JP2002512525A

JP2002512525A - ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）により産生されるプロテアーゼを含有する親水性組成物

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Publication number: JP2002512525A
Application number: JP50253299A
Authority: JP
Inventors: フオートニー，ドナルド・ザン; ダーハム，ドナルド・リチヤード; ヤング，カング
Original assignee: ダブリユ・アール・グレイス・アンド・カンパニー・コネテイカツト
Priority date: 1997-06-02
Filing date: 1998-06-01
Publication date: 2002-04-23
Anticipated expiration: 2018-06-01
Also published as: EP0988374A4; AU7695798A; ATE425246T1; US6017531A; WO1998055604A1; EP0988374B1; DE69840649D1; EP0988374A1; JP3621114B2

Abstract

(57)【要約】創面切除および創傷の治癒の応用のための組成物および使用方法が提供される。当該組成物はビブリオ(Vibrio)属の微生物により産生されるあるプロテアーゼを含有する。

Description

【発明の詳細な説明】ビブリオ属(Vibrio)により産生されるプロテアーゼを含有する親水性組成物技術分野本発明は、酵素、とりわけプロテアーゼを含有する親水性製薬学的組成物に関する。当該組成物は室温貯蔵で酵素活性を維持することが可能である。より具体的には、本発明は、ビブリオ(Vibrio)属の微生物により産生されるプロテアーゼを含有する親水性組成物に関する。当該組成物は挫滅組織切除および／もしくは創傷の治癒に有用である。本発明は、さらに、挫滅組織切除のためおよび／もしくは創傷治癒剤としてのこれらの製薬学的組成物の使用に関する。発明の背景創傷の治癒は複雑な過程であり、これはしばしば創傷領域中の非生存可能な(n on-viable)壊死組織の存在によりさらに複雑にされる。挫滅組織切除は、創傷から非生存可能組織を除去して感染症を予防しかつ治癒を助長する過程である。かなりの努力が、生存可能組織と非生存可能組織を区別することが可能な物質を発見するためになされてきた。生存可能組織を攻撃しない一方で生命を奪われた(devitalized)組織を消化することができた物質の発見は、外科手術なしで生命を奪われた組織を除去することを可能にすることができた。それは、熱傷、皮膚潰瘍、圧迫性潰瘍、切開性、外傷性および発熱性の創傷、ならびに末梢血管疾患に続発する潰瘍のような、局所的に生命を奪われた組織が生存可能な生物体から除去されることを必要とする事実上全部の疾患過程もしくは損傷で有益な治療薬であるとみられる。かなりの注目を引きつけてきた一領域は、皮膚潰瘍および熱傷からの壊死組織の早期の挫滅組織切除を遂げるためのタンパク質分解酵素および他の化学物質の使用である。こうした生命を奪われた組織は優れた培養培地であり、そして、さらに、例えばひどく熱傷された患者の大多数の死亡の差し迫った(proximate)原因である敗血症の主要な根源である。皮膚潰瘍もしくは熱傷からの焼痂と普遍的に称される生命を奪われた組織は、乾燥された血液、化膿性滲出液、ならびに表皮および真皮の皮膚層中で通常見出される変性されたタンパク質の複雑な混合物である。焼痂中で見出される変性されたタンパク質は、主として、コラーゲン、エラスチン、フィブリン、ヘモグロビンおよび他の凝固されたタンパク質である。コラーゲンは皮膚の乾燥重量の約75％を含んで成り、そして、壊死した破片および焼痂の主構成要素である。その保護的ムコ多糖鞘が損傷もしくは破壊された、半生存可能な損なわれたコラーゲンの線維(strand)が壊死組織を創傷表面に固定する。これらの線維は、壊死物質がその基部(base)から分離されるために、完全に排除されなければならない。この完全な挫滅組織切除は、そうすれば、治癒過程の間に肉芽組織の発生を可能にする。タンパク質分解酵素が創面切除剤としての使用に適するためには、そのプロテアーゼが生存可能組織と非生存可能組織を区別し；焼痂中で見出される幅広く多様な変性されたタンパク質を容易にかつ徹底的に加水分解し：生理学的ｐＨおよび温度で機能し；付属する治療（例えば、浄化剤、局所抗生物質）と適合性であり；正常な創傷の治癒を妨害せず；そして多様な製剤中および広範な温度で安定のままであることが望ましい。さらに、プロテアーゼでの熱傷の創傷の治療は皮膚移植を悪化させる(complicate)べきでない。多数のタンパク質分解酵素製剤が、成功の変動する程度を伴い、創面切除剤として使用されてきた。しかしながら、それに伴う一問題は、タンパク質分解酵素の安定な製剤を得ることがしばしば問題が多いことである。疎水性製剤は油中水乳濁液である一方、親水性製剤は水中油乳濁液である。大部分のタンパク質分解酵素は疎水性製剤に処方され、そして、酵素を安定化させるために冷蔵された温度で貯蔵されなければならない。この理由から、疎水性製剤の明確な欠点が存在する。この欠点は、投与前に製剤の温度を上昇させる必要性、投与部位への酵素の低下された到達可能性、および穏やかな浄化処置による投与部位からの製剤の除去の困難を包含する。本発明の製剤は、酵素、好ましくはプロテアーゼ、およびより好ましくはビブリオ属(Vibrio)のプロテアーゼを安定化しそして周囲温度での安定性を維持する親水性製剤を提供することにより従来技術の困難を克服する。従って、それは治療薬としての使用に十分適する。発明の要約本発明は室温で安定な酵素活性を維持することが可能な親水性製薬学的組成物を提供する。当該組成物は周囲温度で最低100日間80％より大きな酵素活性を維持する。グリセリルココエートが当該親水性組成物に酵素を安定化する特徴を与えるようである。本発明のとりわけ好ましい一局面は、ビブリオプロテオリティクス(Vibrio proteolyticus)ＡＴＣＣ５３５５９により産生される細胞外中性プロテアーゼを包含する組成物である。壊死組織の挫滅組織切除のための本プロテアーゼのとりわけ好ましい一製造手順および使用方法は、共通に譲渡される米国特許第５，１４５，６８１号に記述され、これはこれにより引用により組み込まれ、そしてそっくりそのまま頼られる。本発明のこの態様は創傷を治療するのに有用である。創傷の治療は挫滅組織切除および創傷の治癒を包含する。本発明のさらに別の局面は、壊死組織の挫滅組織切除のための、および創傷治癒剤としての、これらの安定化された細胞外中性プロテアーゼ製薬学的組成物の使用である。図面の簡単な説明図１はビブリオリシン(vibriolysin)を含有する多様な親水性組成物の貯蔵寿命の安定性を比較する。発明の詳細な記述本発明のプロテアーゼは、それらを創傷の挫滅組織切除および治癒の応用での使用のための理想的な候補とする特性の組み合わせを特徴とする。具体的な説明として、かつ、制限としてでなく、これらのプロテアーゼは：ｉ．変性されたコラーゲン、エラスチンおよびフィブリンを包含する壊死組織の成分を加水分解し； ii．インビボの本来の組織を本質的に加水分解せず；そして iii．局所製剤中で、２５℃で貯蔵される場合に安定な活性を表わす。本発明のプロテアーゼは、生存可能組織と非生存可能な壊死組織とを区別することが可能であり、そして、また、持続された期間の間、他のプロテアーゼに許容されない製剤中で活性でもある。本出願および添付された請求の範囲の目的上、本発明のプロテアーゼの前述の特性は以下のように決定された。すなわち、本発明のプロテアーゼを用いる最初のインビトロの有効性研究、焼痂に伴う構成タンパク質（例えば変性されたコラーゲン、フィブリン、変性されたエラスチン）および本来の組織が酵素的加水分解にかけられた。本発明のプロテアーゼは、トラヴェース［Travase］（商標）からのプロテアーゼに比較してこれらの基質に対するより優れた活性を表わすことが示された。さらに、本発明のプロテアーゼは、部分的な厚い部分の創傷(thickness wound)からの焼痂を加水分解することが示された。プロテアーゼの調製本発明のプロテアーゼは、適するビブリオ属(Vibrio)の種の栄養培地中での醗酵、およびその後生じる培養液からプロテアーゼを回収することにより産生されうる。醗酵は、例えば、海塩、硫酸ナトリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウムおよびある微量元素のような無機塩を含有する、カゼイン加水分解物、ＮＺ−アミンＢ、もしくはダイズ粉栄養培地中、約7.6から8.6までのｐＨ、好ましくは約ｐＨ7.8で、および約25℃から30℃までの温度、例えば約27℃で、培養物が初期定常期成長に達するまで嫌気的に実施される。酵素は、その後、慣習的手順により醗酵培養液から回収されうる。典型的には、培養液は最初に細胞部分および不溶性物質を分離するよう遠心分離もしくは濾過される。その後、上清が例えば限外濾過により濃縮される。生じる限外濾過物を、そのまま使用することができるか、あるいはアセトンのような有機溶媒もしくは硫酸アンモニウムのような無機塩により沈殿させ、次いで遠心、イオン交換クロマトグラフイーまたは濾過により創面切除性組成物で有用な酵素を単離することができる。プロテアーゼは凍結乾燥される場合にもまた安定であり、当業者に慣例であるような他の処置もまた、ビブリオ属(Vibrio)の微生物を培養するためおよび本発明のプロテアーゼをそれから回収するために使用されてよい。本プロテアーゼの供給源としての使用に有用な微生物は、いずれかの適するビブリオ属(Vibrio)、アエロモナス属(Aeromonas)、シュードモナス属(Pseudomona s)、セラチア属(Serratia)もしくはバチルス属(Bacillus)、または上の特性を有するプロテアーゼを分泌する他の海洋性微生物の種を含みうる。この目的上とりわけ好ましい一微生物は、ビブリオプロテオリティクス(Vibrio proteolyticu s)（ＡＴＣＣ５３５５９）である。この微生物の生存可能な培養物は、入手可能性に関して何等制限なしに、アメリカンタイプカルチャーコレクション (American Type Culture Collection)（ＡＴＣＣ）、１２３０１パークローンドライヴ、メリーランド州ロックヴィル２０８５２(12301 Parklawn Drive ，Rockville，Maryland 20852)に取消不可能に(irrevocably)寄託され、そして、その譲受人、Ｗ．Ｒ．グレイスアンドＣｏ．−Ｃｏｎｎ．(W.R．Grace & Co.-Conn.)は、その譲渡に際してＡＴＣＣを通じて大衆への当該培養物の永久的な入手可能性を保証する。本明細書でビブリオリシンと称されるビブリオプロテオリティクス(Vibrio proteolyticus)（ＡＴＣＣ５３５５９）により分泌されるプロテアーゼのＤＮＡ配列が配列番号１に述べられる。ビブリオプロテオリティクス(Vibrio proteolyticus)（ＡＴＣＣ５３５５９）は好ましいプロテアーゼの供給源を含んで成る一方、有用なビブリオ属(Vibrio)属の微生物の他の種が、産生されたプロテアーゼをスクリーニングし、それにより上述された手順を使用することにより、当業者により容易に同定され得る。ビブリオ属(Vibrio)の種の直接培養に加え、本発明のプロテアーゼは、本発明のビブリオ属(Vibrio)由来のプロテアーゼの構造遺伝子または本来のプロテアーゼと本質的に同一のプロテアーゼ活性を保持するその断片もしくは突然変異体を含有する挿入物を伴う適する発現ベクターで形質転換もしくはトランスフェクションされた組換え宿主細胞の培養によってもまた調製されうる。こうした手順は、例えば、野生型のビブリオ属(Vibrio)の微生物で得られるものを上回ってプロテアーゼの収量を増大させるため、もしくは改良された突然変異体プロテアーゼを産生するために望ましいことがある。プロテアーゼのクローニングの技術は組換えＤＮＡ技術の当業者に公知であり、そしていずれかの適するクローニング手順が本発明のプロテアーゼの製造に使用されてよい。こうした手順は、例えば、米国特許第４，４６８，４６４号；欧州公開特許出願第０１３０，７５６号；ＰＣＴ公開特許出願第ＷＯ８７／０４４６１号；およびロフラー(Loffler)、Food Technology、64−70ページ（1986 年１月）に記述され；その全体はこれにより引用により組み込まれ、そしてそっくりそのまま従うことができる。本発明のビブリオ属(Vibrio)プロテアーゼをクローニングするためのとりわけ好ましい一手順は、共通に譲渡される米国特許第４，９６６，８４６号に記述され、その全体はこれにより引用により組み込まれ、そしてそっくりそのまま従うことができる。この特許の手順に従えば、遺伝子ライブラリーが、最初に、本発明のプロテアーゼを合成することが上述されたアッセイにより決定されたビブリオ属(Vibrio)の供給源細胞のＤＮＡを使用して調製される。染色体ＤＮＡがビブリオ属(Vibrio)の供給源細胞から抽出され、そして既知の手順により制限酵素で消化されてＤＮＡの大断片への切断を与える。Ｓａｕ３Ａでの部分的消化が好ましいとは言え、他の制限酵素（例えば、ＭｂｏＩ、ＢａｍＨＩなど）が使用されてよい。ＤＮＡ断片がその後、ブロテアーゼ酵素を発現するクローンの単離を可能にするのに適するベクターに連結される。この目的上好ましい−ベクターはＢａｍＨＩ消化された大腸菌 (E．coli)コスミドベクターｐＨＣ７９（ベセスダリサーチラボラトリーズ( Bethesda Research Laboratories)）である。組換えベクター（すなわち、プロテアーゼを含有するゲノムからのＤＮＡ断片を含有するｐＨＣ７９コスミド）をその後、バクテリオファージ粒子、好ましくはバクテリオファージλにパッケージングし、それによりバクテリオファージλ粒子中で遺伝子ライブラリーを生じさせる。バクテリオファージ中での遺伝子ライブラリーの産生のためにはコスミドベクターもしくはλベクターが使用される。他の場合にはプラスミドベクターが使用されうる。結果として生じるバクテリオファージ粒子がその後、遺伝子ライブラリーのＤＮＡ断片を適するグラム陰性宿主細胞に挿入するのに使用される。好ましくは、組換えバクテリオファージ粒子が、例えば大腸菌(E．coli)株ＨＢ１０１のような大腸菌(E．coli)をトランスフェクションするのに使用されるとは言え、大腸菌(E．coli)の他の株が所望の場合は使用されてよい。大腸菌(E．coli)株は天然には細胞外中性プロテアーゼ酵素を合成しないため、大腸菌(E．colj)クローンは、下述されるアッセイによりプロテアーゼ遺伝子の存在および発現について容易に評価されうる。プロテアーゼ酵素を合成するビブリオ属(Vibrio)のコロニーが乳のカゼイン成分のタンパク質加水分解により乳アガープレート(milk agar plate)上に清澄化( clearing)の領域を生じることができることが既知である。非組換え大腸菌(E．c oli)コロニーは本来プロテアーゼを分泌しない。かように、機能的プロテアーゼ遺伝子を含有する本発明の大腸菌(E．coli)クローンは、従って、このアッセイにより容易に同定される。この乳清澄化アッセイは、大腸菌(E．coli)および天然に細胞外プロテアーゼを産生しない他の宿主株での使用に好ましい。他のグラム陰性およびグラム陽性株が宿主として使用されてよい。確認が他のプロテアーゼアッセイを使用することによりなされてもよい。例えば、クローンが、これらのクローンの醗酵培養物がハイド(Hide)粉末アズール、アゾコールもしくはＮ−［３−（２−フリル）アクリロイル］−アラニルフェニルアラナミド（ＦＡＡＰＡ）のような基質を加水分解することが可能であることを立証することにより、プロテアーゼ酵素の発現について確認されてよい。あるいは、これらのアッセイが、プロテアーゼ遺伝子を含有するクローンを同定するために最初の場合に使用されてよい。大腸菌(E．coli)および他の「非分泌性」宿主（すなわち、天然にプロテアーゼを分泌しない宿主）での中性プロテアーゼ遺伝子の発現が乳アガープレート上の清澄化の領域として検出され得ることは、２点で重要である。第一に、これは、活性の機能的酵素がグラム陰性宿主により合成されているという証拠である。第二に、乳アガープレート上のプロテアーゼの細胞外での存在は、この酵素が分泌もしくは細胞溶解のいずれかにより何らかの様式で外面化(externalized)されているという証拠である。大腸菌(E．coli)およびいくつかの他のグラム陰性細菌は、通常、培地中に有意の量のプロテアーゼを分泌しないため、これは、これらの非分泌性宿主でのビブリオ属(Vibrio)のプロテアーゼ遺伝子の発現の結果として産生されるプロテアーゼ酵素を回収する能力に関して重要である。配列番号１はビブリオプロテオリティクス(Vibrio proteolyticus)ＡＴＣＣ５３５５９から得られるビブリオリシン遺伝子のＤＮＡ配列を含有する。このＤＮＡ配列は、米国特許第４，９６６，８４６号に記述されるビブリオプロテオリティクス(Vibrio proteolyticus)遺伝子の6.7kbのＨｉｎｄIII断片の一部を含んで成り、これはビブリオリシンをコードする。１個の読取り枠がおよそ塩基 249から2078まで存在し、この内に、ビブリオリシンをコードするＤＮＡ領域が見出される。好ましい性能の特徴を本質的に保持する前述のプロテアーゼの突然変異体およびハイブリッドもまた本明細書で使用のために企図される。本明細書で使用されるところの「突然変異体」という用語は、野生型もしくは親の酵素と比較して、その中の変化がアミノ酸配列中に存在するプロテアーゼを指す。これは置換、付加および欠失の改変を包含する。また、これは、酵素の断片、もしくはプロテアーゼ活性を保有する内部欠失を含んで成るものを包含することができる。「ハイブリッド」は、２種もしくはそれ以上の親酵素からのアミノ酸配列を組み合わせそして双方に共通の特徴を表わす、遺伝子的に工作されたプロテアーゼを指す。突然変異体のプロテアーゼの製造の技術は当業者に公知であり、そして、放射線もしくは化学物質への微生物の曝露、部位特異的突然変異誘発、および適切な制限酵素での切断を包含する。放射線もしくは化学物質による突然変異誘発は本質的に無作為過程であり、そして所望の特徴を有する酵素を産生する微生物を同定するのに退屈な選択およびスクリーニングを必要とし得る。本発明の目的上好ましい突然変異体の酵素は、従って部位特異的突然変異誘発により製造される。この処置は、予め決められた部位での最低１個のアミノ酸の置換、欠失および／もしくは挿入がプロテアーゼ酵素中で生じられるような酵素遺伝子の改変を必要とする。部位特異的突然変異誘発の技術は当業者に公知であり、そして、例えば欧州公開特許出願第０１３０，７５６号およびＰＣＴ公開特許出願第ＷＯ８７／０４４６１号に記述され、それらの全体はこれにより引用により組み込まれ、そしてそっくりそのまま従うことができる。カセット突然変異誘発として知られるこうした一処置では、沈黙(silent)制限部位が、標的コドンもしくはコドン類に接近して隣接するプロテアーゼ遺伝子中に導入される。複式(duplex)合成オリゴヌクレオチドカセットがその後、制限部位の間の間隙(gap)に連結される。このカセットが、間隙中のコーディング配列を復帰させそして標的コドンに変えられたコドンを導入するよう工作される。本特許のビブリオ属(Vibrio)プロテアーゼでのこうした処置の使用は、野生型もしくは親のプロテアーゼの特性を改良するために望ましいことがありうる。例えば、プロテアーゼの活性部位中もしくはその周辺のメチオニン、ヒスチジン、システインもしくはトリプトファン残基が、エステル(Estell)ら、J．Biologica l Chemistry、Vol.160、No.11、2518-2521ページ(1985)で示唆されるとおり、化学的酸化に対する安定性を改良するために置き換えられてよい。親もしくは野生型のプロテアーゼのハイブリッドが、同様に、１種の親酵素（ビブリオ属(Vibrio)由来である必要はない）の遺伝子の一領域を第二の親酵素の遺伝子に連結することによる、上で論考されたカセット突然変異誘発処置に類似の既知のタンパク質工学処置により製造されてよい。当該プロテアーゼの臨床特性本発明のプロテアーゼは創傷の治療での使用に十分適し、そして創傷の挫滅組織切除および創傷の治癒の応用でとりわけ有用である。この特性は、動物およびヒトの臨床試験を包含する多数の試験状況で立証され得る。１種の幅広く使用されるアッセイは、メルツ(Mertz)ら（Journal Surgical Research（1990）48:245 -248）により記述されたものに類似のブタでの部分的な厚い部分の熱傷創傷(thi ckness burn wound)である。このアッセイで、処方されたプロテアーゼは有効性を決定するため多様な対照と比較され得る。創傷の挫滅組織切除については、有効性が、他の適応症のなかでも、焼痂の非存在、軟化もしくは溶解；生存可能組織成分の非加水分解；および／または創傷の非刺激により決定される。加えて、挫滅組織切除は組織学的に評価され得；創傷が採皮刀で除去され得、固定され得かつ埋め込まれ得、そして切片が切断され得そして例えばゴモリス三色染色(Gomori's Trichrome stain)で染色され得る。こうした切片の光学顕微鏡での分析は、非生存可能組織の消化の程度を示すことができる。局所の創傷の治癒については、有効性が、他の適応症のなかでも、創傷の拘縮、治癒の増大された速度および／もしくは改良された治癒により決定される（すなわち、触覚刺激に対する応答、より少ない焼痂、改良された新生血管形成などを維持する）。本発明のプロテアーゼの創傷の治癒の特性は局所応用のみに制限されない。この創傷の治癒の特性は、外科手術もしくは他の創傷により引き起こされる癒着の予防およびおそらくその治療を包含し得る。癒着は、手術性もしくは他の外傷後に通常は腹部でフィブリン形成として最初に発生するフィブリンおよびコラーゲンの束である。大部分の癒着は臨床的な病的状態に至らないとは言え、小腸閉塞および不妊症の原因としてのそれらの役割は十分認識される。実験モデルでは、癒着は熱的もしくは機械的外傷、虚血、炎症または外来性物質により誘発されうる。癒着形成の抑制での本発明のプロテアーゼの有効性を決定するための公知の一モデルはウサギ子宮角モデル（ドゥーディ(Doody)ら、Fer til & Steril（1989）51:509-512）である。有効性は、対照と比較して低下された癒着量および／もしくは低下された癒着密度によりこのモデルで決定される。処方および投与入手可能な賦形剤および担体を使用する創面切除プロテアーゼの製剤は、当業者に既知の標準的方法に従って製造される。プロテアーゼは、軟膏剤、ローション剤、ゲル剤、パスタ剤、泡沫剤、エアゾル剤に処方され得るか、もしくはビーズに固定され得る。プロテアーゼは創傷の包帯、テープもしくはガーゼにもまた固定され得る。当該酵素製剤は親水性もしくは疎水性のいずれかであり得る。疎水性基剤の例はパラフィン−鉱物油を包含し、また、親水性基剤はワセリン−プロピレン水基剤を包含する。親水性製剤は、とりわけ酵素が室温での貯蔵の間に当該製剤中で安定である場合は好ましい。この好みの理由は、創傷に投与する前に製剤の温度を上昇させなくてよいという便宜性を包含する。より重要なことは、親水軟膏剤中の酵素は壊死組織の加水分解のためにより到達可能であるべきであり、また、疎水性基剤と対照的に、この軟膏剤は、生理的食塩水で洗浄することにより創傷から容易に除去され得る。抗生物質、湿潤物質、デオキシリボヌクレアーゼ、フィブロネクチン、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２）、ならびに／もしくは血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）などのような増殖因子を包含する付加的有効成分が、所望の場合は当該製剤中に包含され得る。局所投与は創傷の挫滅組織切除に最も適切であるとは言え、他の投与経路がある状況下では望ましいことがある。標準的局所製剤は、例えば0.01〜10重量％のプロテアーゼを使用することを使用する。こうした製剤は、通常、例えば１日あたり約１〜６回、冒された領域に反復して適用される。しかしながら、適用の数、適用の型および軟膏剤もしくは他の製剤の濃度はもちろん創傷の重篤度および型ならびに対象の性質に依存する。局所投与は、傷つけられた組織の血管形成および治癒を刺激するためにもまた適切である。基層(substrate)は、熱傷、骨折、形成外科手術のもののような外科的剥離、切断、裂傷、褥瘡、治癒の遅い(slow-healing)潰瘍、腱炎、滑液包炎、膣炎、子宮頸炎、環状切除、会陰切開、毛巣嚢胞の創傷、癰、日焼け、凍傷を包含する。局所性もしくはおそらく全身性の投与は、外科手術もしくは他の創傷により引き起こされる癒着の予防もしくはおそらく治療に適切である。局所投与は、注入、皮下埋込術もしくは標的近傍に直接埋め込まれる徐放製剤により得る。埋込術はとりわけ手術状況下で直接実用的である。徐放性形態はポリマー中に処方され得、これは当該技術分野の熟練内に十分ある。製剤中のプロテアーゼの濃度は、状態の重篤度およびポリマーからのプロテアーゼ放出の速度を包含する多数の因子に依存する。以下の略語が本発明を記述する上で全体を通じて使用される。すなわちＨＢＯ₃ − ホウ酸ＣａＣｌ₂ − 塩化カルシウムＣａＳＯ₄ − 硫酸カルシウム cm − センチメートルＣｕＳＯ₄ − 硫酸銅 ℃ − 摂氏温度ｇ − グラム（単数もしくは複数）Ｉ．Ｍ． − 筋肉内 kb − キロ塩基対ＭｇＳＯ₄ − 硫酸マグネシウムＭｎＣｌ₂ − 塩化マンガン mg − ミリグラム（単数もしくは複数） ml − ミリリットル（単数もしくは複数） mm − ミリメートル（単数もしくは複数） mM − ミリモル濃度 mS − ミリジーメンス nm − ナノメートル（単数もしくは複数）Ｏ．Ｄ． − 光学濃度％ − パーセントＫ₂ＨＰＯ₄ − リン酸カリウムＮａＯＨ − 水酸化ナトリウムＮａ₂ＭｏＯ₃ − モリブデン酸ナトリウムＮａ₂ＳＯ₄ − 硫酸ナトリウムＨ₂Ｏ − 水ｗ／ｖ − 体積対重量ＺｎＳＯ₄ − 硫酸亜鉛実施例以下の実施例は本発明の実用例の特定の具体的説明を与えるようはたらくが、しかしそれらは本発明の範囲を制限するようにはたらくことをいかなる様式においても意図されていない。実施例１ビブリオリシンの調製Ｖ．プロテオリティクス(V．proteolyticus)ＡＴＣＣ５３５５９を、以下の組成、すなわち（１リットルあたりgもしくはml）ＮＺ−アミンＢ、40；Ｎａ₂ＳＯ₄、25；ブドウ糖、10；Ｋ₂ＨＰＯ₄、４；ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、0.4；ダラスティル(Darastil)−８２７０（ディアボーン(Dearborn)）0.1ml、および微量元素溶液6.1mlを含む培地中で培養した。微量元素溶液は、以下、すなわちＺｎＳＯ₄ ・７Ｈ₂Ｏ、18.29；ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ、18.86；ＣａＳＯ₄・２Ｈ₂Ｏ、0.91g、ＨＢＯ₃、0.07；およびＮａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ、0.04を含んで成る（１リットルあたりグラム）。滅菌前にｐＨを7.0に調節した。Ｖ．プロテオリティクス(V．proteolyticus)を、1.5もしくは10リットルのいずれかの醗酵槽で培養した。前述の培地を含有する醗酵槽に、同一組成の培地を含有する振とうフラスコ中でＶ．プロテオリティクス(V．proteolyticu s)を20時間成長させることにより得られた１％（ｖ／ｖ）培地を接種した。醗酵を、28℃、1,000〜1,250rpmおよび１分あたり培地１体積あたり1.0体積の空気の通気で実施した。醗酵のｐＨを、酸および塩基滴定剤の自動添加によりｐＨ7.8 で維持した。Ｖ．プロテオリティクス(V．proteolyticus)の成長を640nmの光学濃度を測定することにより監視し、また、プロテアーゼ活性をアゾカゼインの加水分解を定量することにより監視した。アゾカゼインの加水分解は、プロテアーゼのサンプルを、0.5mlの最終体積で1.0mg/mlのアゾカゼイン（スルファニルアミドアゾカゼイン、シグマコーポレーション(Sigma Corp.)、ミズーリ州セントルイス）を含有する50mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.4）中37℃で10分間インキュベーションすることにより測定する。このインキュベーション期間の終了時点で、0.5m lの10ｗ／ｖ％トリクロロ酢酸を添加しかつ直ちに混合し、そして生じる混合物をその後氷上で10分間保存する。混合物をその後遠心分離し、そして生じる上清の光学濃度を、緩衝アゾカゼイン溶液中で、酵素を含有しないかもしくは不活性化された酵素を含有するかのいずれかのブランクに対し420nmで測定する。活性の１単位を、420nmで2.5の吸光度の変化を発生させるのに必要とされる酵素の量と定義する。醗酵の初期定常成長期の間に、生成物のプロテアーゼは、以前に記述されたアゾカゼインアッセイにより測定されるような、およそ85,200ないし12 7,800アゾカゼイン単位／リットルの力価に達する。培養液を、細胞部分を分離するための遠心分離により収穫した。タンパク質分解活性を含有する上清を、アミコン(Amicon)Ｓ１ＯＹ１０のらせん状の巻き付けられたフィルター(spiral wound filter)（アミコンコーポレーション(Amicon Corp.)、マサチューセッツ州レキシントン）を使用して濃縮した。濃縮物を、１mMＣａＣｌ₂を含有する50nMトリス緩衝液、ｐＨ7.5で、保持物 (retentate)の誘電率がおよそ１mSとなりかつｐＨが中性となるまでダイアフィルトレーションした(diafiltrated)。この物質を凍結乾燥し、そして使用もしくは処方されるまで一20℃で貯蔵した。実施例２親水性クリーム組成物好ましい親水性クリーム組成物を以下のように製造した。当該クリームは、示された濃度で以下の成分を含有する。成分重量パーセントグリセリルココエート 34 グリセリルトリラウレート 5 グリセリン 13 抗菌剤 0.2 リン酸緩衝液（ｐＨ7.0） 46 ビブリオリシン 1.8 グリセリルココエート、グリセリルトリラウレートおよびグリセリンを一緒に混合しそして60℃に加熱した。別個の容器中で、抗菌剤コスモシル［Cosmocil］（商標）ＣＱ（ＩＣＩアメリカスインク(ICI Americas，Inc.)）およびリン酸緩衝液（0.3MＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ7.0）を合わせ、そして60℃に加熱した。緩衝溶液をその後、グリセリル含有溶液に添加し、そして混合しながら40℃に冷却した。実施例１でのとおり調製されたビブリオライシンをその後、混合しながらゆっくりと添加し、そして室温に冷却させた。実施例３貯蔵寿命の安定性実施例２の親水性組成物から抽出される酵素活性を、４℃もしくは25℃（周囲室温）のいずれかでの貯蔵後の時間にわたって監視した。1/10グラムの組成物を定期的に取り出し、0.9％ＮａＣｌおよび0.5mMＣａＣｌ₂を含有する100mMＴＥＳ（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−２−アミノエタンスルホン酸）緩衝液ｐＨ7.5の１mlで抽出した。混合物をボルテックスを用いて徹底的に攪拌し、1 0倍に希釈し、そして残余のタンパク質分解活性を、実施例１で記述されたようなアゾカゼインの加水分解により測定した。本組成物から回収された残余のタンパク質分解活性を図１に示し、また、ビブリオリシンを含有する他の標準的親水性組成物と比較する。主題の組成物中の当該酵素の安定性は従来技術の組成物より有意により良好である。実施例４組成物からのプロテアーゼの放出可能性親水性組成物の１個の主張される利点は治療薬（例えばプロテアーゼ）の創傷部位への到達可能性である。多様な組成物からのビブリオリシンの放出可能性を以下のように測定した。すなわち、乳カゼインアガー（1.5％）プレートを調製し、そして６mmの円形の穴をアガーからパンチで切り取った(punched)。各穴を、ビブリオリシン組成物もしくはビブリオリシン緩衝溶液のいずれかで満たし、そしてプレートを37℃でインキュベーションした。プロテアーゼが各穴から乳カゼインアガー中に移動する際に、それがカゼインを加水分解し、各穴の周囲に加水分解のかさ(halo)の清澄化の領域を残す。加水分解の領域を時間の関数で測定し、そして下に示す。すなわち組成物 7.5時間での加水分解の領域（mm）ビブリオリシン／緩衝液 18.5（100）^a ビブリオリシン／ｐＢ−０１３５−１５７ 16.2（88）ビブリオリシン／プラスチベース(plastibase) 14.5（78）ビブリオリシン／シルヴァディーン(silvadene) 17（92）^a 酵素の放出可能性パーセント。これらのデータは、ビブリオリシンが疎水性組成物（例えばプラスチベース）より親水性組成物（例えばｐＢ−０１３５−１５７およびシルヴァディーン）からより容易に放出されることを示す。実施例５組成物のインビトロ活性実施例２のビブリオリシン含有組成物は創傷の治療に有用である。天然のブタ皮膚はコラーゲンの優れた起源であり（〜70％）、コラーゲンは壊死組織の主成分である。当該組成物の挫滅組織切除活性を監視するため、皮膚消化の定量的可視化を可能にする単純なアッセイを考案した。簡潔には、当該方法は、３cm²のメディスキン−Ｉ(Mediskin-I)（ブタ皮膚）（バイオプラスティインク(Biopl asty，Inc.)）を20秒間煮沸することにより変性させることから成る。変性された皮膚を吸い取って乾かし、そして外科用テープでペトリ皿上に据付けた。試験組成物（〜１g）を変性された皮膚に適用し、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）の溶液を皿の底部に添加して皮膚の乾燥を予防した。皿を覆いそして37℃でインキュベーションした。６ないし24時間のインキュベーションの後に、組成物を、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）の穏やかな流れを使用して皮膚から除去した。この方法を使用して、ビブリオリシン組成物は、酵素組成物が適用された場所の直接下の皮膚を完全に加水分解することが示された。本組成物がビブリオリシン／疎水性組成物（例えばプラスチベース）より活性であったこと、ならびに、当該組成物が変性されたブタ皮膚のコラーゲンの加水分解で商業的製品（例えば、トラヴェース(Travase)、エレース(Elase)、サンテイル(Santy1)、グラニュレックス(G ranulex)およびヴァリダーゼ(Varidase)）より優れていたことがさらに示された。実施例６当該組成物のインビボ活性実施例２の酵素組成物での１もしくは２回のいずれかの治療後の焼痂の酵素消化の有効性を評価するため、第３度の熱傷（完全な厚さ）の損傷をモデルとして選択した。適切な麻酔および剃ること(shaving)の後に、３列の蒸気熱傷をブタで創製した。６個の創傷を30秒間、６個の創傷（40秒）、６個の創傷（50秒）に蒸気を当てた。創傷は損傷後に明らかな血流を伴わず白色に見えた。縁は赤色であり、第２度の損傷の薄い（２mm）外輪を示した。創傷を閉鎖包帯（オプサイト (Op-Site)）で覆った。ブタを24時間後に観察し、そして包帯を麻酔なしで交換した。傷つけた後48時間にブタを麻酔した。創傷を滅菌生理的食塩水で洗浄した。全創傷は薄膜焼痂を伴い白色のままであった。製剤を適用し、そして全創傷を閉鎖包帯で覆った。製剤は、実施例２のビブリオリシン組成物、同等なベヒクル組成物（ビブリオリシンを含まない）、および未処理の対照であった。治療24時間後にブタを麻酔し、そしてオプサイト(Op-Site)を除去した。創傷を滅菌生理的食塩水およびガーゼで穏やかに浄化した。総体的な観察結果を記録しかつ写真を作成した。製剤の第二の適用を適用し、そしてブタを再度閉鎖包帯中に包んだ。焼痂の消化のパーセントを表Ｉに示す。ビブリオリシン組成物での２回の治療後に焼痂の80〜95％が除去された。創傷の残存する基部は桃色であり、また、いくつかの例では、皮下血管が脂肪を通して観察された。自発的出血は示されなかった。比較により、処理されないもしくはベヒクルで処理された創傷は薄膜焼痂を残存していた。収穫された創傷の組織学的検査が視覚的な主観的評価を確証した。熱傷の創傷を切除し、10％中性緩衝ホルマリン中で48時間固定し、そしてパラフィン蝋中に埋め込んだ。代表的切片（７μ）をゴモリ三色(Gomori's Trichrome)で染色し、そしてオリンパスヴァノックス(Olympus Vanox)ＡＨ光学顕微鏡を用いて写真撮影した。ビブリオリシンで処理された創傷の切片の分析は、加水分解が、皮下脂肪のすぐ上のレベルまで、非生存可能の表皮および真皮全体に下向きに進行したことを示した。未処理の創傷もしくはベヒクルを受領する創傷の切片は加水分解を示さなかった。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年６月１日（１９９９．６．１）【補正内容】請求の範囲１．製薬学的に有効な量の酵素、および室温で最低100日間80パーセントより大きな酵素活性を維持するのに有効な量のグリセリルココエートを含んで成る親水性製薬学的組成物であって、前記酵素がビブリオプロテオリティクス(Vibrio proteolyticus)の培養により産生される細胞外中性プロテアーゼである組成物。２．取消。３．取消。４．取消。５．創傷を創面切除するのに有用である、請求の範囲１の組成物。６．創傷の治癒を促進するのに有用である、請求の範囲１の組成物。７．前記プロテアーゼが配列番号１を有するＤＮＡ配列によりコードされる、請求の範囲１の組成物。８．グリセリンをさらに含んで成る、請求の範囲１の組成物。９．抗菌剤をさらに含んで成る、請求の範囲１の組成物。１０．約0.5ないし約2.0％のプロテアーゼ、約10.0ないし約70.0％のグリセリルココエート、約０ないし約30.0％のグリセリルトリラウレート、約０ないし約40.0％のグリセリン、約0.05ないし約0.5％の抗菌剤、約30.0ないし約80.0％の緩衝液をさらに含んで成る、請求の範囲１の組成物。１１．請求の範囲１に記載の親水性製薬学的組成物を投与することを含んで成る、こうした治療を必要とする対象からの壊死および非生存可能の組織の除去を提供する治療方法。１２．治療が、熱傷、骨折、外科的剥離、蓐瘡、治癒の遅い潰瘍、腱炎、滑液包炎、膣炎、子宮頸炎、環状切除、会陰切開、毛巣嚢胞の疣贅、癰、日焼けおよび凍傷から選択される状態の治療のために遂げられる、請求の範囲１１の方法。１３．取消。１４．取消。１５．組成物が局所に適用される、請求の範囲１１の方法。１６．組成物が毎日約１ないし６回局所に適用される、請求の範囲１５の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 19/00 Ａ６１Ｐ 19/08 19/08 31/04 31/04 43/00 １１１ 43/00 １１１Ｃ１２Ｒ 1:63）Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＡ６１Ｋ 37/54 Ｃ１２Ｒ 1:63） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ヤング，カングアメリカ合衆国ペンシルベニア州18912チヤルフオント・アスペンコート104

Claims

【特許請求の範囲】１．製薬学的に有効な量の酵素、および室温で最低100日間80パーセントより大きな酵素活性を維持するのに有効な量のグリセリルココエートを含んで成る親水性製薬学的組成物。２．前記酵素がプロテアーゼである、請求の範囲１の組成物。３．前記プロテアーゼがビブリオ属(Vibrio)により産生される細胞外中性プロテアーゼである、請求の範囲２の組成物。４．前記ビブリオ属(Vibrio)がビブリオプロテオリティクスストリーム(Vib rio proteolyticus stream)である、請求の範囲３の組成物。５．創傷を創面切除するのに有用である、請求の範囲１の組成物。６．創傷の治癒を促進するのに有用である、請求の範囲１の組成物。７．前記プロテアーゼが配列番号１を有するＤＮＡ配列によりコードされる、請求の範囲１の組成物。８．グリセリンをさらに含んで成る、請求の範囲１の組成物。９．抗菌剤をさらに含んで成る、請求の範囲１の組成物。１０．約0.5ないし約2.0％のプロテアーゼ、約10.0ないし約70.0％のグリセリルココエート、約０ないし約30.0％のグリセリルトリラウレート、約０ないし約40.0％のグリセリン、約0.05ないし約0.5％の抗菌剤、約30.0ないし約80.0％の緩衝液をさらに含んで成る、請求の範囲１の組成物。１１．請求の範囲１に記載の親水性製薬学的組成物を投与することを含んで成る、こうした治療を必要とする対象からの壊死および／もしくは非生存可能の組織の除去を提供する治療方法。１２．治療が、熱傷、骨折、外科的剥離、蓐瘡、治癒の遅い潰瘍、腱炎、滑液包炎、膣炎、子宮頸炎、環状切除、会陰切開、毛巣嚢胞の疣贅、癰、日焼けおよび凍傷から選択される状態の治療のために遂げられる、請求の範囲１０の方法。１３．プロテアーゼがビブリオ属(Vibrio)により産生される中性プロテアーゼである、請求の範囲１０の方法。１４．ビブリオ属(Vibrio)がビブリオプロテオリティクス(Vibrio proteolyti cus)株である、請求の範囲１２の方法。１５．組成物が局所に適用される、請求の範囲１１の方法。１６．組成物が毎日約１ないし６回局所に適用される、請求の範囲１５の方法。