前、22℃で16時間インキュベートし た。 ルシフェラーゼアッセイを、連続的な光子開放を長くするために、エネルギー 源としてＳ−アデノシル−メチオニン(SAM)を用いて、Promegaに従って実施した 。植物の葉抽出物を、細胞溶解緩衝液において調製し、そして次に、氷上で貯蔵 した。ルシフェリン及びSAMを含むアッセイ溶液40μｌを有するアッセイ管を室 温で２分〜５分間、プレインキュベートし、その後、抽出物10μｌの添加により 反応を開始した。混合の後、すぐに管をBeckmanシンチレーションカウンターLS6 800に移し、そして光の発光を、単一光子計数プログラム（特別プログラム番号 ６）を用いて検出した。光の発光を、光子（又は計数）／分(cpm)として決定し 、この後、反応における10μｌの抽出物緩衝液を用いて決定されたバックグラウ ンドを引き算した。 表１におけるルシフェラーゼアッセイ結果は、cpm／葉ディスクとして報告さ れる。SpMas-bn5とSpMas-bn3との組合せは、SpMas-bn5のみと比較して、ルシフ ェラーゼ活性の84％低下をもたらし、そしてSpMas-bn3のみと比較して、71％の 低下をもたらす。これは、同じ細胞における別々のbn５及びbn３ペプチドの発現 による細胞致死機能の再構成を示す。類似する結果が表２〜４に報告される。 表１．例２に記載のようなcpm／葉ディスクとして報告されるルシフェラーゼ活 性。バイオリスティク的に導入された個々の構造体は、ルシフェラーゼレポータ ー構造体と共に導入された。 表２．cpm／葉ディスクとして及び８枚の葉ディスクの平均として報告されるル シフェラーゼ活性。バイオリスティク的に導入された個々の構造体は、例２に記 載されるように、ルシフェラーゼレポーター構造体と共に導入された。技術的理 由のために測定されなかったサンプルは“損失”として報告される。表３．cpm／葉ディスクとして及び８枚の葉ディスクの平均として報告されるル シフェラーゼ活性。バイオリスティク的に導入された個々の構造体は、例２に記 載のようなルシフェラーゼレポーター構造体と共に導入された。 表４．cpm／葉ディスクとして及び８枚の葉ディスクの平均として記録されたル シフェラーゼ活性。バイオリスティク的に導入される個々の構造体は、例２に記 載のようなルシフェラーゼレポーター構造体と共に導入された。技術的理由のた めに測定されなかったサンプルは“損失”として報告される。 例 ３ 例３は、強い構造プロモーターの制御下でアミノ−末端バルナーゼ部分ペプチ ド及びカルボキシ−末端バルナーゼ部分ペプチドを発現するタバコ系を記載する 。 pER4013におけるSpMas-bn5遺伝子を、カナマイシン又はG418に対する耐性を付 与するために選択マーカーとしてnptII遺伝子を有する、T-DNAベクターpWTT2200 のSmaＩ部位中にPvuIIフラグメントとして再クローン化する。pER4022におけるS pMas-bn3遺伝子を、クロルスルフロンに対する耐性を付与するために選択マーカ ーとしてALS遺伝子を有する、T-DNAベクターpNG5185のSmaＩ部位中にPvuIIフラ グメントとして再クローン化する。 ベクターのみの対照と共に、個々の構造体を、標準の葉ディスク形質転換方法 を用いて、ニコチアナ タバキュウム（Nicotiana tabaccum）品質プチットHava na中に別々に導入する。SpMas-bn5及びSpMas-bn3トランスジーンを担持するいく つかの独立したトランスジェニック個体を、ノザン分析により発現についてアッ セイする。 個々の種類からの３種の独立したトランスジェニック個体を、高い発現体として 選択し、そして個々の対照形質転換体種類のうち３種をまた選択する。交雑を、 １）SpMas-bn5トランスジェニック植物とpNG5185トランスジェニック植物との間 で、２）SpMas-bn3トランスジェニック植物とpWTT2200トランスジェニック植物 との間で、及び３）SpMas-bn5とSpMas-bn3トランスジェニック植物との間で行な う。第３組の交雑においてのみ、機能的細胞致死機能が、SpMas-bn5及びSpMas-b n3遺伝子の両者を担持するそれらの細胞において発現される。これは、子孫集団 の１／４を表わす。 従って、交雑（１）及び（２）においては、カナマイシン耐性、クロルスルフ ロン耐性及び二重耐性子孫が予測され、そしてその二重耐性接合体はバルナーゼ 活性の再構成により殺害される。 例 ４ 例４は、種子被膜において発現されるプロモーターの制御下でアミノ末端バル ナーゼ部分ペプチド及びカルボキシ−末端バルナーゼ部分ペプチドを発現するタ バコ系を記載する。 例１に記載のようにして、bn５及びbn３コード配列を、スイカから単離され、 そしてpWM403として知られている種子被膜プロモーターにそれぞれ作用可能に連 結するキメラ遺伝子を調製する。WM403遺伝子の転写の開始の前の領域の２kbpフ ラグメントを、個々のキメラ遺伝子のために使用する。個々のbn５及びbn３キメ ラ遺伝子を、上記例３に記載のようにして、それぞれ植物二元ベクターpWTT2200 及びpNG5185中にクローン化する。個々の種類からの３種の独立したトランスジ ェニック個体を高い発現体として選択し、そして個々の対照形質転換体種類（ベ クターのみ）からの３種のトランスジェニック個体をまた選択する。交雑を、１ ）pWM403-bn5トランスジェニック植物とpNG5185トランスジェニック植物との間 で、２）pW M403-bn3トランスジェニック植物とpWTT2200トランスジェニック植物との間で、 及び３）pWM403-bn5とpWM403-bn3トランスジェニック植物との間で行なう。クロ ルスルフロン及びカナマイシンの両者に対して耐性の子孫植物を選択し、そして 種子及び種子被膜成長の評価のために成熟せしめる。 例 ５ 例５は、種子被膜において発現される２種の異なったプロモーターの制御下で 、アミノ−末端バルナーゼ部分ペプチド及びカルボキシ−末端バルナーゼ部分ペ プチドを発現するタバコ系を記載する。 例１に記載されるように、bn５及びbn３コード配列を、タバコから単離され、 そしてpT218(Fobertなど.，The Plant Journal 6:567-77(1994))として知られて いる種子被膜プロモーターに作用可能にそれぞれ報告するキメラ遺伝子を調製す る。T218プロモーター２kbpフラグメントを、個々のキメラ遺伝子のために使用 する。例４に記載されるように、bn５及びbn３キメラ遺伝子を、それぞれ植物二 元ベクターpWTT2200及びpNG5185中にクローン化する。高い発現性のトランスジ ェニック個体を、例４に記載のようにして同定する。交雑を、１）pT218-bn5ト ランスジェニック植物とpNG5185トランスジェニック植物との間で、２）pT218-b n3トランスジェニック植物とpWTT2200トランスジェニック植物との間で、３）pT 218-bn5とpWM403-bn3トランスジェニック植物との間で、及び４）pWM403-bn5とp T218-bn3トランスジェニック植物との間で行なう。クロルスルフロン及びカナマ イシンの両者に対して耐性の子孫植物を選択し、そして種子及び種子被膜成長の 評価のために成熟せしめる。 例 ６ 例６は、じゅうたん組織細胞において発現されるプロモーターの制御下でアミ ノ−末端バルナーゼ部分ペプチド及びカルボキシ末端 バルナーゼ部分ペプチドを発現するタバコ系を記載する。 例１に記載されるように、bn５及びbn３コード配列を、タバコから単離され、 そしてpTA29（Marianiなど.，Nature 347:737-41(1990)）として知られているじ ゅうたん組織−特異的プロモーターに作用可能にそれぞれ連結するキメラ遺伝子 を調製する。例４に記載されるように、bn５及びbn３キメラ遺伝子を、それぞれ 植物二元ベクターpWTT2200及びpNG5185中にクローン化する。高い発現性のトラ ンスジェニック個体を、例４に記載のようにして同定する。交雑を、１）pTA29- bn5トランスジェニック植物とpNG5185トランスジェニック植物との間で、２）pT A29-bn3トランスジェニック植物とpWTT2200トランスジェニック植物との間で、 及び３）pTA29-bn5とpTA29-bn3トランスジェニック植物との間で行なう。クロル スルフロン及びカナマイシンの両者に対して耐性の子孫植物を選択し、そして種 子及び種子被膜成長の評価のために成熟せしめる。 例 ７ 例７は、コリシンＥ７ヌクレアーゼ機能に基づく二成分システムの開発につい て記載する。 配列の後方の210個のアミノ酸に対する広範囲な配列相同性を共有する４種の コリシンについての遺伝子配列は知られており、そして前記コリシンのアミノ末 端部分は非常に異なっている。コリシンのカルボキシ末端の約15,000ドルトンの 領域は、ヌクレアーゼがアミノ末端領域を通して標的化される細胞の細胞死に関 与することが知られている非特異的ヌクレアーゼ機能を含んで成る。それらの配 列の一列配列は、高い可変性であるカルボキシ末端からのアミノ酸65−35に位置 する約30個のアミノ酸の領域を示す。コリシンのカルボキシ末端からのアミノ酸 残基のこの領域内に、メチオニン残基55が存在する。 コリシンＥ７の既知の配列に基づけば、５’側コード配列は、カルボキシ末端 からの位置135残基に位置するロイシンコドンの代わりにメチオニンコドン、及 びカルボキシ末端からの残基55でのメチオニンコドンの代わりに挿入される停止 コドンを組込むことによって、ポリメラーゼ鎖反応を通して創造される。３’側 コード配列は、開始コドンとしてカルボキシ末端からの残基55でのメチオニンコ ドン、及びコリシンＥ７情報の通常の停止コドンを用いて、ポリメラーゼ鎖反応 を通して創造される。他の二成分候補体は、類似する態様で製造されるが、しか し１）５’側コード配列のための停止コドン及び３’側コード配列のためのメチ オニンコドンにより、カルボキシ末端からの位置４８残基でのトレオニンを置換 し、又は２）５’側コード配列のための停止コドン、及び３’側コード配列のた めのメチオニンコドンにより、カルボキシ末端からの位置43残基でのバリンを置 換する。類似するアミノ酸置換が、広範囲の他の候補体二成分システムを製造す るために同じ領域において行なわれる。 個々の対のコード配列を、例１に記載のようにして、植物細胞において構成的 に発現される遺伝子を創造するためにSpMasプロモーターを有するベクター中に クローン化する。次に、前記対の候補体遺伝子を、例２に示されるように、別々 に、又は組合して、植物葉ディスク中にバイオリスティク的に導入する。 例 ８ 例８は、植物細胞における致死機能の再構成のための二成分システムを記載す る。 例８Ａ：例８Ａは35Ｓプロモーターを用いての２種の部分バルナーゼ遺伝子（ bn３及びbn５）のサブクローニング、及び増強された35Ｓプロモーターを用いて のバルナーゼ遺伝子のサブクローニングを記載する。 35Ｓプロモーターに作用可能に連結された部分bn３及びbn５遺伝子を、次の態 様でサブクローンした。プラスミドpER4013（SpMAS-bn5、バルナーゼ遺伝子bn５ をコードする）及びpER4022（SpMAS-bn3、バルナーゼ遺伝子bn３をコードする） を、NcoＩ及びXbaＩにより消化し、そしてbn５及びbn３コード領域に対応するフ ラグメントをゲル精製した。35S-Gus合成遺伝子を含むプラスミドpEL5051を、Nc oＩ及びXbaＩにより消化し、GUSコード領域を切り出した。35Ｓプロモーターを 含む、pEL5051からの残るNcoＩ／XbaＩフラグメントをゲル精製した。次に、bn ３及びbn５フラグメントを、35Ｓプロモーターにそれぞれ連結される、bn３及び bn５をそれぞれコードする、pEL5152及びpEL5161を製造するために、pEL5051の このNcoＩ／XbaＩフラグメント中にそれぞれ別々にクローンした。 増強された35Ｓプロモーターに作用可能に連結されたバルスター遺伝子を次の 態様でサブクローンした。バシラス アミロリクイファシエンスからの完全なバ ルスターコード配列を、受託番号X15545としてGenBankから入手する（Hartley， J.Mol.Biol．202:913-915(1988)）。最初に、バルスターの完全なコード配列を 得た。前記完全な機能的バルスターを含むコード配列を生成するために、バルス ターコード配列の末端に対応するPCRプライマーを製造した。それらのプライマ ーは、５’側末端でのBspHＩ及び３’側末端でのXbaＩのための追加の制限部位 を含んだ。それらのプライマーを、製造業者の推薦に従って、TAQ DNAポリメラ ーゼと共にバシラス アミロリクイファシエンスゲノムDNAを用いてのPCR増幅の ために使用した。バシラス アミロリクイファシエンス株ATCC No．23842染色体 DNAを、標準の方法に従って単離した。PCRフラグメントをBspHＩ及びXbaＩによ り消化し、そしてバルスターコード配列を有するフラグメントをゲル精製し、そ してNcoＩ及びXbaＩにより消化 されたpUC20中にクローンした。 少なくとも２種のプラスミドを、正しいサイズの挿入体バンドを有するものと して制限消化により同定した。それらのプラスミドを配列決定し、そして正しい バルスター配列を有する１つのプラスミドをpNG5011と命名した。プラスミドpNG 5011を、上記のような第２回目のPCR精製のためのDNA源として使用し、但し、Ve nt DNAポリメラーゼを使用した。得られるフラグメントをゲル精製し、そしてEc oRＶ−消化されたpBluescriptプラスミド中にクローンした。正しいサイズのフ ラグメントを有するものとして制限消化により同定された少なくとも２種のプラ スミドを配列決定し、そして正しいバルスター配列をそれらのクローンの少なく とも１つのために確かめた。このプラスミドをpBH4004と命名した。プラスミドp BH4004をBspHＩ及びXbaＩにより消化し、そしてバルスターに対応するフラグメ ントをゲル精製した。 ２番目に、増強された35Ｓプロモーターを得た。プラスミドpKL3049は、XbaＩ 制限部位でNOS３’領域に連結される、キチナーゼコード配列ChiAにNcoＩ制限部 位で結合される、35Ｓエンハンサー領域の２つのコピーを有する35Ｓプロモータ ー（このプロモーターは、e35S又は増強された35Ｓと命名される）から成る合成 遺伝子を含む。プラスミドpKL3049をNcoＩ及びXbaＩにより消化し、そしてe35S プロモーターを含むフラグメントゲル精製した。e35Sプロモーターを含むこのゲ ル精製されたフラグメントを、上記ゲル精製されたバルスターフラグメントに連 結し、そして得られるプラスミドをpSG5351と命名し、これはe35S−バルスター 合成遺伝子を構成する。 例８Ｂ：例８Ｂは、植物細胞における致死機能の再構成のためのバイオリステ ィクアッセイを記載する。この例は、致死機能が再構 成されたバルナーゼのRNアーゼ活性によることを示す。この再構成は、バルスタ ー、すなわちバルナーゼのRNアーゼ活性の特異的インヒビターの同時発現による この致死機能の特異的低下により示された。 細胞致死性の再構成は、35S-LUCキメラ遺伝子を含んで成る、プラスミドpJJ37 92のDNAと共に、pEL5152及びpEL5161プラスミドDNAの混合物により植物葉に衝撃 を与えることによってアッセイされた。この再構成された活性がバルナーゼのRN アーゼ活性の阻害に対して応答性であることを示すために、植物の葉に、pJJ379 2と共に、pEL5152，pEL5161、及びpSG5351の混合物により衝撃を与えた。対照と して、pEL5152，pEL5161及びpSG5351を、pJJ3792と共に別々にバイオリスティク 的に供給した。 プラスミドDNAを、２回のCsCl密度グラジエント遠心分離により精製された二 本鎖環状分子として調製した。分光光度計によるDNA濃度の測定の後、個々のプ ラスミドの濃度を、10mMのトリス、１mMのEDTA（pH8.0）の溶液において400mg／ mlに調整した。プラスミドを例２に記載のような標準の方法に従って混合し、但 しそれぞれDNA混合物40μｌを、タングステン粒子20μｌ、100mMのスペルミジン 20μｌ及び2.5ＭのCaCl₂50μｌと共に混合した。遠心分離の後、粒子を70％エタ ノール50μｌに懸濁した。40μｌのDNA混合物は、４μｌのpJJ3792及び12μｌの pEL5152，pEL5161又はpSG5351を別々に、又は一緒に含んだ。CsCl精製されたフ ィルターDNAを用いて、個々のサンプルのための体積を40μｌにした。 衝撃は例２に記載のようにして実施され、但しタバコの葉ディスクが使用され 、そしてヘリウム圧力は150psiであった。ルシフェラーゼアッセイを例２に記載 のようにして実施し、但し植物の葉抽出物を200μｌの細胞溶解緩衝液(Cell Lys is Buffer)(Promega)に おいて調製し、サンプルを遠心分離し、そして次に、上清液20μｌを100μｌの 細胞溶解緩衝液に希釈した。アッセイは、40μｌのアッセイ溶液及び５μｌの希 釈された植物抽出物を使用した。典型的なアッセイ結果は、表５に示され、そし て処置当たり10枚の葉ディスクについての平均cpmとして報告される。 35S-bn5及び35S-bn3の組合せは、３種の対照の平均に比較して、ルシフェラー ゼ活性の86％の低下をもたらした。35S-bn3及び35S-bn5へのe35S−バルスターの 添加は、対照の平均の48％にルシフェラーゼ活性の回復をもたらした。この結果 は、同じ細胞におけるbn５及びbn３の発現により再構成される細胞致死機能がバ ルナーゼのRNアーゼ活性であることを示す。 表５．タバコの葉ディスク当たりのcpmとして及び10枚のタバコの葉ディスクに ついての平均cpmとして記録されたルシフェラーゼ活性。値は、（測定されたcpm −バックグラウンド）×0.001である。 例 ９ 例９は、部位−特異的突然変異誘発を通しての二成分システムの機能の改良を 記載する。 例９Ａ：例９Ａは、増強された安定性のための突然変異誘発されたペプチドを コードするキメラ遺伝子の構成を記載する。 bn５遺伝子に関しては、特異的ヌクレオチド変化は、そのアミノ酸配列がMAQV INTFDGVADYLOTYHKLPDNYITKSEAQALGWからMAQVINTFDGVADYLIRYHKLPDNYITKSEAQALGW に変更されるよう導入された。bn５の位置16でのグルタミン残基（成熟バルナー ゼタンパク質の位置15）がイソロイシン残基により置換され、そしてbn５の位置 17でのアルギニン残基（成熟バルナーゼタンパク質の位置16）がアルギニン残基 により置換された（変化は下線が引かれている）。bn３配列に関しては、特異的 ヌクレオチド変化が、そのアミノ酸配列がMASKG NLADVAPGKSIGGDIFSNREGKLPGKSGRTWREADINYTSGFRNSDRILYSSDWLIYKTTDHYQTFTKIRか らMASKGNLADVAPGKSIGGDIFSNRESKLPGKSGRTWREADINYTSGFRNSDRILYSSDWLIYKTTDHYQT FTRIRに変更されるよう導入された。bn３の位置30でのグリシン残基（成熟バル ナーゼタンパク質の位置65）がセリン残基により置換され、そしてbn３の位置73 でのリシン残基(成熟バルナーゼタンパク質の位置108)がアルギニン残基により 置換された（変化は下線が引かれている）。 ヌクレオチド変化は、例１の同じ一般的方法を用いて、PCRにより導入された 。修飾されたbn５配列を創造するために、２種のPCR反応を、鋳型としてバルナ ーゼコード配列−含有プラスミドを用いて実施し、ここで１つの反応は下記プラ イマーNC207及びNC225を用い、そしてもう１つの反応は下記NC224及びNC143を用 いる： 得られるDNAフラグメントをゲル精製し、そして次に、一緒に混合し、その後 、プライマー対NC207及びNC143とのPCR反応を実施した。得られるフラグメント を、HindIIIにより消化し、フラグメント同一性を確認し、そして次に、NcoＩ及 びXbaＩにより消化し、その後、pUC120中にクローニングした。bn５（bn５−２ ）の十分な修飾されたコード配列を含んで成る、得られるプラスミドを、pAR455 4と命名した。クローンされたフラグメントを配列決定した。 修飾されたbn３配列を創造するために、２種のPCR反応を、鋳型としてバルナ ーゼコード配列−含有プラスミドを用いて実施し、ここで１つの反応は下記プラ イマーNC144及びNC221を用い、そして他の１つの反応は下記プライマーNC222及 びNC223を用いる 得られるDNAフラグメントをゲル精製し、そして次に、一緒に混合し、その後 、プライマー対NC144及びNC223とのPCR反応を実施した。得られるフラグメント をNotＩにより消化し、フラグメント同一性を確認し、そして次に、NcoＩ及びXb aＩにより消化し、その後、pUC120中にクローニングした。bn３（bn３−２）の 十分な修飾されたコード配列を含んで成るその得られるプラスミドを、pAR4561 と命名した。クローンされたフラグメントを配列決定した。 植物において、修飾されたbn５及び修飾されたbn３ペプチドを構成的に発現す るキメラ遺伝子を創造するために、プラスミドpAR4554及びpAR4561をNcoＩ及びX baＩにより消化し、適切なフラグメントをゲル精製し、そして個々をプラスミド pEL5051中に挿入し、そしてNcoＩ−XbaＩ消化により除去されたβ−グルクロニ ダーゼ（uidA）遺伝子のコード配列をbn５−２及びbn３−２コード配列により置 換し、そして得られる大きなフラグメントをゲル精製した。得られるキメラ遺伝 子は、CaMV 35Sプロモーターに作用可能に連結される個々の部分コード配列、及 びオクトピンシンターゼ遺伝子の３’側ポリアデニル化領域を有する。挿入され たフラグメントのサイズを、アガロースゲル電気泳動により確かめた。キメラbn ５−２遺伝子を含むプラスミドをpEL5061と命名し、そしてキメラbn３−２遺伝 子を含むプラスミドをpEL5071と命名した。 例９Ｂ：例９Ｂは、植物細胞において、修飾されていないペプチドに比較して 、２種の修飾されたペプチドの活性を決定するための バイオリスティクアッセイを記載する。 リボヌクレアーゼ活性の再構成を、２種の部分遺伝子と個々に比較して、２種 の部分遺伝子の同時バイオリスティク供給により、例８に記載のようにしてアッ セイする。これは、DNA供給のための標的物として若いタバコ植物の葉組織によ る一回の実験で行なわれる。典型的な実験からのデータは、表６に示される。修 飾されたバルナーゼフラグメントが同じ細胞において発現された場合、ルシフェ ラーゼ活性は、４種の対照の平均の19％に減じられた。修飾されていないバルナ ーゼフラグメントが同じ細胞において発現された場合、ルシフェラーゼ活性は、 ４種の対照の平均の56％以下に減じられた。 表６．タバコの葉ディスク当たりのcpmとして、及び処理当たり11枚の葉ディス クについての平均として記録されるルシフェラーゼ活性。データは、（測定され たcpm−バックグラウンド）×0.001として報告される。 リボヌクレアーゼ活性の再構成をまた、DNA供給のための標的物として若いコ ショウ植物の葉組織によりアッセイした。１回の実験からのデータは、表７に示 される。修飾されたバルナーゼフラグメントが同じ細胞において発現された場合 、ルシフェラーゼ活性は、４種の対照の平均の９％に減じられた。修飾されてい ないバルナーゼフラグメントが同じ細胞において発現された場合、ルシフェラー ゼ活性は、４種の対照の平均の60％に減じられた。 表７．コショウ植物の葉ディスク当たりのcpm−バックグラウンドとして及び処 理当たり８枚の葉ディスクの平均として記録されたルシフェラーゼ活性。データ は、（測定されたcpm−バックグラウンド）×0.001として報告される。 例９Ｃ：例９Ｃは、植物細胞における修飾されていないペプチドと比較しての ２種の修飾されたペプチドの相対的活性を決定するためのバイオリスティクアッ セイを記載する。 DNA供給のために使用される２種の修飾された部分遺伝子の低下する量での希 釈実験を行なった。これは、例８に記載されるように、DNA供給のための標的物 として若いコショウ植物の葉組織による一回の実験で行なわれた。典型的な実験 からのデータは表８に示される。修飾されたバルナーゼフラグメントbn５−２及 びbn３−２は、２，６及び18μｌで一緒に使用される場合、４種の対照の平均値 のルシフェラーゼ活性の60％、17％、及び９％を有する。修飾されていないバル ナーゼフラグメントbn５及びbn３は、18μｌで一緒に使用される場合、４種の対 照の平均値のルシフェラーゼ活性の60％を有する。修飾された部分遺伝子の量の 約10％は、２種の修飾されていない部分遺伝子の標準量と比較して、LUC活性の 同等の低下を付与する。類似するデータが、この実験が反復される場合に得られ た。 表８．コショウの葉ディスク当たりのcpmとして及び処理当たりの８枚の葉ディ スクの平均として記録されるルシフェラーゼ活性。データは、（測定されたcpm −バックグラウンド）×0.001として報告される。 実験９Ｄ：実験９Ｄは、エンドウのさや組織における修飾されていないペプチ ドに比較しての２種の修飾されたペプチドの活性を決定するためのバイオリステ ィクアッセイを記載する。 エンドウのさや組織におけるリボヌクレアーゼ活性の再構成を、フィルターDN Aのみの対照と比較して、２種の部分遺伝子の同時のバイオリスティク供給によ り、例８に記載のようにしてアッセイした。これは、DNA供給のための標的物と して未熟のエンドウのさやの内面からの組織による一回の実験で行なわれた。典 型的な実験からのデータは、表９に示される。修飾されたバルナーゼフラグメン トが同じ細胞において発現される場合、ルシフェラーゼ活性は、L uc対照の２％に低められる。 表９．エンドウのさやディスク当たりのcpmとして及び処理当たり12枚のディス クの平均として記録されるルシフェラーゼ活性。データは、（測定されたcpm− バックグラウンド）×0.001として報告される。 例９Ｅ：例９Ｅは、エンドウ種子被膜組織における修飾されていないペプチド と比較しての２種の修飾されたペプチドの活性を決定するためのバイオリスティ クアッセイを記載する。 エンドウ種子被膜組織におけるリボヌクレアーゼ活性の再構成を、フィルター DNAのみの対照のルシフェラーゼ活性と比較しての２種の部分遺伝子の同時バイ オリスティク供給により、例８に記載の ようにしてアッセイした。これは、DNA供給のための標的物として未熟のエンド ウ種子（直径0.9cm以下）からの組織による一回の実験により行なわれた。１回 の実験からのデータは表10に示される。修飾されたバルナーゼフラグメントが同 じ細胞において発現される場合、ルシフェラーゼ活性はLuc対照の２％に低めら れた。 表10．エンドウ種子被膜当たりのcpmとして及び処理当たり６枚のディスクの平 均として記録されるルシフェラーゼ活性。データは（測定されたcpm−バックグ ラウンド）×0.001として報告される。 例 10 例10は、２種の部分遺伝子がアグロバクテリウムによりタバコ細胞中に導入さ れる場合、細胞致死性が生じることを記載する。 たとえば例９Ａに記載されるように、bn５及びbn３キメラ遺伝子を担持するプ ラスミドを消化し、キメラ遺伝子自体を分離する。そのキメラ遺伝子を、T-DNA ベクターにおける適切な制限部位でそれぞれ挿入する。 さらに、バルナーゼ活性の細菌発現を妨げるためにイントロンにより破壊され たバルナーゼコード配列を有する対照の致死性遺伝子 を使用する。たとえば、Vancanneytなど.，Mol.Gen.Genet．220:245-50(1990)に より使用されるst-1s ivs2イントロンを、成熟バルナーゼタンパク質の位置36で バリンコドン中に挿入する（バルナーゼ遺伝子の位置37が、成熟バルナーゼタン パク質のアラニン残基の前のメチオニン残基の付加のために、本明細書において 使用される）。キメラ遺伝子を、CaMV 35Sプロモーター及び３’末端でのオクト ピンシンターゼ３’側未翻訳領域に作用可能に連結されるイントロンと共にバル ナーゼコード配列を用いて構成する。適切なT-DNAベクターを、この構造体から 調製する。 若いタバコ葉植物を、１）35S-bn5のみの、２）35S-bn3のみの、３）35S-bn5 ／35S-bn3の同時の、又は４）35Ｓ−バルナーゼINTのアグロバクテリウム−介在 DNA供給のために、標準の技法に従って使用する。それぞれ新鮮なプレートから の、適切なプラスミドを含むアグロバクテリウムコロニーを用いて、10μｇ／ml のテトラサイクリンを含むLB ５mlを接種する。それらの培養物を28℃で48時間 、増殖する。次に、個々の培養物１mlを、20μＭのアセトシリンゴン及び10μｇ ／mlのテトラサイクリンを含むLB 50mlを有する別々のフラスコ中に移す。それ らの培養物を28℃で16時間、増殖せしめる。次に、細胞を30分間、テーブルトッ プ遠心分離器において回転沈殿せしめ、そして細胞を、３％のスクロース、0.5m MのMES、pH5.6及び10μＭのアセトシリンゴンと共にMS塩50mlを含む溶液に懸濁 する。600nmでのODを、１〜1.5に調整する。次に、細胞を室温で３時間までの間 、放置し、その後、葉に注射する。 長さ７〜10cmのタバコの葉の裏面上のみにニックを入れ、そしてアグロバクテ リウム細菌を、アグロバクテリウムにより１mlの注射器を満たし、そしてその注 射器の先端（針は有さない）をニックに対してきつく配置することによって、葉 中に浸透せしめる。圧力を 注射器のピストンに適用し、そして中間−肋と２つの側部葉脈との間の葉におけ るセクターに、アグロバクテリウム溶液を注入する。溶液が導入される場合、緑 色から暗緑色への葉の色の変化によりアグロバクテリウム溶液の導入をモニター することができる。 室温での約５日間のインキュベーションの後、細胞の死が、退緑化、及び褐色 化、続く完全な組織の破壊により観察される。bn５もbn３キメラ遺伝子も、個々 においては、細胞の死を生ぜしめない。しかしながら、bn５及びbn３キメラ遺伝 子が一緒に導入される場合、又は損なわれていないバルナーゼINTが導入される 場合、細胞の死が観察される。細胞の死の正確なタイミングは異なる。 例 11 例11は、じゅうたん組織細胞におけるバルナーゼの発現を誘発するためへのリ プレッサー／活性化因子融合タンパク質の使用を記載する。 この方法は、図１に図解される。維持現場において、雄性稔性である副系Ａ₁ 及びＡ₂が、雄性不稔性である系Ａを生成するために交雑される。副系Ａ₁は１又 は複数のtetオペレーター及びTATA−ボックスから成る人工プロモーターと共に 優性雄性不稔性遺伝子（Ms）を有する。この条件下で、雄性不稔性遺伝子は転写 されず、そして副系Ａ₁は雄性稔性である。副系Ａ₂は、キメラ転写活性化因子の 発現を駆動するじゅうたん組織−特異的プロモーターを有する。この転写活性化 因子は、tetオペレーターを認識するtetリプレッサーを、真核活性化ドメイン、 すなわち単純ヘルペスウィルスからのビリオンタンパク質16（VP16）活性化ドメ インに融合せしめることによって製造される。このtetリプレッサー／VP16活性 化因子融合体（“Act”として略図において略語化されている）は、最小プロモ ーター及び７個のtetオペレーターから植物において転写を活 性化することが、Weinmannなど．(1994)により示されている。副系Ａ₁及びＡ₂を 交雑し、じゅうたん組織において特に発現される転写活性化因子(Act)及びtetオ ペレーターMs遺伝子の両者を含むので、雄性不稔性である系Ａ₁を生成する。前 記転写活性化因子は、特にじゅうたん組織において雄性不稔性遺伝子の発現を誘 発するtetオベレーターに結合する。Ms遺伝子、たとえばリボヌクレアーゼ（た とえば、バルナーゼ）のじゅうたん組織−特異的発現は、雄性不稔性を生成する ことが示されている。ハイブリッド種子生成現場においては、次に、雄性不稔性 である系Ａが、いづれかの系Ｂに交雑され、ハイブリッド種子が生成される。 多くの収穫物においては、雄性稔性であることが、生成されるハイブリッドの ためには好都合である。これはまた、図１にも示されており、これは、１つの遺 伝子座で２種の選択的対立遺伝子を創造するためにcre／loxシステムの使用を示 しており、ここで前記１つの対立遺伝子(Ａ₁)はtetオペレーター−Ms遺伝子から 成り、そして他の対立遺伝子(Ａ₂)はじゅうたん組織−特異的プロモーターを追 い払われたリプレッサー／VP16活性化因子から成る。初期形質転換体は、じゅう たん組織−特異的プロモーターとtetリプレッサー／VP16活性化因子との間に反 対の配向で挿入されたtetオペレーター−Ms遺伝子を有する。Lox部位は、tetオ ペレーター−Ms挿入体の両側上で、同じ配向で配置される。この系におけるtet リプレッサー／活性化因子は、挿入体がじゅうたん組織−特異的プロモーターと tetリプレッサー／活性化因子との間に存在するので、サイレントである。Ms遺 伝子はまたサイレントであるが、しかしtetリプレッサー／活性化因子を担持す る系への交雑に基づいて活性化される。系Ａ₂は、cre組換え酵素（バクテリオフ ァージＰ１からの）を担持する系に系Ａ₁を交雑することによって創造される。C re 組換え酵素はtetオペレーター−Ms遺伝子を切断し、じゅうたん組織におけるリ プレッサー／活性化因子の発現を可能にする。ホモ接合性にされる場合、これは 系Ａ₂として使用される。 例 12 例12は、クラドスポリウム フルバムからのAVR9誘発体ペプチド、及びその対 応する耐性遺伝子、すなわちリコペルシコン エスキュレンタムからのCf９の、 じゅうたん組織細胞を特異的に殺害するためへの使用を記載する。 この態様を用いてハイブリッド種子を生成するための方法は、図２に図示され ている。維持者現場においては、雄性稔性である副系Ａ₁及びＡ₂が交雑され、雄 性不稔性である系Ａが生成される。副系Ａ₁においては、クラドスポリウム フ ルバムAvr9無毒性遺伝子が、じゅうたん組織−特異的プロモーター(p172a、アメ リカ特許第5,254,801号に記載される)から発現されている。AVR9ポリペプチドを 、Hammond-Kosackなど．(1994)に記載のようにして、タバコPr1aタンパク質から のシグナルペプチドに融合する。副系Ａ₂においては、トマトCf９遺伝子（その 対応するトマト耐性遺伝子）が、第２のじゅうたん組織−特異的プロモーター（ この表示においては“TA29”）から発現される。副系Ａ₁及びＡ₂の両者は、AVR9 及びCf９ポリペプチドが、別々に発現される場合、細胞の死を付与しないので、 雄性稔性である。しかしながら、副系Ａ₁及びＡ₂が系Ａを生成するために一緒に 交雑される場合、過敏性応答（HR）がじゅうたん組織において開始され、細胞の 死がもたらされる。Hammond-Kosackなど．(1994)及びJonesなど．(1994)は、AVR 9及びCf９の両者を発現する細胞は壊死的になり、そしてCf９発現が細胞−自律 性であることを示している。従って、じゅうたん組織細胞−死は、他の器官に悪 影響を与えないで、雄性不稔性を付与すべきである。Cf９ 及びAvr9を発現するためへの２種の別個のじゅうたん組織−特異的プロモーター の使用は、いくらかの発現がじゅうたん組織の外部で生じ、その組織の死をもた らす危険性を最小にする。ハイブリッド種子生成現場においては、雄性不稔性で ある系Ａが、ハイブリッド種子を生成するために、いづれかの系Ｂに交雑され得 る。 前記例におけるように、cre／loxシステムを用いて、１つの遺伝子座で２種の 選択的対立遺伝子を創造し、ここで１つの対立遺伝子(Ａ₁)はp127a-Avr9遺伝子 を担持し、そして他の１つの対立遺伝子(Ａ₂)はTA29-Cf9遺伝子を担持する。初 期形質転換体は、じゅうたん組織−特異的プロモーターとCf９との間に反対の配 向で挿入されるp127a-Avr9遺伝子を有する。Lox部位は、そのp127a-Avr9遺伝子 の両側上に同じ配向で配置される。ホモ接合性にされる場合、これは系Ａ₁とし て使用される。この系におけるTA29-Cf9遺伝子は、挿入体がじゅうたん組織−特 異的プロモーターとCf９遺伝子との間に存在するので、サイレントである。p127 a-Avr9遺伝子のみが、この系において発現されるであろう。系Ａ₂は、cre組換え 酵素（バクテリオファージＰ１からの）を担持する系に系Ａ₁を交雑することに よって創造される。Cre組換え酵素はp127a-Avr9遺伝子を切断し、TA29-Cf9の発 現を可能にする。ホモ接合性にされる場合、これは系Ａ₂として使用される。 例 13 例13は、植物ゲノム中に前に導入されたlox部位中への２種の機能的発現カセ ットを挿入するためへのcre-loxシステムの使用を記載する。この方法は、切除 に比較して挿入現象の効率を高めるために、Albertなど，Plant J．7:649-659(1 995)により記載のような突然変異lox部位の組合せを使用する。 突然変異lox部位(Albertなど．により記載のようなlox₆₆)を、 creをコードする構造遺伝子に結合されるCaMV35Sプロモーターを有する組換え発 現カセットを用いて所望する植物ゲノム中に導入される。lox₆₆部位を、構造遺 伝子とプロモーターとの間に配置する。次に、この植物からのプロトプラストを 、選択マーカー、たとえばヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(hpt)に連 結される第２突然変異部位(lox₇₁)、及び第１の機能的発現カセット（たとえば 、じゅうたん組織−特異的プロモーターの制御下でのAVR9）を担持するプラスミ ドにより形成転換する。lox部位でのhptの挿入は、選択マーカー（ヒグロマイシ ン耐性）を提供する35S-lox_wt-hptを生成する。野生型lox部位は、２種の突然変 異部位間でのクロスオーバー現象から再構成される。さらなる下流においては、 第２の二重突然変異lox部位が創造され、挿入部位でのクロスオーバー現象を妨 害し、それにより、挿入されたフラグメントの切除を妨げる。さらに、挿入は35 S-cre発現カセットを非機能的にし、それにより、安定した組込みを妨げるcre組 換え酵素の連続した発現を妨げる。 上記工程が、オリジナル植物系、及び第２機能的発現カセット（じゅうたん組 織−特異的プロモーターの制御下でのCF９）を担持する第２プラスミドを用いて 反復される。適切な自家受粉の後、２種の再生された植物組織が創造され、ここ で１つは第１の発現カセットに対してホモ接合性であり、そしてもう１つは第２ の発現カセットに対してホモ接合性である。それらの２種の系間での交雑は、２ 種のタンパク質がじゅうたん組織細胞において特異的に発現されるヘテロ接合性 植物を導びく。 代わりの対立遺伝子を創造するための挿入を用いての代わりの手段は、上記35 S-lox₆₆-cre構造体により１つの植物を、次の成分、すなわちじゅうたん組織− 特異的プロモーターlox₇₁の制御下での lox₇₁-hpt-AVR9を含んで成る構造体により第２の植物を形質転換することである 。２種の植物が交雑される場合、hpt-AVR9配列が挿入のその部位から切除され、 そして35Ｓプロモーターとcre構造遺伝子との間のloX₆₆部位で組込むであろう。 ヒグロマイシン耐性に対する選択が、形質転換された細胞の選択を可能にする。 第１の方法におけるように、前記工程が、じゅうたん組織−特異的プロモータ ーの制御下で、第２発現カセット、すなわちCF９により反復される。適切な自家 受粉及び交雑は、２種のタンパク質がじゅうたん組織細胞において特異的に発現 されるヘテロ接合性植物を導びく。 本明細書に記載される例及び態様は例示目的のためであり、そして種々の修飾 又は変更が当業者により提案され、そして本発明の範囲内で行なわれ得ることが 理解される。本明細書に引用されるすべての出版物、特許及び特許出願は、すべ ての目的のために引用により組込まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，Ｍ Ｘ (72)発明者 ラルストン，エド アメリカ合衆国，カリフォルニア 94523, プレザント ヒル，チョーサー ドライブ 52 (72)発明者 バーゲス，ダイアン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94705, バークレー，ケルシー ストリート 2823

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結され た第１の非構成的植物プロモーターを含んで成る第１発現カセット、及び第２の ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結された第２の非構 成的植物プロモーターを含んで成る第２の発現カセットを含んで成る植物細胞で あって、少なくとも前記第１又は第２の発現カセットが前記細胞に対してヘテロ 接合性であり、そして前記第１及び第２のプロモーターが、異なっているが、し かし前記第１及び第２のポリペプチドが同じ細胞において発現されるようにオー バーラップする特異性を有することを特徴とする植物細胞。 ２．前記第１及び第２のポリペプチドが単一の機能的ポリペプチドの別々の副 配列を個々に含んで成る請求の範囲第１項記載の植物細胞。 ３．前記機能的ポリペプチドがバルナーゼである請求の範囲第２項記載の植物 細胞。 ４．前記第１又は第２のプロモーターが組織−特異的プロモーターである請求 の範囲第１項記載の植物細胞。 ５．第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結され た第１の植物プロモーターを含んで成る第１の発現カセット、及び第２のポリペ プチドをコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結された第２の植物プロモ ーターを含んで成る第２の発現カセットを含んで成る植物細胞であって、前記第 １及び第２のポリペプチドが、単一の機能的ポリペプチドの別々の副配列を個々 に含んで成ることを特徴とする植物細胞。 ６．前記機能的ポリペプチドがバルナーゼである請求の範囲第５ 項記載の植物細胞。 ７．前記第１及び第２のプロモーターが、異なっているが、しかし前記第１及 び第２のポリペプチドが同じ細胞において発現されるようにオーバーラップする 特異性を有する請求の範囲第５項記載の植物細胞。 ８．植物細胞の細胞機能を修飾するための方法であって、 第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結された第 １の非構成的植物プロモーターを含んで成る第１の発現カセット、及び第２のポ リペプチドをコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結された第２の非構成 的植物プロモーターを含んで成る第２の発現カセットを前記細胞中に導入する段 階を含んで成り、ここで前記第１及び第２のプロモーターが、異なっているが、 しかし前記第１及び第２ポリペプチドが同じ細胞において発現されるようにオー バーラップする特異性を有することを特徴とする方法。 ９．前記第１及び第２のポリペプチドが単一の機能的ポリペプチドの別々の副 配列を個々に含んで成る請求の範囲第８項記載の方法。 10．前記機能的ポリペブチドがバルナーゼである請求の範囲第９項記載の方法 。 11．植物細胞における細胞機能を修飾するための方法であって、 第１の非機能的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結 された第１の植物プロモーターを含んで成る第１の発現カセット、及び第２の非 機能的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結された第２ の植物プロモーターを含んで成る第２の発現カセットを、前記植物細胞中に導入 する段階を含んで成り、ここで前記第１及び第２のポリペプチドが単一の機能的 ポリペプチドの別々の副配列を個々に含んで成ることを特徴とする方法。 12．前記機能的ポリペプチドがバルナーゼである請求の範囲第11項記載の方法 。 13．真核細胞の増殖を妨げるための方法であって、 第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結される第 １の組織−特異的プロモーターを含んで成る第１の発現カセット、及び第２のポ リペプチドをコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結された第２の組織− 特異的プロモーターを含んで成る第２の発現カセットを、前記細胞中に導入する 段階を含んで成り、ここで前記第１及び第２のプロモーターが前記細胞において 機能的であり、そして前記第１及び第２のポリペプチドの細胞における存在が細 胞機能を害することを特徴とする方法。 14．２種の相同染色体の個々の上の同じ遺伝子座に位置する第１及び第２発現 のカセットを含んで成る植物細胞を含む植物であって、 第１の染色体相同体上に存在する前記第１の発現カセットが、第１のポリペプ チドをコードする第１のポリヌクレオチド配列に作用可能に連結された第１植物 プロモーターを含んで成り、ここで組換え酵素が前記第１のプロモーターと前記 第１のポリヌクレオチド配列との間に存在し； 第２の染色体相同体上に存在する前記第２の発現カセットが、前記第１のポリ ヌクレオチド配列に非作用可能に連結された前記第１の植物プロモーターを含ん で成り、ここで介在発現カセットが２種の組換え酵素部位を両端に有し、そして 前記第１のプロモーターと前記第２の発現カセットの前記第１のポリヌクレオチ ド配列との間に位置し、前記介在発現カセットが第２のポリペプチドをコードす る第２のポリヌクレオチド配列に作用可能に連結された第２の植物プロモーター を含んで成り；そして 前記第１及び第２のポリペプチドの細胞における存在がその細胞に対して致死 性であることを特徴とする植物。 15．前記組換え酵素部位がlox部位である請求の範囲第14項記載の植物。 16．前記第１のポリペプチドがトランス活性化因子タンパク質である請求の範 囲第14項記載の植物。 17．前記第２のポリペプチドがバルナーゼである請求の範囲第14項記載の植物 。 18．前記第１のポリペプチドが植物病原体に由来する無毒性遺伝子生成物であ り、そして前記第２のポリペプチドが前記無毒性遺伝子と関連する耐性遺伝子生 成物である請求の範囲第14項記載の植物。 19．前記第１及び第２のプロモーターがじゅうたん組織細胞においてそれぞれ 機能的である請求の範囲第14項記載の植物。 20．植物における細胞機能を修飾するための方法であって、 第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドに作用可能に連結さ れた第１の植物プロモーターを含んで成る第１の発現カセットを植物中に導入し 、ここで組換え酵素部位が前記第１のプロモーターと前記第１のポリヌクレオチ ドとの間に存在し； 前記第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに非作用可能に連結さ れた前記第１の植物プロモーターを含んで成る第２の発現カセットを前記植物中 に導入し、ここで介在発現カセットが組換え酵素部位を両端に有し、そして前記 第１のプロモーターと前記第２の発現カセットの前記第１のポリペプチドとの間 に位置し、前記介在発現カセットが第２のポリペプチドをコードするポリヌクレ オチドに作用可能に連結された植物プロモーターを含んで成り；そして 前記第１及び第２のポリペプチドの細胞における存在がその細胞に対して致死 性であることを特徴とする方法。 21．前記組換え酵素部位がlox部位である請求の範囲第20項記載の方法。 22．前記第２のポリペプチドがバルナーゼである請求の範囲第20項記載の方法 。 23．前記第１のポリペプチドが植物病原体に由来する無毒性遺伝子生成物であ り、そして前記第２のポリペプチドが前記無毒性遺伝子と関連する耐性遺伝子生 成物である請求の範囲第20項記載の方法。 24．植物における細胞機能を修飾するための方法であって、 組換え酵素部位間に位置する第１の発現カセットを、そのゲノム中に組込んで いる第１の植物系からの植物を提供し、ここで前記第１の発現カセットは前記細 胞に対して致死性ではなく； 組換え酵素部位間に位置する第２の発現カセットを、そのゲノム中に組込んで いる第２の植物系からの植物を提供し、ここで前記第２の発現カセットは前記細 胞に対して致死性ではなく； ここで前記組換え酵素部位が個々の２種の相同染色体上の同じ遺伝子座で存在 し、そして前記第１及び第２の発現カセットの植物細胞における存在がその細胞 に対して致死性であり；そして 前記第１の植物系からの植物と前記第２の植物系からの植物とを交雑し、それ により、両介在発現カセットが機能的である細胞を含み、そしてそれにより、前 記細胞を殺害するハイブリッド植物を生成する段階を含んで成る方法。 25．前記組換え酵素がcreであり、そして前記組換え酵素部位が lox部位である請求の範囲第24項記載の方法。