JP2002513747A - ヘモグロビン−ハプトグロビン複合体 - Google Patents

ヘモグロビン−ハプトグロビン複合体

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Abstract

(57)【要約】 ヘモグロビンの構築物複合体、ヘモグロビンに結合した肝細胞修飾物質、およびヘモグロビンに結合したヘパトグロビンが、哺乳類患者への投与のために提供される。構築物複合体をエクスビボで形成することもでき、またはヘモグロビン−肝細胞修飾物質の組み合わせを患者に投与し、哺乳類体内のヘパトグロビンがそれに結合して、インビボで構築物複合体を形成することもできる。本明細書に記載の構築物複合体を用いて、肝疾患を診断および治療することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、蛋白質複合体および医学的応用におけるその使用に関する。より具
体的には、本発明は、体の特定の部分および／または臓器に対する治療作用を有
する、薬物、遺伝子、その他などの治療用物質とのヘモグロビン化合物の複合体
、ならびにそのような複合体を体の特定の部分および臓器を標的として送る手段
に関する。同様に、撮像剤などの診断用物質とのヘモグロビンの複合体も本発明
の範囲内である。
【０００２】 発明の背景および従来技術 ヘモグロビンおよび修飾ヘモグロビンの薬物送達手段としての使用が以前に提
唱されている。赤血球の本来の成分としてのヘモグロビンは、体全体に比較的大
量に存在して循環しており、はっきりと確認された生体容認性と、薬物を体全体
に送達する可能性とを有している。
【０００３】 したがって、Ｋｌｕｇｅｒらは米国特許第５３９９６７１号において、ヘモグ
ロビン化合物の４量体構造の分子内安定性を得るために架橋されているが、送達
するための薬物が共有結合できる官能性残基をクロスリンカー残基上に含むヘモ
グロビン化合物を記載している。
【０００４】 Ａｎｄｅｒｓｏｎらは米国特許第５６７９７７７号において、ヘモグロビン化
合物とポリペプチド薬物との複合体を記載しており、この複合体においてポリペ
プチド薬物は、グロビン鎖に固有の、または遺伝子工学的に導入されたシステイ
ンユニットへのジスルフィド結合を介して、グロビン鎖に結合されている。
【０００５】 ハプトグロビン（Ｈｐ）は、血清糖蛋白質の α2−グロビンファミリーの一部
を構成している。ハプトグロビンは哺乳類の血漿中に存在し、ヒト血漿の α2−
グロブリン画分の約４分の１を占める。個人はそれぞれ、緊密な構造的・化学的
同一性を持つ、ハプトグロビンの３つの表現型の１つを有している。ハプトグロ
ビンは複数のαβ２量体からなり、表現型は通常Ｈｐ１−１、Ｈｐ２−１、およ
びＨｐ２−２と表される。β鎖はすべてのハプトグロビン表現型で等しいが、α
鎖は異なる（α1 およびα2 ）。すべての鎖のアミノ酸配列が知られている。Ｈ
ｐ１−１は２つの α1β２量体からなり、分子量約９８ｋＤａである。Ｈｐ２−
１およびＨｐ２−２の構造は次のとおりに書くことができる：それぞれ、(α1β
)2(α2β)n、ただしｎ＝０、１、２、・・・および(α2β)m、ただしｍ＝３、４
、５、・・・。
【０００６】 主に身体の１つの部分または１つの臓器に影響をおよぼす疾患または障害を患
う患者への薬物送達は、治療を必要とする部分または臓器を高特異的に標的とす
る送達法を選択することによって、最もうまく達成される。そのような送達シス
テムは、活性薬物を最も効果的に利用して、必要な用量レベルを低下させ、薬物
の副作用を低下させる。
【０００７】 ハプトグロビンの１つの機能は、赤血球の溶解から生じる細胞外ヘモグロビン
を結合し、肝臓の肝細胞上の特異的受容体によって認識される、本質的に不可逆
的なハプトグロビン−ヘモグロビン複合体を形成することである。このようにし
て、ヘモグロビンは肝臓を標的として送られ、代謝を受ける。
【０００８】 遺伝子および遺伝子産物の調節および操作は、様々な疾患および遺伝的障害の
治療のための強力な手段となる可能性がある。細胞に特別に導入されているとき
、遺伝子はそれがコードする治療用生体分子を発現するために宿主細胞の生合成
装置を利用することができる。遺伝子治療を成功させるためには、インビボでの
遺伝子送達の有効な方法を考案しなければならない。最近開発されたそのような
技法の一つに、受容体仲介送達がある。これは、標的受容体を発現する細胞に、
高特異的に送達されるという利点を有している。
【０００９】 低分子量の治療薬および診断薬の組織への特異的ターゲティング(targeting)
は、受容体仲介送達の利用によりおおいに強化される。蛍光または放射性同位体
標識された物質などの診断薬を標的受容体のリガンドとの複合体として投与する
と、それら標的受容体を有する細胞の位置と量が示される。これらの複合体は、
培養中の細胞における受容体の結合および輸送特性を特徴付ける際にも有用であ
る。このような情報は、インビトロまたはインビボのいずれにおいても、認識さ
れる細胞を含む組織の検出および／またはその治療設計において有用である。
【００１０】 発明の概要 本発明の目的は、治療上活性な物質または診断薬とのヘモグロビン−ハプトグ
ロビン複合体の受容体を有する肝細胞または他の細胞の特異的ターゲティングの
ための手段および組成物を提供することである。
【００１１】 本発明のさらに別の目的は、インビボで、哺乳類患者の肝臓に対して有益な効
果を発揮するように選択された物質と、肝細胞を特異的に標的とする物質との新
規な複合体を提供することである。
【００１２】 本発明は、肝細胞修飾剤が結合しているハプトグロビン−ヘモグロビン構築物
複合体について記載する。このようなハプトグロビン−ヘモグロビン構築物複合
体は、特定の肝細胞修飾剤（薬物、診断薬、撮像化合物、その他）を肝臓、およ
び適当なヘモグロビン−ハプトグロビン受容体を有する他の細胞に送達するため
に、結合した薬剤のための有効な肝細胞ターゲティング媒体としてはたらく。
【００１３】 「構築物複合体」という表現は、本明細書では生物活性のある治療薬または診
断薬が結合しているヘモグロビンとハプトグロビンとの組み合わせを指すために
用いられる。本発明は、ヘモグロビン化合物、ハプトグロビン、および薬物、診
断薬または遺伝子などの興味対象となる肝細胞修飾物質からなる構築物複合体を
提供する。本発明の１つの態様において、構築物複合体を生体外で調製し、次い
で患者に投与する。別の態様において、ヘモグロビン−肝細胞修飾物の複合体を
体外で調製し、患者に投与し、患者の血清中に本来存在するハプトグロビンとハ
プトグロビン−ヘモグロビン−肝細胞修飾物質の構築物複合体を形成する。さら
に別の態様において、ヘモグロビン−肝細胞修飾物質−構築物複合体の投与前、
投与中、または投与後のいずれかに、知られている手法のハプトグロビン投与に
よって患者のハプトグロビンレベルを補足することができる。いずれの場合にも
、構築物複合体は、そのハプトグロビンおよびヘモグロビン部分の存在によって
、リガンドとして肝細胞受容体に特異的に標的を定め、結合する。
【００１４】 エクスビボまたはインビボのいずれかで形成された本発明の構築物複合体は、
Ｈｂ−Ｈｐ複合体の受容体を有するいかなる細胞も標的とし、これは原発性肝細
胞癌から生じた転移も含む。このような癌は全身に分布し、サイズが小さいため
、転移を特定して治療することは、通常困難である。このような受容体を有する
二次肝転移、すなわち肝臓外の肝細胞癌細胞も、肝臓の細胞と同様に、本発明の
構築物複合体によって標的とされ、本明細書において用いられる用語の「肝細胞
」とみなされるべきである。
【００１５】 さらに、本発明の構築物複合体は、肝細胞修飾物質が、例えば、隣接する細胞
に対し、それらが肝細胞ではなくても活性を有する薬物である場合、隣接する細
胞にも有益な効果を発揮することができる。また、構築物複合体は、肝細胞修飾
のために他の方法で送達された、プロドラッグ、酵素、もしくは酵素をコードし
、効果を引き出すために活性化を必要とする遺伝子などの、他の治療薬または診
断薬の活性を調節または開始させることができる。肝細胞の修飾または他の薬剤
もしくは細胞に対する効果を引き起こすこのような作用をもたらす薬剤は、本発
明の肝細胞修飾剤である。
【００１６】 本発明の構築物複合体は、一般には下記の式によって表すことができる： (Ｈｐ)a − (Ｈｂ)b − (Ｌc−Ａd)e 式中、ａ＝１〜約１０であり； ｂ＝０．５〜約１０であり； ｃ＝０〜約１０であり； ｄ＝１〜約２０であり； ｅ＝１〜約２０であり； Ｈｐは本明細書に記載のハプトグロビンであり； Ｈｂは本明細書に記載のヘモグロビンであり； Ｌは本明細書に記載のリンカーであり；かつ Ａは本明細書に記載の肝細胞修飾剤であり、 複合体中のＨｐのＨｂに対する化学量論は、２つの蛋白質上にある結合部位の利
用可能な数によって規定されるが、一般にはおよそ１：０５〜１：２程度である
。
【００１７】 好ましい実施形態の説明 広範囲の肝細胞修飾物質を、本発明の複合体において用いることができる。こ
れらは、肝細胞と相互作用可能で、その結果、肝臓においてインビボで作用可能
な、治療薬、診断薬、マーカーまたはこれらに類するものでありうる。これらは
、正常な肝臓の細胞または転移を経たそのような細胞の治療のために設計するこ
とができる。したがって、肝細胞修飾物質は、抗新生物物質（例えば、ドキソル
ビシン、ダウノルビシン、リシン、ジフテリア毒素、ジフテリア毒素Ａ）、抗ウ
イルス物質（例えば、アラ−ＡＭＰ、トリフルオロチミジン、インターフェロン
、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リバビリン、シタラビン、アシクロビル、
ジドノシン、ビダラビン、アデフォビル、ザルシタビン、ラミブジン、フィアル
ブリジン、および他のヌクレオシド類縁体）、抗炎症物質、抗寄生虫物質、抗菌
物質、抗酸化物質、肝防護薬、撮像および診断薬、遺伝子療法を達成するための
核酸およびその化合物、脂質を代謝させる薬剤、抗毒物、蛋白質、酵素、酵素お
よびプロドラッグの組み合わせ、ならびにこれらに類するものでありうる。
【００１８】 本発明の構築物複合体において有用な診断薬の例には、放射性同位元素で標識
したリジンおよびプトレッシン、ならびに蛍光化合物のモノダンシルカダベリン
およびフルオレセインが含まれる。低分子量の治療薬を選択的に細胞に向け、非
標的組織での副作用および血管クリアランスを最小にすることもできる。本明細
書における治療薬の例には、細胞成長および活性のモジュレーターであるプトレ
ッシンと、抗マラリア物質であるプリマキンとが含まれる。
【００１９】 より具体的には、本明細書の構築物複合体において用いることができる肝細胞
修飾物質には、慢性肝損傷から肝硬変への動的プロセスである肝線維症を治療ま
たは予防するための薬剤、ならびにウイルス性肝炎やアルコール性および潜源性
肝疾患を含む他の慢性肝障害を治療または予防するための薬剤が含まれる。これ
らの肝細胞修飾物質には、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、プロスタグランジ
ンＥ１、Ｅ２、Ｉ２およびその類縁体、コルヒチン、ならびにシリマリンなどの
細胞防護薬が含まれ、これらはすべて肝臓の損傷からの防護において効果的で、
抗線維形成特性を有することが示されている。本発明の範囲内の肝細胞修飾物質
である、他の肝臓防護物質には、グルタチオン、ＳＡ ３４４３（環状二硫化物
）、Ｓ−アデノシルメチオニン、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、
α−トコフェロール、ビタミンＣ、デフェロキサミン、（＋）シアニダノール−
３、マンニトール、トリプトファン、パンテテイン、パントテン酸、シスタミン
、システイン、アセチルシステイン、フォリン酸、ウリジンモノリン酸、硫酸亜
鉛、シザンドリンＢおよびコプシニンなどのフリーラジカル捕捉剤／抗過酸化剤
；前述のプロスタグランジンおよびその類縁体ジメチルＰＧＥ、ミソプロストー
ルおよびエニソプロスト、ならびにプロスタサイクリンＰＧＩ２およびその類縁
体イロプロストなどのリポキシゲナーゼ阻害剤；トリフルオロペラジン、ベラパ
ミル、ニフェジピンおよび関連のジヒドロピリジン化合物、ならびにジルチアゼ
ムなどのカルシウムチャネル遮断薬；プロテイナーゼ阻害剤；心房性ナトリウム
排泄増加ペプチ； α2−マクロフェトプロテイン；合成直鎖テルペノイド；プト
レッシン；コレスチラミン；ε−アミノカプロン酸；フェニルメチルスルホニル
フッ化物；ペプスタチン；グリチルリチン；果糖１，６−２リン酸；およびウル
ソデオキシコール酸が含まれる。
【００２０】 本発明の複合体の成分として有用なヘモグロビン化合物は、患者または動物へ
の投与のために必要な程度の生体適合性、興味対象となる肝細胞修飾物質の結合
に必要な部位を提供し、ハプトグロビンに対して十分な結合親和性を有する、実
質的にいかなるヘモグロビン化合物であってもよい。これらの制限の中で、これ
はヒトまたは動物由来の天然ヘモグロビンであってもよい。これは修飾された天
然ヘモグロビン、例えばその２量体への解離を最小にするための分子内架橋型ヘ
モグロビン、オリゴマー型または重合体型であってもよい。これは天然のグロビ
ン鎖または簡単な方法で変異されたグロビン鎖を有する、組換源および技法から
誘導されたヘモグロビンであってもよい。これは、ハプトグロビンに親和性を有
する、Ｈｂのサブユニットもしくはフラグメント、またはその誘導体からなって
いてもよい。これはグロビン鎖の個々のアミノ酸が部位特異的突然変異生成また
は他の手段によって除去または置換されているヘモグロビンであってもよい。ハ
プトグロビンへの結合に対するヘモグロビンの親和性を低下させることが知られ
ている特定の修飾は、本発明において用いられるヘモグロビン化合物では避ける
ことが好ましい。
【００２１】 好ましいヘモグロビン化合物の１つの型は、２量体への解離を防ぐために分子
内架橋されているヘモグロビン４量体を含み、官能基を、肝細胞修飾物質との化
学反応に直接または化学リンカー分子を介してのいずれかで利用できる状態にし
ているものである。このようなヘモグロビン化合物は、興味対象となる治療用物
質に特異的な、既知の調節された数の反応部位を提供するため、正確に調節され
た量の治療用物質を所定量のヘモグロビン化合物に結合することができるという
利点を有する。また、これらは治療用活性物質に連結するためにグロビン鎖上の
部位を利用することを避けて、グロビン鎖の立体配座崩壊を最小にし、ヘモグロ
ビン−ハプトグロビンの結合、および構築物複合体の肝細胞上の受容体蛋白質へ
の結合の妨害を最小にするという追加の利点も有する。
【００２２】 ヒトヘモグロビン、例えば、期限を過ぎた赤血球から得、Ｐｌｉｕｒａらの米
国特許第５４３９５９１号に記載の置換クロマトグラフィ法によって精製したヒ
トヘモグロビンは、本発明の複合体において用いるヘモグロビン生成物調製のた
めの好ましい原料の１つである。この物質は、前述のＫｌｕｇｅｒらの米国特許
第５３９９６７１号に記載の３官能性架橋剤、すなわち、その官能基の２つをヘ
モグロビン４量体のサブユニット間の分子内架橋に用い、３つ目の官能基は続く
求核分子との反応に利用できる状態にしておく試薬によって架橋されていてもよ
い。そのような架橋試薬の具体的な例は、トリメソイルトリス（３，５−ジブロ
モサリチレート）、ＴＴＤＳ、で、その化学式を添付の図１に示しており、その
調製は前述のＫｌｕｇｅｒらの米国特許第５３９９６７１号に記載されている。
【００２３】 架橋ヘモグロビン、すなわち安定型４量体ヘモグロビンを複合体の成分として
用いるとき、肝細胞修飾物質を直接または化学リンカーもしくはスペーサーを介
してのいずれかでヘモグロビンに結合し、次いでこの複合体を患者に投与してイ
ンビボでハプトグロビン−ヘモグロビンの結合が起こるようにすることもできる
。完全な構築物複合体（ハプトグロビン−ヘモグロビン−肝細胞修飾物質）を、
望まれる場合には、生体外で形成し、次いで患者に投与することもでき、これは
状況によっては肝細胞に最終的に送達される活性物質の量をよりうまく調節でき
ることもある。しかし、そのような方法は、ハプトグロビンのレベルがゼロまた
は低い例外的患者、例えば急性溶血の状態にある患者を除き、通常は必要ではな
い。このような患者には、本発明の構築物複合体の投与前、投与中、および／ま
たは投与後に、ハプトグロビンを投与することができる。しかし、通常は、患者
血漿中にはインシトゥで構築物複合体を形成し、肝細胞にそれを送達するのに十
分なハプトグロビンがある。２部分複合体を調製して患者に投与し、インシトゥ
で３部分複合体を形成することは、一般的により安価で複雑性も低い。
【００２４】 分子内架橋されているヘモグロビンを使用すると、ヘモグロビンおよびハプト
グロビンにはそれぞれ２つの結合部位があるため、複数のヘモグロビンおよび／
またはハプトグロビンを含む高分子量重合体を生じることになろう。非架橋ヘモ
グロビンを本発明の構築物複合体の成分として用いることには利点があると考え
られる。このようなヘモグロビンに肝細胞修飾物質が結合したものは、分子量約
３２ｋＤａの２量体ヘモグロビンに解離し、この解離した２つの２量体ヘモグロ
ビン生成物がハプトグロビンの１個の分子に結合して、本発明の複合体を形成す
ることになる。したがって、高分子量ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体の形
成が避けられる。αβ−２量体へのハプトグロビンの結合は一般に、架橋ヘモグ
ロビンへのハプトグロビンの結合に比べて、非常に速やかに起こる反応である。
非架橋ヘモグロビンの使用によって得られる、より低分子量の複合体は、改善さ
れた肝細胞受容体への結合と取り込みを示しうる。
【００２５】 ２量体に解離する形のヘモグロビンを本発明の成分として用いる場合、または
ヘモグロビン２量体自体を用いる場合、例えば、２量体が６４ｋＤａのヘモグロ
ビンを再形成できないように修飾されている場合、本発明の構築物複合体を生体
外で形成し、次いで完成された構築物複合体を患者に投与して、分子量が非常に
小さい分子種を体内に投与すること、すなわち薬物を排泄を通じて非常に早く排
出することに伴うリスクを回避することが好ましい。修飾された２量体の排出前
に複合体がインビボで十分に形成される場合には、ハプトグロビンに事前に結合
することなく、治療薬または診断薬を有するＨｂ２量体を投与することが可能で
あろう。
【００２６】 本発明の構築物複合体において有用なヘモグロビン化合物の他の例は、１９９
７年１１月３日に出願されたＫｌｕｇｅｒおよびＬｉの「化学的に導入されたジ
スルフィド架橋を有するヘモグロビンとその調製」という表題の米国仮特許出願
に記載の型の、チオール、好ましくは末端側鎖チオールを含む修飾基を有する２
量体ヘモグロビンである。肝細胞修飾物質をこのような２量体ヘモグロビンに、
露出したチオールとの直接反応、またはチオールの活性化型との直接反応、また
は混合ジスルフィド形成、またはリンカー分子を介してのいずれかによって、連
結することができる。この型の構築物複合体は体外で作製し、この形で患者に投
与する。ヘモグロビン−肝細胞修飾物質結合体も、インビボＨｐ結合のために投
与することができる。解離可能なヘモグロビン（分子量３２ｋＤａ）は、ハプト
グロビンの結合を容易にする露出した２量体−２量体界面を提供するため、これ
らの使用は架橋ヘモグロビン４量体の使用に比べて有益である。
【００２７】 本発明の構築物複合体は、酸化窒素結合を障害するような様式で修飾されたヘ
モグロビンも用いることができる。このような修飾ヘモグロビンは、当技術分野
において知られている。ＮＯ結合が低下すると、一部のヘモグロビンで認められ
ている作用である、たとえ少量でも投与したときにヘモグロビンが患者の血圧を
改変する傾向を低下することができる。
【００２８】 構築物複合体形成において、選択したヘモグロビン上の反応部位と肝細胞修飾
物質との間に、化学リンカーまたはスペーサー基を挿入しなければならないこと
がある。これは、ヘモグロビン上で連結に利用できる化学基の性質、および肝細
胞修飾化合物上でこの目的のために利用できる化学基に応じて異なる。例えば、
ポリリジンなどのポリカチオン部分は、ＴＴＤＳ修飾されたヘモグロビンの親電
子部位に適当に結合して、ＤＮＡが静電的相互作用によって結合する部位を提供
する。リジンの直鎖重合体は、この目的のために適当なカチオン部分を提供する
。
【００２９】 本発明の好ましい実施形態の構築物複合体はハプトグロビン分子を含み、この
ハプトグロビンはハプトグロビン１−１またはいかなる他の表現型でもよく、ヘ
モグロビン化合物の１つまたは複数の分子に強い非共有相互作用によって結合さ
れていてもよい。ヘモグロビンは、前述のとおり、架橋されているか、オリゴマ
ー化されていてもよく、または修飾されていなくてもよい。
【００３０】 図１は、架橋ヘモグロビンの調製に関与する化学的段階であって、本発明の様
々な実施形態に従って構築物複合体を形成するためのリンカーおよび／または薬
剤、ならびにハプトグロビンとの反応のための段階を図示している。ＴＴＤＳを
ヘモグロビンと反応させ、その結果、３つの３，５−ジブロモサリチル酸基のう
ちの２つが残存する。ヘモグロビン上のＬｙｓ−８２およびβ−Ｌｙｓ−８２の
１級アミンをアミド結合によってクロスリンカーに結合し、完全なままで、さら
なる反応に利用可能な第３のジブロモサリチル酸基を有する、分子内架橋した安
定型４量体ヘモグロビンを形成する。第２の段階において、架橋ヘモグロビンを
、薬剤または薬剤を後に結合するために必要なリンカー（実施例１の場合はポリ
リジン）と反応させる。別の場合には、肝細胞修飾物質または活性薬剤が、図１
のスキームのポリリジンに代わり、構築物を形成する。これで、複合体はいつで
も患者に投与して構築物複合体をインシトゥで形成することができ、または代わ
りにハプトグロビンを生体外で形成された複合体と反応させ、複合体のヘモグロ
ビン部分に結合させて、いつでも患者に投与可能な３部分複合体を形成すること
もできる。あるいは、最終段階として、リンカーが結合したＴＴＤＳ修飾ヘモグ
ロビンを、ハプトグロビンおよび結合した薬剤と反応させることもできる。投与
後、構築物複合体は肝細胞に結合し、そこでハプトグロビン−ヘモグロビンがそ
の選択的受容体への結合を仲介し、ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体に選択
的な肝細胞受容体を用いて肝細胞修飾物質を肝細胞に送達し、これに進入できる
ようにする。
【００３１】 具体的実施例 実施例１−ＴＴＤＳ架橋ヘモグロビン（ＴＨｂ）のポリ（Ｌ−リジン）への結合 ＴＴＤＳ架橋ヘモグロビンのポリ（Ｌ−リジン）結合体（ＴＨｂ−Ｋn ）を、
ＴＨｂ−ＤＢＳ（１つの加水分解されていない３，５−ジブロモサリチル酸官能
基を有するＴＴＤＳ架橋ヘモグロビン）にポリ（Ｌ−リジン）を１：１のモル比
で加え、１つのポリ（Ｌ−リジン）鎖にヘモグロビン１分子だけが結合した結合
体の形成を促進することによって合成した。この実験で用いたポリ（Ｌ−リジン
）は、リジンのカルボキシル基とα−アミノ基との間にアミド結合を有する直鎖
重合体である。平均分子量４ｋＤａ(Ｋ4kDa)、７.５ｋＤａ(Ｋ7.5kDa) 、２６ｋ
Ｄａ(Ｋ26kDa) および３７ｋＤａ(Ｋ37kDa) の重合体がＴＨｂに結合した。
【００３２】 ＴＴＤＳ（１３．９ｍｇ）／エタノール（１００μＬ）をデオキシヘモグロビ
ン（５ｍＬ、８．５ｇ／ｄＬ）／５０ｍＭホウ酸塩ｐＨ９．０に加えた。反応混
合物を３０℃、窒素雰囲気下で４５分間撹拌した。次いで、ヘモグロビンをＣＯ
で充満させ（溶液は氷上に維持した）、ヘモグロビン溶液を５０ｍＭホウ酸塩ｐ
Ｈ９．０で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（長さ２００ｍｍ×直径２
５ｍｍ）を通過させることにより、過剰の架橋試薬を除去した。得られたヘモグ
ロビン溶液（３．６ｇ／ｄＬ）を再度ＣＯで充満させた。ポリ（Ｌ−リジン）溶
液を５０ｍＭホウ酸塩ｐＨ８．０中で調製し、下記の表１に示すとおりにヘモグ
ロビン（３．６ｇ／ｄＬ、１．９ｍＬ）に加えた。ポリ（Ｌ−リジン）のヘモグ
ロビンに対するモル比は、４つの重合体すべてで１：１であった。ＴＨｂ−ポリ
（Ｌ−リジン）結合体(ＴＨｂ−Ｋn) を血清びん中に密封し、再度ＣＯで充満さ
せ、室温で２日間放置した。これらの試料のヘモグロビン濃度を、ドラブキン試
薬を用いて定量した。
【００３３】
【表１】 アニオン交換クロマトグラフィ：未精製のＴＨｂ−Ｋn 複合体を、ＳｙｎＣｈ
ｒｏｐａｋ ＡＸ−３００カラム（長さ２５０ｍｍ×直径４．６ｍｍ、SynChrom
, Inc. ）でのアニオン交換クロマトグラフィを用いて分析した。塩化ナトリウ
ム勾配を用いて様々な修飾ヘモグロビンを溶出した。溶出液を２８０ｎｍでモニ
ターした。
【００３４】 分析時までに、未反応のＴＨｂ−ＤＢＳはすべて加水分解されてＴＨｂを生じ
た。反応の結果、生成物の混合物を生じ、これらはすべて、予期されたとおり、
アニオン交換クロマトグラフィ媒質上でＴＨｂよりも前に移動した。収率は、早
く溶出されたピークのピーク面積を加算し、全ピーク面積と比較することによっ
て算出した。このようにして計算したポリ（Ｌ−リジン）修飾ヘモグロビンの収
率は、Ｋ4kDa、Ｋ7.5kDa、Ｋ26kDaおよびＫ37kDaについて、それぞれ３７、３７
、８１、および８４％であった。
【００３５】 ＴＨｂ−Ｋn結合体の精製：ＴＨｂ−Ｋn結合体を結合していないＴＨｂから、
２５ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．４で平衡化したＰＯＲＯＳ ＨＱ／５０
カラム（長さ５２ｍｍ、直径１４ｍｍ）でのアニオン交換クロマトグラフィによ
って分離した。修飾Ｈｂを塩化ナトリウム勾配によって溶出した。溶出液を２８
０ｎｍでモニターし、集めたＴＨｂ−Ｋn結合体を含む分画を登録商標Ａｍｉｃ
ｏｎ透析ろ過装置および３０ｋＤａ分離膜を用いて濃縮した。
【００３６】 サイズ排除クロマトグラフィ：精製したＴＨｂ−Ｋn結合体 およびそのハプト
グロビン複合体の分子量分布を、２５ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．２を含む０．
５Ｍ塩化マグネシウム、流速０．４ｍＬ／分で平衡化および溶出する、登録商標
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラム（長さ３００ｍｍ、直径１０ｍｍ、Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）でのサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を用いて調べた。溶出液
を２８０ｎｍおよび４１４ｎｍでモニターした。ヘモグロビン対ポリ（Ｌ−リジ
ン）の化学量論は、分子量標準に対応する溶出時間にしたがって、４ｋＤａのポ
リ（Ｌ−リジン）を用いての１：１から、分子量がより高いポリ（Ｌ−リジン）
リンカーを用いての４：１までの化学量論による異質物からなる構築物までの範
囲であった。未修飾ＴＨｂは存在しなかった。これらの構築物はクロマトグラフ
ィの塩濃度が高い状態で安定であった。
【００３７】実施例２−ＴＨｂ−Ｋnとハプトグロビン１−１との間の複合体形成 複合体の調製には下記の原液を用いた：１．７４ｍｇ／ｍＬのハプトグロビン
１−１(Ｈｐ)／水および１．０ｍｇ／ｍＬの ＴＨｂ−Ｋn／５０ｍＭホウ酸ナト
リウムｐＨ９.０溶液（ＴＨｂ−Ｋn濃度はすべてヘモグロビンの濃度を表す）。
ハプトグロビン（１４μＬ）を ＴＨｂ−Ｋnのリン酸カリウムｐＨ７．０溶液に
加えて、最終濃度を下記のとおりとした：２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．０中
、０．１２ｍｇ／ｍＬ（１．２２μＭ）のハプトグロビンおよび０．１９ｍｇ／
ｍＬ（２．９μＭ）の ＴＨｂ−Ｋn（最終容積２００μＬ）。室温で１８０分間
インキュベートした後、試料をＳＥＣを用いて分析した。
【００３８】 ＴＨｂ−Ｋn のハプトグロビン１−１との複合体：ＴＨｂ−Ｋn のハプトグロ
ビンとの複合体形成を、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を用いて追跡す
ることができる。図２Ａは、室温で１８０分間インキュベートした後のＴＨｂ−
Ｋ4kDaのＨｐとの混合物組成を示している。新しい高分子量のピークが２５．５
分に現れる。溶出期間全体の２８０ｎｍおよび４１４ｎｍにおける吸光度の比（
Ａ280／Ａ414）のプロットにより、構築物複合体および他のピークにおけるハプ
トグロビンとヘモグロビンとの相対比が示される。新しいピーク全体の吸光度の
比（Ａ280／Ａ414）は０．９で、ハプトグロビンおよびヘモグロビン成分の両方
がこの複合体に存在することが示される。ハプトグロビン１−１は２９．７分で
移動し、Ａ280／Ａ414比が高いことで容易に同定される。図２Ｂは、室温で１８
０分間インキュベートした後のＨｐとのＴＨｂ−Ｋ7.5kDa混合物のＳＥＣを示し
ている。ここでも、Ａ280／Ａ414比０．７３の新しいピークが２５．１分に現れ
、続いてハプトグロビンが２９．７分に現れ、Ａ280／Ａ414比０．３のＴＨｂ−
Ｋ7.5kDaが３５．８分に現れる。ＴＨｂ−Ｋ26kDaおよびＴＨｂ−Ｋ37kDaのハプ
トグロビンとの複合体のＳＥＣの分析は、それらの分子量分布が広範であるため
、より複雑である。結果をそれぞれ図２Ｃおよび２Ｄに示している。ＴＨｂ−Ｋ 26kDa およびＴＨｂ−Ｋ37kDaがいずれもハプトグロビンと複合体を形成すること
は、図２Ｃおよび２Ｄから明白である。Ａ280／Ａ414比は、ＴＨｂ−Ｋ26kDa−
Ｈｐでは０．６４で、ＴＨｂ−Ｋ37kDa−Ｈｐでは０．６９である。
【００３９】 ＴＨｂ−Ｋ26kDa−Ｈｐ複合体形成の程度：ＴＨｂ−Ｋnの構造的に異なるすべ
ての成分がハプトグロビンに結合するかどうかを調べるために、ＴＨｂ−Ｋ26kD a を１５％過剰のハプトグロビンと共に、様々な長さの時間インキュベートし、
次いでＳＥＣを用いて分析した。複合体の調製には下記の原液を用いた：１．７
４ｍｇ／ｍＬのハプトグロビン１−１／水および７．４ｍｇ／ｍＬのＴＨｂ−Ｋ 26kDa ／リン酸カリウムｐＨ７．０溶液で、最終濃度を下記のとおりとした：２
５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．０中、０．７４ｍｇ／ｍＬ（７．５ｍＭ）のハプ
トグロビンおよび０．４１ｍｇ／ｍＬ（６．４ｍＭ）のＴＨｂ−Ｋ26kDa（Ｈｐ
対Ｈｂのモル比１．２：１）。室温で様々な長さの時間インキュベートした後、
混合物をＳＥＣを用いて分析した。反応の進行を、ＳＥＣ図のハプトグロビンピ
ークの消失をモニターすることによって追跡した。２４時間後、ＴＨｂ−Ｋ26kD a の８５％がハプトグロビンと結合した。得られたＴＨｂ−Ｋ26kDa−Ｈｐ複合体
は、３７０ｋＤａ〜約１０００ｋＤａの範囲の広い分子量分布を有している（図
３）。
【００４０】実施例３−ＴＨｂ−ＫnおよびＴＨｂ−Ｋn−ＨｐへのＤＮＡ結合。ゲル易動度シ フトアッセイ： ゲル易動度シフトアッセイを実施して、プラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶｂｅｔａ
）のＴＨｂ−Ｋn結合体に対する結合の化学量論を評価した。このゲル電気泳動
法は、ＤＮＡの移動特性が蛋白質を結合することによって変化するという知見に
基づいている。蛋白質と、蛋白質が質量の大部分を構成するＤＮＡ−蛋白質複合
体のいずれも、１％アガロースゲルに進入しない。ＴＨｂ−Ｋn 対ＤＮＡの比を
漸増させて混合物を分析する場合、複合体の化学量論に対応する比およびそれ以
上でＤＮＡバンドの消失が認められる。４つの結合体それぞれについて、および
ＴＨｂ−Ｋ26kDa−Ｈｐ複合体について、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む３２μＬ
の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３中に、０．４〜６４００ｎｇの結合体（こ
の重量はヘモグロビン成分に基づいている）を含む溶液を調製した。プラスミド
ＤＮＡ（１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２８μＬの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７
．３中に５６０ｎｇ）を各試料に滴下し、混合物を室温で１時間インキュベート
した。試料（１５μＬ）を、臭化エチジウム（０．２μｇ／ｍＬ）を含む１％ア
ガロースゲル上で分析した。ゲルへのＤＮＡの進入を防止した結合体の量を求め
た。結果を下記の実施例に記載している。
【００４１】実施例４−ＴＨｂ−Ｋ26kDaおよびＴＨｂ−Ｋ26kDa−Ｈｐ複合体へのＤＮＡ結合 ：チアゾールオレンジ蛍光消光法： この色素蛍光アッセイは、ＤＮＡインターカレーション色素（チアゾールオレ
ンジ）がＤＮＡに結合した場合にのみ蛍光を発するという知見に基づいている。
ＴＨｂ−Ｋn とＤＮＡとの間の複合体形成が、インターカレーション色素のＤＮ
Ａからの置換および全蛍光の低下を引き起こす。
【００４２】 この実験において下記の原液を用いた：０．０５ｍｇ／ｍＬのＤＮＡ（ｐＣＭ
Ｖｂｅｔａ）、０．０１０ｍｇ／ｍＬのＴＨｂ−Ｋ26kDaまたはＴＨｂ−Ｋ26kDa −Ｈｐ複合体、１．７５×１０-6Ｍのチアゾールオレンジ（１％メタノール中０
．１ｍｇ／ｍＬ溶液を水で１９０倍に希釈した）、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む
２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３。プラスミドＤＮＡ（１０μＬ）、ＴＨｂ−
Ｋ26kDa（容積は２．５から６０μＬまで変化する）および緩衝液（最終容積２
００ｍＬとする）を一般的な９６穴プレート中で混合し、室温で２．５時間イン
キュベートする。ＨＥＰＥＳ緩衝液中にチアゾールオレンジを含む試料も調製し
、バックグラウンド対照として用いた。蛍光をＰａｃｋａｒｄの登録商標Ｆｌｕ
ｏｒｅＣｏｕｎｔプレート読みとり器上で、励起４８５ｎｍおよび発光５３０ｎ
ｍを用いて測定した。ＴＨｂ−Ｋ26kDa −Ｈｐ複合体を前述のとおりに調製し、
精製せずに用いた。これを０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ
ｐＨ７．３で希釈し、最終濃度０．０１０ｍｇ Ｈｂ／ｍＬとした。
【００４３】 ゲル易動度シフトアッセイおよび蛍光消光アッセイの両方で、ＴＨｂ−Ｋnが
ＤＮＡに結合することが示された。図４Ａ（左）および４Ｂ（右）は、実施例４
にしたがって生成したハプトグロビン−ヘモグロビン−ＤＮＡ結合体のゲル易動
度シフトアッセイを示している。１４０ｎｇのＤＮＡを（Ａ）ＴＨｂまたは（Ｂ
）ＴＨｂ−Ｋ26kDa の漸増量に加えた。両方のゲルのレーン１はＤＮＡ分子量マ
ーカーを含む。他のレーンのＨｂ含量は、（Ａ２）５０ｎｇ、（Ａ３）１００ｎ
ｇ、（Ａ４）２００ｎｇ、（Ａ５）４００ｎｇ、（Ａ６）８００ｎｇ、（Ａ７）
１６００ｎｇ、（Ａ８）空、（Ｂ２）２５ｎｇ、（Ｂ３）５０ｎｇ、（Ｂ４）１
００ｎｇ、（Ｂ５）２００ｎｇ、（Ｂ６）４００ｎｇ、（Ｂ７）８００ｎｇ、（
Ｂ８）ＤＮＡのみである。ゲル易動度シフトアッセイに関しては、図４に示すと
おり、ＤＮＡ試料中のＴＨｂ−Ｋn の比率を上げると、ＤＮＡの移動に影響をお
よぼした。図４Ａは、蛋白質５０〜１６００ｎｇの範囲のＴＨｂ漸増量と共にイ
ンキュベートした後のＤＮＡの移動特性を示している。この濃度範囲では、ＤＮ
Ａ移動の変化が検出できないため、ＴＨｂはＤＮＡと結合していない。ＴＨｂ−
Ｋ26kDaはＤＮＡ結合において最も有効である。１００ｎｇのＴＨｂ−Ｋ26kDa（
ＴＨｂ−Ｋ26kDa対ＤＮＡの比＝０．７重量比）は、ＤＮＡのアガロースゲルへ
の進入を完全に防止した（図４Ｂ）。すべてのＤＮＡを結合するために、約４０
０ｎｇの他のＴＨｂ−Ｋn調製物が必要とされた。ＴＨｂ−Ｋ26kDaについての結
果は蛍光消光アッセイとよく一致しており、蛍光消光アッセイでは同じＴＨｂ−
Ｋ26kDa対ＤＮＡの比で８６％の蛍光低下を示した。図５は、ＤＮＡ−チアゾー
ルオレンジ蛍光に対するＴＨｂ26kDaの効果を示している。図５において、ＴＨ
ｂ−Ｋ26kDaの量はヘモグロビン成分にのみ基づいている。
【００４４】 ＴＨｂ−Ｋ26kDa−Ｈｐ複合体もＤＮＡに結合する。２００ｎｇのＴＨｂ−Ｋ2 6kDa −Ｈｐが１４０ｎｇのＤＮＡがアガロースゲルに進入するのを完全に防止す
ることが明らかにされた（ＴＨｂ−Ｋ26kDa−Ｈｐ対ＤＮＡの比＝１．４重量比
）。図６は、ゲル易動度シフトアッセイによるＴＨｂ−Ｋ26kDa−ＨｐのＤＮＡ
への結合を示している。１４０ｎｇのＤＮＡをＴＨｂ−Ｋ26kDa−Ｈｐの漸増量
に加えた：２５ｎｇ（レーン２）、５０ｎｇ（３）、１００ｎｇ（４）、２００
ｎｇ（５）、４００ｎｇ（６）、８００ｎｇ（７）、重量はヘモグロビン成分に
基づいている。分子量標準をレーン１にのせ、１４０ｎｇのＤＮＡをレーン８に
のせた。同じＴＨｂ−Ｋ26kDa−Ｈｐ対ＤＮＡの比（１．４：１重量比）では、
蛍光アッセイによりわずか４２％の蛍光低下が示され、２．８の比では８１％の
蛍光低下が示されている。蛍光アッセイを図７に示している（結合体の重量はそ
のヘモグロビン成分のみに基づいている）。ＴＨｂ−Ｋ26kDa−Ｈｐに関するゲ
ル易動度シフトアッセイの比較により、ハプトグロビン複合体を用いるとき、Ｄ
ＮＡがゲル中に移動するのを防止するためには、約２倍の蛋白質結合ポリ（Ｌ−
リジン）が必要とされることが示されている。ヘモグロビン結合ポリ（Ｌ−リジ
ン）の量は両方の実験で等しかったため、ＴＨｂ−Ｋ26kDa−ＨｐのＤＮＡ結合
能の低下はおそらく、ＴＨｂ−Ｋ26kDa−Ｈｐ―ＤＮＡ複合体が立体的に込み合
っているためである。
【００４５】 これらの実施例において、ヒト肝細胞へのハプトグロビン受容体を介したイン
ビボでの標的遺伝子送達に必要なすべての成分を有する構築物が合成され、特徴
付けられた。ポリ（Ｌ−リジン）をＴＴＤＳ架橋ヘモグロビンに結合して、その
正に荷電したε−アミン基とＤＮＡのリン酸基の負電荷との静電的相互作用によ
りＤＮＡを結合するための部位を提供した。過去に、ＤＮＡの負電荷の９０％よ
りも多くが中和されると、線状ＤＮＡ鎖は、より安定で細胞によって内部に取り
込まれやすい形状のトロイド構造に圧縮されることが明らかにされている。電気
的中性の複合体を生じるＤＮＡ対ポリ（Ｌ−リジン）の比で、最適な遺伝子発現
が報告されている。
【００４６】 ゲル易動度シフトおよび蛍光アッセイによって、ＴＨｂ−Ｋ26kDa−Ｈｐ複合
体がプラスミドＤＮＡに結合して、ハプトグロビン受容体仲介性のエンドサイト
ーシスによりオリゴヌクレオチドを送達することが可能な構築物の組み立てを完
了することが示されている。
【００４７】実施例５−トリチウム化または非トリチウム化リジンを有する架橋ヘモグロビン の合成 Ｌ−[3Ｈ]−リジンの溶液を窒素気流下で蒸発させて５９.５ｎｍｏｌ（５ｍＣ
ｉ）の固体物質を得た。放射性同位体標識されていないＬ−リジン５９．５ｎｍ
ｏｌを同様に調製した。ＴＴＤＳ（３９．８ｍｇ）をエタノール（２７０μｍＬ
）に溶解し、この溶液の２００μＬを５０ｍＭホウ酸塩ｐＨ９．０中のデオキシ
ヘモグロビン（１０ｍＬ、９．２ｇ／ｄＬ）に加えた。反応混合物を窒素雰囲気
下、室温で１時間撹拌し、次いで酸素化した。混合物の半分から、ゲルろ過によ
って過剰の架橋剤を除去し、次いで溶液をＣＯで充満して凍結し、Ｋｌｕｇｅｒ
（米国特許第５３９９６７１号）によって記載されているように、クロスリンカ
ー上に活性化エステルを有する架橋Ｈｂ（ＴＨｂ−ＤＢＳ、６２ｍｇ／ｍＬ）を
得た。未精製反応混合物のもう一方の半分から、０．１Ｍ Ｌ−リジン／Ｌ−リ
ジン塩酸塩溶出緩衝液（ｐＨ９．０）を用いたゲルろ過によって未反応の架橋剤
を除去した。溶出液をＣＯで充満し、室温で終夜放置した。この方法を用いて、
リジンは活性化エステルを介してリンカーに結合し、ＴＨｂ−Ｌｙｓを得た。新
しく解凍したＴＨｂ−ＤＢＳ（２９．５ｎｍｏｌ、３０．５μＬ）を、放射性同
位体標識したリジンおよび放射性同位体標識していないリジンに毎日３日間加え
た。ＴＨｂ−Ｌｙｓ（７００μＬ）を次いで両混合物に加え、生成物を脱塩した
。反応の完了は、アニオン交換クロマトグラフィによって確認した。
【００４８】実施例６−ハプトグロビン−ＴＨｂ−Ｌｙｓ複合体： ハプトグロビン（水中１．６１ｍｇ／ｍＬのハプトグロビン１−１、１１μＬ
）をＴＨｂ−Ｌｙｓ（５０ｍＭホウ酸ナトリウムｐＨ９．０中３８ｍｇ／ｍＬ）
に加えて、下記の最終濃度とした：０．６８ｍｇ／ｍＬ（６．９μＭ）のハプト
グロビンおよび０．４１ｍｇ／ｍＬ（６．４μＭ）のＴＨｂ−Ｌｙｓを、２５ｍ
Ｍリン酸カリウムｐＨ７．０で最終容積２００μＬとした。１８時間以内に、ハ
プトグロビン−ＴＨｂ−Ｌｙｓ複合体がＳＥＣにより２８０および４１４ｎｍに
吸収を示す高分子量種として観察され、本来のハプトグロビンおよび元のＴＨｂ
−Ｌｙｓ生成物とは別に溶出された（図８）。構築物複合体をＳＥＣにより精製
した。カラムはリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で平衡化し、溶出した。
【００４９】実施例７−ハプトグロビン−ＴＨｂ−[3Ｈ]−Ｌｙｓ複合体： ＴＨｂ−[3Ｈ]−Ｌｙｓ（７５μＬ、４１ｍｇ／ｍＬ、０.６５７Ｃｉ／ｍｍｏ
ｌ）を、部分精製したハプトグロビン１−１（０．２７３ｍＬ、３．７ｍｇ／ｍ
Ｌ）のＰＢＳ ｐＨ７．４溶液に加えた。混合物を室温で終夜インキュベートし
た。ＴＨｂ−[3Ｈ]−Ｌｙｓ−Ｈｐ複合体を、ＰＢＳ ｐＨ７.４で平衡化および
溶出するＳＥＣを用いて精製した。放射活性は主にＳＥＣにより同定された高分
子量種で認められ、これは２８０および４１５ｎｍに吸収を示し、本来のハプト
グロビンおよび元のＴＨｂ−Ｌｙｓ生成物とは別に溶出され、保持時間が実施例
６の非放射性同位体標識生成物に対応していた。
【００５０】実施例８−フルオレセイン−ヘモグロビン結合体（ＦＬ−Ｈｂ）の合成： ５−ヨードアセトアミドフルオレセイン（５−ＩＡＦ、１１ｍｇ、２１μｍｏ
ｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、５０μＬ）溶液を、５０ｍＭリ
ン酸カリウムｐＨ７．０中のオキシヘモグロビン（６０ｍｇ／ｍＬ、５ｍＬ）に
４℃で撹拌しながら徐々に加えた。４℃で３時間反応させた後、５０ｍＭリン酸
カリウムｐＨ７．２で透析液中に５−ＩＡＦが検出されなくなるまで透析するこ
とにより、過剰の５−ＩＡＦを除去した。生成物のＵＶ−可視吸光スペクトルか
ら、４９６ｎｍに特徴的なフルオレセインの吸収帯が認められた。
【００５１】実施例９−ＦＬ−Ｈｂのハプトグロビン１−１、２−１、および混合表現型ハプ トグロビンとの複合体： ＦＬ−Ｈｂ（５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．２中６ｍｇ／ｍＬ、４０μＬ）
をハプトグロビン１−１、２−１または混合表現型（Ｈｐmix）（水中２．８ｍ
ｇ／ｍＬ、３９μＬ）に加えて、下記の最終濃度とした：２５ｍＭリン酸カリウ
ムｐＨ７．０の最終容積１８０μｌ中、０．６ｍｇ／ｍＬ（６．２μＭ）のＨｐ
および１．３ｍｇ／ｍＬ（２１μＬ）のＦＬ−Ｈｂ。室温で１０分間インキュベ
ートした後、混合物をＳＥＣによって分析した。ＦＬ−Ｈｂのハプトグロビン１
−１との複合体は３３分で移動し（図９Ａ−Ｈｐ１−１およびＨｐ１−１のＦＬ
−Ｈｂとの複合体の重ね合わせＳＥＣクロマトグラム）、ハプトグロビンとはそ
の４１４ｎｍの吸収によって明らかに区別することができる。ＦＬ−Ｈｂは４２
．９分で移動した（図９Ａ）。ＦＬ−ＨｂのＨｐ１−１およびＨｐmix との複合
体を、ＵＶ−可視分光法（図９Ｂ−ハプトグロビン１−１およびＨｐmix のＦＬ
−Ｈｂとの複合体のＵＶ−可視スペクトル、矢印はフルオレセインに特徴的なバ
ンドを示している）および蛍光分析法によって単離し、分析した。この物質は、
４８０ｎｍで励起され、５２０ｎｍで発光する蛍光と、４９６ｎｍにλmax を持
つフルオレセインの特徴的吸収帯を示す。ＦＬ−ＨｂのＨｐ２−１およびＨｐmi x との複合体をそれぞれ図９Ｃおよび９Ｄに示している。構築物複合体をＳＥＣ
でＰＢＳ緩衝液で溶出して精製した。
【００５２】実施例１０−トリチル化プトレッシンを有する架橋ヘモグロビンの合成： ２００ｍＬの精製したＨｂを５０ｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ９．０中に透析ろ過し
、次いで脱酸素化して、濃度を７．１ｇ／ｄＬに調整した。Ｈｂを、ＴＴＤＳ対
Ｈｂの比２：１で、３０℃で４５分間架橋し、次いで５０ｍＭホウ酸ｐＨ９．０
緩衝液により脱塩して、最終濃度３．１ｇ／ｄＬとした。１．４３ｍＬの脱塩し
たＨｂを、放射性同位体標識したプトレッシン（１ｍＣｉ／ｍＬ、６．９４×１
０-5ｍｍｏｌ／ｍＬ）１ｍＬのアリコート２つそれぞれに加え、室温で１．５時
間反応させた（Ｈｂ：プトレッシン＝１０：１）。０．９ｍｇの冷プトレッシン
（放射性同位体標識プトレッシンの４０倍過剰）を１７ｍＬのＴＨｂ−ＤＢＳと
、ＴＨｂ−ＤＢＳ：プトレッシン＝１．５：１の比で反応させた。この溶液５ｍ
Ｌを２つの反応混合物それぞれに加え、室温で終夜混合した。両方の混合物を次
いで、新しく架橋し、脱塩したＴＨｂ−ＤＢＳ（５．３×１０-5ｍｏｌ）に加え
、室温で１．５時間反応させた。次いで、２０倍過剰の冷プトレッシン（１７２
ｍｇ）を加え、終夜反応させた。ＴＨｂ−[3Ｈ]Ｐｕ を次いで乳酸リンガー液中
に透析ろ過した。比活性は１．５Ｃｉ／ｍｏｌ、９０ｍｇ／ｍＬであった。
【００５３】実施例１１−ハプトグロビン１−１のＴＨｂ−[3Ｈ]Ｐｕ との複合体： ハプトグロビン（水中３.０ｍｇ／ｍＬ、５１μＬ）をＴＨｂ−[3Ｈ]Ｐｕ（Ｐ
ＢＳ ｐＨ７．２中１０ｍｇ／ｍＬ、２０μＬ）に加えて、下記の最終濃度とし
た：２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．０の最終容積１１０μｌ中、１．４ｍｇ／
ｍＬ（１４μＭ）のハプトグロビンおよび１．８ｍｇ／ｍＬ（２８μＭ）のＴＨ
ｂ−[3Ｈ]Ｐｕ 。混合物を室温で２時間インキュベートした後、ＳＥＣにより分
析した。溶出液のフラクション（０．４ｍＬ）を集め、シンチレーション計数に
よって分析した。ＴＨｂ−[3Ｈ]Ｐｕ−Ｈｐ 複合体は溶出時間２０〜２８分の高
分子量種として移動し（図１０）、３０分のハプトグロビンのバンドおよび３７
分のＴＨｂ−[3Ｈ]Ｐｕ とよく分離された。ＴＨｂ−[3Ｈ]Ｐｕ−Ｈｐ は２８０
ｎｍおよび４１４ｎｍの両方で吸収を示し（Ａ280nm／Ａ414nm＝０．７４）、Ｔ
Ｈｂ[3Ｈ]Ｐｕ とほぼ同等の比放射活性（ｃｐｍ／ｍｇ Ｈｂ）を有している。
構築物複合体をＳＥＣによって精製した。
【００５４】実施例１２−モノダンシルカダベリンを有する架橋ヘモグロビンの合成： 精製したＨｂ（８．０ｇ／ｄＬ、１００ｍＬ、１．２５×１０-4ｍｏｌ）を５
０ｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ９．０中に透析ろ過し、次いで酸素化し、脱酸素化した
。ＴＴＤＳ（Ｈｂモル数の２倍過剰、０．２６ｇ、２．５×１０-4ｍｏｌ）脱酸
素化溶液を加え、混合物を３５℃で１時間撹拌し、次いでＣＯで充満した。この
時点でのイオン交換クロマトグラフィでは、少量の未反応Ｈｂ（１．７％）が認
められたにすぎなかった。約２０ｍＬの０．１Ｍ ＨＣｌ中、モル数にして１５
倍過剰のモノダンシルカダベリン（ＭＤＣ）を５０ｍＭホウ酸ｐＨ９．０で２５
ｍＬに調整したものを、架橋Ｈｂ（０．６３ｇ、１．８８×１０-3ｍｏｌ）に加
えた。室温で６０時間後、ＭＤＣ−Ｈｂを１０ｍＭ ホウ酸ｐＨ９．０に対して
透析ろ過した。生成物をゲルろ過によって精製し、乳酸リンガー液中に透析ろ過
した。
【００５５】実施例１３−ハプトグロビン１−１のＴＨｂ−ＭＤＣとの複合体： ＴＨｂ−ＭＤＣ（乳酸リンガー液ｐＨ７．２中２０ｍｇ／ｍＬ、３．５μＬ）
をハプトグロビン１−１（水中１．１ｍｇ／ｍＬ、２００μＬ）に加えて、下記
の最終濃度とした：１．１ｍｇ／ｍＬ（１１μＭ）のＨｐおよび０．３４ｍｇ／
ｍＬ（５．４μＭ）のＴＨｂ−ＭＤＣ。混合物を室温で２４時間インキュベート
した後、ＳＥＣにより分析した。ＴＨｂ−ＭＤＣのハプトグロビンとの複合体は
溶出時間２１〜２９分の高分子量種として移動した（図１１）。この物質はハプ
トグロビン（３０．９分）とは分離して移動し、２８０ｎｍおよび４１４ｎｍの
両方で吸収を示した（Ａ280nm／Ａ414nm＝０．７０）。ＴＨｂ−ＭＤＣは３７．
９分で溶出し、Ａ280nm／Ａ414nm＝０．２９である。構築物複合体をＳＥＣによ
って精製することができる。
【００５６】実施例１４−プリマキンを有する架橋ヘモグロビン（ＴＨｂ−ＰＱ）の合成： ＴＴＤＳ（１４．０ｍｇ）／エタノール（１００μＬ）をデオキシヘモグロビ
ン（１０ｍＬ、５８ｍｇ／ｍＬ）／５０ｍＭホウ酸ｐＨ９．０に加えた。反応混
合物を窒素雰囲気下、室温で１時間撹拌した。次いで、過剰の架橋剤をゲルろ過
で５０ｍＭホウ酸ｐＨ９．０で溶出することによって除去し、生成物（ＴＨｂ−
ＤＢＳ、４３ｍｇ／ｍＬ）をＣＯで充満した。プリマキン２リン酸（０．５ｇ、
１．１ｍｍｏｌ）を５０ｍＭホウ酸ｐＨ９．０（１０ｍＬ）に溶解し、得られた
溶液のｐＨを１０Ｍ ＮａＯＨで８．５に調整した（プリマキンが一部沈殿した
）。ＴＨｂ−ＤＢＳ（１０ｍＬ）をプリマキンに加え、反応混合物を暗所、室温
で終夜撹拌した。次いで、生成物をろ過し、ろ液を５０ｍＭホウ酸ｐＨ９．０に
対して透析した。生成物のアニオン交換クロマトグラフィ（図１２）により、Ｔ
Ｈｂ−ＰＱは混合物中のすべてのヘモグロビン成分の６８％を構成することが明
らかにされた。生成物を逆相クロマトグラフィを用いて分析すると、プリマキン
に結合したＴＨｂ−ＤＢＳはすべてのβ鎖の６４％を構成している。
【００５７】実施例１５−ハプトグロビン１−１のＴＨｂ−ＰＱとの複合体： ＴＨｂ−ＰＱ（５０ｍＭホウ酸ｐＨ９．０中１５ｍｇ／ｍＬ、６７μＬ）をハ
プトグロビン１−１（水中４．０ｍｇ／ｍＬ、５００μＬ）に加えて、下記の最
終濃度とした：２．０ｍｇ／ｍＬ（２０μＭ）のＨｐおよび１．０ｍｇ／ｍＬ（
１５．７μＭ）のＴＨｂ−ＰＱ。混合物を室温で２１時間インキュベートした後
、ＳＥＣおよびアニオン交換クロマトグラフィにより分析した。ＴＨｂ−ＰＱの
ハプトグロビンとの複合体は溶出時間２１〜２９分の高分子量種として移動した
（図１３）。この物質は非架橋ヘモグロビンと複合したハプトグロビン（２９．
９分）およびハプトグロビン（３０．６分）とは分離して移動し、２８０ｎｍお
よび４１４ｎｍの両方で吸収を示した（Ａ280nm／Ａ414nm＝０．７０）。アニオ
ン交換クロマトグラフィにより、すべての未修飾ヘモグロビンと、ＴＨｂ−ＰＱ
およびＴＨｂの両方の７４％とがＨｐと反応したことが示された。この結果は、
ヘモグロビンの７８％がＨｐと反応したことを示すＳＥＣ分析とよく一致してい
る。
【００５８】実施例１６−ハプトグロビン−［ポリ−Ｏ−ラフィノース−Ｈｂ］およびハプト グロビン−［６４ｋＤａ−Ｏ−ラフィノース−Ｈｂ］複合体 Ｐｌｉｕｒａ（米国特許第５５３２３５２号）の方法に従い、ＨｂＡ０を酸化
ラフィノース（ＯＲ）を用いて架橋し、重合した。重合したＨｂ（＞６４ｋＤａ
のＯＲ−Ｈｂ）に相当する６４ｋＤａよりも大きい分子量種を、サイズ排除クロ
マトグラフィによって６４ｋＤａの種から分離した。Ｈｂ調製物を、水中のヒト
ハプトグロビン１−１と別々に合わせ、最終濃度０．２ｍｇ Ｈｂ／ｍＬおよび
０．１２５ｍｇハプトグロビン／ｍＬとした（最終Ｈｂ：Ｈｐ＝約２．２：１）
。混合物を２２℃で１時間インキュベートし、次いで解離、非変性溶出条件（０
．５Ｍ ＭｇＣｌ2、２５ｍＭトリスｐＨ７．４）でのサイズ排除クロマトグラ
フィによって分析した。図１４は２８０ｎｍ（実線）および４１４ｎｍ（破線）
で検出したサイズ排除クロマトグラフィの溶出特性を示しており、これによって
修飾ヘモグロビンがハプトグロビンと結合していることが明らかにされている。
修飾ヘモグロビンをハプトグロビンとインキュベートすることにより、修飾ヘモ
グロビンまたはハプトグロビンのいずれにも対応しない高分子量種が得られ、こ
れは４１４ｎｍに吸収を示すことからヘモグロビンの含有を示唆している。
【００５９】実施例１７−修飾ヒトＨｂ([3Ｈ]−ＮＥＭ−Ｈｂ）の血漿中ラットハプトグロビ ンへの結合 １ｍＣｉの 3Ｈ−Ｎ−エチルマレイミド([3Ｈ]−ＮＥＭ)／ペンタンを０．５
ｍＬのリン酸緩衝液中で蒸発させ、緩衝液１ｍＬ中２５ｍｇのＨｂを加えて、Ｎ
ＥＭ：Ｈｂの最終比を０．０６：１、すなわち３７μＣｉ／ｍｇ Ｈｂとした。
４℃で２４時間後の逆相ＨＰＬＣ分析により、放射性同位体標識の大部分が修飾
されたベータピークに取り込まれたことが示された。４７時間後、１５倍過剰（
βＣｙｓ９３のチオールに対し）の非標識ＮＥＭを加えた。塩および結合してい
ないＮＥＭをゲルろ過によって除去し、最終濃度を１０．２ｍｇ Ｈｂ／ｍＬに
調整した。次いで、この物質（3Ｈ−ＮＥＭ−Ｈｂ）の少量をハプトグロビンを
含むラット血清と合わせ、放射性同位体標識した成分がすべてＨｐに結合したか
どうかを調べた。ラット血清のＨｐ結合能を６７０μｇ Ｈｂ／ｍｇ血清に調整
した。Ｈｂ結合能に基づいて、０．５および２．０当量の 3Ｈ−ＮＥＭ−Ｈｂを
血清と合わせ、０．５Ｍ ＭｇＣｌ2、２５ｍＭトリスｐＨ７．４を用いた解離
、非変性条件で溶出したサイズ排除クロマトグラフィによって分析した（図１５
）。 3Ｈ−ＮＥＭ−Ｈｂ調製物において、放射活性はすべて３２ｋＤａのピーク
で認められた。０．５当量の 3Ｈ−ＮＥＭ−Ｈｂでは、放射活性はすべてＨｂ−
ハプトグロビンのピーク（３１分）中に現れた。２．０当量では、ハプトグロビ
ンは飽和し、過剰の 3Ｈ−ＮＥＭ−Ｈｂは結合せずに残存する（４１分）。血漿
成分と組合わされた放射活性の７３％は、約２２分の高ＭＷピークに現れる。こ
れらの知見は、修飾ヒトＨｂ、 3Ｈ−ＮＥＭ−Ｈｂ、のすべての成分は、血漿中
のラットハプトグロビンとの結合が可能であることを示すものである。
【００６０】実施例１８−ラットにおける修飾Ｈｂおよびハプトグロビン複合体の生体分布 修飾Ｈｂを肝臓を標的として送るＨｐの能力を、放射性同位体生態分布試験で
測定した。２つの試験品を、トリチウム標識したＮ−エチルマレイミドで修飾し
た精製ヒト ＨｂＡ0([3Ｈ]−ＮＥＭ−Ｈｂ)から調製した。すなわち、乳酸リン
ガー液中 [3Ｈ]−ＮＥＭ−Ｈｂ単独、およびラット血漿中わずかに過剰のラット
ハプトグロビンと複合した [3Ｈ]−ＮＥＭ−Ｈｂである。次の３つの処置群を分
析した：（Ａ）血漿中の修飾Ｈｂ−ハプトグロビン複合体投与を受けた健常ラッ
ト、（Ｂ）修飾Ｈｂだけの投与を受けた健常ラット（ラットのＨｂ結合能のおよ
そ２倍）、および（Ｃ）修飾Ｈｂだけの投与を受けたハプトグロビン欠乏ラット
。それぞれの場合に、約３ｍｇのＨｂを意識のあるスプレーグ ドーリー（Spra
gue-Dawley）ラットに投与した。肝臓および血漿試料を、投与後３０、６０、お
よび１２０分の時点で採取し、可溶化およびクエンチング後に放射活性をカウン
トした。値を全用量のパーセンテージおよび濃度／用量に変換し、様々な分析を
図１６に示している。これは放射活性の含有量を示しており、用量パーセンテー
ジを示すものである。図１６Ａは、血漿中の用量のパーセンテージを示している
。図１６Ｂは肝臓における用量のパーセンテージを示している。図１６Ｃは、肝
臓＋血漿における用量のパーセンテージを示している。図１６Ｄは、肝臓／血漿
濃度を示している。星印（*および**）は異なる時点の処置群内の差（ｐ＜０.０
５）を示している。十字記号（†および‡）は異なる処置群の同時点での差（ｐ
＜０．０５）を示している。
【００６１】 血漿の保持はＡ群で最も高く、Ａ群およびＢ群はいずれもＣ群よりも高かった
。血漿含量における最大の差は１２０分の時点で、Ａ群の血漿はＣ群の３倍、Ｂ
群の３．５倍の放射活性を含んでいた。ＡおよびＢ群の肝臓含量は、すべての時
点でＣ群よりも高かった。３０分では、ＡおよびＢ群は肝臓に全用量の約２０％
を有していたのに対し、Ｃ群は１１％であった。ＡおよびＢ群において肝臓含量
は３０分および６０分の時点で同等で、１２０分の時点までに低下した。１２０
分までに、ＡおよびＢ群の肝臓含量はＣ群に比べてそれぞれ５倍および２倍高か
った。ＡおよびＢ群は、３０分の時点で血漿および肝臓区画に用量の６０％を含
み、これに比べてＣ群の動物ではそのおよそ半分の量を含んでいた。肝臓対血漿
の濃度／用量比は、すべての群で時間と共に上昇し、ＡおよびＢ群の肝臓濃度は
１２０分までに血漿濃度の約４倍となり、同じ時点でのＣ群の比のおよそ２倍で
あった。群間の肝臓および血漿を合わせた平均含量を比較することによって、血
漿保持および肝臓ターゲティングの改善がさらに示され、図１７に、すなわち合
計用量に対し肝臓および血漿を合わせた平均パーセンテージの比を示している。
網掛けバーはＡ／Ｃ群から、黒いバーはＢ／Ｃ群から、白いバーはＡ／Ｂ群から
のものである。ＡおよびＢ群の肝臓および血漿を合わせた含量は、一貫してＣ群
よりも高く、１２０分の時点でＡ群は合わせた含量がＣ群よりも４倍高かった。
分布曲線下面積を時点ゼロに外挿せずに計算し（表２）、ＡおよびＢ群の肝臓取
り込みがＣ群の約２倍であることが示された。データは全般に、あらかじめ形成
された修飾Ｈｂとの複合体、または投与されたＨｂと複合体を形成することが可
能な場合に内在性Ｈｐの形のいずれかでＨｐが存在するとき、肝臓内に生成物を
濃縮する能力がより大きいことを示している。また、薬物結合体がより長い時間
組織の取り込みに利用可能となるように、Ｈｂ結合体の血漿保持がハプトグロビ
ンとの組み合わせによって増大するということが明らかに示されてもいる。
【００６２】
【表２】
【００６３】 したがって、薬剤は、側鎖官能基、分子内クロスリンカー、または分子内クロ
スリンカーに結合した第２のリンカーのいずれかへの結合を用いて、３２ｋＤａ
のヘモグロビン２量体および６４ｋＤａの分子内架橋Ｈｂのいずれにも結合でき
ることが明らかにされた。これらの構築物はすべてハプトグロビンに結合した。
このようなインビボまたはエクスビボで形成された構築物複合体の肝臓への選択
的ターゲティングおよび循環半減期の延長も、さらに示された。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の構築物複合体の１つの実施形態を製造するプロセスを図によって例示
した反応スキームを示す図である。
【図２】 ２８０ｎｍおよび４１４ｎｍの吸光度を溶出時間に対してプロットした形で表
したサイズ排除クロマトグラフィの結果で、実施例２の４つの生成物の分子量分
布を示す図である。複合体は、分子量がＡは４ｋＤａ、ｂは７．５ｋＤａ、Ｃは
２６ｋＤａおよびＤは３７ｋＤａのポリ（Ｌ−リジン）を用いて形成した。
【図３】 実施例２で生成した、ハプトグロビンと２４時間インキュベートした後の２６
ｋＤａのポリ（Ｌ−リジン）を用いる生成複合体に関する、同様のプロットを示
す図である。
【図４】 ＡはＴＨｂ、およびＢは実施例４にしたがって生成したＴＨｂ−ポリ（Ｌ−リ
ジン）存在下でのＤＮＡのゲル易動度シフトアッセイを示す図である。
【図５】 実施例４の生成物の色素蛍光アッセイを示す図である。
【図６】 実施例４の生成物のゲル易動度シフトアッセイを示す図である。
【図７】 実施例４のもう１つの生成物の蛍光アッセイを示す図である。
【図８】 実施例６の生成物のサイズ排除クロマトグラムを示す図である。
【図９】 Ａはハプトグロビン１−１、Ｃはハプトグロビン２−１、Ｄはハプトグロビン
２−２を用いた、実施例９の生成物のサイズ排除クロマトグラムを示す図である
。 また、Ｂは実施例９の生成物のＵＶ−可視スペクトルを示す図である。
【図１０】 実施例１１の生成物のサイズ排除クロマトグラムを示す図である。
【図１１】 実施例１３の生成物のサイズ排除クロマトグラムを示す図である。
【図１２】 実施例１４の生成物および出発物質のアニオン交換クロマトグラム（重ね合わ
せ）を示す図である。
【図１３】 実施例１５の生成物の重ね合わせたサイズ排除クロマトグラムを示す図である
。
【図１４】 実施例１６の生成物について、２８０ｎｍ（実線）および４１４ｎｍ（破線）
で検出したサイズ排除クロマトグラフィの溶出特性を示す図である：Ａはハプト
グロビン１−１、Ｂは６４ｋＤａのＯＲＨｂ、Ｃはハプトグロビン−［６４ｋＤ
ａ ＯＲＨｂ］、Ｄは＞６４ｋＤａのＯＲＨｂ、Ｅはハプトグロビン−［＞６４
ｋＤａ ＯＲＨｂ］。
【図１５】 実施例１７の生成物のサイズ排除クロマトグラムを示す図である。
【図１６】 Ａ〜Ｄは実施例１８で得られた結果の分析のグラフ表示の図である。
【図１７】 実施例１８で得られた結果のさらなる分析のグラフ表示の図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 Ａ６１Ｋ 37/14 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 モーア，マリー，シルヴィー，セリーヌ カナダ．エル７ジー ５ダブリュ３ オン タリオ，ジョージタウン，スタンディッシ ュ ストリート 83 Ｆターム(参考） 4C076 CC05 CC14 CC16 CC21 CC27 CC31 CC34 CC35 CC41 FF68 4C084 AA02 AA03 AA06 AA07 AA13 BA31 BA44 CA59 DC50 NA10 NA13 ZA752 ZB112 ZB212 ZB262 ZB332 ZB352 ZB372 ZC192 ZC332 ZC372 4C085 HH11 KB83 LL05 4H045 AA10 BA41 CA40 EA27 EA28 FA74

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヘモグロビンとそれに結合した肝細胞修飾物質とを含むヘモ
    グロビン構築物複合体であって、哺乳類患者においてインビボでハプトグロビン
    に結合し、肝細胞修飾物質を患者の肝細胞に送達することが可能な構築物複合体
    。
  2. 【請求項２】 ヘモグロビンと、ヘモグロビンに結合した肝細胞修飾物質と
    、ヘモグロビンに結合したハプトグロビンとを含むヘモグロビン構築物複合体。
  3. 【請求項３】 哺乳類患者に請求項１に記載の構築物複合体を投与すること
    によってインビボで形成された、請求項２に記載の構築物複合体。
  4. 【請求項４】 肝細胞修飾物質が化学リンカーの媒介によりヘモグロビンに
    結合している、前記請求項のいずれか一項に記載の構築物複合体。
  5. 【請求項５】 肝細胞修飾物質が肝細胞と相互作用可能で、その結果、哺乳
    類患者の肝臓においてインビボで作用可能であって、かつ治療薬、診断薬および
    マーカーから選択された薬剤である、前記請求項のいずれか一項に記載の構築物
    複合体。
  6. 【請求項６】 肝細胞修飾物質が、抗新生物物質、抗ウイルス物質、抗炎症
    物質、抗寄生虫物質、抗菌物質、抗酸化物質、肝防護薬、細胞防護薬、線維形成
    に影響をおよぼす薬、核酸、脂質代謝薬、抗毒物、蛋白質および酵素から選択さ
    れる治療薬である、請求項５に記載の構築物複合体。
  7. 【請求項７】 肝細胞修飾物質が核酸である、請求項５に記載の構築物複合
    体。
  8. 【請求項８】 肝細胞修飾物質が興味対象となる蛋白質をコードする遺伝子
    である、請求項６に記載の構築物複合体。
  9. 【請求項９】 肝細胞修飾物質がプトレッシンである、請求項５に記載の構
    築物複合体。
  10. 【請求項１０】 肝細胞修飾物質がプリマキンである、請求項６に記載の構
    築物複合体。
  11. 【請求項１１】 肝細胞修飾物質が診断薬である、請求項５に記載の構築物
    複合体。
  12. 【請求項１２】 診断用化合物が放射性同位体標識された化合物または蛍光
    化合物である、請求項１１に記載の構築物複合体。
  13. 【請求項１３】 ヘモグロビンが分子内架橋されているヒトヘモグロビンで
    ある、前記請求項のいずれか一項に記載の構築物複合体。
  14. 【請求項１４】 ヘモグロビンが、化学残基をその後の肝細胞修飾物質との
    反応に利用できる状態にしておく架橋試薬により、直接または化学リンカー基の
    媒介によって分子内架橋されている、請求項１３に記載の構築物複合体。
  15. 【請求項１５】 架橋試薬が３官能性試薬であって、その官能基の２つをヘ
    モグロビンの分子内架橋に用い、３つ目の官能基は求核剤との反応に利用できる
    状態にしておく試薬である、請求項１４に記載の構築物複合体。
  16. 【請求項１６】 架橋試薬がトリメソイルトリス（３，５−ジブロモサリチ
    レート）である、請求項１５に記載の構築物複合体。
  17. 【請求項１７】 哺乳類患者の肝細胞障害を治療するための医薬品調製にお
    ける、前記請求項のいずれか一項に記載の構築物複合体の使用。
  18. 【請求項１８】 哺乳類患者の肝細胞障害を診断するための医薬品調製にお
    ける、請求項１から１６のいずれか一項に記載の構築物複合体の使用。
  19. 【請求項１９】 哺乳類患者のハプトグロビン受容体を有する転移細胞を治
    療するための医薬品調製における、請求項１から１６のいずれか一項に記載の構
    築物複合体の使用。
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