BR112020022633A2 - copolímero biocompatível contendo moléculas de agente ativo múltiplas - Google Patents

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BR112020022633A2
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BR112020022633-5A
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Christian Geraths
Christophe Thommen
Michael Hackebeil
Davide Panighetti
Hans Hitz
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Cis Pharma Ag
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Abstract

COPOLÍMERO BIOCOMPATÍVEL CONTENDO MOLÉCULAS DE AGENTE ATIVO MÚLTIPLAS. A presente divulgação se refere à liberação de agentes ativos, por exemplo, substâncias medicamentosas, usando como portadores para sua liberação copolímeros biocompatíveis compreendendo aminoácidos ligados na cadeia lateral tendo agentes ativos ligados aos seus grupos alfa-amino e/ou alfa-carboxila, diretamente ou por intermédio de moléculas ligantes. O copolímero contendo agentes ativos pode ser funcionalizado para conter porções de alvejamento específicas do tipo celular ou do tipo tecidual.

Description

“COPOLÍMERO BIOCOMPATÍVEL CONTENDO MOLÉCULAS DE AGENTE ATIVO MÚLTIPLAS” REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos EUA No 62/762.549, depositado em 10 de maio de 2018, pedido este que é incorporado aqui a título de referência em sua totalidade.
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] O presente pedido está sendo depositado junto com uma Listagem de Sequências em formato eletrônico. A Listagem de Sequências é fornecida como um arquivo intitulado “CIS-010 PCT_ST25.txt”, criado em 2 de maio de 2019, que é de 4 KB em tamanho. A informação no formato eletrônico da Listagem de Sequências é incorporada aqui a título de referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] A invenção se refere à liberação de agentes ativos, por exemplo, substâncias medicamentosas, usando como portadores para sua liberação copolímeros biocompatíveis compreendendo aminoácidos ligados na cadeia lateral tendo agentes ativos ligados aos seus grupos alfa-amino e/ou alfa-carboxila, diretamente ou por intermédio de moléculas ligantes.
FUNDAMENTOS
[004] Câncer é uma das maiores ameaças à saúde humana e dado o fato de que sua probabilidade é uma função da idade, os números de caso aumentarão com o envelhecimento da população. Berger, NA et al. (2006) Cancer in the Elderly, Transactions of the American Clinical and Climatological Association 117: 147 - 156; Yancik, R (2005) Cancer J. 11: 437 - 41. Nos últimos anos, as terapias tumorais fizeram enormes melhorias devido ao uso de agentes específicos de tumores tais como anticorpos monoclonais. Estes anticorpos bloqueiam os sinais de proliferação tais como a via do fator de crescimento epidérmico (EGFR) (Cetuximabe Erbitux®,
Merck KGaA;/Panitumumabe, Vectibix®, Amgen/Trastuzumabe, Herceptin®, Roche) ou impedem a formação de novos vasos sanguíneos alvejando-se a via do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (Bevacizumabe, Avastin®, Roche) para retardar o crescimento tumoral. Visto que seus antígenos alvos são usualmente super- expressados em tecidos tumorais, as células saudáveis são menos prejudicadas, portanto, as terapias com anticorpos têm menos efeitos fora do alvo em comparação aos agentes citotóxicos convencionais. Zhou, Q. (2017) Biomedicines 5(4); Reichert, JM (2017) MAbs 9: 167 - 181. A única especificidade de anticorpos foi também usada para abordagens de combinação destinadas a alvejar fármacos citotóxicos a células tumorais. Estes assim chamados conjugados de anticorpo e fármaco (ADCs) provaram ser superiores às monoterapias com anticorpos ou agentes citotóxicos. Embora conhecido desde a década de 1960, o conceito de ADC finalmente encontrou interesse na indústria farmacêutica no desenvolvimento clínico recentemente e mais do que 60 ADCs estão passando por testes clínicos. Mullard, A (2013) Nat Rev Drug Discov 12: 329; Beck, A et al. (2017) Nat Rev Drug Discov 16: 315 - 337.
[005] A primeira geração de ADCs usou grupos amino livres nos anticorpos para fixar fármacos citotóxicos e construções ligantes de fármacos. Com até 80 grupos amino livres por anticorpo, sua funcionalização leva a espécies de ADC altamente heterogêneas com diferentes razões de fármaco para anticorpo (DAR) e afinidades devido à ligação não intencionada de fármacos citotóxicos à interface de ligação dos anticorpos. A heterogeneidade com respeito a DARs pode ser restrita até certo ponto ajustando-se a estequiometria de fármaco e anticorpo usados na reação. Com respeito à especificidade do sítio, a heterogeneidade foi limitada pela acessibilidade química da década de 1980 quando os primeiros testes clínicos foram conduzidos. Demorou mais de 20 anos para a aprovação pela FDA do primeiro ADC. O desenvolvimento de ADCs aumentou dramaticamente tendo em vista que: 30 ADCs entraram em grupos reativos. Estas heterogeneidades foram também os principais problemas e preocupações regulatórias com os primeiros ADCs. Yao, H et al. (2016) Int J Mol Sci 17(2): 194. Além disso, os primeiros ADCs foram baseados em imunoglobulinas de camundongo conhecidas por evocarem respostas imunes importantes. Por causa destas desvantagens a primeira geração de ADC falhou em mostrar muita melhoria em relação a terapias convencionais, de modo que gentuzumabe ozogamicina (Mylotarg®), o primeiro ADC aprovado pela FDA, foi voluntariamente retirado do mercado pela Pfizer em 2010. Beck, A et al. (2017) Nat Rev Drug Discov 16(5): 315 - 337; Beck, A et al. (2010) Discov Med 10(53): 329 - 39.
[006] A segunda geração de ADCs atenua estas dificuldades alvejando-se grupos tiol livres dos anticorpos humanizados. Estes grupos tiol livres foram gerados antes da reação de acoplamento por redução suave (por exemplo, com 1,4-ditiotreitol (DTT)) de 4 pontes dissulfeto intercadeia na região da dobradiça dos anticorpos. Com esta estratégia, os sítios de ligação potenciais podem ser reduzidos para 8, resultando em uma homogeneidade mais alta dos ADCs. Dado o fato de que as ligações dissulfeto intercadeia desempenham um papel crucial na integridade do anticorpo, a homogeneidade mais alta foi frequentemente paga pelos efeitos negativos sobre a estabilidade do anticorpo. Embora ligantes mais específicos que preservam a integridade da ponte dissulfeto tenham sido designados (como elaborado, por exemplo, em Shaunak, S et al. (2006) Nat Chem Biol 2(6): 312 - 3 e Balan, S et al. (2007) Bioconug Chem 18(1): 61 - 76), os ADCs gerados sofreram de baixos DARs que eram tipicamente de cerca de 3 a 4. Se a carga do fármaco foi ainda mais aumentada, a estabilidade dos anticorpos foi negativamente afetada, levando à depuração rápida da corrente sanguínea. Além disso, a afinidade dos anticorpos por seus alvos específicos de célula tumoral foi negativamente afetada. Beck et al. (2017) Nat Rev Drug Discov 16(5): 315 - 337; Yao et al. (2016) Int J Mol Sci 17(2): 194.; Beck et al. (2010) Discov Med 10(53): 329 - 39. Visto que apenas algumas entidades citotóxicas foram acopladas a estes anticorpos, agentes citotóxicos convencionais como doxorrubicina provaram ser insuficientemente eficazes em matar células tumorais. Tolcher, AW (1999) J Clin Oncol 17(2): 478 - 478. Portanto, novas classes de agentes citotóxicos tiveram que ser usadas cuja citotoxicidade era várias ordens de magnitudes mais alta. Exemplos para estas substâncias são inibidores de microtúbulo como mertansina (DM1) ou monometilauristatina E (MMAE). Beck et al. (2017). Com tais substâncias medicamentosas potentes, é crucial que a carga tóxica de ADCs seja apenas liberada em seu sítio alvo. De outro modo, é provável que resultem efeitos colaterais severos. O ligante entre o fármaco e o anticorpo desempenham desse modo um papel principal. ADCs recentemente comercializados como Trastuzumabe entansina (Kadcyla®, Roche) e Brentuximabe vedotina (Adcetris®, Tekada Pharmaceutical) bem como o conceito de Mersana (Mersana Therapeutics Inc. (Cambridge, MA)) usam ligantes com base em maleimida que são conhecidos reagirem com proteínas portadoras de cisteína, em particular albumina sérica. Alley, SC et al. (2008) Bioconjug Chem 19(3): 759 - 765. Shen, BQ et al. (2012) Nat Biotechnol 30(2): 184 - 9.
[007] A assim chamada terceira geração de ADCs fizeram uso de acoplamento específico de sítio do fármaco ao anticorpo. Um exemplo proeminente é Vadatuximabe tailirina da Seattle Genetics contra leucemia mieloide aguda (AML). O ADC contém uma cisteína geneticamente projetada na posição 239 em ambas as cadeias pesadas que é usada para o acoplamento do dímero pirrolobenzodiazepina (PBD) que é capaz de reticular o DNA, desse modo bloqueando a divisão celular e causando a morte celular. O ADC foi testado com êxito em um estudo de fase I e está correntemente em um teste clínico de fase III. Beck et al. (2017); Kennedy, DA et al. (2015) Cancer Res 75(15 Supp.), Abstract DDT02-04. Outros exemplos de acoplamento específico de sítio de fármaco a anticorpo fazem uso de etiquetas inteligentes tal como uma “etiqueta de aldeído” (Redwood Biosciences, Catalent) ou uma “etiqueta de sortase” (SMAC-Technology™, NBE Therapeutics; Stefan, N et al.
(2017) Mol Cancer Ther 16(5): 879 - 892). As últimas duas abordagens introduzem etiquetas de peptídeo geneticamente projetadas no anticorpo para funcionar como motivos específicos para reações de acoplamento enzimático. ADCs de terceira geração representam produtos mais homogêneos com estabilidade aumentada, mas ainda liberam apenas algumas entidades tóxicas por anticorpo.
[008] Para evitar esta limitação, uma nova abordagem que usa um portador polimérico foi recentemente desenvolvida pela Mersana Therapeutics. Este conceito é baseado na funcionalização de um polímero portador degradável (referido como “Fleximers”) com várias moléculas de fármaco citotóxicas. O polímero carregado com fármaco é subsequentemente acoplado a um anticorpo monoclonal por química de ligante convencional. Com isto, o DAR pode ser aumentado para 12 a 15 moléculas de fármaco por moléculas de anticorpo, moléculas de fármaco estas que foram distribuídas sobre 3 a 5 portadores de polímero ligados. “Non-clinical pharmacokinetics of XMT-1522, a HER2 targeting auristatina-based antibody drug conjugate”; apresentação de pôster na reunião anual da American Association for Cancer Research (AACR) em Washington D.C, 2017. Embora esta abordagem tenha muitas vantagens, o ADC resultante contém polímeros Fleximer de comprimento de cadeia e carga de fármaco variáveis. Em combinação com a química de ligante de tiol-maleinimida que foi usada, o peso molecular dos ADCs varia até certo ponto. Além disso, o polímero Fleximer compreende ligações éster biodegradáveis, levantando os problemas de armazenamento a longo prazo e/ou estabilidade sérica Koitka, M et al. (2010) J Pharm Biomed Anal 51(3): 664 - 78; Li, B et al. (2005) Biochem Pharmacol 70(11: 1673 - 84.
[009] Além de anticorpos, outros agentes específicos de alvo incluindo aptâmeros foram elaborados para bloquear ou ativar vias aberrantes para tratar doenças metabólicas e câncer. Aptâmeros são polinucleotídeos pequenos de filamento único com uma conformação tridimensional definida formada por pareamento de base de Watson-Crick.
Devido à sua estrutura bem definida, eles podem ser feitos para se ligar a alvos específicos incluindo moléculas pequenas isoladas tais como toxinas bacterianas ou marcadores de superfície em células com afinidade alta.
Mercier, MC et al. (2017) Canceres (Basel) 9(6): E69; Ruscito, A et al. (2016) Front Chem 4 :14. Aptâmeros são muito menores do que anticorpos, mais fáceis de produzir e carecem de imunogenicidade.
Ray, P et al. (2013) Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis 61(4): 255 - 271; Pei, X et al. (2014) Mol Clin Oncol 2(3): 341 - 348; Zhou, G et al. (2016) Oncotarget 7(12):13446 - 63. Eles são usualmente gerados a partir de um agrupamento de até 1015 polinucleotídeos aleatórios em um processo de enriquecimento que envolve etapas iterativas de ligação, lavagem e amplificação.
Depois de cada ciclo, os aptâmeros com a afinidade alvo mais alta são escolhidos para o ciclo seguinte.
Isto leva à seleção de moléculas com afinidades de ligação na faixa nano- ou ainda sub-nanomolar depois de 10 a 12 ciclos.
Este processo é também conhecido como evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX). Zhou, G et al. (2016). Análoga a anticorpos, a primeira abordagem de aptâmero terapêutico visou bloquear as vias relacionadas a doenças através de interação com proteínas, receptores ou metabólitos chaves.
Um exemplo proeminente é Macugen® (Pegaptanibe; EyeTech Pharmaceuticals, Pfizer), o primeiro aptâmero terapêutico aprovado pela FDA que entrou no mercado em 2004. Macugen® é um aptâmero de RNA com 27 nucleotídeos de comprimento e é usado em degeneração macular relacionada à idade (AMD), uma doença ocular grave que causa cegueira.
AMD é caracterizada por formação anormal de vasos sanguíneos devido a níveis elevados de fatores de crescimento.
O alvo de Macugen® é VEGF165 (isoforma), um fator de crescimento responsável pela angiogênese.
Visto que este aptâmero tinha apenas uma meia-vida curta devido à rápida depuração e degradação renais, o mesmo foi ligado a um polímero de PEG de 40 kDa para aumentar seu tamanho global.
Além disso, alguns nucleotídeos foram substituídos com 2’-flúor-
pirimidina e 2’-O-metil-purina para evitar a degradação por nucleases.
Biagi, C et al. (2014) Eur J Clin Pharmacol 70(12): 1505 - 12; Pozarowska, D et al. (2016) Cent Eur J Immunol 41(3) : 311 - 316. Ao contrário de anticorpos anti-VEGF (por exemplo, Bevacizumabe, Avastin®; Roche), Macugen® nunca foi usado ou licenciado para o tratamento de câncer devido ao desempenho deficiente em aplicações sistêmicas, provavelmente devido à compensação de efeitos por vias de desvio (por exemplo, PDGF-B). Alvarez, RH et al. (2006) Mayo Clin Proc 81(9) : 1241 - 57. A seguir das melhorias feitas em anos mais recentes, várias tentativas foram feitas para usar aptâmeros não apenas para alvejamento e bloqueio mas também como portadores para agentes citotóxicos.
Bagalkot e colaboradores desenvolveram um complexo de aptâmero-doxorrubicina tirando-se vantagem da capacidade do agente de se intercalar no DNA.
Entretanto, este complexo sofreu de eficiência de carga deficiente e depuração sistêmica rápida.
Bagalkot, V et al. (2006) Angew Chem Int Ed 45(48): 8149 - 8152. Em 2010, uma diferente abordagem foi desenvolvida com base em nanopartículas de PLGA-PEG carregadas com docetaxel/cisplatina.
Estas partículas foram guiadas às células de câncer de próstata por funcionalização com A10, um aptâmero que alveja uma proteína de membrana de célula tumoral.
Este sistema de liberação de fármaco bastante complexo mostrou resultados promissores pelo menos em experimentos in vitro.
Kolishetti, N et al. (2010) Proc Natl Acad Sci USA 107(42): 17939 - 17944. Aptâmeros foram testados ainda quanto à liberação de vários produtos terapêuticos com base em nucleotídeo tais como siRNA (RNAs interferentes curtos tipicamente designados para suprimir a expressão específica de gene). Chu, TC et al. (2006) Nucleic Acids Res 34(10): e73. Apesar do desenvolvimento de muitas abordagens diferentes que utilizam a capacidade de alvejamento de aptâmeros para o tratamento de tumor, até que os presentes aptâmeros sofram de capacidade de carga deficiente, a instabilidade séria e a depuração renal rápida, todas as quais propriedades limitam sua aplicação clínica.
Nenhum destes conjugados ou complexos de aptâmero-fármaco entraram em fase clínica III ou no mercado. Zhou et al. (2016).
[010] Par superar as deficiências mencionadas acima e aumentar a razão de fármaco para anticorpo/aptâmero (DAR) enquanto simultaneamente preservando a afinidade de anticorpo/aptâmero pelo respectivo alvo, nós desenvolvemos uma nova estratégia que utiliza um polímero biocompatível, hidrofílico, não degradável como um portador de agentes ativos. O polímero é inicialmente “carregado” com múltiplas moléculas de agente ativo. O agente ativo é introduzido no polímero durante a síntese usando monômeros conjugados a agente ativo (monômeros terapêuticos) ou subsequente à síntese através de funcionalização. Tipicamente, o polímero contendo agente ativo é subsequentemente acoplado a uma porção de alvejamento de tumor, por exemplo, um anticorpo monoclonal ou um aptâmero. Devido à sua alta hidrofilicidade, o polímero é capaz de portar mesmo fármacos citotóxicos altamente hidrofóbicos enquanto mantendo as propriedades farmacocinéticas do respectivo anticorpo/aptâmero. Moléculas de polímero podem ser fabricadas para portar uma multiplicidade (dentro dos limites, qualquer número desejável) de moléculas de agente ativo.
[011] A abordagem apresentada nesta divulgação tem a vantagem de que apenas um sítio de acoplamento é necessário para ligar uma infinidade de moléculas de agente ativo a uma molécula de anticorpo ou aptâmero. Pelo uso de métodos de acoplamento específico de sítio, por exemplo, reações de acoplamento enzimático a etiquetas de peptídeo no término C das cadeias pesadas de um anticorpo, polímero contendo agente ativo será localizado muito longe da interface de ligação do anticorpo. Com esta abordagem, a afinidade máxima pelo tecido alvo é preservada bem como um produto relativamente homogêneo é recebido. A estratégia de ligação escolhida forma uma ligação peptídica estável entre o copolímero e anticorpo/aptâmero, o que garante alta estabilidade dos ADCs na corrente sanguínea. Além disso, o acoplamento de copolímero contendo agente ativo completamente funcionalizado e caracterizado ao anticorpo/aptâmero na última etapa é destinado em minimizar a tensão conformacional nas proteínas de ligação sensíveis. Além disso, o projeto escolhido dos copolímeros facilita o acoplamento de dois ou mais agentes ativos diferentes à mesma molécula, permitindo terapias de combinação. Uma vez que o agente ativo (também referido como fármaco citotóxico ou a carga tóxica no contexto de câncer) é liberado dentro de uma célula alvejada, por exemplo, uma célula tumoral e a porção de alvejamento (por exemplo, um anticorpo ou um aptâmero) é degradada, acredita-se que o copolímero relativamente pequeno seja removido do corpo por depuração renal.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[012] A presente divulgação se refere a uma molécula de copolímero contendo moléculas múltiplas de um agente ativo bem como a métodos para fabricar este copolímero. O copolímero é fabricado por polimerização de uma mistura de reação compreendendo (1) um ou mais (tipos de) monômeros principais polimerizáveis, monômeros estes que são caracterizados como tendo pelo menos um grupo vinílico e não contendo um resíduo de aminoácido, (2) um ou mais (tipos de) monômeros co-principais das fórmulas I e/ou II em que pelo menos um de Y e Z é H, (3) um agente para controlar a polimerização de radical, agente este que é preferivelmente um agente de RAFT e (4) um sistema iniciador para gerar espécies de radical livre. A mistura de reação pode opcionalmente compreender ainda um ou mais monômeros de co-princípio de qualquer uma das fórmulas III a X. A última polimerização produz um copolímero que pode ser funcionalizado com moléculas de agente ativo múltiplas. Esta funcionalização ocorre em grupos alfa-amino ou alfa- carbóxi livres de unidades de monômero co-principal. Fórmula I em que R é -H, -CH3, -CH2-CH3 ou -(CH2)2-CH3; X é -NH(CH2)4-,-NH(CH2)3-, - O-C6H4-CH2-, -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, -S-CH2- ou -NH-C6H4-CH2- ; Y é H ou -CO- CnH2n+1 (com n = 1 a 8); Z é H (se A para -O-) ou -CnH2n+1 (com n = 1 a 8); e A é -O- ou -NH-. Fórmula II em que: R é -H, -CH3, -CH2-CH3 ou -(CH2)2-CH3; Z é H (se A for O) ou -CnH2n+1 (com n = 1 a 8); e A é -O- ou -NH-.
[013] Dependendo da estrutura do agente ativo, moléculas de agente ativo podem ser ligadas direta ou indiretamente por intermédio de estruturas ligantes a grupos alfa-amino ou alfa-carboxílicos de monômeros de co-princípio no copolímero. O último ligante deve ser estável durante o armazenamento e na corrente sanguínea para evitar a liberação não intencionada do fármaco citotóxico. O ligante pode ser capaz de ser clivado por enzimas intracelulares específicas ou pode ser de um tipo “não degradável” e apenas destruído nos ambientes adversos de lisossomas e peroxissomas.
[014] A molécula de copolímero contendo moléculas múltiplas de um agente ativo pode ser funcionalizada ainda com porção de alvejamento específica de um tipo celular ou específica de um tipo tecidual.
Porções de alvejamento potenciais são, mas não são limitadas a, anticorpos monoclonais, fragmentos de anticorpo, nanocorpos (anticorpos de domínio único), DARPins (designadas proteínas de repetição de anquirina), hormônios de peptídeo, proteínas que se ligam a proteínas expressadas na superfície de célula tumoral, aptâmeros com base em DNA ou RNA ou moléculas pequenas capazes de se ligarem a receptores de superfície celular que são conhecidos como sendo super-expressados em células tumorais, por exemplo, ácido fólico ou biotina.
A ligação covalente da porção de alvejamento é realizada em uma forma específica de sítio, tipicamente envolvendo um grupo reativo no grupo principal do copolímero (que tipicamente é introduzido por intermédio de um agente de RAFT). Estratégias de acoplamento adequadas incluem reações catalisadas por enzima com etiquetas de peptídeo, por exemplo, acoplamento mediado por sortase, etiquetas de aldeído ou etiquetas de transglutaminase ou a assim chamada reação por “clique” entre copolímero e a porção de alvejamento.
O último processo pode ser obtido por integração de aminoácidos não canônicos (não naturais), reativos na porção de alvejamento durante a síntese ou pós-síntese.
Acoplamento mediado por sortase e acoplamento mediado por transglutaminase são métodos preferidos.
No primeiro mecanismo, a porção de alvejamento é modificada para conter um motivo de sortase.
A molécula de copolímero que porta moléculas múltiplas de um agente ativo pode ser transformada em um alvo para a transpeptidação mediada por sortase por introdução de um estiramento de oligo-glicina no grupo principal do copolímero.
Este pode ser convenientemente obtido durante a polimerização em que um agente de RAFT convencional é substituído com um agente de RAFT derivado contendo 2 a 8 resíduos de glicina.
No caso de uma reação mediada por transglutaminase, o grupo principal do copolímero introduzido por um agente de transferência de cadeia adequado pode compreender um motivo de peptídeo contendo um resíduo de lisina (ou glutamina)
reativo ou um motivo que não de peptídeo por exemplo, uma estrutura ligante contendo um grupo amino terminal. A última modificação do grupo principal pode especialmente ser usada em combinação com transglutaminases microbianas, que são conhecidas como aceitando os motivos que não de peptídeo com altas taxas de renovação.
[015] Em diferentes modalidades as reações enzimáticas aqui apresentadas podem ser também usadas para modificar o sítio da porção de alvejamento específica do tipo celular ou tecidual especificamente com um grupo reativo, por exemplo, um assim chamado grupo “reativo por clique” (tal como azida para cicloadição [3+2] ou tetrazina para cicloadição [4+2]) que é subsequentemente usado para ligar um copolímero desta divulgação contendo a “contraparte” (por exemplo, um alcino no caso de uma cicloadição [3+2] ou um alceno tenso para uma cicloadição [4+2]) da reação por clique em seu grupo principal. As partes reativas mencionadas acima da reação por clique são significadas como permutáveis.
[016] Em uma outra modalidade, em que o agente ativo é instável tal como é o caso para moléculas contendo um radioisótopo de vida curta, o copolímero fabricado como descrito acima é primeiro funcionalizado com uma porção de alvejamento específica de tipo celular ou tipo tecidual usando um dos métodos descritos acima, por exemplo, acoplamento mediado por sortase ou mediado por transglutaminase. Antes do uso terapêutico, o conjugado de porção de alvejamento-copolímero depois é carregado com agente ativo, por meio do qual moléculas de agente ativo são ligadas direta ou indiretamente por intermédio de uma estrutura ligante a grupos alfa-amino ou carboxílicos livres do copolímero.
[017] Um copolímero contendo moléculas múltiplas de um agente ativo pode ser também fabricado em duas reações de polimerização sucessivas. Por exemplo, a primeira reação de polimerização é realizada em uma primeira mistura de reação compreendendo um ou mais (tipos de) monômeros principais polimerizáveis não contendo um grupo aminoácido, um agente de RAFT e um sistema iniciador para gerar espécies de radical livre, a polimerização produzindo um pré-polímero de RAFT. A segunda reação de polimerização é realizada em uma segunda mistura de reação compreendendo o pré-polímero de RAFT da primeira reação de polimerização, um ou mais (tipos de) monômeros de co-princípio das fórmulas I e/ou II e um sistema iniciador para gerar espécies de radical livre. A reação pode opcionalmente incluir um ou mais (tipos de) monômeros co-principais de qualquer uma das fórmulas III a X, e/ou um ou mais monômeros principais polimerizáveis não contendo um grupo aminoácido.
[018] Em uma modalidade mais particular, um copolímero que contém moléculas de agente ativo múltiplas é fabricado por polimerização de uma mistura de reação compreendendo (1) um ou mais (tipos de) monômeros principais polimerizáveis, monômeros estes que são caracterizados como tendo pelo menos um grupo vinílico e não contendo um resíduo de aminoácido, (2) um ou mais (tipos de) monômeros co-principais da fórmula I e/ou fórmula II em que pelo menos um de Y e Z é H, (3) opcionalmente um ou mais (tipos de) monômeros co-principais das fórmulas III a X (4) um agente de RAFT contendo um espaçador monodisperso (isto é, um espaçador de tamanho uniforme) de 5 a 25 unidades e (5) um sistema iniciador para gerar espécies de radical livre.
[019] Em diferentes modalidades, um copolímero que contém moléculas de agente ativo múltiplas é fabricado por polimerização de uma mistura de reação compreendendo (1) um ou mais (tipos de) monômeros principais polimerizáveis, monômeros estes que são caracterizados como tendo pelo menos um grupo vinílico e não contendo um resíduo de aminoácido, (2) um ou mais (tipos de) monômeros co- principais das fórmulas III a X, (3) opcionalmente um ou mais (tipos de) monômeros co-principais da fórmula I e/ou fórmula II, (4) um agente para indução de polimerização de radical controlada, agente este que é preferivelmente um agente de RAFT e (5) um sistema iniciador para gerar espécies de radical livre.
Fórmula III
R O X O HN
L A Carga Payload Z em que R é -H, -CH3, -CH2-CH3 ou -(CH2)2-CH3; X é -NH(CH2)4-,-NH(CH2)3-, - O-C6H4-CH2-, -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, -S-CH2- ou -NH-C6H4-CH2-; Z é H (se A para -O- ) ou -CnH2n+1 (com n = 1 a 8); carga se refere a um agente ativo; L é um ligante e A é -O- ou -NH-. Fórmula IV
R O X O HN
Y L Carga Payload em que R é -H, -CH3, -CH2-CH3 ou -(CH2)2-CH3; X é -NH(CH2)4-,-NH(CH2)3-, - O-C6H4-CH2-, -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, -S-CH2- ou -NH-C6H4-CH2-; Y é H ou -CO- CnH2n+1 (com n = 1 a 8); carga se refere a um agente ativo; e L é um ligante. Fórmula V
R O X O HN
L L Carga Payload Carga Payload em que R é -H, -CH3, -CH2-CH3 ou -(CH2)2-CH3; X é -NH(CH2)4-,-NH(CH2)3-, - O-C6H4-CH2-, -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, -S-CH2- ou -NH-C6H4-CH2-; carga se refere a um agente ativo e L é um ligante, por meio do qual os ligantes usados para funcionalizar os grupos alfa-amino e carbóxi não precisam ser idênticos. Fórmula VI
R O O Z N
L A Payload O Carga em que R é -H, -CH3, -CH2-CH3 ou -(CH2)2-CH3; X é -NH(CH2)4-,-NH(CH2)3-, - O-C6H4-CH2-, -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, -S-CH2- ou -NH-C6H4-CH2-; Z é H (se A para -O- ) ou -CnH2n+1 (com n = 1 a 8); carga se refere a um agente ativo; L é um ligante e A é -O- ou -NH-. Fórmula VII
R O O HN
O Carga Payload L em que R é -H, -CH3, -CH2-CH3 ou -(CH2)2-CH3; X é -NH(CH2)4-,-NH(CH2)3-, - O-C6H4-CH2-, -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, -S-CH2- ou -NH-C6H4-CH2-; carga se refere a um agente ativo; e L é um ligante. Fórmula VIII
R O O N O
L Carga Payload L Carga Payload em que R é -H, -CH3, -CH2-CH3 ou -(CH2)2-CH3; X é -NH(CH2)4-,-NH(CH2)3-, - O-C6H4-CH2-, -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, -S-CH2- ou -NH-C6H4-CH2-; carga se refere a um agente ativo e L é um ligante, por meio do qual os ligantes usados para funcionalizar os grupos alfa-amino e carbóxi não precisam ser idênticos. Fórmula IX
R O X O HN L A Z J OH
J em que R é -H, -CH3, -CH2-CH3 ou -(CH2)2-CH3; X é -NH(CH2)4-,-NH(CH2)3-, - O-C6H4-CH2-, -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, -S-CH2- ou -NH-C6H4-CH2-; Z é H (se A para -O- ) ou -CnH2n+1 (com n = 1 a 8); L é um ligante; J é H ou um núcleo de iodo radioativo e A é -O- ou -NH-. Fórmula X
R O X O
HN L L Payload
J OH
J em que R é -H, -CH3, -CH2-CH3 ou -(CH2)2-CH3; X é -NH(CH2)4-, -NH(CH2)3-, -O-C6H4-CH2-, -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, -S-CH2- ou -NH-C6H4-CH2-; J é H ou um núcleo de iodo radioativo. Carga se refere a um agente ativo; e L é um ligante, por meio do qual os ligantes usados para funcionalizar os grupos alfa-amino e carbóxi não precisam ser idênticos.
[020] Em uma modalidade mais particular, um copolímero que contém moléculas de agente ativo múltiplas é fabricado por polimerização de uma mistura de reação compreendendo (1) um ou mais (tipos de) monômeros principais polimerizáveis, monômeros estes que são caracterizados como tendo pelo menos um grupo vinílico e não contendo um resíduo de aminoácido, (2) um ou mais (tipos de) monômeros co-principais das fórmulas III a X, (3) opcionalmente um ou mais (tipos de) monômeros co-principais da fórmula I e/ou fórmula II em que pelo menos um de Y e Z é H, (4) um agente de RAFT contendo um espaçador monodisperso de 5 a 25 unidades e (5) um sistema iniciador para gerar espécies de radical livre.
[021] Um copolímero contendo moléculas múltiplas de um agente ativo pode ser também fabricado em duas reações de polimerização sucessivas. Por exemplo, a primeira reação de polimerização é realizada em uma primeira mistura de reação compreendendo um ou mais (tipos de) monômeros principais polimerizáveis não contendo um grupo aminoácido, um agente de RAFT e um sistema iniciador para gerar espécies de radical livre, a polimerização produzindo um pré-polímero de RAFT. A segunda reação de polimerização é realizada em uma segunda mistura de reação compreendendo o pré-polímero de RAFT da primeira reação de polimerização, um ou mais (tipos de) monômeros de co-princípio das fórmulas III a X e um sistema iniciador para gerar espécies de radical livre. A reação pode opcionalmente incluir um ou mais (tipos de) monômeros co-principais da fórmula I e/ou fórmula II e/ou um ou mais monômeros principais polimerizáveis não contendo um grupo aminoácido.
[022] A última moléculas de copolímero contendo moléculas múltiplas de um agente ativo pode ser funcionalizada ainda com uma porção de alvejamento específica de tipo celular ou tipo tecidual como foi descrito para a modalidade inicial.
[023] O termo entre parênteses “tipos de” foi incluído para tornar claro que expressões tais como “um ou mais monômeros co-principais polimerizáveis” não se referem a uma ou mais moléculas do monômero mas a quantidades de um ou mais monômeros quimicamente diferentes das fórmulas em questão.
[024] Em qualquer um dos copolímeros descritos acima contendo moléculas múltiplas de um agente ativo, a quantidade total de monômeros de qualquer uma da fórmula I à fórmula X preferivelmente varia de 1 % (mol) a 49,9 % (mol) de todos os monômeros contidos no copolímero. Mais preferivelmente, a quantidade total de monômeros da fórmula I à fórmula X varia de 1 % (mol) a 35 % (mol) de todos os monômeros contidos no copolímero. Ainda mais preferivelmente, a quantidade total de monômeros da fórmula I à fórmula X varia de 1 % (mol) a 20 % (mol) de todos os monômeros contidos no copolímero. O mais preferivelmente, a quantidade total de monômeros da fórmula I à fórmula X varia de 5 % (mol) a 15 % (mol) de todos os monômeros contidos no copolímero.
[025] Em qualquer um dos copolímeros descritos acima contendo moléculas múltiplas de um agente ativo, os copolímeros têm pesos moleculares médios de 5.000 Daltons a 100.000 Daltons. Mais preferivelmente, os copolímeros têm pesos moleculares médios de 6.000 Daltons a 60.000 Daltons. O mais preferivelmente, os copolímeros têm pesos moleculares médios de 6.000 Daltons a 20.000 Daltons.
[026] Em qualquer um dos copolímeros descritos acima contendo moléculas múltiplas de um agente ativo, pelo menos 80 % (p) das moléculas de copolímero têm um peso molecular médio de 5.000 Daltons a 100.000 Daltons. Mais preferivelmente, pelo menos 80 % (p) das moléculas de copolímero têm um peso molecular médio de
6.000 Daltons a 60.000 Daltons. O mais preferivelmente, pelo menos 80 % (p) das moléculas de copolímero têm um peso molecular médio de 6.000 Daltons a 20.000 Daltons.
[027] Como debatido acima, misturas de polimerização para a preparação de qualquer um dos copolímeros descritos acima contendo moléculas múltiplas de um agente ativo podem compreender um agente de RAFT que porta um grupo reativo que pode ser usado para a funcionalização do copolímero com uma porção de alvejamento específica de tipo celular ou tipo tecidual. O último grupo reativo pode ser um tiol, um aldeído, um alcino, uma azida, uma amina, uma carboxila, um éster, uma diazirina, uma fenil azida, um tioéster, um diazo, um fosfinoéster reativo de Staudinger (ou fosfinotioéster), uma hidrazina, uma oxima, um acrilato para realizar ligações de aza- Micheal ou um motivo capaz de ser usado em uma reação de acoplamento enzimático. O motivo pode ser uma oligo-glicina compreendendo 2 a 8 aminoácidos, motivo de peptídeo este que permite o acoplamento mediado por reações de sortase, um substrato reativo em transglutaminase, uma etiqueta de aldeído ou uma sequência de inteína autocatalítica.
[028] Em outras modalidades específicas, o agente de RAFT é inativado uma vez que a polimerização e/ou funcionalização foram concluídas, por meio das quais a eliminação do grupo RAFT é realizada por tratamento térmico, reação com aminas adequadas (aminólise) ou uma nova reação com uma molécula de iniciador na presença de um oxoácido de fósforo ou com excesso de iniciador sem oxoácido de fósforo.
[029] Em qualquer um dos copolímeros descritos acima contendo moléculas múltiplas de um agente ativo, o agente ativo pode ser um inibidor de microtúbulo, um agente intercalante, um agente alquilante, um antimetabólito, um hormônio ou agente de modulação de receptor hormonal, um inibidor de tirosina cinase, um fármaco com base em polinucleotídeo capaz de interferir com um gene ou seu respectivo RNA mensageiro, uma toxina bacteriana com base em proteína, uma enzima adequada para terapia com pró-fármaco (conceito ADEPT) ou um radioisótopo. O agente ativo pode ser também uma molécula traçadora incluindo um fluoróforo de molécula pequena, um fluoróforo com base em proteína/peptídeo, uma sonda fluorescente próxima do infravermelho (NIR), uma sonda bioluminescente, um agente de radiocontraste ou um radioisótopo.
[030] A presente divulgação também se refere a composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade eficaz de um copolímero contendo moléculas múltiplas de um agente ativo como detalhado acima e um portador. Dependendo da natureza do agente ativo, estas composições podem ser usadas no tratamento de vários cânceres ou de outras doenças/condições.
[031] A presente divulgação também abrange métodos de tratamento de diferentes tipos de cânceres ou outras doenças e condições compreendendo a administração de uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um copolímero contendo moléculas múltiplas de um agente ativo da presente divulgação (também referida aqui como “porção ativa”). Dentro do escopo da presente divulgação estão também usos das composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade eficaz de um copolímero contendo moléculas múltiplas de um agente ativo da presente divulgação para o tratamento de um câncer ou uma outra doença ou condição em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um copolímero contendo moléculas múltiplas de um agente ativo.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[032] A menos que de outro modo definido, todos os termos devem ter seu significado habitual na técnica relevante. Os termos seguintes são definidos e devem ter os significados seguintes:
[033] Como usado aqui, “portador ou excipiente farmaceuticamente aceitável” é intencionado a incluir qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardadores de absorção e semelhantes, compatíveis com a administração farmacêutica, tal como água estéril isenta de pirogênio. Portadores adequados são descritos em Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA, 19a ed. 1995), um texto de referência padrão no campo, que é incorporado aqui a título de referência. Exemplos não limitantes de materiais que podem servir como portadores farmaceuticamente aceitáveis são açúcares tais como lactose, glicose e sacarose; ciclodextrinas tais como alfa-, beta- e gama-ciclodextrinas; amidos tais como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados tais como sódio carboximetil celulose, etil celulose e acetato de celulose; tragacanto em pó; malte; gelatina; talco; excipientes tais como manteiga de cacau e ceras de supositório; óleos tais como óleo de amendoim, óleo de caroço de algodão, óleo de açafroa, óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de soja; glicóis tais como propileno glicol; ésteres tais como oleato de etila e laurato de etila; ágar; agentes tamponantes tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água isenta de pirogênio; solução salina isotônica; solução de Ringer; álcool etílico e soluções tampão de fosfato, bem como outros lubrificantes compatíveis não tóxicos tais como lauril sulfato de sódio e estearato de magnésio, bem como agentes corantes, agentes de liberação, agentes de revestimento, agentes adoçantes, flavorizantes e perfumantes, preservantes e antioxidantes podem estar também presentes na composição, de acordo com o julgamento do formulador. Também abrangidos são emulsionantes/surfactantes tais como cremophor EL e solutol HS15, lecitina e fosfolipídeos tais como fosfatilcolina. Lipossomos podem ser também usados. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o composto ativo, o uso do mesmo nas composições é considerado. Compostos ativos suplementares podem ser também incorporados nas composições.
[034] O termo “indivíduo” como usado aqui se refere a um indivíduo mamífero. Preferivelmente, o indivíduo é um indivíduo humano.
[035] O termo “porção ativa” se refere a um copolímero contendo moléculas múltiplas de um agente ativo da presente divulgação (copolímero este que pode ser funcionalizado ainda com uma porção de alvejamento específica do tipo celular ou específica do tipo tecidual).
[036] O termo “porção de alvejamento específica do tipo celular ou específica do tipo tecidual” no contexto desta divulgação se refere a uma molécula que se liga a um marcador de superfície nas células de um tipo específico ou nas células de um tecido particular com uma avidez, que a torna útil para a liberação às células de um agente ativo de carga. A mesma pode ser um anticorpo monoclonal, um domínio único, fragmento variável de uma cadeia de anticorpo, um anticorpo de cadeia única, um DARPin (Proteína de Repetição de Anquirina Designada), um aptâmero com base em DNA ou RNA, um aptâmero com base em peptídeo, um peptídeo ou proteína capazes de se ligarem a um marcador de superfície celular, um hormônio ou uma molécula pequena capaz de se ligar a um marcador de superfície celular.
[037] Uma “molécula traçadora” é definida como uma molécula que é capaz de produzir um sinal de leitura em uma aplicação diagnóstica ou científica. A mesma pode ser um fluoróforo de molécula pequena, um fluoróforo com base em proteína/peptídeo, uma sonda fluorescente próxima do infravermelho (NIR), uma sonda bioluminescente, um agente de radiocontraste ou um radioisótopo.
[038] Por uma “quantidade eficaz” de uma porção ativa da divulgação significa uma quantidade da porção ativa que, quando administrada uma vez ou múltiplas vezes durante o curso de um tratamento, confere um efeito terapêutico sobre o indivíduo tratado, em uma razão risco/benefício razoável aplicável a qualquer tratamento médico. O efeito terapêutico pode ser objetivo (isto é, mensurável por algum teste ou marcador) ou subjetivo (isto é, o indivíduo fornece uma indicação de ou sente um efeito). Uma quantidade eficaz de uma porção ativa da divulgação é uma quantidade da porção ativa que compreende um agente ativo preferivelmente em uma quantidade variando de cerca de 0,01 mg/kg de peso corpóreo de um indivíduo a cerca de 50 mg/kg de peso corpóreo e mais preferivelmente de cerca de 0,1 a cerca de 30 mg/kg de peso corpóreo. Doses eficazes também variarão dependendo da via de administração, bem como da possibilidade de co-utilização com outros agentes. Será entendido, entretanto, que a uso diário total da porção ativa e composições farmacêuticas da presente divulgação será decidido pelo médico responsável dentro do escopo do bom senso médico. O nível de dose eficaz específico para qualquer paciente particular dependerá de uma variedade de fatores incluindo o transtorno sendo tratado e a severidade do transtorno; a atividade do agente ativo específico utilizado; a composição específica utilizada; a idade, peso corpóreo, saúde geral, sexo e dieta do paciente; o tempo de administração, via de administração e taxa de excreção da porção ativa específica utilizada; a duração do tratamento; fármacos usados em combinação ou contemporaneamente com a porção ativa específica utilizada; e fatores semelhantes bem conhecidos na técnica médica. Observa-se que quando usada no contexto de profilaxia ou prevenção, uma “quantidade eficaz” de uma porção ativa da divulgação significa ser uma quantidade da porção ativa que, quando administrada uma vez ou múltiplas vezes durante o curso de um tratamento, confere um efeito profilático desejado sobre o indivíduo tratado.
[039] O termo “agente ativo” significa uma substância terapeuticamente ativa, que é ligada aos copolímeros desta divulgação. No contexto de câncer terapia, o agente ativo tipicamente é uma substância/molécula citotóxica. Substâncias/moléculas citotóxicas exemplares incluem inibidores de microtúbulo tais como monometil auristatina E (MMAE) ou entansina (DM1), fármacos intercalantes, por exemplo, doxorrubicina, agentes alquilantes tais como ciclofosfamida (CP), antimetabólitos tais como 5-fluoruracila (5-FU), hormônios ou agentes de modulação de receptor hormonal tais como citrato de tamoxifeno, inibidores de tirosina cinase tais como Afatinibe ou Bosutinibe, toxinas com base em peptídeo, por exemplo, α- amanitina, inibidores de ponto de verificação imunológico tais como nivolumab® ou pembrolizumab®, enzimas adequadas para terapia com pró-fármaco enzimático dirigido por anticorpo (ADEPT), fármacos com base em polinucleotídeo capazes de interferir com um gene ou seu respectivo RNA mensageiro (siRNA, microRNA ou RNA anti-sentido) e radioisótopos tais como, mas não limitados a, flúor-18, cobre-64, gálio- 68, zircônio-89, índio-111, iodo-123 (aplicação diagnóstica) ou estrôncio-89, ítrio-90, iodo-131, samário-153, lutécio-177, rádio-223 e actínio-225 (aplicação terapêutica).
[040] Radioisótopos são acoplados a um monômero de co-princípio antes da polimerização ou a um copolímero depois da polimerização. Agentes quelantes que são covalentemente acoplados aos monômeros de co-princípio antes da polimerização ou a um copolímero depois da polimerização podem ser usados para imobilizar radioisótopos. Agentes quelantes incluem, mas não são limitados a, ácido (1,4,7,10)-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético [DOTA], ácido 2,2′,2”-(10-(2,6- dioxotetraidro-2H-piran-3-il)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triil)triacético [DOTA-GA], ácido 1,4,7-triazaciclononano-N,N’,N”-triacético [NOTA], ácido 1,4,8,11- tetraazaciclotetradecano-1,4,8,11-tetraacético) [TETA] e dietileno-triamina- pentaanidrido acético [DTPA].
[041] O termo “agente ativo” no contexto desta divulgação abrange ainda substâncias capazes de superar a resistência da célula tumoral, por exemplo, inibindo- se um fator anti-apoptótico tal como Bcl-2 ou alvejando-se uma bomba de efluxo celular (tal como o transportador de MDR-1) ou substâncias anti-inflamatórias incluindo corticosteroides, glicocorticoides e fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (por exemplo, prostaglandinas) que são úteis para reduzir efeitos colaterais da terapia relacionados à inflamação.
[042] Um “monômero” significa um composto de peso molecular baixo que pode ser polimerizado. Para monômeros co-principais da fórmula I ou II ou para monômeros principais, peso molecular baixo tipicamente significa um peso molecular de menos do que 800 Daltons. Para monômeros co-principais das fórmulas III a X, peso molecular baixo tipicamente significa um peso molecular de menos do que 1500 Daltons. Quando referido no contexto de um copolímero, o termo “monômero” se refere aos menores blocos de construção do copolímero.
[043] Os termos “agente de RAFT” e “processo de RAFT” envolvem polimerização convencional do radical livre de um monômero na presença de um agente de transferência de cadeia adequado (CTA). Agentes de RAFT comumente usados incluem compostos de tiocarboniltio tais como ditioésteres, ditiocarbamatos, tritiocarbonatos e xantatos, agentes estes que medeiam a polimerização por intermédio de um processo de transferência de cadeia reversível. Chiefari, J. et al. (1998) Macromolecules 31(16): 5559 - 62.
[044] O termo “pré-polímero” se refere a um polímero curto encabeçado por um agente de RAFT e compreendendo 10 a 25 unidades de um monômero principal hidrofílico, por exemplo, dimetil-acrilamida. Tais pré-polímeros representam agentes de macro-RAFT solúveis em água que são usados em uma segunda reação de polimerização para sintetizar copolímeros de monômeros principais e co-principais em um ambiente aquoso.
[045] Os termos “substrato, motivo ou etiqueta” ou “substrato, motivo ou etiqueta reativos” são usados permutavelmente para se referirem a estruturas químicas sendo capazes de tomar parte em uma reação enzimaticamente catalisada. Estas estruturas químicas são reconhecidas pelo centro ativo de uma enzima e podem formar imediatamente um complexo de enzima-substrato covalente ou eletrostático antes que a reação enzimática catalisada ocorra. No contexto da presente divulgação, estas reações são frequentemente usadas para mediar a ligação covalente de um copolímero desta divulgação a uma célula tumoral ou porção de alvejamento específica de tecido. Substratos, motivos e etiquetas típicos são sequências definidas de aminoácidos ou peptídeos, grupos funcionais reativos como grupos amino, tiol ou carboxila ou ligações carbono insaturadas em uma região de espaçador flexível do grupo principal do copolímero.
[046] O termo “conjugado de anticorpo-fármaco”, abreviado “ADC”,
representa uma combinação de um anticorpo que alveja antígenos específicos de tipo celular ou tipo tecidual (incluindo antígenos tumorais) com uma molécula de fármaco ou uma infinidade de moléculas de fármaco em que as moléculas de fármaco são covalentemente ligadas ao anticorpo. No contexto da presente divulgação, ADC se refere a um conjugado de um anticorpo de alvejamento de antígeno específico de tipo celular ou de tipo tecidual com um copolímero contendo moléculas múltiplas de um agente ativo da presente divulgação. Como debatido, o copolímero da presente divulgação porta uma infinidade de moléculas de agente ativo ou uma combinação de moléculas de agente ativo diferentes que são ligadas, por intermédio de um ligante ou diretamente, a grupos alfa-amino e alfa-carbóxi nos monômeros co-principais.
[047] O termo “aptâmero” é definido como segue: aptâmeros são moléculas de oligonucleotídeo ou peptídeo que se ligam a uma molécula alvo específica. Aptâmeros são usualmente criados selecionando-os a partir de um agrupamento de sequências aleatórias grande em um processo de enriquecimento iterativo para identificar a sequência de aptâmero com a afinidade a alvo mais alta. Este processo é também conhecido como “evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX)”. Mais especificamente, aptâmeros podem ser classificados como DNA, RNA, ácido xeno nucleico (XNA) (uma alternativa sintética para ácidos nucleicos naturais que difere na cadeia principal de açúcar) ou aptâmeros de peptídeo. Aptâmeros consistem em filamentos (usualmente curtos) de oligonucleotídeos ou sequências de aminoácidos. A sequência de oligonucleotídeo pode ser desse modo formada de um tipo de nucleotídeo, por exemplo, DNA ou uma combinação de diferentes tipos de nucleotídeo, por exemplo, DNA, RNA e ou especialmente designados assim chamados “nucleotídeos bloqueados” tendo sua porção ribose modificada com uma ponte extra que conecta o oxigênio 2’ e o carbono 4’. Aptâmeros nesta divulgação também significam aptâmeros de peptídeo consistindo em um ou mais domínios de peptídeo curtos.
[048] O termo “conjugado de aptâmero-fármaco” significa uma combinação de um aptâmero com uma molécula de agente ativo ou moléculas de agente ativo diferentes. No contexto da presente divulgação, as moléculas de agente ativo são ligadas aos copolímeros antes ou subsequente ao acoplamento do copolímero ao aptâmero.
[049] O termo “efeito de permeabilidade e retenção (EPR) realçado” é usado para descrever a dinâmica de transporte molecular e de fluido anormal no tecido tumoral, especialmente para fármacos macromoleculares. Moléculas de certos tamanhos (tipicamente lipossomos, nanopartículas e fármacos macromoleculares) tendem a acumular no tecido tumoral em níveis mais altos do que em tecidos normais. A explanação geral que é dada para este fenômeno é que, de modo que células tumorais cresçam prontamente, elas devem estimular a produção de vasos sanguíneos. Os vasos tumorais recentemente formados são usualmente anormais em forma e arquitetura e são permeáveis para moléculas de peso molecular mais alto. Além disso, tecidos tumorais usualmente carecem de drenagem linfática eficaz de modo que, uma vez que uma molécula entrou no tecido tumoral, ela não é eficazmente removida deste tecido.
[050] O termo “aminoácido ligado à cadeia lateral” no contexto de um monômero co-principal significa que um aminoácido é covalentemente ligado através de sua cadeia lateral (por exemplo, através de uma ligação éster ou amida) a uma porção contendo um grupo acriloíla. Monômeros das fórmulas I ao X contêm aminoácidos ligados na cadeia lateral.
[051] Os termos “monômero principal” e “monômero co-principal” são usados principalmente para facilitar a descrição da invenção. Monômeros principais se referem a monômeros que não incluem um aminoácido e monômeros co-principais se referem a monômeros que contêm um aminoácido.
[052] Copolímeros contendo os últimos monômeros principais e de co-
princípio são também genericamente referidos como “copolímeros Cellophil”, o termo “Cellophil” servindo para indicar a presença nos copolímeros de monômeros contendo aminoácidos ligados na cadeia lateral (que podem ser funcionalizados ainda como, por exemplo, nas fórmulas III a X). Os aminoácidos ligados na cadeia lateral incluem lisina (K), tirosina (Y), serina (S), treonina (T), cisteína (C), 4-hidroxiprolina (HO-P), ornitina (ORN) e 4-amino-fenilalanina (HOX). Os aminoácidos podem ser as formas L ou D ou misturas racêmicas. Nos copolímeros, um único tipo de aminoácido ligado à cadeia lateral ou tipos múltiplos de aminoácidos ligados na cadeia lateral podem estar presentes. Por exemplo, um copolímero pode compreender tanto acriloil-L-lisina (AK) quanto acriloil-L-treonina (AT). Por uma questão de clareza, todos os monômeros descritos pelas fórmulas I a X incluem um aminoácido ligado à cadeia lateral (funcionalizado ou não funcionalizado). Os copolímeros contendo aminoácido desta divulgação compreendem um ou mais monômeros principais polimerizáveis, monômeros estes que são caracterizados como tendo pelo menos um grupo vinílico mas não contendo um resíduo de aminoácido, um ou mais monômeros co-principais de acordo com qualquer um da fórmula I à fórmula X (incluindo a leitura de monômeros co-principais em duas ou mais das últimas fórmulas).
[053] Preferivelmente, os monômeros co-principais estão presentes em uma mistura de polimerização em uma quantidade entre 1 % (mol) e 49,9 % (mol) de todos os monômeros contidos no copolímero. Mais preferivelmente, os monômeros co- principais estão presentes em uma mistura de polimerização em uma quantidade entre 1 % (mol) e 35 % (mol), ainda mais preferivelmente entre 1 % (mol) e 20 % (mol) e o mais preferivelmente entre 5 % (mol) e 15 % (mol) de todos os monômeros contidos no copolímero.
[054] A síntese de monômeros contendo aminoácidos ligados na cadeia lateral foi descrita previamente. Zbaida, D et al. (1987) Reactive Polymers, Ion Exchangers, Sorbents 6(2-3): 241 - 253. Tais monômeros podem ser preparados reagindo-se o complexo de aminoácido e cobre de lisina, tirosina, serina, treonina, cisteína, ornitina, 4-amino-fenilalanina ou 4-hidroxiprolina com cloreto de acriloíla, cloreto de metacriloíla, cloreto de etilacriloíla ou cloreto de propilacriloíla, seguido por tratamento com uma corrente de gás sulfeto de hidrogênio ou uma solução ácida de sulfeto de sódio para produzir o monômero desprotegido. Os protocolos são divulgados sob os exemplos.
[055] Em modalidades particulares, os monômeros de princípio são derivados de acrilamida e incluem dimetil-acrilamida, N-isobutil-acrilamida, N-terc.butil- acrilamida, N-hidroxietil-acrilamida, N-(2-Hidroxipropil)-acrilamida, N-(3-Hidroxipropil)- acrilamida, N-(3-Hidroxipropil)-metacrilamida, N-(2-Hidroxipropil)-metacrilamida, cloridrato de N-(3-aminopropil)-acrilamida ou cloridrato de N-(3-aminopropil)- metacrilamida.
[056] Em outras modalidades particulares, os monômeros de princípio são derivados de ácido acrílico incluindo ácido metacrílico, 2-hidroxietil-acrilato, 2- hidroxipropil-acrilato, 3-hidroxipropil-acrilato, 2-hidróxi-1-metiletil-acrilato, cloridrato de 2-aminoetil-acrilato, 3-hidroxipropil-metacrilato, 2-hidróxi-1-metiletil-metacrilato, 2 - hidroxietil-metacrilato, 2-hidroxipropil-metacrilato e cloridrato de 2-aminoetil- metacrilato.
[057] Copolímeros compreendendo um ou mais tipos de monômeros co- principais das fórmulas I a X e um ou mais tipos de monômeros principais são tipicamente preparados em uma reação de polimerização de radical. É importante que os copolímeros desta divulgação tenham uma distribuição de tamanho estreita porque em várias terapias, em particular em terapias contra o câncer, a carga de fármaco tem que ser precisamente controlada. Se ela não for cuidadosamente controlada, efeitos de superdosagem ou subdosagem podem ser encontrados. Para obter copolímeros com uma distribuição de tamanho estreita, o número de radicais livres no processo de polimerização tem que ser controlado. Isto pode ser obtido pelo uso de técnicas de polimerização incluindo polimerização de radical com transferência de átomo (ATRP), polimerização mediada por nitróxido (NMP) ou polimerização reversível por adição- fragmentação-transferência de cadeia (polimerização RAFT). RAFT é a técnica mais preferida para os copolímeros descritos aqui visto que é compatível com um amplo espectro de monômeros, especialmente acrílicos e pode ser facilmente realizada em sistemas aquosos. Além disso, a polimerização RAFT pode ser usada para a síntese de copolímeros em bloco. Além disso, o grupo de RAFT pode ser usado para adicionar uma porção reativa ao grupo principal de um polímero (por exemplo, para conjugação com um anticorpo ou aptâmero). A tecnologia RAFT foi inventada por um grupo de pesquisa da Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization (CSIRO). Chiefari et al. (1998). O controle da distribuição de tamanho de cadeia é obtido por intermédio de reações de transferência de cadeia da cadeia polimérica em crescimento a um agente de transferência de cadeia. Um assim chamado agente de RAFT forma um intermediário e é capaz de fragmentar em um radical na cadeia de propagação (designado como grupo R) e uma porção de estabilização (designada como grupo Z). Como uma consequência, o número de radicais é limitado e todas as cadeias poliméricas em crescimento têm uma probabilidade similar de propagação, resultando em copolímeros com uma distribuição de tamanho estreita. Índices de polidispersão típicos (PDIs) [definidos como Mw/Mn, onde Mw é a massa molar média ponderada e Mn é a massa molar média numérica do polímero] obtidos em polimerizações RAFT estão na faixa de 1,05 a 1,4. Agentes de RAFT adequados são compostos de tiocarboniltio. Compostos de tiocarboniltio podem ser divididos em quatro classes principais, isto é, ditiobenzoatos, tritiocarbonatos, ditiocarbamatos e xantatos.
[058] Uma mistura de polimerização típica desta divulgação compreende, portanto, monômeros principais e co-principais, um agente de RAFT e um iniciador de radical. A mistura depois é vertida em um recipiente ou molde adequado, em que a polimerização é induzida. Iniciadores podem ser iniciadores térmicos, por exemplo, VA-044 que é desestabilizado em temperatura elevada para produzir radicais reativos, iniciadores redox ou fotoiniciadores. Iniciadores redox preferidos para polimerização em solução aquosa são peróxidos, por exemplo, persulfato de amônio ou persulfato de potássio em combinação com tiossulfato de sódio ou compostos do tipo azo, por exemplo 2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-il)propano]dicloridrato ou 4,4’-Azobis(ácido 4- cianovalérico). Para reações de polimerização em solventes não aquosos, iniciadores/catalisadores do tipo azo, por exemplo, Azobis(isobutironitrila (AIBN), 1,1’- Azobis(cicloexano-1-carbonitrila), 2,2’-Azobis(4-metóxi-2,4-dimetilvaleronitrila) são preferidos. Iniciadores do tipo azo modificados por polímero por exemplo, (polidimetilsiloxano, polietilenglicol) podem ser também utilizados. Os iniciadores mencionados acima são usualmente desestabilizados em temperaturas mais altas levando à formação de radicais reativos.
[059] Alternativamente, os monômeros podem ser fotopolimerizados em um recipiente ou molde que seja transparente à radiação de um comprimento de onda capaz de iniciar a polimerização dos monômeros vinílicos ou acrílicos. Compostos fotoiniciadores adequados podem ser do tipo I, por exemplo, α-amino alquilfenonas ou tipo II, por exemplo, benzofenonas. Fotossensibilizadores que permitem o uso de comprimentos de onda mais longos podem ser também utilizados. Dependendo do composto iniciador usado, a polimerização é iniciada por aquecimento, radiação ou adição de um catalisador.
[060] Em algumas modalidades desta divulgação, é útil sintetizar um macro- RAFT ou pré-polímero composto de 10 a 25 unidades monoméricas de um monômero principal hidrofílico antes da polimerização dos copolímeros (contendo uma mistura de monômeros principais e co-principais). Com isto, a hidrofilicidade dos agentes de RAFT frequentemente hidrofóbicos pode ser realçada, facilitando as reações de polimerização em um ambiente aquoso.
[061] Em outras modalidades, o agente de RAFT propriamente dito é quimicamente modificado pela integração de um espaçador de polietilenoglicol (PEG) monodisperso solúvel em água de 5 a 25 unidades. O agente de RAFT modificado exibe uma solubilidade em água melhorada e permite a síntese de copolímeros hidrofílicos contendo aminoácido em uma etapa de polimerização.
[062] Visto que o agente de RAFT é conhecido como instável na presença de aminas e é responsável por um odor forte dos copolímeros obtidos, o mesmo deveria ser usualmente inativado uma vez que o processo de polimerização e funcionalização for concluído. Métodos preferidos para a inativação do grupo de RAFT nesta divulgação são reações com nucleófilos, eliminação térmica ou uma segunda reação com um iniciador em combinação com um agente doador de próton ou um excesso de um iniciador funcionalizado.
[063] Visto que os copolímeros desta divulgação são intencionados a serem usados para a liberação de fármaco em um paciente, é geralmente preferível purificar os copolímeros depois da polimerização. Esta etapa remove os ingredientes potencialmente nocivos incluindo iniciadores, monômeros ou catalisadores residuais. Métodos de purificação preferidos para os copolímeros desta invenção são diálise, filtração por fluxo tangencial e ultrafiltração de capilar.
[064] Observa-se que definir os valores de parâmetro úteis não requer esforço indevido tanto porque o número de parâmetros é limitado quanto as faixas preferidas de alguns valores paramétricos são conhecidas. O nível de monômeros co-principais em um copolímero contendo aminoácido preferivelmente estará entre 1 % (mol) e 49,9 % (mol), mais preferivelmente entre 1 % (mol) e 35 % (mol), ainda mais preferivelmente entre 1 % (mol) e 20 % (mol) e o mais preferivelmente entre 5 % (mol) e 15 % (mol) de todos os monômeros presentes na mistura de polimerização. O peso molecular médio do copolímero contendo aminoácido (sem carga terapêutica) geralmente estará entre 5.000 e 100.000 Daltons, preferivelmente entre 6.000 e
60.000 Da e o mais preferivelmente entre 6.000 e 20.000 Da.
[065] Uma vez que a copolimerização e a purificação foram concluídas, um copolímero desta invenção compreendendo monômeros co-principais da fórmula I e/ou II está pronto para a funcionalização com moléculas de agente ativo e/ou porção de alvejamento específica de um tipo celular ou específica de um tipo tecidual (por exemplo, um anticorpo). Esta funcionalização resulta no estabelecimento de ligações covalentes entre moléculas de copolímero e agente ativo e/ou porção de alvejamento. No caso de certos agentes ativos, por exemplo, certos radioisótopos, um agente quelante é covalentemente ligado ao copolímero e o agente ativo é mantido pelo agente quelante.
[066] Em modalidades particulares, um agente ativo (aqui um fármaco citotóxico ou molécula usados na terapia contra o câncer) pode ser um inibidor de microtúbulo tal como monometil auristatina E (MMAE) ou entansina (DM1); um fármaco intercalante, por exemplo, doxorrubicina; um agente alquilante tal como ciclofosfamida (CP); um antimetabólito tal como 5-fluoruracila (5-FU); um hormônio ou agente de modulação de receptor hormonal tal como citrato de tamoxifeno; um inibidor de tirosina cinase tal como Afatinibe ou Bosutinibe; uma toxina com base em peptídeo, por exemplo, α-amanitina; um inibidor de ponto de verificação imunológico tal como nivolumab® ou pembrolizumab® ; uma enzima adequada para terapia enzimática dirigida por anticorpo com pró-fármaco (ADEPT); um fármaco com base em polinucleotídeo capaz de interferir com um gene ou sua respectivo RNA mensageiro, siRNA, microRNA ou RNA anti-sentido; ou um radioisótopo tal como, mas não limitado a, flúor-18, cobre-64, gálio-68, zircônio-89, índio-111, iodo-123 (aplicação diagnóstica) ou estrôncio-89, ítrio-90, iodo-131, samário-153, lutécio-177, rádio-223 e actínio 225 (aplicação terapêutica).
[067] Ainda em outras modalidades particulares, os agentes ativos são uma combinação de um fármaco citotóxico e um fármaco sendo capaz de superar a resistência da célula tumoral, por exemplo inibindo-se um fator anti-apoptótico tal como Bcl-2 ou alvejando-se uma bomba de efluxo celular (tal como o transportador de MDR-1).
[068] Os agentes ativos mencionado acima são exemplos não limitantes de agentes e classes de agentes que são compatíveis com os copolímeros desta divulgação e alguém técnico no assunto pode usar variantes ou derivados dos agentes e classes de agentes divulgados sem exceder o escopo desta divulgação.
[069] Dependendo da estrutura de um agente ativo, a mesma pode ser diretamente acoplada a um grupo alfa-amino ou um grupo alfa-carboxílico de um monômero de co-princípio no copolímero ou acoplado por uma estrutura ligante ao copolímero. Tal ligante pode funcionar como um espaçador simples entre agente ativo e copolímero, funcionar como um modificador da farmacocinética do copolímero ou conter um elemento que permite ou que facilita a liberação do agente ativo em uma célula ativa. Ligantes devem ser estáveis durante o armazenamento e mais tarde na corrente sanguínea para evitar a liberação não intencionada do agente ativo. A liberação de agente ativo do copolímero deveria ocorrer apenas dentro das células alvos. Ligantes úteis (focando na terapia contra o câncer) deveriam, portanto, ser sensíveis aos fatores intercelulares tais como caspases ou catepsinas, glucuronidase (GUSB) (ligantes com base em β-glucuronida), pH ácido (encontrado em tecidos tumorais ou organelas celulares [lisossomas]) ou um ambiente de redução (que responde para aumentar as concentrações de glutationa intercelular). Uma outra possibilidade será o uso de ligantes não degradáveis do tipo de diamina ou do tipo de tioéter que não são alvos de uma enzima específica e são apenas degradados nas condições adversas do lisossoma ou peroxissomas. O último tipo de ligante é preferido visto que ele é associado com a estabilidade sérica máxima e toxicidade não específica reduzida.
[070] Em outras modalidades, um copolímero não é funcionalizado com agente ativo ou complexo de agente ativo-ligante depois da síntese mas é diretamente sintetizado como um copolímero contendo agente ativo por meio da incorporação de monômeros co-principais das fórmulas III a X. A carga do agente ativo é definida pelas quantidades molares de monômeros principais, monômeros de co-princípio das fórmulas III a X e monômeros de co-princípio das fórmulas I e II presentes durante a polimerização. Esta abordagem é especialmente útil para o projeto de copolímeros compreendendo combinações de diferentes agentes ativos visto que ele permite que agentes ativos sejam trazidos tanto durante síntese bem como subsequente à síntese por funcionalização de monômeros de co-princípio das fórmulas I e II. Quando o agente ativo é um radioisótopo de meia-vida curta, por exemplo, iodo-123, a ligação a monômeros de co-princípio da fórmula IX e X (se J for H) pode ser realizada depois da polimerização.
[071] Como também debatido acima, copolímeros contendo múltiplos agentes ativos podem ser funcionalizados ainda com porções de alvejamento específicas do tipo celular ou do tipo tecidual. Embora esta etapa de funcionalização seja tipicamente realizada depois que agentes ativos foram acoplados ao copolímero, em situações especiais, por exemplo, no caso de agentes ativos com uma meia-vida curta tais como certos radioisótopos, pode ser necessário primeiro preparar um conjugado de um copolímero (compreendendo monômeros de co-princípio das fórmulas I, II, IX e/ou X) e uma porção de alvejamento. O carregamento do copolímero cujos agentes ativos pode então ocorrer pouco antes da administração a um indivíduo. Porções de alvejamento potenciais são, mas não são limitadas a, anticorpos monoclonais incluindo inibidores de ponto de verificação imunológico, fragmentos de anticorpo, nanocorpos (anticorpos de domínio único), DARPins, hormônios de peptídeo, proteínas que não de anticorpo capazes de se ligar a receptores de superfície celular, aptâmeros com base em DNA/RNA bem como moléculas pequenas capazes de se ligar a receptores de superfície celular (por exemplo, ácido fólico ou biotina no contexto de tumor). A ligação covalente da porção de alvejamento ao copolímero deve ser realizada em uma maneira específica de sítio para obter um produto homogêneo bem como para preservar a afinidade de ligação da porção de alvejamento.
Estratégias de acoplamento adequadas apresentadas nesta divulgação são reações catalisadas por enzima com etiquetas de peptídeos, por exemplo, acoplamento mediado por sortase, etiquetas de aldeído ou etiquetas de transglutaminase ou a assim chamada reação por “clique” entre copolímero e porção de alvejamento.
O último processo pode ser obtido através de integração durante a síntese de aminoácidos reativos, não canônicos (não naturais) em uma porção de alvejamento proteinácea, por exemplo, um anticorpo (tal como por meio de uma técnica de expansão de códon que usa um códon de parada reprogramado que é reconhecido por um tRNA para um aminoácido não natural). Entre os métodos mencionados acima, o acoplamento mediado por sortase é um método preferido para o acoplamento dirigido por sítio de um copolímero a uma porção de alvejamento.
Sortase se refere a um grupo de enzimas procarióticas que modificam as proteínas de superfície reconhecendo-se e clivando-se um sinal de separação carboxil-terminal.
Para as enzimas derivadas de Staphylococcus aureus o sinal de reconhecimento consiste no motivo LPXTG (Leu-Pro-qualquer-Thr-Gly) e para enzimas derivadas de Staphylococcus pyogenes o mesmo é Cis LPXTA (Leu- Pro-qualquer-Thr-Ala). A sequência de sinal é precedida por uma sequência de transmembrana altamente hidrofóbica e um agrupamento de resíduos básicos tais como arginina.
A clivagem ocorre entre os resíduos Thr e Gly/Ala da sequência de sinal, com ligação transitória do resíduo Thr ao resíduo Cys no sítio ativo da sortase, seguido por transpeptidação que liga a proteína covalentemente a um componente da parede celular (por exemplo, a camada de peptido-glicano de bactérias gram- positivas). Cozzi, R. et al. (2011) FASEB J 25(6): 1874 - 86. Este mecanismo enzimático pode ser adaptado para obter fusão de peptídeos ou proteínas e foi usado recentemente para a preparação de ADCs.
O pedido de patente europeu no 20130159
484 (EP 2 777 714); Beerli, RR et al. (2015) PloS One 10(7): e0131177. Na abordagem divulgada, um anticorpo monoclonal foi geneticamente modificado para conter motivos de sortase nos términos C de suas cadeias pesadas e leves e um fármaco citotóxico foi modificado para conter um estiramento de oligo-glicina. A reação catalisada por sortase adicionou as moléculas de fármaco modificadas aos términos C das cadeias de anticorpo com alta eficiência, resultando em um ADC homogêneo.
[072] Por modificação do grupo principal de um copolímero desta divulgação com um estiramento de oligo-glicina, o copolímero propriamente dito torna-se um alvo para reações catalisadas por sortase. Visto que o copolímero pode ser carregado com uma infinidade de agentes ativos, esta abordagem resulta em ADCs em que muitas moléculas de agente ativo são ligadas a um pequeno número de sítios definidos (inócuos) em um anticorpo (2 a 4 etiquetas de sortase C-terminais por moléculas de anticorpo). Consequentemente, o DAR é elevado e com ele, a potência do ADC. O estiramento de oligo-glicina do copolímero pode ser introduzido no início da polimerização usando um agente de RAFT recentemente desenvolvido contendo 2 a 8 resíduos de glicina. Quando este agente de RAFT funcionalizado é usado, apenas um motivo de sortase está presente em cada molécula de copolímero.
[073] Um outro método de acoplamento enzimático preferido utiliza uma reação catalisada por transglutaminase. Transglutaminases, também chamadas proteína-glutamina gama-glutamiltransferases usualmente proteínas de reticulação transferindo-se o grupo γ-carboxiamida do resíduo de glutamina de uma proteína ao grupo ε-amino do resíduo de lisina da mesma ou uma outra proteína. Durante as duas últimas décadas, estas enzimas foram usadas em diversas áreas como na indústria alimentícia como “meat-glue” (Martins IM et al. (2014), Appl. Microbiol. Biotechnol. 98: 6957 - 64?), engenharia tecidual (Ehrbar M. et al. (2007) Bio-macromolecules, 8(10):3000 - 7), modificação de proteínas terapêuticas (Mero A. et al. (2011) J Control Release, 154(1):27 - 34) ou liberação de gene (Trentin D. et al. (2005) J Control
Release, 102(1):263 - 75).
[074] Neste contexto, transglutaminases microbianas (MTgs) são a classe preferida de enzimas visto que elas são, ao contrário de transglutaminases humanas endógenas, enzimas independentes de cálcio e nucleotídeo. Elas consistem em um único domínio, em comparação aos quatro domínios de transglutaminases humanas e têm cerca de metade do peso molecular de transglutaminases humanas. Além disso, MTgs operam em uma faixa maior de valores de pH, tampões e temperaturas e têm uma lista muito maior de substratos potenciais. Kieliszek M et al. (2014) Rev Folia Microbiol. 59 : 241 - 50; Martins IM. et al. (2014).
[075] Em analogia à estratégia de acoplamento mediado por sortase, um motivo de transglutaminase é introduzido ao grupo principal de um copolímero desta divulgação por modificação de um agente de RAFT, garantindo que apenas um motivo de transglutaminase seja introduzido por cadeia polimérica. Motivos adequados são peptídeos pequenos tais como, mas não limitados a, FKGG (Ehrbar M. et al. (2007)) como sequência aceitante de lisina potencial e LQSP ou TQGA (Caporale A. et al. (2015) Biotechnol J. 10(1):154 - 61) como sequências aceitantes de glutamina [neste caso um resíduo de lisina reativo na porção de alvejamento específica da célula cancerosa é usado]; ou um espaçador de PEG monodisperso de 5 a 25 unidades de comprimento contendo um grupo amino terminal como sequências aceitantes de glutamina potenciais. A partir de uma perspectiva econômica, espaçadores de amino- PEG são os motivos mais preferidos para copolímeros desta divulgação visto que eles podem ser introduzidos sem síntese de fase sólida e estratégias de proteção complexa.
[076] Uma variante deste estratégia utiliza a transglutaminase para ligação dirigida por sítio de um grupo reativo por clique (por exemplo, uma azida ou uma tetrazina) à porção de alvejamento, por exemplo, um anticorpo monoclonal, grupo reativo ligado a anticorpo este que é subsequentemente usado para reação com um grupo reativo por clique “oposto” (tenso em alcino ou/alceno) no grupo principal polimérico de um copolímero desta divulgação. As partes reativas mencionadas no copolímero/anticorpo são significadas como permutáveis.
[077] Outros métodos para ligar uma porção de alvejamento a um copolímero podem ser utilizados. Anticorpos de alvejamento ou outros polipeptídeos podem ser alterados pós-traducionalmente, por exemplo, convertendo-se uma função hidroxila em uma cadeia lateral de aminoácido a um aldeído reativo. No caso de porções de alvejamento com base em polinucleotídeo, por exemplo, aptâmeros, o acoplamento a um copolímero desta divulgação poderia ser obtido por reação com grupos funcionais reativos (por exemplo aminas, tióis, aldeídos) integrados no aptâmero durante a síntese de fase sólida. Outras técnicas de acoplamento dirigido por sítio que são bem conhecidas na técnica podem ser usadas para acoplar um copolímero a uma porção de alvejamento. Composições farmacêuticas
[078] As composições farmacêuticas da presente divulgação compreendem uma quantidade eficaz de uma porção ativa da presente divulgação formulada junto com um ou mais portadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[079] As composições farmacêuticas desta divulgação podem ser administradas parenteralmente, por pulverização por inalação, topicamente, retalmente, nasalmente, bucalmente, vaginalmente ou por intermédio de um reservatório implantado, preferivelmente por administração por injeção (ou infusão). As composições farmacêuticas desta divulgação podem conter qualquer portador, adjuvante ou veículo farmaceuticamente aceitável não tóxico convencional. Em alguns casos, o pH da formulação pode ser ajustado com ácidos, bases ou tampões farmaceuticamente aceitáveis para realçar a estabilidade da porção ativa formulada ou sua forma de liberação. O termo parenteral como usado aqui inclui técnicas de injeção ou infusão subcutânea, intracutânea, intravenosa, intramuscular, intra-
articular, intra-arterial, intra-sinovial, intraesternal, intratecal, intralesional e intracraniana.
[080] Preparações injetáveis, por exemplo, suspensões aquosas ou oleaginosas injetáveis estéreis, podem ser formuladas de acordo com a técnica conhecida usando agentes dispersantes ou umectantes e agentes de suspensão adequados. A preparação injetável estéril pode ser também uma solução, suspensão ou emulsão injetável estéril em um diluente ou solvente parenteralmente aceitável não tóxico. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser utilizados estão água, solução de Ringer, U.S.P. e solução de cloreto de sódio isotônica. Excipientes solubilizantes incluem solventes orgânicos solúveis em água tais como polietilenoglicol 300, polietilenoglicol 400, etanol, propileno glicol, glicerina, N-metil-2- pirrolidona, dimetilacetamida e dimetilsulfóxido; surfactantes não iônicos tais como Cremophor EL, Cremophor RH40, Cremophor RH60, Solutol HS15, d-α-tocoferol polietilenoglicol 1000 succinato, polisorbato 20, polisorbato 80, monooleato de sorbitano, poloxâmero 407, Labrafil M-1944CS, Labrafil M-2125CS, Labrasol, Gellucire 44/14, Softigen 767 e ésteres de ácido mono- e digraxo de PEG 300, 400 e 1750; lipídeos insolúveis em água tais como óleo de mamona, óleo de milho, óleo de caroço de algodão, óleo de oliva, óleo de amendoim, óleo de hortelã-pimenta, óleo de açafroa, óleo de gergelim, óleo de soja, óleos vegetais hidrogenados, óleo de soja hidrogenado e triglicerídeos de cadeia média de óleo de coco e óleo de semente de palma, várias ciclodextrinas tais como α-ciclodextrina, β-ciclodextrina, hidroxipropil-β- ciclodextrina (por exemplo, Kleptose) e sulfobutiléter-β-ciclodextrina (por exemplo, Captisol); e fosfolipídeos tais como lecitina, fosfatidilcolina soja hidrogenada, diestearoilfosfatidilglicerol, L-α-dimiristoilfosfatidilcolina e L-α-dimiristoil- fosfatidilglicerol. Strickley (2004) Pharm. Res. 21: 201 - 30.
[081] As formulações injetáveis podem ser esterilizadas, por exemplo, por filtração através de um filtro de retenção de bactérias ou incorporando-se agentes esterilizantes em uma composição sólida estéril (ou esterilizam a composição sólida por irradiação) que subsequentemente pode ser dissolvida ou dispersa em água estéril ou outro meio estéril injetável antes do uso.
[082] De modo a prolongar o efeito de um agente ativo, é frequentemente desejável retardar a absorção de um agente ativo a partir da injeção subcutânea ou intramuscular. A absorção retardada de uma porção ativa parenteralmente administrada é realizada dissolvendo-se ou colocando-se em suspensão a porção ativa em um veículo oleoso. Formas de depósito injetáveis são fabricadas microencapsulando-se a porção ativa em polímeros biodegradáveis tais como polilactida-poliglicolida. Dependendo da razão da porção ativa para polímero e da natureza do polímero particular utilizado, a taxa de liberação de agente ativo pode ser controlada. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem poli(ortoésteres) e poli(anidridos). Formulações injetáveis de depósito são também preparadas aprisionando-se a porção ativa em lipossomos ou microemulsões que são compatíveis com tecidos corporais.
[083] Composições para administração retal ou vaginal são preferivelmente supositórios que podem ser preparados misturando-se uma porção ativa desta divulgação com um excipiente ou portador não irritante adequado tal como manteiga de cacau, polietilenoglicol ou uma cera de supositório, excipientes/portadores estes que são sólidos em temperatura ambiente mas líquido em temperatura corporal e, portanto, derretem no reto ou na cavidade vaginal e liberam a porção ativa (e, consequentemente, o agente ativo).
[084] Formas de dosagem para administração tópica ou transdérmica de uma porção ativa desta divulgação incluem unguentos, pastas, cremes, loções, géis, pós, soluções, pulverizações, inalantes ou emplastros. A porção ativa é misturada sob condições estéreis com um portador farmaceuticamente aceitável e quaisquer preservantes ou tampões conforme pode ser necessário. Formulações oftálmicas,
gotas para ouvidos, unguentos oculares, pós e soluções são também considerados como estando dentro do escopo desta divulgação.
[085] Os unguentos, pastas, cremes e géis podem conter, além de uma porção ativa desta divulgação, excipientes tais como gorduras animais e vegetais, óleos, ceras, parafinas, amido, tragacanto, derivados de celulose, polietilenoglicóis, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco e óxido de zinco ou misturas dos mesmos.
[086] Pós e pulverizações podem conter, além de uma porção ativa desta divulgação, excipientes tais como lactose, talco, ácido silícico, hidróxido de alumínio, silicatos de cálcio e pó de poliamida ou misturas destas substâncias. Pulverizações podem conter adicionalmente propelentes habituais.
[087] Emplastros transdérmicos podem ser fabricados dissolvendo-se ou dispensando-se a porção ativa no meio apropriado. Realçadores de absorção podem ser também usados para aumentar o fluxo da porção ativa através da pele. A taxa pode ser controlada fornecendo-se uma membrana de controle de taxa ou dispersando-se a porção ativa em uma matriz ou gel poliméricos.
[088] Para liberação pulmonar, uma composição farmacêutica da divulgação é formulada e administrada ao paciente em forma particulada sólida ou líquida por administração direta por exemplo, inalação no sistema respiratório. Formas particuladas sólidas ou líquidas da porção ativa preparado para praticar a presente divulgação incluem partículas de tamanho respirável: isto é, partículas de um tamanho suficientemente pequeno para passar através da boca e laringe após a inalação e nos brônquios e alvéolos dos pulmões. A liberação de produtos terapêuticos aerossolizados, particularmente antibióticos aerossolizados, é conhecida na técnica (consultar, para exemplo a Pat. dos EUA No 5.767.068, Pat. dos EUA No 5.508.269 e WO 98/43650). Um debate da liberação pulmonar dos antibióticos é também encontrado na Pat. dos EUA No 6.014.969.
[089] A dose diária total de uma porção ativa desta divulgação administrada a um indivíduo ou paciente humano em dose única ou em doses divididas preferivelmente inclui 0,01 a 50 mg/kg de peso corpóreo de agente ativo ou, mais preferivelmente, 0,1 a 30 mg/kg de peso corpóreo de agente ativo. Composições de dose única podem conter tais quantidades ou submúltiplos das mesmas compensam a dose diária. Em geral, regimes de tratamento de acordo com a presente divulgação compreendem a administração a um indivíduo humano em necessidade de tal tratamento de cerca de 1 mg a cerca de 5000 mg de agente ativo (compreendido em uma porção ativa desta divulgação) por dia em dose única ou doses divididas. Doses para animais mamíferos podem ser estimadas com base nas últimas doses humanas.
[090] Uma porção ativa desta divulgação pode ser administrada, por exemplo, por injeção, intravenosamente, intra-arterialmente, subdermicamente, intraperitonealmente, intramuscularmente ou subcutaneamente; ou bucalmente, nasalmente, transmucosamente, topicamente, em uma preparação oftálmica ou por inalação, como uma dose diária compreendendo cerca de 0,01 a cerca de 50 mg/kg de peso corpóreo de agente ativo. Alternativamente, dosagens (com base em uma dose diária entre cerca de 1 mg e 5000 mg de agente ativo) podem ser administradas a cada 4 a 120 horas ou de acordo com as necessidades da porção ativa particular. Os métodos aqui contemplam a administração de uma quantidade eficaz de uma porção ativa (em uma composição farmacêutica) para obter o efeito desejado ou estabelecido. Tipicamente, as composições farmacêuticas desta divulgação serão administradas de cerca de 1 a cerca de 6 vezes per dia ou alternativamente, como uma infusão contínua. Tal administração pode ser usada como uma terapia crônica ou aguda. A quantidade de porção ativa que pode ser combinada com excipientes ou portadores farmaceuticamente aceitáveis para produzir uma única forma de dosagem variará dependendo do hospedeiro tratado e do modo de administração particular. Uma composição típica conterá de cerca de 5 % a cerca de 95 % de porção ativa (p/p). Alternativamente, tais preparações podem conter de cerca de 20 % a cerca de
80 % de porção ativa. Regimes de dosagem e tratamento específicos para qualquer paciente particular dependerão de uma variedade de fatores, incluindo a atividade da porção ativa específica utilizada, a idade, peso corpóreo, estado de saúde geral, sexo, dieta, tempo de administração, taxa de excreção, combinação de fármaco, a severidade e curso da doença, condição ou sintomas, a disposição do paciente à doença, condição ou sintomas e o julgamento do médico.
[091] Todas as referências citadas neste pedido, incluindo publicações, patentes e pedidos de patente, devem ser consideradas como tendo sido incorporadas em sua totalidade.
[092] O relato de faixas de valores aqui é meramente intencionada a servir como um método abreviado de se referir individualmente a cada valor separado que cai dentro da faixa, a menos que de outro modo indicado aqui e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se ele fosse individualmente relatado aqui. A menos que de outro modo estabelecido, todos os valores exatos fornecidos aqui são representativos de valores aproximados correspondentes (por exemplo, todos os valores exatos exemplares fornecidos com respeito a um fator ou medição particulares pode ser considerado como também fornecendo uma medição aproximada correspondente, modificada por “cerca de”, onde apropriado).
[093] A descrição aqui de qualquer aspecto ou modalidade da invenção usando termos tal como a referência a um elemento ou elementos é intencionada a fornecer suporte para um aspecto ou modalidade similares da divulgação que “consiste em”, “consiste essencialmente em” ou “substancialmente compreende” aquele elemento ou elementos particulares, a menos que de outro modo estabelecido ou claramente contradito pelo contexto (por exemplo, uma composição descrita aqui como compreendendo um elemento particular deve ser entendida como também descrevendo uma composição consistindo naquele elemento, a menos que de outro modo estabelecido ou claramente contradito pelo contexto).
[094] Esta invenção inclui todas as modificações e equivalentes do assunto relatado nos aspectos ou reivindicações apresentados aqui na medida máxima permitida pela lei aplicável.
[095] A presente divulgação, assim geralmente descrita, será entendida mais facilmente a título de referência aos exemplos seguintes, que são fornecidos por via de ilustração e não são intencionados a ser limitantes da presente invenção.
EXEMPLOS Nota: Nos exemplos que se referem à síntese de aminoácidos ligados na cadeia lateral os nomes são fornecidos primeiro em nomenclatura IUPAC. Posteriormente, nomes abreviados são usados. A Tabela 1 mostra a correspondência. Tabela 1: Nomes IUPAC e abreviações IUPAC Abreviação Monômeros co-principais ácido (S)-6-acrilamido-2-aminoexanoico Acriloil-L-lisina, AK ácido (2S)-3-(acriloilóxi)-2-aminopropanoico Acriloil-L-serina, COMO ácido (2S)-3-(acriloilóxi)-2-aminobutanoico Acriloil-L-treonina, AT ácido (S)-3-(4-(acriloilóxi)fenil)-2-aminopropanoico Acriloil-L-tirosina, AY ácido (S)-2-(4-acrilamidofenil)-2-aminoacético Acriloil-L-amino- fenilalanina, AHOX ácido (2S)-4-(acriloilóxi)pirrolidino-2-carboxílico Acriloil-L-cisteína, AC ácido (R)-3-(acriloiltio)-2-aminopropanoico Acriloil-L-oxi-prolina,
AHOP ácido (R)-5(3-(5-acrilamido-1-carboxipentil)tioureido)-2-(6- AK-Fluoresceína-V1 hidróxi-3-oxo-3H-xanten-9il)benzoico ácido (R)-5-((5-acrilamido-1-carboxipentil)carbonil-2-(6- AK-Fluoresceína-V2 hidróxi-3-oxo-3H-xanten-9il)benzoico ácido (S)-6-acrilamido-2-(4-(((2S,3S,4S,6R)-3-hidróxi-2- AK-DOX-V1 metil-6-(((1S,3S)-3,5,12-triidróxi-3-(2-hidroxiacetil)-10- metóxi-6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11-hexaidrotetracen-1- il)óxi)tetraidro-2H-piran-4-il)amino)-4- oxobutanamido)hexanoico ácido (2S)-6-acrilamido-2-((1-(6-(((S)-1-(((S)-1-((4- AK-DOX-V2 (((((2S,3S,4S,6R)-3-hidróxi-2-metil-6-(((1S,3S)-3,5,12- triidróxi-3-(2-hidroxiacetil)-10-metóxi-6,11-dioxo- 1,2,3,4,6,11-hexaidrotetracen-1-il)óxi)tetraidro-2H-piran-4- il)carbamoil)óxi)metil)fenil)amino)-1-oxo-5-ureidopentan-2- il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-6-oxoexil)-2,5- dioxopirrolidin-3-il)amino)hexanoico ácido (S)-6-acrilamido-2-(3-(4- AK-Fenol hidroxifenil)propanamido)hexanoico ácido (S)-2,2’,2’’-(10-(2-((5-acrilamido-1- AK-DOTA carboxipentil)amino)-2-oxoetil)-1,4,7,10- tetraazaciclododecano-1,4,7-triil)triacético Substâncias poliméricas (14-metil-2,5,8,13-tetraoxo-3,6,9,12- pré-polímero de BOC- tetraazapentadecil)carbamato de α-etil-tritiocarbonato-ω- G3-DMA-RAFT terc-butil poli(N,N-dimetilacrilamida) α-etil-tritiocarbonato-ω-N-(2-(2-(2-(2- pré-polímero de G3- aminoacetamido)acetamido)acetamido)etil)isobutiramida DMA-RAFT poli(N,N-dimetilacrilamida) (14-metil-2,5,8,13-tetraoxo-3,6,9,12- BOC-G3-Cellophil tetraazapentadecil)carbamato de ω-terc-butila ácido poli(N,N-dimetilacrilamida-co-(S)-6-acrilamido-2- aminoexanoico) ω-N-(2-(2-(2-(2- G3-Cellophil aminoacetamido)acetamido)acetamido)etil)isobutiramida ácido poli(N,N-dimetilacrilamida-co-(S)-6-acrilamido-2- aminoexanoico) (47-metil-2,5,8,46-tetraoxo- BOC-G3-PEG11- 12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42-undecaoxa-3,6,9,45- Cellophil tetraazaoctatetracontil)carbamato de ω-terc-butila ácido poli(N,N-dimetilacrilamida-co-(S)-6-acrilamido-2- aminoexanoico) (14-metil-2,5,8,13-tetraoxo-3,6,9,12- BOC-G3-Cellophil- tetraazapentadecil)carbamato de ω-terc-butila ácido (Fluoresceína)8 poli(N,N-dimetilacrilamida-co-(S)-5-(3-(4-acrilamido-1- carboxibutil)tioureido)-2-(6-hidróxi-3-oxo-3H-xanten-9- il)benzoico) (47-metil-2,5,8,46-tetraoxo- H2N-G3-PEG11- 12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42-undecaoxa-3,6,9,45- Cellophil- tetraazaoctatetracontil)carbamato de ω-terc-butila ácido (Fluoresceína)8 poli(N,N-dimetilacrilamida-co-(S)-5-(3-(4-acrilamido-1- carboxibutil)tioureido)-2-(6-hidróxi-3-oxo-3H-xanten-9- il)benzoico) α-etil-tritiocarbonato-ω-N-(3-azidopropil)isobutiramida pre polímero de RAFT- poli(N,N-dimetilacrilamida) DMA-N3 ω-N-(3-azidopropil)isobutiramida ácido poli(N,N- Cellophil-N3 dimetilacrilamida-co-(S)-6-acrilamido-2-aminoexanoico) ω-N-(3-azidopropil)isobutiramida ácido poli(N,N- Cellophil- dimetilacrilamida-co-(R)-5-((5-acrilamido-1- (Fluoresceína)8-N3 carboxipentil)carbonil-2-(6-hidróxi-3-oxo-3H-xanten- 9il)benzoico) α-etil-tritiocarbonato-2-((2-isobutiramidoetil)amino)-2- pre polímero de RAFT- oxoetoxicarbamato de ω-terc-butila-poli(N,N- DMA-Oxima-BOC dimetilacrilamida) 2-((2-isobutiramidoetil)amino)-2-oxoetoxicarbamato de ω- Cellophil-Oxima-BOC terc-butila-ácido poli(N,N-dimetilacrilamida-co-(S)-6- acrilamido-2-aminoexanoico)
2-((2-isobutiramidoetil)amino)-2-oxoetoxicarbamato de ω- Cellophil- terc-butila-ácido poli(N,N-dimetilacrilamida-co-(S)-5-(3-(4- (Fluoresceína)8-Oxima- acrilamido-1-carboxibutil)tioureido)-2-(6-hidróxi-3-oxo-3H- BOC xanten-9-il)benzoico) ω-N-(2-(2-(aminoóxi)acetamido)etil)isobutiramida-ácido Cellophil- poli(N,N-dimetilacrilamida-co-(S)-5-(3-(4-acrilamido-1- (Fluoresceína)8-Oxima carboxibutil)tioureido)-2-(6-hidróxi-3-oxo-3H-xanten-9- il)benzoico) α-etil-tritiocarbonato-ácido ω-isobutírico-ácido poli(N,N- RAFT-Cellophil-CO2H dimetilacrilamida-co-(S)-6-acrilamido-2-aminoexanoico) (20-metil-19-oxo-3,6,9,12,15-pentaoxa-18- Cellophil BOC-NH- azahenicosil)carbamato de terc-butila-ácido poli(N,N- PEG5-(DMA30/AK8) dimetilacrilamida-co-(S)-6-acrilamido-2-aminoexanoico) N-(17-amino-3,6,9,12,15- Cellophil NH2-PEG5- pentaoxaheptadecil)isobutiramida- ácido poli(N,N- (DMA30/AK-DOTA8) dimetilacrilamida-co-(S)-2,2’,2’’-(10-(2-((5-acrilamido-1- carboxipentil)amino)-2-oxoetil)-1,4,7,10- tetraazaciclododecano-1,4,7-triil)triacético) N1-dibenzociclooctino-N6-(20-metil-19-oxo-3,6,9,12,15- Cellophil DBCO-NH- pentaoxa-18-azahenicosil)adipamida ácido poli(N,N- PEG5-(DMA30/AK- dimetilacrilamida-co-(S)-2,2’,2’’-(10-(2-((5-acrilamido-1- DOTA8) carboxipentil)amino)-2-oxoetil)-1,4,7,10- tetraazaciclododecano-1,4,7-triil)triacético) α-cicloalcino-ácido ω-isobutírico-ácido poli(N,N- Cicloalcino- dimetilacrilamida-co-(S)-2,2’,2’’-(10-(2-((5-acrilamido-1- Cellophil(DOTA)-CO2H carboxipentil)amino)-2-oxoetil)-1,4,7,10- tetraazaciclododecano-1,4,7-triil)triacético) N-(1-(4-(6-metil-1,2,4,5-tetrazin-3-il)fenil)-2-oxo- Tetrazina-Cellophil 6,9,12,15,18-pentaoxa-3-azaicosan-20-il)isobutiramida [DMA30/AK-DOTA8]. ácido poli(N,N-dimetilacrilamida-co-(S)-2,2’,2’’-(10-(2-((5- acrilamido-1-carboxipentil)amino)-2-oxoetil)-1,4,7,10- tetraazaciclododecano-1,4,7-triil)triacético) ácido 6-amino-9-(2-carbóxi-5-((5-(((((4aS,7R)-4-metil-1-(4- AFDye-488-Clique- (23-metil-2,22-dioxo-6,9,12,15,18-pentaoxa-3,21- Cellophil [DMA30/AK- diazatetracosil)fenil)-2,4a,5,6,7,8,9,10- DOTA8] octaidrocicloocta[d]piridazin-7- il)óxi)carbonil)amino)pentil)carbamoil)fenil)-4,5-dissulfo-3H- xanten-3-imínio poli(N,N-dimetilacrilamida-co-(S)-2,2’,2’’- (10-(2-((5-acrilamido-1-carboxipentil)amino)-2-oxoetil)- 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triil)triacético) Intermediários ácido 2-(((etiltio)carbonotioil)tio)-2-metilpropanoico Etil-RAFT 2-(((etiltio)carbonotioil)tio)-2-metilpropanoato de 2,5- RAFT-NHS dioxopirrolidin-1-ila (2-(2-(((etiltio)carbonotioil)tio)-2- RAFT-EDA-BOC metilpropanamido)etil)carbamato de terc-butila 2,2,2-trifluoroacetato de 2-(2-(((etiltio)carbonotioil)tio)-2- RAFT-EDA-OTf metilpropanamido)etanamínio
(6,6-dimetil-7,12,15,18-tetraoxo-4-tioxo-3,5-ditia- BOC-G3-RAFT 8,11,14,17-tetraazanonadecan-19-il)carbamato de terc- butila ácido (S)-6-(((alilóxi)carbonil)amino)-2-aminoexanoico H-Lys(Alloc)-OH 2-((((9H-fluoren-9-il)metóxi)carbonil)amino)-3- FMOC-Val-OSu metilbutanoato de (S)-2,5-dioxopirrolidin-1-ila ácido (S)-2-((S)-2-((((9H-fluoren-9- FMOC-Val-Lys(Alloc)- il)metóxi)carbonil)amino)-3-metilbutanamido)-6- OH (((alilóxi)carbonil)amino)hexanoico ((S)-1-(((S)-6-(((alilóxi)carbonil)amino)-1-((4- FMOC-Val-Lys(Alloc)- (hidroximetil)fenil)amino)-1-oxoexan-2-il)amino)-3-metil-1- PABOH oxobutan-2-il)carbamato de (9H-fluoren-9-il)metila ((S)-5-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-6-((4- H-Val-Lys(Alloc)- (hidroximetil)fenil)amino)-6-oxoexil)carbamato de alila PABOH ((S)-5-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-diidro-1H-pirrol-1- MC-Val-Lys(Alloc)- il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-6-((4- PABOH (hidroximetil)fenil)amino)-6-oxoexil)carbamato de alila ((S)-5-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-diidro-1H-pirrol-1- MC-Val-Lys(Alloc)- il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-6-((4-((((4- PABO-PNP nitrofenóxi)carbonil)óxi)metil)fenil)amino)-6- oxoexil)carbamato de alila ((S)-5-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-diidro-1H-pirrol-1- MC-Val-Lys(Alloc)- il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-6-((4- PABC-DOX (((((2S,3S,4S,6R)-3-hidróxi-2-metil-6-(((1S,3S)-3,5,12- triidróxi-3-(2-hidroxiacetil)-10-metóxi-6,11-dioxo- 1,2,3,4,6,11-hexaidrotetracen-1-il)óxi)tetraidro-2H-piran-4- il)carbamoil)óxi)metil)fenil)amino)-6-oxoexil)carbamato de alila ((2S,3S,4S,6R)-3-hidróxi-2-metil-6-(((1S,3S)-3,5,12- MC-Val-Lys-PABC-DOX triidróxi-3-(2-hidroxiacetil)-10-metóxi-6,11-dioxo- 1,2,3,4,6,11-hexaidrotetracen-1-il)óxi)tetraidro-2H-piran-4- il)carbamato de 4-((S)-6-amino-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5- diidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3- metilbutanamido)hexanamido)benzila ((2S,3S,4S,6R)-3-hidróxi-2-metil-6-(((1S,3S)-3,5,12- MC-Ala-Lys-PABC-DOX triidróxi-3-(2-hidroxiacetil)-10-metóxi-6,11-dioxo- 1,2,3,4,6,11-hexaidrotetracen-1-il)óxi)tetraidro-2H-piran-4- il)carbamato de 4-((S)-6-amino-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5- diidro-1H-pirrol-1- il)hexanamido)propanamido)hexanamido)benzila (4-nitrofenil) carbonato de 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5- MC-Val-Cit-PABO-PNP diidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5- ureidopentanamido)benzila ácido 2,2’,2’’-(10-(2-((2,5-dioxopirrolidin-1-il)óxi)-2-oxoetil)- DOTA-NHS 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triil)triacético ácido 2,2’,2’’-(10-(2,6-dioxotetraidro-2H-piran-3-il)-1,4,7,10- DOTA-Anidrido tetraazaciclododecano-1,4,7-triil)triacético ácido 2,2′,2”-(10-(1-carbóxi-4-((4- p-NCS-Bz-DOTA-GA isotiocyanatobenzil)amino)-4-oxobutil)-1,4,7,10- tetraazaciclododecano-1,4,7-triil)triacético ((2S,3S,4S,6R)-3-hidróxi-2-metil-6-(((1S,3S)-3,5,12- MC-Val-Cit-PABC-DOX triidróxi-3-(2-hidroxiacetil)-10-metóxi-6,11-dioxo- 1,2,3,4,6,11-hexaidrotetracen-1-il)óxi)tetraidro-2H-piran-4- il)carbamato de 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-diidro-1H- pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5- ureidopentanamido)benzila Produtos químicos N-Hidroxissuccinimida NHS cloridrato de N-etil-N′-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida EDC∙HCl 2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-il)propano]dicloridrato VA044 álcool 4-aminobenzílico PABOH N-Etoxicarbonil-2-etóxi-1,2-diidroquinolina EEDQ Diisopropiletilamina DIEA cloroformiato de 4-nitrofenila Cloroformiato de PNP N-metil-2-pirrolidona NMP Diclorometano DCM Tetra-hidrofurano THF Acetato de etila EtOAc Metanol MeOH éster succinimidílico de N-alfa-(9-Fluorenilmetiloxicarbonil)- FMOC-Val-OSu L-valina Exemplo 1: Síntese de monômero de ácido (S)-6-acrilamido-2-aminoexanoico por intermédio de complexo de cobre
[096] L-lisina (14,62 g; 100 mmol) foi dissolvido em 150 mL de água deionizada e aquecido até cerca de 80 °C. Carbonato de cobre (16,6 g; 75 mmol) foi adicionado em porções durante um período de 30 minutos. A reação foi agitada por 30 minutos adicionais. A suspensão azul escuro, quente foi filtrada através de gel de sílica. O filtro foi lavado com uma quantidade pequena de água. No dia subsequente, o complexo de lisina e cobre contendo o filtrado combinado foi resfriado em um banho de gelo e 100 mL de tetra-hidrofurano (THF) foram adicionados. Uma solução de cloreto de acriloíla em éter metil-terc-butílico (TBME) (8,9 mL, 110 mmol) foi adicionada gota a gota durante um período de uma hora. O pH foi inicialmente mantido entre 8 e 10 por adição gota a gota, em paralelo de solução de hidróxido de sódio a 10 %. Depois que metade da solução de cloreto de acriloíla foi adicionada, o produto começou a precipitar. Quando a maioria do cloreto de acriloíla foi adicionada, a adição de hidróxido de sódio foi retardada para permitir que o pH caísse para cerca de 6 e a temperatura da mistura de reação atingisse a temperatura ambiente. A suspensão azul foi agitada durante um adicional de 2 horas e depois foi filtrada. O material sólido retido no filtro foi lavado com água e acetona e depois seco. Um rendimento de 6,5 g de complexo de acriloil-L-lisina e cobre foi obtido.
[097] Complexo de acriloil-L-lisina e cobre (29,5 g) foi colocado em suspensão em 300 mL de água deionizada e resfriado em um banho de gelo. Gás H2S foi borbulhado na suspensão até que a precipitação de sulfeto de cobre fosse completa. Três gramas de carvão ativo foram adicionados à suspensão. A suspensão foi aquecida brevemente até 100 °C. Depois de resfriar até a temperatura ambiente, 500 mL de acetona foram adicionados à suspensão que depois foi filtrada em gel de sílica. O filtrado claro foi colocado em um evaporador rotativo. Depois da evaporação do solvente, o produto sólido foi recristalizado a partir de 200 mL de acetona aquosa a 50 %. Um rendimento de 17,76 g (70 %) de pó branco foi obtido. A estrutura do composto foi verificada por espectroscopia de RMN e LC-MS. Exemplo 2: Síntese ácido (2S)-3-(acriloilóxi)-2-aminopropanoico
[098] Uma solução de L-serina (5 g, 47,6 mmol) em água (50 mL) foi aquecida até 80 °C e carbonato de cobre sólido (5,79 g, 26,2 mmol) foi adicionado. A solução foi agitada por 10 min. O resíduo não dissolvido foi subsequentemente coletado por filtração e lavado com água (30 mL). O filtrado combinado foi resfriado em um banho de gelo e KOH (27,1 mL, 47,6 mmol) foi adicionado lentamente. A esta solução uma mistura de cloreto de acriloíla (4,52 mL, 59,5 mmol) em acetona (30 mL) foi adicionada gota a gota. A mistura de reação depois foi incubada a 4 °C durante a noite sob agitação. O sólido formado foi isolado e lavado com água (50 mL)/metanol (50 mL)/éter etil-terc-butílico (50 mL) (MTBE) e finalmente seco sob pressão reduzida para fornecer complexo de O-acriloil-L-serina-Cu2+ (3,8 g, 10,01 mmol; 42,1 % de rendimento). O cobre no complexo foi subsequentemente removido por um procedimento similar como aquele descrito no exemplo 1. Um rendimento de 1,43 g (45 %) de acriloil-L-serina como pó branco foi obtido. A identidade do composto foi verificada por espectroscopia de RMN e LC-MS. Exemplo 3: Síntese de ácido (2S)-3-(acriloilóxi)-2-aminobutanoico
[099] Um vaso de reação com 6 mL de ácido trifluoroacético (TFA) foi resfriado em um banho de gelo. Subsequentemente, L-treonina sólido (2,00 g, 16,79 mmol) foi adicionado e a mistura foi agitada por 5 min. Ácido triflurometanossulfônico (0,18 mL, 2,0 mmol) e, subsequentemente, cloreto de acriloíla (2,5 mL, 32,9 mmol) foram adicionados e a mistura de reação foi incubada por 2 h na temperatura ambiente. Depois da conclusão da reação, o produto foi precipitado com éter metil-terc-butílico (MTBE). Depois do isolamento do sólido, o produto foi lavado com MTBE e acetona. Cloridrato de O-acriloil-L-treonina foi finalmente seco sob pressão reduzida para fornecer um pó branco (32 % de rendimento). A estrutura do composto foi verificada por espectroscopia de RMN e LC-MS. Exemplo 4: Síntese de ácido (S)-3-(4-(acriloilóxi)fenil)-2-aminopropanoico
[0100] A síntese do complexo de O-acriloil-L-tirosina-Cu2+ foi realizada de acordo com o procedimento descrito no exemplo 1. Cobre foi removido do complexo pelo procedimento seguinte: 73,15 g (140 mmol) de complexo de O-acriloil-L-tirosina- Cu2+ foi dissolvido em 220 mL de HCl 2 N em um prato de trituração. A mistura foi homogeneizada usando equipamento Polytron® PT 3000. Subsequentemente, a mistura foi filtrada e o resíduo lavado duas vezes com 50 mL de HCl 2 N. O composto sólido depois foi seco em NaOH a 40 °C sob pressão reduzida para fornecer cloridrato de O-acriloil-L-tirosina (46,96 g, 63 % de rendimento). Exemplo 5: Síntese de ácido (S)-2-(4-acrilamidofenil)-2-aminoacético
[0101] Boc-4-amino-L-fenilalanina (2,50 g, 8,9 mmol, Anaspec, Fremont, CA) foi dissolvido em 25 mL de clorofórmio. Trietilamina (2,47 mL, 17,8 mmol) foi fornecida a esta solução e a mistura foi resfriada até -15 °C. Subsequentemente, cloreto de acriloíla (0,79 mL, 9,8 mmol) em clorofórmio foi adicionado gota a gota à mistura sob agitação. Depois que a adição de cloreto de acriloíla foi concluída, a mistura de reação foi agitada por três horas adicionais. A mistura de reação foi passada posteriormente através de um filtro de vidro, o ácido (S)-2-(4-acrilamidofenil)-2-aminoacético protegido foi purificado por cromatografia em coluna e os solventes residuais foram evaporados. O ácido (S)-2-(4-acrilamidofenil)-2-((terc-butoxicarbonil)amino)acético obtido (500 mg, 1,5 mmol) foi dissolvido em 5 mL de diclorometano (DCM). Ácido trifluoracético (TFA) (800 µL, 10,38 mmol) foi adicionado e a solução foi agitada por 1 h na temperatura ambiente. Posteriormente, o solvente foi removido sob pressão reduzida, 5 mL de DCM foram adicionados e o solvente foi novamente removido sob pressão reduzida. Este procedimento foi repetido várias vezes. Finalmente, o produto foi dissolvido em 3 mL de DCM e precipitado com éter metil-terc-butílico (MTBE). O sólido foi coletado em um filtro de vidro e seco a vácuo para obter acriloil-4-amino-L- fenilalanina pura em um rendimento de 15 %. A estrutura do composto foi verificada por RMN. Exemplo 6: Síntese de ácido (2S)-4-(acriloilóxi)pirrolidino-2-carboxílico e ácido (R)-3-(acriloiltio)-2-aminopropanoico
[0102] A síntese destes compostos foi realizada como descrito no exemplo 1. Para ácido (2S)-4-(acriloilóxi)pirrolidino-2-carboxílico e ácido (R)-3-(acriloiltio)-2- aminopropanoico, os materiais de partida foram, respectivamente, 4-hidróxi-L-prolina e L-cisteína. Exemplo 7: Síntese de ácido (S)-6-acrilamido-2-(3-(4- hidroxifenil)propanamido) hexanoico (AK-Fenol)
[0103] A uma solução de AK (538 mg, 2,69 mmol) e TEA (443 µL, 3,18 mmol) em DMF (9 mL) foi adicionado reagente de Bolton-Hunter (643 mg, 2,44 mmol). A mistura de reação foi agitada durante a noite na temperatura ambiente. A mistura de reação depois foi filtrada e os voláteis foram removidos sob uma corrente de N2. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de SiO2. A estrutura foi verificada por espectroscopia de RMN. Exemplo 8: Síntese de derivados de metacrila/etilacrila/propilacrila de aminoácidos
[0104] As sínteses de derivados de metacrila/etilacrila/propilacrila foram realizadas usando o respectivo cloreto ácido, por exemplo, cloreto de metacriloíla, sob as condições descritas nos exemplos 1 a 7. Exemplo 9: Síntese de monômero co-principal modificado por fluoresceína AK-Fluoresceína-V1
[0105] Em um vaso de reação de 20 mL uma solução de acriloil-L-lisina [consultar o exemplo 1] (150 mg, 0,749 mmol), isotiocianato de fluoresceína (FITC, 321 mg, 0,824 mmol) e trietilamina (0,114 mL, 0,824 mmol) foi preparada em DMF. A reação foi incubada durante a noite na escuridão e na temperatura ambiente sob agitação constante. Subsequentemente, a solução foi filtrada através de um filtro de 0,4 µm para remover as partículas potenciais. Posteriormente, o solvente residual foi removido aplicando-se vácuo em um evaporador rotativo a 30 °C. A estrutura foi confirmada por RMN e LC-MS (98 % de rendimento, com uma pureza de > 95 %). O monômero sintetizado foi testado posteriormente em uma copolimerização com dimetilacrilamida (DMA) [90/10 mol/mol] usando DMF como solvente e AIBN como iniciador. A reação de polimerização foi realizada a 65 °C por 6 h e o copolímero resultante foi analisado por cromatografia de permeação em gel (GPC) usando o protocolo apresentado no exemplo 13. Exemplo 10: Síntese de monômero co-principal modificado por fluoresceína AK-Fluoresceína-V2
[0106] A reação foi realizada com Fluoresceína-NHS como material de partida de acordo com os protocolos de síntese apresentados no exemplo 9 mas com um excesso de 10 % em mol de AK que foi removido depois de reação por precipitação.
[0107] A estrutura foi confirmada por RMN e LC-MS (rendimento de 85 %, com uma pureza de > 93 %). O monômero sintetizado foi testado posteriormente em uma copolimerização com dimetilacrilamida (DMA) [90/10 mol/mol] usando DMF como solvente e AIBN como iniciador. A reação de polimerização foi realizada a 65 °C por 6 h e o copolímero resultante foi analisado por GPC usando o protocolo apresentado no exemplo 13. Exemplo 11: Síntese de um monômero de co-princípio modificado por doxorrubicina (DOX) com um ligante não clivável (AK-DOX-V1)
[0108] A uma solução de DOX∙HCl (200 mg, 345 µmol, 1,00 eq.) e Et3N (50 µL, 348 µmol, 1,01 eq.) em DMF foi adicionado anidrido succínico (36,2 mg, 362 µmol, 1,05 eq.). A mistura foi agitada sob atmosfera inerte na temperatura ambiente por 30 min e depois NHS (43,7 mg, 379 µmol, 1,10 eq.) e, subsequentemente, EDC∙HCl (69,4 mg, 362 µmol, 1,05 eq.) foram adicionados. A mistura resultante foi agitada durante a noite na temperatura ambiente e depois AK (69,0 mg, 345 µmol, 1,00 eq.) e, subsequentemente, Et3N (53 µL, 379 µmol, 1,10 eq.) foram adicionados. A mistura de reação foi agitada novamente durante a noite na temperatura ambiente. Os voláteis foram evaporados sob uma corrente de N2 e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de SiO2 para obter o produto desejado (228 mg, 276 µmol, 80 %). Exemplo 12: Síntese de um monômero de co-princípio modificado por doxorrubicina com um ligante sensível a catepsina B (AK-DOX-V2)
[0109] Uma solução de DOX∙HCl (86 mg, 149 µmol, 1,10 eq.), MC-Val-Cit- PABO-PNP (100 mg,136 µmol, 1,00 eq.) e N,N-diisopropiletilamina (DIPEA) (26 µL, 149 µmol, 1,10 eq.) em N-metil-2-pirrolidona (NMP) é agitada por 2 h na temperatura ambiente. À mistura resultante são adicionados AK (28,5 mg, 142 µmol, 1,05 eq.) seguido por DIPEA (26 µL, 149 µmol, 1,10 eq.). A mistura de reação é agitada durante a noite na temperatura ambiente. Os voláteis são evaporados sob uma corrente de N2 e o resíduo é purificado por cromatografia em SiO2 para obter o produto desejado (109 mg, 81 µmol, 60 %). Exemplo 13: Procedimento geral para a síntese de BOC-Gn-Cellophil Etapa 1: Síntese do intermediário RAFT-NHS:
[0110] A uma solução de ácido 2-[[(Etiltio)tioxometil]tio]-2-metil-propanoico (22,85 g, 102 mmol, 1,0 eq.), sintetizado como descrito em Tucker et al. (ACS Macro Letters (2017) 6(4): 452 - 457) e 1-hidroxipirrolidinino-2,5-diona (12,89 g, 112 mmol, 1,1 eq.) em CH2Cl2 foi adicionado EDC∙HCl (21,48 g, 112 mmol, 1,1 eq.) a 0 °C. A mistura de reação foi deixada agitar na temperatura ambiente por 16 h. A mistura de reação depois foi parcialmente evaporada (cerca de metade do volume total) sob um fluxo de N2 e diluída com AcOEt e água duplamente destilada (ddH2O). A solução bifásica foi transferida em um funil de separação e, depois da extração, a fase orgânica foi sucessivamente lavada com ddH2O, uma solução aquosa saturada de NaHCO3 (3 x), ddH2O (2 x) e salmoura. A fase orgânica foi seca (Na2SO4) e todos os voláteis foram removidos sob pressão reduzida. O resíduo foi triturado com n-hexano e a suspensão amarela resultante foi filtrada. A torta foi lavada com n-hexano. O sólido amarelo foi seco sob pressão reduzida e o intermediário resultante (RAFT-NHS) foi usado sem purificação adicional (31,8 g, 99,0 mmol, 97 %). Todos os dados analíticos estavam de acordo com os valores de literatura. Yang et al. (2012) Macromolecular rapid communications 33(22): 1921 - 6. Etapa 2: Síntese do intermediário RAFT-EDA-BOC:
[0111] A uma solução de material de partida de RAFT-NHS (1,22 g, 3,61 mmol 1,0 eq.) em CH2Cl2 foi adicionada gota a gota e a -10 °C uma solução de t-butil-(2- aminoetil) carbamato (0,81 g, 5,0 mmol, 1,4 eq.) e Et3N (1,0 mL, 7,2 mmol, 2,0 eq.) em CH2Cl2. A mistura de reação foi agitada por 12 h na temperatura ambiente. A mistura orgânica foi sucessivamente lavada com uma solução aquosa saturada de NH4Cl (2 x), uma solução aquosa saturada de NaHCO3 (2 x) e salmoura. A fase orgânica foi seca (Na2SO4) e todos os voláteis foram removidos sob pressão reduzida.
O resíduo foi recristalizado a partir de uma mistura de n-heptano e Et2O. Os cristais amarelos foram filtrados, lavados com n-heptano e secos sob pressão reduzida para fornecer o intermediário seguinte (RAFT-EDA-BOC, 1,26 g, 3,44 mmol, 95 %). A estrutura do composto obtido foi verificada por espectroscopia de MS e RMN. Etapa 3: Síntese do intermediário RAFT-EDA-OTf:
[0112] Uma solução fria de RAFT-EDA-BOC (1,25 g, 3,41 mmol, 1,0 eq.) em TFA foi agitada por 60 min. A mistura de reação depois foi diluída com MeOH e CH2Cl2 (1/2) e os voláteis foram parcialmente (⅔ do volume total) removidos sob um fluxo de N2. O RAFT-EDA-OTf resultante foi isolado como um óleo amarelo (2,00 g, 3,29 mmol, 96 %) e foi usado na etapa seguinte sem purificação adicional. A estrutura do composto obtido foi verificada por espectroscopia de MS e RMN. Etapa 4: Síntese de um intermediário BOC-Gn-RAFT:
[0113] Uma solução de BOC-G3 (697 mg, 2,41 mmol, 1,0 eq.), hidrato de 1- hidroxibenzotriazol (hidrato de HOBt) (92,0 mg, 600 µmol, 0,25 eq.) e EDC∙HCl (485 mg, 2,53 mmol, 1,05 eq.) em CH2Cl2 foi agitada por 30 min a 0 °C sob atmosfera inerte (N2). A esta solução foi sucessivamente adicionada gota a gota uma solução de RAFT- EDA-OTf (917 mg, 2,41 mmol, 1,0 eq.) em CH2Cl2 e DIPEA (2,13 mL, 12,5 mmol, 5,2 eq.). A mistura de reação foi agitada por 1 h a 0 °C e depois durante a noite na temperatura ambiente. A mistura de reação foi diluída com CH2Cl2 e a mistura orgânica foi sucessivamente lavada com uma solução saturada de NH4Cl (3 x), com uma solução saturada de NaHCO3, ddH2O e salmoura. A fase orgânica foi coletada, seca (Na2SO4) e os voláteis foram parcialmente removidos (⅔ do volume total) sob pressão reduzida. À solução resultante foi adicionado EtOAc. A solução turva resultante depois foi armazenada no refrigerador durante a noite para obter uma suspensão amarela, que foi filtrada e a torta foi lavada com EtOAc frio. O sólido amarelo foi seco sob pressão reduzida para obter agente de BOC-G3-RAFT (396 mg, 736 µmol, 31 %). A estrutura do composto obtido foi verificada por espectroscopia de
MS e RMN. Etapa 5: Síntese de um pré-polímero de BOC-Gn-DMA-RAFT
[0114] A uma solução de DMA (192 µL, 1,86 mmol, 10 eq.) em dioxano foram sucessivamente adicionados agente de BOC-G3-RAFT (100 mg, 186 µmol, 1,0 eq.) e AIBN (6,1 mg, 37 µmol, 0,20 eq.). A mistura de reação foi agitada por 6 h a 60 °C. O produto de reação depois foi precipitado em n-hexano. A suspensão amarela clara foi filtrada e a torta resultante lavada com n-hexano e finalmente dissolvida em acetona. Os voláteis foram depois removidos sob pressão reduzida para obter pré-polímero de BOC-G3-DMA-RAFT como um óleo amarelo (280 mg, 186 µmol, 99 %). A estrutura do composto obtido foi verificada por espectroscopia de MS e RMN. Etapa 6 (opcional): Síntese de um pré-polímero de Gn-DMA-RAFT
[0115] Uma solução do pré-polímero de BOC-G3-DMA-RAFT em dioxano é tratada com uma solução de HCl (4 M) em dioxano por 2 h. Os voláteis são removidos sob um fluxo de N2 na temperatura ambiente. O resíduo é usado sem purificação adicional. A estrutura do composto obtido é verificada por espectroscopia de MS e RMN. Etapa 7: Síntese de um BOC-Gn-Cellophil
[0116] A uma solução de DMA (1,23 mL, 11,9 mmol, 70 eq.) e AK (272 mg, 1,36 mmol, 8 eq.) em ddH2O foram sucessivamente adicionados pré-polímero de BOC-G3-DMA (221 mg, 170 µmol, 1,0 eq.) e VA044 (27,5 mg, 85 µmol, 0,4 eq.). A mistura de reação foi agitada por 4 h a 55 °C. A mistura de reação foi diluída com ddH2O e dioxano. A esta solução foi sucessivamente adicionado ácido fosfínico (50 w %, 93 µL, 850 µmol, 5 eq.), TEA (118 µL, 850 µmol, 5 eq.) e VA044 (27,5 mg, 85 µmol, 0,5 eq.). A mistura de reação foi agitada por 4 h a 100 °C. A mistura resultante depois foi dialisada (MWCO 3,5 kDa) contra ddH2O e o concentrado foi seco por congelamento para obter BOC-G3-Cellophil como um pó branco (1,20 g, 120 µmol, 71 % sobre duas etapas). A estrutura do composto obtido foi verificada por espectroscopia de RMN e GPC usando o protocolo seguinte: Uma solução de estoque de 3,33 mg/mL de copolímero foi preparada em tampão de eluição (água deionizada contendo 0,05 % (p/v) NaN3) e filtrada através de um filtro com seringa de 0,45 µm. Subsequentemente, 0,4 mL de solução de estoque foi injetado na porta do dispositivo de GPC (1260 Infinity LC-System, Agilent, Santa Clara, CA). A cromatografia foi realizada em uma vazão constante de 0,5 mL/min em tampão de eluição. Amostras de copolímero foram separadas em um sistema de três colunas Suprema (pré-coluna, 1000 Å, 30 Å; tamanho de partícula de 5 µm; PSS, Mainz, Germany) que foi colocado em um forno de coluna externa a 55 °C. Os copolímeros foram analisados por RI (índice refrativo) e detectores de UV. Uma curva de calibração (10 pontos) foi estabelecida usando um padrão de pululano. Os pesos moleculares de copolímeros caracterizados foram estimados com referência a este padrão.
[0117] A síntese do derivado de pentaglicina (BOC-G5-Cellophil) foi obtida seguindo o protocolo acima com modificações menores usando BOC-G5-sal de Na como material de partida. BOC-G5-sal de Na foi obtido a partir de pentaglicina e sintetizado de acordo com Wang, T.-P. et al (2012) Bioconjugate Chemistry 23(12): 2417 - 2433. Outros copolímeros de Cellophil funcionalizados em oligoglicina podem ser gerados usando um protocolo similar. Exemplo 14: Síntese de BOC-Gn-PEGx-Cellophil
[0118] A síntese de BOC-G3-PEG11-Cellophil foi obtida seguindo os procedimentos gerais acima (Exemplo 13: etapa 1 a 4 e 7). A etapa 2 foi executada usando BOC-PEG11-CH2CH2-NH2 como material de partida para produzir RAFT- PEG11-BOC e a etapa 3 foi realizada usando HCl em EtOAc.
[0119] A síntese do derivado de PEG23 (BOC-G3-PEG23-Cellophil) foi obtida seguindo o protocolo acima com modificações menores usando BOC-PEG23-CH2CH2- NH2 como material de partida. Outros copolímeros de Cellophil funcionalizados em oligoglicina e PEG podem ser gerados por um protocolo similar.
Exemplo 15: Síntese de um BOC-Gn-Cellophil-(Fluoresceína)8 ou um BOC- Gn-PEGx-Cellophil-(Fluoresceína)8
[0120] A uma solução de BOC-G3-Cellophil (1,0 eq.) ou BOC-G3-PEG11- Cellophil (1,0 eq.) (para a preparação consultar o exemplo 13, etapa 7) em uma solução aquosa de NaHCO3 (0,1 N) foi lentamente adicionada uma solução de FITC (16 eq.) em DMSO. A mistura de reação resultante foi agitada por 16 h na temperatura ambiente e dialisada (MWCO 3,5 kDa) contra uma solução aquosa de NaHCO3 (0,1 N) e, depois, ddH2O. O concentrado foi seco por congelamento para obter um pó laranja escuro (rendimento: 80 a 92 %). As estruturas dos compostos foram verificadas por RMN e GPC.
[0121] As sínteses dos derivados de triglicina e triglicina-(PEG)23 foram obtidas usando o mesmo protocolo. Exemplo 16: Síntese de um H2N-Gn-Cellophil-(Fluoresceína)8 ou um H2N-Gn- PEGx-Cellophil-(Fluoresceína)8
[0122] A uma solução de BOC-G3-Cellophil-(Fluoresceína)8 (1,0 eq.) ou BOC- G3-PEG11-Cellophil -(Fluoresceína)8 (1,0 eq.) em EtOH foi adicionada uma solução de HCl em EtOH (≈1,25 N). A mistura de reação resultante foi agitada por 2 h na temperatura ambiente e dialisada (MWCO 3,5 kDa) contra água (2 x). O concentrado foi seco por congelamento para obter um pó laranja escuro (eletrostático) (99 %). As estruturas dos compostos foram verificadas por RMN e GPC. Exemplo 17: Síntese de Cellophil contendo doxorrubicina sensível à Catepsina B Etapa 1 Preparação de H-Lys(Alloc)-OH
[0123] Uma solução de cloridrato de L-lisina (1,0 eq.) e carbonato de cobre (II) básico (1,1 eq.) em H2O (100 mL) foi submetida ao refluxo por 30 min. Os sólidos formados durante o refluxo foram removidos por filtração a quente. O filtrado foi resfriado até 0 °C e ajustado ao pH 9 pela adição de bicarbonato de sódio sólido (3,1 eq.). Cloroformiato de alila (1,5 eq.) foi adicionado gota a gota durante um período de 1 h, enquanto a solução agitada a 0 °C. Durante esta adição, a mistura de reação foi mantida no pH 9 pela adição de bicarbonato de sódio sólido. A mistura de reação foi deixada aquecer até a temperatura ambiente e agitada durante a noite. O produto sólido azul formado durante a reação foi coletado por filtração em rendimento quantitativo.
[0124] O sal de cobre sólido de Lys(Alloc) foi colocado em suspensão em H2O (250mL) e 2eq. De tioacetamida (2,0 eq.) foram adicionados. A suspensão alcalina foi agitada a 50 °C por 3 h, durante o tempo este que o sólido lentamente dissolveu. Subsequentemente, a solução foi acidificada ao pH 2 com HCl 2 M e foi fervida por 5 min. O CuS precipitado foi removido por filtração. O filtrado foi concentrado sob vácuo a cerca de 60 mL, ponto este em que o sal de cloridrato de Lys(Alloc) precipitou como um sólido branco (79 %), que foi recuperado por filtração. Etapa 2 Preparação de FMOC-Val-Lys(Alloc)-OH
[0125] Uma solução vigorosamente agitada de FMOC-Val-OSu (1,0 eq.) em Dioxan (30 mL) na temperatura ambiente foi combinada com uma solução de Lys(Alloc)-OH (1,1 eq.) e NaHCO3 (2,1 eq.) em água (30 mL). A temperatura foi mantida abaixo de 25 °C usando um banho de água fria durante os primeiros 30 min. A mistura continuou a ser agitada na temperatura ambiente por 14 h. A mistura foi diluída com água (50 mL) e depois acidificada ao pH 3 com ácido cítrico a 15 %. A suspensão resultante foi extraída com acetato de etila (3 x 100 mL) e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água e salmoura, secas e evaporadas para fornecer um sólido branco amarelado. O sólido foi dissolvido em THF e depois éter metil terc-butílico (MTBE) foi adicionado para fornecer o sólido branco puro (80 %) depois da filtração. Etapa 3 Preparação de FMOC-Val-Lys(Alloc)-PABOH
[0126] Uma solução agitada de FMOC-Val-Lys(Alloc)-OH (1,0 eq.) e PABOH
(1,1 eq.) em THF (15 mL) na temperatura ambiente foi tratada com EEDQ (1,1 eq.). Depois de 16 h, a mistura foi evaporada à secura a 30 °C e o resíduo foi recristalizado a partir de MTBE para fornecer o produto amarelo escuro (84 %). Etapa 4: Preparação de H-Val-Lys(Alloc)-PABOH
[0127] FMOC-Val-Lys(Alloc)-PABOH (1,0 eq) em CH₂Cl₂ (35 ml) na temperatura ambiente foi tratado com dietilamina (50 ml). A mistura foi sonificada brevemente e agitada na temperatura ambiente por 4 h. Os solventes foram evaporados e o resíduo foi fluxado com CH₂Cl₂ e submetido à cromatografia em sílica para fornecer o produto como uma espuma incolor (69 %). Etapa 5: Preparação de MC-Val-Lys(Alloc)-PABOH
[0128] H-Val-Lys(Alloc)-PABOH (1,1 eq.) e DIEA (1,1 eq.) em CH₂Cl₂ (5 ml) na temperatura ambiente foram tratados com MC-NHS (1,1 eq.) em CH₂Cl₂ (2 ml). A mistura foi agitada na temperatura ambiente durante a noite. Acetato de etila (60 ml) foi adicionado e a mistura foi lavada com água e salmoura, seca e evaporada para fornecer o produto desejado (96 %) Etapa 6: Preparação de MC-Val-Lys(Alloc)-PABO-PNP
[0129] Uma solução agitada de MC-Val-Lys(Alloc)-PABOH (1,0 eq.) em THF (15 mL) na temperatura ambiente foi tratada com cloroformiato de PNP (1,2 eq.) e piridina seca (1,5 eq.). A reação foi agitada durante a noite até que a análise de HPLC indicasse que nenhum reativo químico estivesse presente na mistura. A mistura foi diluída com EtOAc (50 mL) e acidificada com ácido cítrico (50 mL, 10 % em H2O). A camada orgânica foi lavada com água (50 mL) e salmoura (25 mL), seca em sulfato de sódio e o solvente foi evaporado para fornecer um sólido amarelo claro. O sólido foi purificado por cromatografia instantânea em gel de sílica (DCM/MeOH a 20:1) para fornecer o composto puro como um sólido amarelado (58 %). Etapa 7: Preparação de MC-Val-Lys(Alloc)-PABC-DOX
[0130] MC-Val-Lys(Alloc)-PABO-PNP (1,0 eq.) e DOX∙HCl (1,1 eq.) em NMP
(8 mL) na temperatura ambiente foram tratados com Et3N (1,1 eq.). A mistura foi posteriormente incubada na escuridão durante 3 dias. A mistura depois foi diluída com 2-Propanol/acetato de etila a 10 % (100 mL) e lavada com água (3 x 100 mL) e salmoura (50 mL), seca e evaporada para fornecer um óleo laranja escuro. Este foi purificado por cromatografia instantânea em gel de sílica para fornecer o produto puro como um sólido vermelho (92 %). Etapa 8: Preparação de MC-Val-Lys-PABC-DOX
[0131] MC-Val-Lys(Alloc)-PABC-DOX (1,0 eq.) em THF (7 mL) sob argônio na temperatura ambiente foi tratado com Pd(PPh3)4 (0,03 eq.), ácido acético (2,5 eq.) e hidreto de tributilestanho (1,5 eq.). A mistura foi agitada na temperatura ambiente na escuridão por 1 h durante tempo este que um sólido laranja começou a se formar. A mistura foi diluída com éter (25 mL) seguido pela adição de HCl 1 M em éter (2 mL). A suspensão resultante foi sonificada brevemente e depois filtrada. O sólido laranja foi lavado repetidamente com éter e depois dissolvido em DCM:MeOH a 5:1. A este foi adicionado Celite (7 g) e depois os solventes foram evaporados. O sólido resultante foi adsorvido em Celite® e carregado seco em uma coluna Celite (a partir de uma pasta fluida em DCM:MeOH a 100:1). A coluna foi eluída com uma mistura de 100:1 DCM:MeOH e depois com uma mistura de 10:1 DCM:MeOH. O produto desejado foi obtido como um sólido laranja (30 %).
[0132] Derivados de ligante MC-Ala-Lys-PABC-DOX, MC-Val-Cit-PABC-DOX tendo diferentes sequências de aminoácido foram sintetizados seguindo os mesmos procedimentos mencionados acima com a exceção de que o ligante de citrulina não precisou de um grupo de proteção alloc. Etapa 9: Acoplamento de ligantes sensíveis à Catepsina B a um copolímero de Cellophil
[0133] Os conjugados de ligante-doxorrubicina mencionados acima foram subsequentemente acoplados ao copolímero de Cellophil (do exemplo 13, etapa 7)
usando o procedimento geral seguinte:
[0134] A uma solução de um copolímero de Cellophil (1,0 eq.) e Et3N (12 eq.) em DMF foi adicionado gota a gota uma solução do conjugado de ligante- doxorrubicina (10 eq.) na temperatura ambiente sob uma atmosfera inerte. A mistura de reação foi agitada durante a noite na temperatura ambiente. A mistura foi finalmente diluída com ddH2O e a suspensão resultante filtrada. O filtrado depois foi dialisado (MWCO 3,5 kDa) contra ddH2O (2 x 10 L) e o concentrado foi liofilizado para obter um pó de fluxo livre vermelho (60 a 70 % de rendimento). A estrutura do composto obtido foi verificada por espectroscopia de RMN. Exemplo 18: Liberação de doxorrubicina mediada por Catepsina B a partir de copolímero de Cellophil.
[0135] Catepsina B do fígado humano (Merck, MW de cerca de 27500) (5 unidades) foi dissolvida em 400 µL de tampão de acetato (50 mM de acetato + 1 mM de EDTA, pH 5,0). 10 µL de solução enzimática foi incubado com 390 µL de solução de ativação (5 mM de ditiotreitol, 100 mM de tampão de fosfato de sódio, 5 mM de EDTA, 100 mM de NaCl, 0,01 % de Brij58, pH 6,0) por cerca de 30 minutos a 37 °C. Enquanto isso, 20 µL de conjugado de ligante polimérico-Dox do exemplo 17 (1 µmol) foi adicionado a 1473 µL da solução de ativação e foi incubado a 37 °C. 32 µL da Enzima ativada (0,01 U) foram adicionados à solução de substrato e a reação foi incubada a 37 °C. A liberação de DOX livre foi monitorada por intermédio de HPLC e medições fotométricas. MC-Val-Lys-PABC-PNP-DOX exibiu a meia-vida mais curta, seguido por MC-Ala-Lys-PABC-DOX e MC-Val-Cit-PABC-DOX. Exemplo 19: Copolimerização de monômeros de co-princípio contendo doxorrubicina (AK-DOX-V1 e AK-DOX-V2).
[0136] A síntese de copolímero de Cellophil contendo doxorrubicina é obtida pelo procedimento geral para a copolimerização de monômeros de co-princípio (Exemplo 13, etapa 7) usando intermediário de BOC-Gn-RAFT, pré-polímero de BOC-
Gn-DMA-RAFT, RAFT-PEGx-BOC ou o reagente desprotegido de BOC correspondente (obtido de acordo com o protocolo descrito no exemplo 13, etapa 6) (1,0 eq.) como um agente de RAFT e um monômero de co-princípio contendo doxorrubicina (8,0 eq.) (AK-DOX-V1 ou AK-DOX-V2). Exemplo 20: Copolimerização de AK-Fenol
[0137] A síntese de copolímero de Cellophil contendo monômeros de iodo reativo foi obtida por intermédio do procedimento geral para a copolimerização de monômeros de co-princípio (Exemplo 13, etapa 7) usando o intermediário BOC-G3- RAFT, pré-polímero de BOC-G3-DMA-RAFT, RAFT-PEG11-BOC ou o reagente desprotegido de BOC correspondente (obtido seguindo o protocolo descrito no exemplo 13, etapa 6) (1,0 eq.) como reagente de RAFT e AK-Fenol (8,0 eq.) como monômero de co-princípio. Ao invés de ddH2O NaHCO3 0,1 M foi usado como solvente. A estrutura do produto desejado foi verificada por espectroscopia de RMN. Exemplo 21: Iodação de portadores poliméricos reativos em iodo
[0138] A uma solução do copolímero de AK-Fenol do exemplo 20 (70 mg, 7,0 µmol) em tampão de PBS (pH = 7,4) foram sucessivamente adicionados NaI (7,86 mg, 52 µmol) e Cloramina T (14,8 mg, 52 µmol). A mistura de reação depois foi agitada por 30 min na temperatura ambiente e posteriormente diluída com uma solução aquosa de Na2S2O5 (0,3 M). A solução resultante depois foi dialisada contra 10 L de ddH2O e o concentrado foi seco por congelamento. A estrutura do produto desejado foi verificada por espectroscopia de RMN. Exemplo 22: Acoplamento de H2N-G5-Cellophil-(Fluoresceína)8 a um anticorpo de modelo Her2+ usando uma reação mediada por sortase
[0139] H2N-G5-Cellophil-(Fluoresceína)8 (exemplo 16) pode ser conjugado ao anticorpo monoclonal completamente humano contra o antígeno Her2 usando o procedimento geral seguinte. O anticorpo monoclonal Her2 [10 μM] geneticamente modificado com um motivo de sortase (LPETG) e uma etiqueta de hexa-histidina (His6)
no término C de suas cadeias pesadas é incubado com H2N-G5-Cellophil- (Fluoresceína)8 [100 μM] na presença de 0,62 μM de sortase A em 50 mM de Hepes, 150 mM de NaCl, 5 mM de CaCl2, pH 7,5 por 3,5 h a 25 °C. A reação é interrompida passando-a através de uma coluna HiTrap de Proteína A (GE Healthcare) equilibrada com 25 mM de sódio fosfato (pH 7,5). A coluna carregada é lavada com 5 volumes de coluna (CVs) de tampão. O conjugado ligado é eluído com 5 CVs de tampão de eluição (ácido succínico 0,1 M, pH 2,8) com frações de 1 CV coletadas em tubos contendo 25 % (v/v) de Tris-base 1 M para neutralizar a solução. Frações contendo proteína são agrupadas e subsequentemente formuladas em 10 mM de succinato de sódio no pH 5,0, 100 mg/mL de trealose, 0,1 % (p/v) de polisorbato 20 por troca de tampão usando colunas NAP-25 (GE Healthcare) de acordo com as instruções do fabricante. O sucesso da reação de acoplamento é verificado qualitativamente por SDS PAGE em géis de Tris-glicina de gradiente de 4 a 20 % e por análise western blot (WB) usando um anticorpo primário anti-His6 e um anticorpo secundário conjugado à peroxidase de raiz forte. A detecção do sinal de WB é realizada usando um kit de quimiluminescência realçada (ECL) (Pierce™, ECL Western Blotting Substract). O anticorpo anti-Her2- LPETG-His6 não modificado serve como controle. O desaparecimento de anticorpo anti-His6 indica que a reação de sortase conduziu à conclusão. Para a análise quantitativa cromatografia de exclusão por tamanho é realizada. A razão de fármaco para anticorpo (DAR) é calculada por comparação de intensidades de pico de anticorpo não modificado residual (comprimento de onda de detecção UV 280 nm). Exemplo 23: Toxicidade exploratória de um copolímero de H2N-G3-Cellophil
[0140] Os portadores poliméricos desta divulgação não são biodegradáveis. Foi importante, portanto, demonstrar que os portadores são inofensivos para tecidos saudáveis. Um estudo de toxicidade exploratória de um portador polimérico da presente divulgação (sem carga) foi realizado. Brevemente, células HepG2 foram plaqueaqdas em placas de poliestireno de 96 poços de fundo claro e parede preta em
100 μL por poço. O composto de teste foi um copolímero de H2N-G3-Cellophil (12 kDa) contendo DMA e AK (90/10 % em mol) que foi preparado pelo procedimento descrito no exemplo 13, etapa 7. As células HepG2 foram dosadas com composto de teste em concentrações de 0,04 a 100 µM. No final da incubação de 72 h a 37 °C, corantes ou anticorpos apropriados foram adicionados às culturas. As placas foram depois varridas usando um imageador celular fluorescente automático (ArrayScan®, Thermo Scientific Cellomics).
[0141] Os oito parâmetros de saúde celular (CHP) seguintes foram avaliados: Contagem celular: Um número decrescente de células por poço indica toxicidade devido à necrose, apoptose ou uma redução na proliferação celular. Tamanho nuclear: Um aumento na área nuclear pode indicar necrose ou parada de ciclo celular G2 e uma diminuição pode indicar apoptose. Estrutura do DNA: Um aumento na estrutura do DNA pode indicar instabilidade cromossômica e fragmentação de DNA. Massa mitocondrial: Uma diminuição na massa mitocondrial indica perda de mitocôndrias totais e um aumento envolve intumescimento mitocondrial ou uma resposta adaptativa às demandas de energia celular. Potencial de membrana mitocondrial (Δψm): Uma diminuição indica uma perda de integridade mitocondrial, tipicamente resultando em sinalização apoptótica; um aumento no potencial de membrana mitocondrial indica uma resposta adaptativa a demandas de energia celular. Estresse oxidativo: Um aumento em espécies de oxigênio reativo (ROS) é uma resposta citotóxica inicial. Teor de glutationa: Uma diminuição no teor de glutationa (GSH) pode resultar da produção de ROS ou da ligação direta ao composto testado. Um aumento no teor de GSH representa uma resposta celular adaptativa ao estresse oxidativo. ATP celular: Depois da lise celular, ATP é liberado da célula. Células que não ativam metabolicamente não liberarão nenhum ATP. Portanto, uma diminuição em células metabolicamente ativas resultará em uma diminuição no nível de ATP detectado.
Tabela 2: Influência do copolímero de H2N-G3-Cellophil sobre CHPs CHP MEC AC50 MTD MEC [µM] AC50 [µM] MTD [µM] [µM] [µM] controle 1/2 controle [µM] 1/2 controle 1/2 Contagem celular NR NR NR 1,73/15,5 2,54/25,7 2/40 Tamanho nuclear NR NR 3,76/NR 8,09/NR Estrutura do DNA NR NR 0,63 (NS)/ 46,7(NS)/
NR NR Massa NR NR NR/NR NR/NR mitocondrial Potencial de NR NR NR/NR NR/NR membrana mitocondrial Estresse oxidativo NR NR 0,539/NR 22,4/NR Teor de glutationa NR NR NR/1,7 NR/10,4 ATP celular NR NR 3,13/14,4 4,15/16,2 Controle 1: cianeto de carbonila 3-clorofenilhidrazona; Controle 2: L-butionina- sulfoximina; MEC: dose mínima eficaz, isto é, a dose mais baixa na qual um efeito é detectado: AC50: Concentração na qual 50 % do efeito máximo é observado; MTD: dose tolerada máxima, isto é, a concentração na qual < 20 % de perda celular foi observada. NR: Nenhuma resposta; NS: não estatisticamente significativo.
[0142] Este estudo revelou que a exposição das células HepG2 ao copolímero de G3-Cellophil em concentrações de até 100 µM não teve nenhum efeito sobre o CHP testado. Isto demonstra a alta biocompatibilidade dos copolímeros da presente divulgação. Exemplo 24: Especificidade da célula cancerosa de um Cellophil- (Fluoresceína)n-ADC
[0143] A afinidade do copolímero de G5-Cellophil-(Fluoresceína)8 funcionalizado com HER2-anticorpo do exemplo 22 por sua célula ativa é examinada em um experimento usando as linhagens celulares do câncer SKBR3 e MDA-MB-468. Células SKBR3 super-expressam o receptor de fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2+), ao passo que células MDA-MB-468 não expressam o receptor (HER2-). A ligação é avaliada por FACS (=separação celular ativada por fluorescência) usando o breve protocolo seguinte:
[0144] As células são plaqueadas em placas de 96 poços com uma densidade de 5.000 a 10.000 células em 160 µL de meio/poço [DMEM suplementado com 4,5 g/L de glicose, 1,5 mM de L-glutamina e 10 % de soro fetal bovino (MG-30, CLS)]. Depois de um dia de incubação a 37 °C em uma incubadora umedecida em uma atmosfera de CO2 a 5 %, as células são colhidas, lavadas e as suspensões celulares ajustadas para uma concentração de 1,25 x 106 células/mL em PBS gelada (pH 7,5) suplementada com 10 % de soro fetal de bezerro (FCS), 1 % de azida sódica. As suspensões celulares são transferidas para o fundo redondo de poliestireno de 12 x 75 mm2 e depois incubadas com 5 μg/mL de Cellophil-(Fluoresceína)16-ADC por 45 min na escuridão a 4 °C. Posteriormente, as células são lavadas 3 vezes por centrifugação a 400 x g por 5 min e recolocadas em suspensão em 500 µL de PBS gelada (pH 7,5, suplementada com 10 % de FCS, 1 % de azida sódica) antes de serem analisadas em um citômetro de fluxo.
[0145] O manchamento por FACS de células SKBR3 expostas a Cellophil- (Fluoresceína)16-ADC ou a Trastuzumabe etiquetado com Fluoresceína está em comparação para demonstrar que a afinidade alvo do anticorpo no Cellophil- Fluoresceína-ADC é preservada. Células MDA-MB-468 são usadas para analisar a ligação não específica do Cellophil-ADC. Exemplo 25: Ligação de um G5-Cellophil-(Fluoresceína)8 a uma proteína modelo
[0146] Uma proteína modelo (mCherry vermelha fluorescente) foi geneticamente modificada com um motivo de reconhecimento de sortase (LPETG) em seu término C e uma cisteína adicional perto de seu término N. Um fragmento de DNA contendo a sequência de codificação modificada para mCherry foi sintetizado in vitro: Sequência de codificação Cys-mCherry-LPETG-His6 (SEQ ID NO:1): 5’-
ATGTGTGGTGGTAGCGGTGGTTCAGGTGGTTCTGGCGGTAGTGGTGGCAGCAT GGTTAGCAAAGGTGAAGAGGATAATATGGCCATCATCAAAGAATTCATGCGCTT CAAAGTTCACATGGAAGGTAGCGTTAATGGCCACGAATTTGAAATTGAAGGTGA AGGCGAAGGTCGTCCGTATGAAGGCACCCAGACCGCAAAACTGAAAGTTACCA AAGGTGGTCCGCTGCCGTTTGCATGGGATATTCTGAGTCCGCAGTTTATGTATG GTAGCAAAGCCTATGTTAAACATCCGGCAGATATTCCGGATTACCTGAAACTGA GCTTTCCGGAAGGTTTTAAATGGGAACGTGTGATGAATTTTGAAGATGGTGGTG TTGTTACCGTTACACAGGATAGCAGCCTGCAGGATGGTGAATTTATCTATAAAGT TAAACTGCGTGGCACGAATTTTCCGAGTGATGGTCCGGTTATGCAGAAAAAAAC CATGGGTTGGGAAGCAAGCAGCGAACGTATGTATCCGGAAGATGGCGCACTGA AAGGTGAAATTAAACAGCGTCTGAAGCTGAAAGATGGCGGTCATTATGATGCAG AAGTTAAAACCACCTACAAAGCCAAAAAACCGGTTCAGCTGCCTGGTGCATATA ACGTTAACATCAAACTGGATATTACCAGCCACAACGAGGATTATACCATTGTGGA ACAGTATGAACGTGCAGAAGGTCGCCATAGTACCGGTGGTATGGATGAACTGTA TAAAGGTGGCAGTGGTGGATCTGGTGGCTCAGGCGGAAGCGGTGGTAGCCTG
CCGGAAACCGGTGGTCTGAATGATATTTTTGAAGCCCAGAAAATCGAATGGCAT GAACATCATCAC CATCACCACTAA-3’
[0147] Este fragmento de DNA foi subclonado no vetor de clonagem pMA-T (Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Germany). A última construção foi digerida com NdeI e BamH1. A digestão foi submetida à eletroforese em um gel de agarose a 1,5 % e o fragmento contendo DNA de mCherry foi excisado e o DNA extraído usando um kit de extração em gel Qiagen (Qiagen, Hilden, Germany). O fragmento de DNA purificado depois foi ligado no vetor de expressão pET28-c usando T4 DNA ligase (New England Biolabs, UK). A correção da sequência de DNA inserida foi subsequentemente verificada por análise de sequência. Para a produção de proteína, o plasmídeo resultante (pCIS-[C]-mcherry-[LPETG]) foi transformado em células BL21DE3 de Escherichia coli competentes. As células foram cultivadas (meio LB +
Ampicilina a 100 µg/ml, 37 °C, frascos de agitação de 500 ml) a um OD600 de 0,4 antes que a expressão da proteína fosse induzida com Isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo a 1 mM (IPTG). As células foram colhidas 4 h mais tarde por centrifugação (6000 x g, 15 min, 4 °C), colocadas em suspensão em tampão de lise (50 mM de NaH2PO4, 0,5 M de NaCl, pH 8,0) e lisadas por sonificação. Os fragmentos celulares foram removidos por centrifugação (30.000 x g, 30 min, 4 °C). Purificação de proteína Cys- mcherry-LPETG-His6 foi realizada por cromatografia de afinidade por Níquel-NTA (Níquel-NTA Agarose, Thermo Fisher Scientific, Germany) de acordo com o protocolo do fabricante. O rendimento proteico foi quantificado por ensaio Bradford (Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany) e tamanho e purificação da proteína recombinante foram verificados por SDS-PAGE.
[0148] mCherry etiquetada com LPETG purificada [10 μM] é subsequentemente incubada com diferentes concentrações de H2N-G5-Cellophil- (Fluoresceína)8 do exemplo 16 [20 a 100 μM] na presença de concentrações crescentes de Sortase A [0,062 a 0,62 μM] em 50 mM de Hepes, 150 mM de NaCl, 5 mM de CaCl2, pH 7,5 por 3,5 h a 25 °C. Reações de controle que carecem de copolímero de Cellophil ou Sortase A são conduzidas em paralelo. As reações (20 µl) são interrompidas pela adição de 5 µl 4x tampão de carga SDS-PAGE +10 % p/v de β-mercaptoetanol (Biorad, Germany) e tratamento térmico (5 min, 95 °C, agitação constante em 600 rpm). As amostras são depois submetidas à eletroforese em 4 a 20 % de géis de SDS-PAGE (Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Gels Biorad, Germany) em 150 V por 30 min e os géis são submetidos subsequentemente a manchamento com azul de Coomassie. O sucesso do acoplamento é estimado com base no aparecimento de um produto com um tamanho maior do que mCherry. Exemplo 26: Funcionalização de Cellophil-(Fluoresceína)8 com aptâmero DML-7 específico de célula tumoral Etapa 1: Síntese de etil carbono-tritioato de 1-((3-azidopropil)amino)-2-metil-
1-oxopropan-2-ila:
[0149] A uma solução de 2-(((etiltio)carbonotioil)tio)-2-metilpropanoato de 2,5- dioxopirrolidin-1-ila (2,4 g, 7,47 mmol, 1,0 eq.) e Et3N (1,249 mL, 8,96 mmol, 1,2 eq.) em CH2Cl2 (44 mL) uma solução de 3-azidopropan-1-amina (0,879 mL, 8,96 mmol, 1,2 eq.) em CH2Cl2 (15 mL) foi adicionada gota a gota durante 60 min na temperatura ambiente e sob uma atmosfera inerte. A mistura de reação foi agitada durante a noite na temperatura ambiente. Finalmente, a mistura de reação foi sucessivamente lavada com uma solução aquosa de HCl (1 M, 3 x 20 mL), ddH2O (2 x 25 mL) e uma solução aquosa saturada de NaHCO3 (20 mL). A fase orgânica foi seca (Na2SO4) e os voláteis foram removidos sob pressão reduzida. O óleo laranja residual (2,25 g, 7,34 mmol, 98 %) foi usado sem purificação adicional. A estrutura do composto do título foi verificada por espectroscopia de RMN. Etapa 2: Síntese de pré-polímero de RAFT-DMA-N3
[0150] A síntese do composto do título foi obtida seguindo o protocolo geral para a síntese de pré-polímero do exemplo 13, etapa 5 e usando etil carbonotritioato de 1-((3-azidopropil)amino)-2-metil-1-oxopropan-2-ila como um material de partida. A estrutura do composto do título foi verificada por espectroscopia de MS e RMN. Etapa 3: Síntese de Cellophil-N3
[0151] A síntese do composto do título foi obtida seguindo o protocolo geral do exemplo 13, etapa 7, usando pré-polímero de RAFT-DMA-N3 como material de partida. A estrutura do composto do título foi verificada por espectroscopia de RMN. Etapa 4: Síntese de Cellophil-(Fluoresceína)8-N3
[0152] A síntese do composto do título foi obtida seguindo o protocolo geral para agentes ativos reativos em amina do exemplo 15, usando Cellophil-N3 e Fluoresceína-NHS como materiais de partida. A estrutura do composto do título foi verificada por espectroscopia de RMN. Síntese alternativa:
[0153] A síntese de copolímero de Cellophil contendo fluoresceína pode ser obtida por intermédio do procedimento geral para a copolimerização de monômeros de co-princípio (exemplo 13, etapa 7), usando pré-polímero de RAFT-DMA-N3 como reagente de RAFT e AK-Fluoresceína-V2 como monômero de co-princípio (8,0 eq.) Etapa 5: Síntese de aptâmero DML-7-[C6]-NH2
[0154] Uma forma modificada de aptâmero DML-7 (Duan et al. (2016) Oncotarget 7(24): 36436), conhecida como específica para células de câncer de próstata metastático, foi sintetizada em fase sólida (Sigma Aldrich, Gillingham, UK): 5’-ACGCTCGGATGCCACTACAGGTTGGGG
TCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAAC GAGAGGTCACCAGCACGTCCATGAG-3’ (SEQ ID NO:2)-[C6]-NH2
[0155] Um espaçador de átomo de seis carbonos e um grupo amino reativo foi adicionado para facilitar a funcionalização. O pó liofilizado do aptâmero foi posteriormente reidratado em (tampão) por 2 h na temperatura ambiente. Subsequentemente, a solução foi aquecida até 95 °C durante um período de 10 min e depois deixada resfriar até a temperatura ambiente durante a noite para obter a conformação tridimensional correta. Etapa 6: Acoplamento de aptâmero DML-7-[C6]-NH2 a Cellophil- (Fluoresceína)8-N3
[0156] A uma solução de DML-7-[C6]-NH2 (1,0 eq., preparada na etapa 5) em tampão de PBS isento de DNAase é adicionado um éster dibenzociclooctino-N- hidroxissuccinimidílico (1,5 eq.). A mistura de reação é misturada na temperatura ambiente até que a conversão completa do aptâmero amina seja observada (LC-MS). Subsequentemente, Cellophil-(Fluoresceína)8-N3 (2,0 eq.) é adicionado e deixado reagir até que a conversão completa de intermediário de aptâmero alcino seja observada. A mistura depois é purificada por GPC semipreparativa com água (+0,01
% NaN3) como eluente. A fração purificada contendo o produto desejado é dessalinizada usando uma coluna de dessalinização (PD10, Thermo Fisher Scientific, German). Subsequentemente o produto desejado é liofilizado para obter um pó branco.
[0157] O Cellophil-(Fluoresceína)8 contendo aptâmero resultante é analisado por ensaio de mudança de eletromobilidade (EMSA). Para esta análise, até 18 µL de uma solução de estoque do último copolímero [0,3 mg/mL em tampão de EMSA (10 mM de Tris-HCl, 75 mM de KCl, 0,25 mM de EDTA, 0,1 % de Triton X100, 5 % de glicerol (v/v), 0,2 mM de DTT, pH 8,0)] 2 µL de 5x tampão de amostra de ácido nucleico (Biorad, Germany) são adicionados. Subsequentemente, a amostra é submetida à eletroforese em um gel de agarose a 1,5 % (suplementado com 0,25 µg/ml de brometo de etídio para manchamento UV, 1x tampão de TAE, 135 V, 35 min). Aptâmero DML- 7 e Cellophil-(Fluoresceína)8-N3 servem como controles. Uma mudança na migração de faixa claramente identificar o aumento no peso molecular do aptâmero devido à ligação covalente da porção Cellophil-(Fluoresceína)8. Exemplo 27: Síntese de um portador polimérico funcionalizado em oxima Etapa 1: Síntese de (6,6-dimetil-7,12-dioxo-4-tioxo-3,5-ditia-8,11- diazatridecan-13-il)oxicarbamato de terc-butila (RAFT-EDA-Oxima-BOC)
[0158] A uma solução de ácido 2-(((terc-butoxicarbonil)amino)óxi)acético (486 mg, 2,54 mmol, 1,0 eq.) em CH2Cl2 (40 mL) foi adicionado hidrato de HOBt (467 mg, 3,05 mmol) e cloridrato de N1-((etilimino)metileno)-N3,N3-dimetilpropano-1,3-diamina (511 mg, 2,67 mmol, 1,05 eq.) a 0 °C sob N2. A solução resultante foi agitada por 30 min a 0 °C. Finalmente 2,2,2-trifluoroacetato de 2-(2-(((etiltio)carbonotioil)tio)-2- metilpropanamido)etanamínio (966 mg, 2,54 mmol, 1,0 eq.) e N-etil-N-isopropilpropan- 2-amina (2,24 mL, 13,2 mmol, 5,2 eq.) foram sucessivamente adicionados e a mistura reativa foi agitada por 1 h a 0 °C e depois durante a noite na temperatura ambiente. Todos os voláteis foram removidos sob pressão reduzida e o resíduo foi absorvido em
EtOAc (100 mL). A mistura orgânica foi sucessivamente lavada com uma solução aquosa saturada de NH4Cl (3 x 40 mL), uma solução aquosa saturada de NaHCO3 (3 x 40 mL), ddH2O (3 x 40 mL) e salmoura (40 mL). A fase orgânica foi seca (Na2SO4) e todos os voláteis removidos sob pressão reduzida. O resíduo sólido amarelo resultante foi colocado em suspensão em Et2O (40 mL). A suspensão foi filtrada e a torta do filtro foi lavada com Et2O (2 x 20 mL), ddH2O (3 x 20 mL) e Et2O (3 x 20 mL) e seca sob vácuo. O produto foi isolado (900 mg, 2,00 mmol, 79 % de rendimento) como um pó amarelo. A estrutura do composto do título foi verificada por espectroscopia de RMN. Etapa 2: Síntese de pré-polímero de RAFT-DMA-Oxima-BOC
[0159] A síntese do composto do título foi obtida seguindo o protocolo geral para a síntese de pré-polímero do exemplo 13, etapa 5 e usando RAFT-EDA-Oxima- BOC como um material de partida. A estrutura do produto desejado foi verificada por espectroscopia de MS e RMN. Etapa 3: Síntese de Cellophil-Oxima-BOC
[0160] A síntese do composto do título foi obtida seguindo o protocolo geral do exemplo 13, etapa 7, usando pré-polímero de RAFT-DMA-Oxima-BOC como um material de partida. A estrutura do composto do título foi verificada por GPC e espectroscopia de RMN. Etapa 4: Síntese de Cellophil-(Fluoresceína)8-Oxima-BOC
[0161] A síntese do composto do título pode ser obtida seguindo o protocolo geral para agentes ativos reativos em amina do exemplo 15 e usando Cellophil-Oxima- BOC e FITC como materiais de partida. A estrutura do composto do título pode ser verificada por espectroscopia de RMN. Etapa 5: Síntese de Cellophil-(Fluoresceína)8-Oxima
[0162] Cellophil-(Fluoresceína)8-Oxima-BOC é desprotegido seguindo o procedimento geral para desproteção de BOC (Exemplo 16).
Etapa 6: Acoplamento de Cellophil-(Fluoresceína)8-Oxima a aldeído-IgG
[0163] Cellophil-(Fluoresceína)8-Oxima pode ser covalentemente acoplado a IgG de anticorpo policlonal (aldeído-IgG) oxidado (NaIO4) como descrito na literatura (Dong et al. (2017) Angew Chem Int Ed 56: 1273). A estrutura do produto desejado pode ser verificada por MS. Exemplo 28: Ligação de Cellophil-(Fluoresceína)8-N3 a uma proteína modelo Etapa 1: Funcionalização em alcino da proteína modelo mCherry:
[0164] A uma solução de proteína modelo mCherry portadora de cisteína do exemplo 25 (1,0 eq.) em tampão de PBS desgaseificado, pH 7,5, é adicionado um excesso de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (100 eq.) sob uma atmosfera inerte. A solução resultante é misturada completamente e deixada repousar por 20 min antes que uma solução desgaseificada de dibenzociclooctino-maleimida (DBCO-maleimida) em DMSO fosse adicionada sob atmosfera inerte. A mistura de reação resultante foi agitada durante a noite na temperatura ambiente. A mistura depois é purificada por GPC semi-preparativa com água (+0,01 % de NaN3) como eluente. A fração purificada contendo o produto desejado é dessalinizada usando uma coluna de dessalinização para obter mCherry-DBCO. Etapa 2: Funcionalização em Cellophil da proteína modelo mCherry por intermédio de química por clique:
[0165] Uma solução de mCherry-DBCO (1,0 eq.) e Cellophil-(Fluoresceína)8- N3 (2,0 eq. obtido do exemplo 26, etapa 4) em tampão de PBS, pH 7,5, é agitada na temperatura ambiente por 16 h. A mistura depois é purificada por cromatografia de afinidade em Ni2+ NTA (Níquel-NTA Agarose, Thermo Fisher Scientific, Germany) de acordo com o protocolo do fabricante. (mCherry contém um etiqueta de hexa- histidina.) A fração purificada contendo o produto desejado é dessalinizada usando uma coluna de dessalinização para obter mCherry-Cellophil(Fluoresceína)8. O conjugado de proteína-polímero resultante pode ser analisado por SDS-PAGE usando o protocolo apresentado no exemplo 25 e Cys-mcherry-LPETG-His6 (consultar o exemplo 25) como controle. Um tamanho aumentado do produto em comparação ao controle observado no gel manchado com Coomassie indica acoplamento bem- sucedido do polímero à proteína. Exemplo 29: Funcionalização de um resíduo de lisina nativo em um anticorpo Her2+ (trastuzumabe) com o NH2-Gn-Cellophil-(DOX)8 modificado acima utilizando uma estratégia de ligação aza-Michael
[0166] A síntese de Trastuzumabe-Cellophil-(DOX)16 é obtida seguindo o protocolo desenvolvido por Bernades, G. J. L. (J Am Chem Soc (2018) 140: 4004-) usando NH2-Gn-Cellophil-(DOX)8 como nucleófilo de amina que é acoplado às cadeias leves do anticorpo. Isto resulta em um complexo de ADC contendo, em média, 16 moléculas de doxorrubicina por moléculas de anticorpo. Trastuzumabe (20 mg/ml em PBS) foi obtido de Carbosynth, UK. Exemplo 30: Eficácia anticâncer de Trastuzumabe-Cellophil-(DOX)16
[0167] A eficácia anticâncer de Trastuzumabe-Cellophil-(DOX)16 (consultar o exemplo 29) pode ser verificada como segue:
[0168] O experimento é realizado em placas de 96 poços usando linhagens celulares de câncer SKBR3 e MDA-MB-468. As células SKBR3 super-expressam o receptor de fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2+), ao passo que células MDA-MB-468 não expressam este receptor (HER2-). Os poços são semeados com
5.000 a 10.000 células em 75 µL de meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 4,5 g/L de glicose, 1,5 mM de L-glutamina e 10 % de soro fetal bovino (MG-30, CLS). Depois de um dia de incubação a 37 °C e 5 % de CO2 em uma incubadora umedecida, diluições seriais de ADC Trastuzumabe-Cellophil-(DOX)16 (preparado no exemplo 29) em 25 µl de meio de crescimento são adicionadas aos poços. Concentrações de ADC finais nos poços variam de 0,02 ng/mL a 20 µg/mL (células ingênuas de ADC servindo como controles negativos). Cada diluição é testada em triplicata. Para propósitos de comparação, culturas paralelas recebem as diluições seriais de Trastuzumabe no meio de crescimento. Depois de 72 h de incubação, as placas são removidas da incubadora e equilibradas até a temperatura ambiente. Depois de aproximadamente 20 minutos, a viabilidade celular é avaliada por ensaio de proliferação celular aWST-1 (Sigma-Aldrich, Germany) que é realizado de acordo com as instruções do fabricante. A leitura do ensaio é absorbância em 420 a 480 nm. A eficácia anticâncer de Trastuzumabe-Cellophil-(DOX)16 é estimada comparando-se os valores de absorbância medidos em culturas tratadas com ADC, não tratadas e tratadas com Trastuzumabe, respectivamente. A comparação dos resultados obtidos com SKBR3 e MDA-MB-468 informará sobre a especificidade alvo do ADC. Exemplo 31: Síntese de um azida-Cellophil(Fluoresceína)8 reativo por clique usando monômeros de co-princípio modificados por Fluoresceína
[0169] AK-Fluoresceína (Exemplo 10) foi copolimerizado em uma polimerização de RAFT com um agente de RAFT modificado por azida (etil carbonotritioato de 1-((3-azidopropil)amino)-2-metil-1-oxopropan-2-ila) utilizando o protocolo seguinte:
[0170] DMA (0,97 mmol, 80 eq.) e AK-Fluoresceína (0,097 mmol, 8 eq.) foram dissolvidos em 2 ml de dioxano seco e N3-RAFT [etil carbonotritioato de (1-((3- azidopropil)amino)-2-metil-1-oxopropan-2-ila] (0,012 mmol, 1 eq.) e AIBN (4,85 µmol, 0,4 eq.) foram adicionados. Depois da dissolução completa, a polimerização foi induzida por aquecimento até 65 °C. A polimerização foi concluída depois de 6 h de incubação a 65 °C. Subsequentemente, a mistura de reação foi resfriada até a temperatura ambiente e o grupo de RAFT do copolímero foi removido usando o protocolo apresentado no exemplo 13. A mistura resultante depois foi dialisada (MWCO 3,5 kDa) contra ddH2O e o concentrado foi liofilizado para obter N3- Cellophil(Fluoresceína)8 como um pó laranja (85 %). A estrutura do composto foi verificada por análise de espectroscopia de RMN e GPC (MW de cerca de 13 kDa, PDI de 1,08)
[0171] N3-Cellophil(Fluoresceína)8 pode ser usado em uma reação por clique isenta de cobre com uma porção de alvejamento específica de célula cancerosa modificada por alcino (por exemplo, DBCO). Exemplo 32: Síntese de conjugado de Cellophil-anticorpo carregado com iodo alvejando uma proteína oncogênica
[0172] De modo a gerar um conjugado de anticorpo e polímero modelo contra um oncogene generalizado, um anticorpo comercialmente disponível que alveja a proteína BMI-1 foi escolhido. BMI-1 (oncogene polycomb ring finger) é necessário para auto-renovação eficiente de divisões celulares de células-tronco hematopoiéticas adultas bem como células-tronco adultas neurais do sistema nervoso periférico e central. BMI-1 foi relatado como um oncogene que regula p16 e p19, que são genes inibidores de ciclo celular. A super-expressão de BMI-1 parece desempenhar um papel importante em vários tipos de câncer, tais como de bexiga, pele, próstata, mama, ovário, colorretal bem como malignidades hematológicas (Lessard J et al. (2003). Nature 423 (6937): 255-60. doi:10,1038; Molofsky AV et. al. (2005). Genes Dev. 19 (12): 1432-7. doi:10,1101/gad,1299505)
[0173] Síntese de NH2-GGG-Cellophil [DMA41/AK-Fenol3] que é capaz de ser carregado com iodo radioativo foi realizada em analogia aos protocolos apresentados no exemplo 20 mas com razões molares ajustadas entre AK-Fenol (3 eq.) e monômeros de princípio DMA (41 eq). O peso molecular médio (5,6 kDA) e a distribuição de peso molecular (PDI 1,18) do copolímero resultante foi documentada por LC-MS e cromatografia de permeação em gel. Depois da purificação por diálise e liofilização, o copolímero de Cellophil foi acoplado a um anticorpo BMI-1 AbFlex™ (monoclonal) contra o oncogene polycomb ring finger humano de tamanho natural contendo um motivo de reconhecimento de sortase (LPETG) usando o protocolo seguinte:
[0174] Anticorpo BMI-1 [6 μM] foi incubado com NH2-GGG-Cellophil [DMA41/AK-Fenol3] [120 μM] na presença de [2 μM] sortase A (proteína Sortase A5 [S. aureaus, Uniprot A0A077UNB8-1] contendo as substituições de aminoácido P94R, D160N, D165A, K190E e K196T e incluindo um Etiqueta de 6xHis C-terminal; Active Motif Inc., USA). em um tampão de reação com base em HEPES (Active Motif Inc., USA) por 1 h a 30 °C. Patente dos EUA número 9.267.127. Reações de controle que carecem de copolímero de Cellophil ou Sortase A foram conduzidas em paralelo. A reação de acoplamento dependente de cálcio foi interrompida pela adição de sal de dissódio de EDTA (250 mM) a uma concentração final de 5 mM e as amostras foram armazenadas a 4 °C até a caracterização final.
[0175] Para a análise, o conjugado de anticorpo-polímero foi digerido com Fabricator® (Genovis Inc., USA). [FabRICATOR (IdeS) é uma cisteína protease que digere anticorpos em um sítio específico abaixo da dobradiça, gerando um agrupamento homogêneo de fragmentos F(ab’)2 e Fc/2]. A digestão foi realizada de acordo com os protocolos do fabricante. Subsequentemente, os produtos de clivagem foram analisados por SDS-PAGE usando o protocolo do exemplo 25. A mudança para peso molecular mais alto na faixa Fc/2 do anticorpo indicou acoplamento bem- sucedido do copolímero de Cellophil ao anticorpo. A eficiência da reação de acoplamento foi analisada em uma maneira semiquantitativa por comparação com a faixa Fc/2 residual (não modificada) do controle negativo. A eficiência do acoplamento foi descoberta ser cerca de 50 %.
[0176] Para a caracterização detalhada de produtos de acoplamento, uma análise de LC-MS do conjugado de IdeS-anticorpo digerido-Cellophil foi realizada usando o protocolo seguinte:
[0177] A mistura de reação do conjugado de IdeS-anticorpo digerido-Cellophil foi diluída 10 vezes com ddH2O. 5 µL da solução resultante foram injetados no sistema
LCMS (G6230 LC-MS TOF System, Agilent, Santa Clara, CA) e separados usando um coluna de HPLC C8 com um eluente consistindo em água, isopropanol, ACN e 0,1 % de FA. Subsequentemente, cromatogramas e espectros foram deconvoluídos usando a solução de software Masshunter da Agilent. A análise de cromatogramas e espectros indicou que o copolímero foi acoplado apenas à cadeia pesada do mAB.
[0178] O conjugado de Cellophil-anti-BMI-1 pode ser carregado com radioisótopos de iodo usando um protocolo apresentado no exemplo 21 para gerar um conjugado de anticorpo-polímero para terapia alvejada contra o câncer. Em algumas modalidades, por exemplo, no caso de um isótopo de iodo com uma meia-vida longa, o carregamento do copolímero contendo AK-Fenol pode ser realizado antes do acoplamento ao anticorpo de alvejamento. Exemplo 33: Síntese de um copolímero de Cellophil (DMAn/AKm) com uma etiqueta de mTG (= NH2-PEGn)-RAFT-BOC
[0179] O seguinte procedimento descreve a síntese de um copolímero de Cellophil capaz de ser funcionalizado com um agente quelante covalentemente ligado para a ligação a radioisótopos. O copolímero aqui apresentado (etiqueta de mTG)- DMA30/AK8 serve para ilustrar o procedimento de síntese geral. O tamanho do copolímero e o número de sítios para a funcionalização contidos no copolímero podem ser alterados mudando-se as razões molares dos monômeros utilizados.
[0180] A uma solução de DMA (116 µL, 1120 µmol, 30 eq.) e AK (60 mg, 300 µmol, 8 eq.) em ddH2O foram sucessivamente adicionados (6,6-dimetil-7-oxo-4-tioxo- 11,14,17,20,23-pentaoxa-3,5-ditia-8-azapentacosan-25-il)carbamato de terc-butila (22 mg, 32,2 µmol, 1,0 eq.) e VA044 (3,6 mg, 11,2 µmol, 0,3 eq.). A mistura de reação foi agitada por 4 h a 60 °C. A mistura de reação depois foi diluída com ddH2O e dioxano. A esta solução foram sucessivamente adicionados ácido fosfínico (50 % em peso, 27 µL, 158 µmol, 5 eq.), TEA (22 µL, 158 µmol, 5 eq.) e AIBN (1,6 mg, 9,5 µmol, 0,3 eq.). A mistura de reação foi agitada por 8 h a 75 °C. A mistura resultante depois foi dialisada (MWCO 3,5 kDa) contra ddH2O e o concentrado foi seco por congelamento para obter Cellophil BOC-NH-PEG5-(DMA30/AK8) como um pó branco (140 mg, 120 µmol, 78 % durante duas etapas). A estrutura do composto obtido foi verificada por espectroscopia de RMN e GPC usando o protocolo seguinte: uma solução de estoque de 3,33 mg/mL de copolímero foi preparada em tampão de eluição (água deionizada contendo 0,05 % (p/v) de NaN3) e filtrada através de um filtro com seringa de 0,45 µm. Subsequentemente, 0,4 mL de solução de estoque foi injetado na porta do dispositivo de GPC (1260 Infinity LC-System, Agilent, Santa Clara, CA). A cromatografia foi realizada em uma vazão constante de 0,5 mL/min em tampão de eluição. Amostras de copolímero foram separadas em um sistema de três colunas Suprema (pré-coluna, 1000 Å, 30 Å; 5 µm de tamanho de partícula; PSS, Mainz, Germany) que foi colocado em um forno de coluna externa a 55 °C. Os copolímeros foram analisados por RI (índice refrativo) e detectores de UV. Uma curva de calibração (10 pontos) foi estabelecida usando um padrão de pululano. Pesos moleculares dos copolímeros caracterizados foram estimados com referência a este padrão. Exemplo 34: Funcionalização de copolímero de Cellophil [BOC-NH-PEG5- (DMA30/AK8)] com Anidrido-DOTA/NHS - DOTA
[0181] A uma solução de Cellophil BOC-NH-PEG5-(DMA30/AK8) (20 mg, 3,45 µmol) em ddH2O uma solução de Anidrido-DOTA (25 mg, 36 µmol) ou NHS-DOTA (27 mg, 36 µmol) em DMSO foi adicionada e agitada por 24 h a 35 °C, a esta solução depois foi adicionado HCl 3M e aquecido até 0 °C por 1 h. A mistura resultante depois foi dialisada (MWCO 3,5 kDa) contra ddH2O e o concentrado foi seco por congelamento para obter NH2-PEG5-(DMA30/AK-DOTA8). A estrutura do composto obtido foi verificada por espectroscopia de RMN. Exemplos 35: Síntese de Cellophil [DBCO-NH-PEG5-(DMA30/AK-DOTA8)].
[0182] Uma solução de Cellophil NH2-PEG5-(DMA30/AK-DOTA8) (3,6 µmol) e DBCO-NHS (18 µmol) e Trietilamina (7,2 µmol) em DMSO seco (1,5 mL) foi agitada por 24h a 25° C. A mistura resultante depois foi dialisada (MWCO 3,5 kDa) contra carbonato de amônio 0,1M e o concentrado foi seco por congelamento para obter Cellophil DBCO-NH-PEG5-(DMA30/AK-DOTA8). A reação foi seguida por intermédio de GPC e a estrutura do composto obtido foi verificada por espectroscopia de RMN. Exemplo 36: Síntese de um conjugado de Trastuzumabe-[Cellophil-(DOTA4]2 radiorrotualdo para células cancerosas que super-expressam receptor de Her2 de alvejamento diagnóstico e terapêutico
[0183] No diagnóstico tumoral, o limite de detecção para o tumor primário ou sua metástase é crucial para a taxa de sobrevivência de pacientes visto que tumores em último estágio são frequentemente associados com um prognóstico deficiente. Usando anticorpos específicos de tecido tumoral radiorrotulados para detecção bem como terapia subsequente de células cancerosas é um método potencialmente promissor para a radiomedicina. Entretanto, abordagens deste tipo foram dificultadas por razões baixas de sinal para ruído devido aos fatos de que apenas alguns radioisótopos podem ser ligados a uma porção de alvejamento/anticorpo e que os radioisótopos de interesse têm meias-vidas curtas (usualmente mais curtas do que a meia-vida do anticorpo). Portanto, uma carga aumentada de radioisótopos seria altamente desejável. Neste exemplo, um conjugado de anticorpo-Cellophil radiorrotulado para detecção e terapia de célula tumoral melhoradas é descrito.
[0184] Um polímero de Cellophil funcionalizado em DBCO sintetizado por procedimentos apresentados no exemplo 33 a 35 é conjugado a um anticorpo específico de célula cancerosa do tipo de IgG (por exemplo, Trastuzumabe para alvejar células cancerosas Her2+) que foi funcionalizado com um grupo azida na glutamina na posição 295 (Q 295) por um procedimento descrito por Dennler et al. (Bioconjugate Chem. (2014) 25: 569 -578).
[0185] Brevemente, o anticorpo é desglicosilado por PNGaseF (Merck KGaA, Darmstadt, Germany). Uma mistura de reação contendo 1 unidade de enzima por 10 µg de Trastuzumabe (Carbosynth Ltd, Berkshir, UK) em PBS (pH 7,4) é incubada durante a noite a 37 °C de modo a ativar Q295. Subsequentemente, Trastuzumabe desglicosilado (6,6 µm) em PBS (pH 8) é incubado com NH2-PEG5-Azida (80 eq. molar) e transglutaminase microbiana (MTGase) (6 U/mL, Zedira, Darmstadt, Germany) por 16 h a 37 °C. Depois da incubação a atividade de MTGase é bloqueda pela adição de tampão de reação de MTGase (Zedira, Darmstadt, Germany). Para remover o excesso de NH2-PEG4-Azida, MTGase e PNGaseF residual, a mistura de reação é trocada de tampão (três vezes) em NH4OAc (0,5m, pH 5,5) usando-se uma coluna Amicon® Ultra de 4 mL (100 kDa de MWCO, Merck KGaA, Darmstadt, Germany).
[0186] A reação por clique real é subsequentemente realizada por incubação de Trastuzumabe-(NH-PEG5-Azida)2 com um excesso molar de 3 vezes de polímero de Cellophil funcionalizado em DBCO por 3 h a 37 °C, produzindo Trastuzumabe- (Cellophil-DOTA4)2. Excesso de polímero e Trastuzumabe não funcionalizado pode ser removido por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) e agrupamento das frações contendo anticorpo completamente funcionalizado.
[0187] A radiorrotulagem do conjugado de anticorpo-Cellophil com 111-InCl3 (4 MBq por µg de Trastuzumabe-(Cellophil-DOTA4)2 é realizada por 1 h a 37 °C, depois do que o conjugado de anticorpo rotulado com índio-111-polímero é purificado por SEC em uma coluna Superdex 75 10/300 GL (GE Healthcare, Chicago, USA) conduzida em uma vazão de 0,5 mL/min. Frações de pico principais são agrupadas. O Trastuzumabe-[Cellophil-(DOTA-In-111)4]2 resultante pode ser usado para detectar células cancerosas Her2+ por tomografia de emissão positrônica (PET), por exemplo, em pacientes com câncer de mama, cólon ou pulmão, com uma sensibilidade mais alta do que pode ser obtido por complexos de anticorpo-radioisótopo convencionais. A sensibilidade aumentada é devido ao aumento da carga de In-111 em comparação a um anticorpo radiorrotulado convencional.
[0188] O mesmo procedimento pode ser usado para preparar um conjugado de anticorpo terapêutico-Cellophil carregado com um radioisótopo terapêutico adequado tal como Lutécio-177 [substituindo o 111-InCl3 usado no procedimento descrito acima com 177-LuCl3]. Exemplo 37: Síntese de um Cicloalcino-Cellophil(DOTAn)-CO2H
[0189] Para funcionalizar um copolímero desta divulgação com um grupo cicloalcino reativo por clique, por exemplo, DBCO, a porção reativa por clique pode ser integrada durante a remoção do grupo RAFT. Etapa 1 - Síntese do Iniciador de Cicloalcino
[0190] Um Iniciador modificado por DBCO é sintetizado seguindo o protocolo de Ulbrich e colaboradores (Polym. Chem., 2014 5, 1340). Etapa 2 -Síntese de copolímero de RAFT-Cellophil-CO2H:
[0191] Síntese de um copolímero de RAFT-Cellophil-CO2H éaobtido seguindo o protocolo geral descrito no exemplo 13 (partindo do reagente de Etil-RAFT Etapa 6 a 7). Etapa 3 - Síntese de copolímero de cicloalcino-Cellophil(DOTAn)-CO2H:
[0192] A uma solução de RAFT-Cellophil-CO2H em DMSO/ddH2O (1/1) é adicionado iniciador contendo cicloalcino (20 eq.) em uma porção. A mistura de reação é selada e aquecida a 70 °C até o desaparecimento da cor amarela (4 h). O progresso da reação é seguido por HPLC também. A solução resultante é resfriada até a temperatura ambiente e o pH é ajustado para 8 antes que p-NCS-Bz-DOTA-GA (Chematech) ou DOTA-NHS seja adicionado (2 eq. por grupo amino reativo no copolímero). A mistura é dialisada contra ddH2O (MWCO: 5000 Da) e o concentrado é liofilizado e caracterizado por espectroscopia de RMN e SEC. Exemplo 38 - Síntese de um conjugado de Trastuzumabe-[Cellophil-(DOTA4]4 radiorrotulado para o alvejamento terapêutico de células cancerosas que super- expressam receptor de Her2
[0193] O polímero de Cellophil funcionalizado em DBCO sintetizado por procedimentos apresentados no exemplo 33 & 35 foi conjugado a um anticorpo específico de célula cancerosa do tipo de IgG (Trastuzumab® para alvejar células cancerosas Her2+) que foram funcionalizadas com 2 grupos azida por cadeia pesada (resultando na adição de até 4 grupos azida por Anticorpo) por meio de um kit de modificação com base em enzima comercialmente disponível (SiteClick™ Antibody Labeling System, Thermo-Fisher-Scientific, Waltham, USA) usado de acordo com o protocolo do fabricante.
[0194] Acoplamento aos grupos azida em Trastuzumabe-azida4 foi realizado de acordo com o protocolo apresentado no exemplo 36 usando um excesso molar de 1,5 vezes de copolímero de DBCO-Cellophil a grupos azida no anticorpo. O acoplamento bem-sucedido foi verificado por SDS-PAGE.
[0195] A radiorrotulagem com 177-LuCl3 [8 MBq por µg de Trastuzumabe- (Cellophil-DOTA4)4] é realizada por incubação por 1 h a 37 °C, depois do que o conjugado de anticorpo rotulado com Lutécio-177-polímero é purificado por SEC em uma coluna Superdex 75 10/300 GL (GE Healthcare, Chicago, USA). O Trastuzumabe-[Cellophil-(DOTA-Lu-177)4]4 resultante pode ser usado para alvejar e destruir as células cancerosas que super-expressam Her2.
[0196] O mesmo procedimento pode ser usado para preparar um conjugado de anticorpo-Cellophil de diagnóstico, substituindo o radioisótopo Lu-177 com um radioisótopo de diagnóstico adequado, por exemplo, Gálio-68 [substituindo-se 68- GaCl3 no lugar de 177-LuCl3 no procedimento apresentado acima]. Exemplo 39: Síntese de um conjugado de Trastuzumabe-[Cellophil-(DOTA8]2 radiorrotulado para o alvejamento diagnóstico e terapêutico de células cancerosas que super-expressam receptor de Her2 a partir da etiqueta de mTg Cellophil
[0197] O copolímero de Cellophil do exemplo 34 pode ser diretamente acoplado a um anticorpo monoclonal como Trastuzumabe por uma reação mediada por transglutaminase usando-se o grupo NH2-PEG5 no copolímero como o substrato. Para isto, o protocolo do exemplo 36 é usado com a exceção de que o NH2-PEG4- Azida é substituído por NH2-PEG5-DMA30/AK-DOTA8 usado em um excesso molar de 40 vezes sobre o anticorpo para gerar um anticorpo com 16 agentes quelantes, isto é, Trastuzumabe-[Cellophil-(DOTA8]2. Exemplo 40: Síntese de um copolímero de Cellophil funcionalizado em tetrazina para acoplamento a uma porção de alvejamento por química por clique de TCO-Tz Etapa 1: Síntese de copolímero de tetrazina-Cellophil:
[0198] Uma solução de copolímero de Cellophil do exemplo 34 (3,6 µmol) e 2- (4-(6-metil-1,2,4,5-tetrazin-3-il)fenil)acetato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila (18 µmol) e Trietilamina (7,2 µmol) em DMSO seco (1,5 mL) foi agitada por 24 h a 25° C. A mistura resultante depois foi dialisada (MWCO 3,5 kDa) contra carbonato de amônio 0,1M e o concentrado foi seco por congelamento para obter tetrazina-Cellophil [DMA30/AK- DOTA8). A reação foi seguida por SEC e a estrutura do composto obtido foi verificada por espectroscopia de RMN. Exemplo 41: Síntese de um Cellophil-[DMA30/AK-DOTA8) modificado por fluoróforo utilizando-se uma cicloadição de alcino forçada por tetrazina [4+2])
[0199] Uma solução de copolímero de Cellophil modificado por tetrazina do exemplo 40 (1,3 µmol) e (E)-6-amino-9-(2-carbóxi-5-((5-(((ciclooct-4-en-1- ilóxi)carbonil)amino)pentil)carbamoil)fenil)-4,5-dissulfo-3H-xanten-3-imínio (1,3 µmol) em DMSO seco (0,5 mL) foi agitada por 24 h a 25° C. A mistura resultante depois foi dialisada (MWCO 3,5 kDa) contra carbonato de amônio 0,1M e o concentrado foi seco por congelamento para obter AFDye-488-clique-Cellophil. A reação foi seguida por GPC e a estrutura do composto obtido foi verificada por espectroscopia de RMN. O derivado de Cellophil rotulado com fluoróforo pode ser usado para realizar estudos farmacocinéticos, por exemplo, para determinar a meia-vida do copolímero na corrente sanguínea ou sua eliminação renal onde um sinal de leitura forte é vantajoso. Exemplo 42 Acoplamento de Cellophil Tetrazina-[DMA30/AK-DOTA8) a uma proteína modificada por TCO
[0200] Uma solução de copolímero de Cellophil funcionalizado em tetrazina do exemplo 40 (3 eq.) é dissolvida em PBS (pH 7,4) e uma proteína modificada por transcicloocteno (TCO) [que poderia ser preparada por um método similar como aquele apresentado no exemplo 36 substituindo-se NH2-PEG5-TCO no lugar de NH2- PEG5-Azida] (1 eq. contendo 2 grupos TCO) dissolvido em PBS (pH 7,4) é adicionada gota a gota sob agitação na temperatura ambiente por 3 h. O polímero não reagido é subsequentemente removido por diálise usando uma membrana com um MWCO de 100 kDa. O sucesso da reação é seguido por SDS-PAGE e HPLC. Exemplo 43 Síntese de AK-DOTA
[0201] A uma solução de AK (50 mg, 250 µmol) e Et3N (104 µL, 749 µmol) em DMF seco (1 mL) foi adicionado DOTA-NHS (HPF6/TFA sal) (200 mg, 262 µmol). A mistura de reação foi agitada durante a noite na temperatura ambiente e filtrada através de uma almofada de algodão. O filtrado foi precipitado em MeCN e depois filtrado. A torta foi lavada com MeCN e seca sob pressão reduzida para obter um pó branco (95 mg, 65 %). Este composto pode ser usado para a incorporação dirigida de agentes quelantes no copolímero durante a polimerização.

Claims (19)

REIVINDICAÇÕES
1. Copolímero, CARACTERIZADO pelo fato de que contém moléculas múltiplas de um agente ativo fabricado por (a) polimerização de uma mistura de reação compreendendo (1) um ou mais monômeros principais polimerizáveis, monômeros estes que são caracterizados como tendo pelo menos um grupo vinílico e não contendo um resíduo de aminoácido, (2) um ou mais monômeros co-principais das fórmulas I ou II em que pelo menos um de Y e Z é H, (3) opcionalmente um ou mais monômeros de co-princípio de qualquer uma das fórmulas III a X (4) um agente para controlar a polimerização de radical e (5) um sistema iniciador para gerar espécies de radical livre, a polimerização produzindo um copolímero; (b) opcionalmente, funcionalização do copolímero com porção de alvejamento específica de um tipo celular ou específica de um tipo tecidual; e (c) acoplamento do agente ativo ao copolímero depois da etapa (a) ou etapa opcional (b).
2. Copolímero contendo moléculas múltiplas de um agente ativo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o copolímero tem um peso molecular médio de 5.000 Daltons a 100.000 Daltons.
3. Copolímero contendo moléculas múltiplas de3 um agente ativo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos 80 % (p) das moléculas de copolímero têm um peso molecular médio de 5.000 Daltons a 100.000 Daltons.
4. Copolímero contendo moléculas múltiplas de um agente ativo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente para controlar a polimerização de radical é um agente de RAFT.
5. Copolímero contendo moléculas múltiplas de um agente ativo, de acordo com a reivindicação 4, o copolímero CARACTERIZADO pelo fato de ser fabricado em duas reações de polimerização sucessivas, em que a primeira reação de polimerização é realizada em uma primeira mistura de reação compreendendo um ou mais monômeros principais polimerizáveis não contendo um grupo aminoácido, um agente de RAFT para controlar a copolimerização e um sistema iniciador para gerar espécies de radical livre, a polimerização produzindo um pré-polímero de RAFT, e em que a segundo reação de polimerização é realizada em uma segunda mistura de reação compreendendo o pré-polímero de RAFT da primeira reação de polimerização, um ou mais monômeros de co-princípio das fórmulas I e/ou II, opcionalmente um ou mais monômeros co-principais da fórmula III a X, opcionalmente um ou mais monômeros principais polimerizáveis não contendo um grupo aminoácido e um sistema iniciador para gerar espécies de radical livre.
6. Copolímero contendo moléculas múltiplas de um agente ativo, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente de RAFT contém um espaçador monodisperso de 5 a 25 unidades.
7. Copolímero contendo moléculas múltiplas de um agente ativo, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente de RAFT contém um grupo reativo que é usado para a funcionalização do copolímero com porção de alvejamento específica de um tipo celular ou específica de um tipo tecidual.
8. Copolímero contendo moléculas múltiplas de um agente ativo, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o grupo reativo é um tiol, um aldeído, um alcino, uma azida, uma tetrazina, um alceno tenso, uma amina, uma carboxila, um éster, uma diazirina, uma fenil azida, um tioéster, um diazo, um fosfinoéster reativo de Staudinger (ou fosfinotioéster), uma hidrazina, uma oxima, um acrilato para realizar ligações aza-Michael ou um motivo capaz de ser usado em uma reação de acoplamento enzimático.
9. Copolímero contendo moléculas múltiplas de um agente ativo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o motivo é uma oligo- glicina compreendendo 2 a 8 unidades de aminoácido e permitindo o acoplamento mediado por reações de sortase, um substrato reativo em transglutaminase, uma etiqueta de aldeído ou uma sequência de inteína autocatalítica.
10. Copolímero contendo moléculas múltiplas de um agente ativo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o grupo RAFT do agente de RAFT é eliminado subsequente à copolimerização ou funcionalização do copolímero.
11. Copolímero contendo moléculas múltiplas de um agente ativo fabricado por polimerização de uma mistura de reação CARACTERIZADO pelo fato de que compreende (a) um ou mais monômeros principais polimerizáveis, monômeros estes que são caracterizados como tendo pelo menos um grupo vinílico e não contendo um resíduo de aminoácido, (b) um ou mais monômeros co-principais das fórmulas III a X, (c) opcionalmente um ou mais monômeros co-principais da fórmula I e/ou fórmula II, (d) um agente para controlar a polimerização de radical, e (e) opcionalmente, funcionalização do copolímero com porção de alvejamento específica de um tipo celular ou específica de um tipo tecidual; e (f) um sistema iniciador para gerar espécies de radical livre.
12. Copolímero contendo moléculas múltiplas de um agente ativo, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o copolímero tem um peso molecular médio de 5.000 Daltons a 100.000 Daltons.
13. Copolímero contendo moléculas múltiplas de um agente ativo, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente para controlar a polimerização de radical é um agente de RAFT.
14. Copolímero contendo moléculas múltiplas de um agente ativo, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente de RAFT contém um grupo reativo que é usado para a funcionalização do copolímero com porção de alvejamento específica de um tipo celular ou específica de um tipo tecidual.
15. Copolímero contendo moléculas múltiplas de um agente ativo, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o grupo reativo é um tiol, um aldeído, um alcino, uma azida, uma tetrazina, um alceno tenso, uma amina, uma carboxila, um éster, uma diazirina, uma fenil azida, um tioéster, um diazo, um fosfinoéster reativo de Staudinger (ou fosfinotioéster), uma hidrazina, uma oxima, um acrilato para realizar ligações aza-Michael ou um motivo capaz de ser usado em uma reação de acoplamento enzimático.
16. Copolímero contendo moléculas múltiplas de um agente ativo, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o motivo é uma oligo- glicina compreendendo 2 a 8 unidades de aminoácido e permitindo o acoplamento mediado por reações de sortase, um substrato reativo em transglutaminase, uma etiqueta de aldeído ou uma sequência de inteína autocatalítica.
17. Copolímero contendo moléculas múltiplas de um agente ativo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o grupo RAFT do agente de RAFT é eliminado subsequente à copolimerização ou funcionalização do copolímero.
18. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz de um copolímero contendo moléculas múltiplas de um agente ativo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17 e um portador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
19. Uso da composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de ser para o tratamento de um câncer ou uma outra doença ou condição em um indivíduo, compreendendo administrar a composição farmacêutica ao indivíduo.
BR112020022633-5A 2018-05-10 2019-05-08 copolímero biocompatível contendo moléculas de agente ativo múltiplas BR112020022633A2 (pt)

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