DE60222457T2

DE60222457T2 - Vorrichtung zur kontrollierten enzymatischen entfernung und wiedergewinnung von gewebe

Info

Publication number: DE60222457T2
Application number: DE60222457T
Authority: DE
Inventors: Amihay Freeman
Original assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd
Current assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd
Priority date: 2001-07-27
Filing date: 2002-07-16
Publication date: 2008-06-12
Anticipated expiration: 2022-07-17
Also published as: DE60222457D1; EP1443988B1; US20030021775A1; ATE372795T1; WO2003011369A1; EP1443988A1; IL160090A0

Description

GEBIET UND HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, eine Vorrichtung und eine pharmazeutische Zusammensetzung zur kontrollierten Entfernung von Zellen von der Oberfläche lebensfähigen Gewebes durch kontinuierliche örtliche Anwendung einer ein proteolytisches Enzym enthaltenden Lösung, und spezieller ein Verfahren, eine Vorrichtung und eine pharmazeutische Zusammensetzung zur nicht-chirurgischen, enzymatischen Behandlung und Biopsie von Hautläsionen. Der nächstliegende Stand der Technik ist durch die Dokumente US-B1-6264666 , US-A 5 037 431 und US-A 3 910 266 definiert, die jedes die Merkmale des Oberbegriffs von Anspruch 1 offenbaren.
Gewebe setzen sich aus einzelnen Zellen und Zellgruppen zusammen, die in einer eiweißartigen extrazellulären Matrix eingebettet sind. Collagenfasern sind die Hauptkomponente dieses allgegenwärtigen Netzwerks, zusammen mit anderen Proteinen, wie etwa Fibronektin, Laminin, Elastin und Tenascin, die einen Mechanismus zur Zellbefestigung bereitstellen. Zelloberflächen-Befestigungsmoleküle, wie etwa die CAM-Proteine, gestatten es Zellen, sich an die extrazelluläre Matrix und an benachbarte Zellen anzuheften. Somit ist die histologische Integrität von Geweben von der Wechselwirkung vieler Protein- und proteinabgeleiteter Moleküle abhängig.
Enzyme, die in der Lage sind, Proteine zu digestieren, oder Proteasen, werden üblicherweise eingesetzt, um die extrazelluläre Matrix von Geweben oder Gewebeproben aufzubrechen, um Zellen zur Erstellung primärer Zellkulturen (1) abzutrennen.. Bei der Isolierung von Zellen zur Kultivierung verwendete Proteasen sind typischerweise selektiv in ihrer proteolytischen Aktivität oder in ihrem Anwendungsverfahren, wodurch sie ein effektives Aufbrechen der Matrix- und Haftproteine erzielen, jedoch eine minimale Digestierung kritischer Zellkomponenten verursachen. Bei der Herstellung einer Primärkultur wird das Gewebe mechanisch in kleine (2-3 mm) Stücke geschnitten, diese Explantate werden gewaschen und in einer isotonischen gepufferten Lösung, die eine Protease, wie etwa Trypsin oder Collagenase, enthält, für 30 Minuten bis zu mehreren Stunden auf Zimmertemperatur schonend geschüttelt. Diese Verfahrensweise, die zu suspendierten, isolierten Zellen führt, ist universell und ist zur Herstellung und Vermehrung primärer Zellkulturen aus einer Vielfalt von Geweben, einschließlich Hautbiopsien (2), eingesetzt worden.
Proteolytische Digestierung von Haut, die ein vollständiges oder teilweises Aufbrechen des Gewebes erzielt, ist, typischerweise als eine Alternative für mechanische Mittel, in einer breiten Vielfalt industrieller, kosmetischer, experimenteller und klinischer Verfahren angewendet worden. Diese umfassen das Enthaaren von Tierhäuten und Fellen (3), Linderung und Förderung der Heilung von Hautläsionen, wie etwa CO₂-Laserchirurgiewunden (4) und Decubitusgeschwüren (5), Debridement nicht lebensfähigen Gewebes, wie etwa bei durch Verbrennungen entstandenem nekrotischem Gewebe (6), Entfernen faserigen Exsudats aus empfindlichen Bereichen, wie etwa dem Auge (7), Erneuerung alternder Haut durch Exfoliation ( US-Patent 5,976,556 an Norton et al.), Entfernen von Läusenissen von Haar ( US-Patent 5,935,572 an Sorenson et al.) und die Behandlung infektiöser Läsionen der Haut, wie etwa Akne und Lepra ( US-Patent 5,958,406 an de Faire et al.).
Behandlung von Hautläsionen
Die Behandlung von Hautläsionen, wie etwa Altersflecken, Melasmen, Keratosen, Naevi, Keloiden, hypertrophischen Narben, Schuppenflechte und Tätowierungen erfordert die Entfernung erkrankter oder abnormaler Hautzellen. Chirurgische Verfahrensweisen sind im allgemeinen schmerzhaft und destruktiv für die gesunden benachbarten Gewebe, was zu Narbenbildung und abnormaler Pigmentierung der behandelten Gebiete (8), der Notwendigkeit der Verabreichung von Anästhesie und zu erheblichem Stresstrauma für den Patienten (9) führt. Zusätzlich wird die chirurgische Exzision gewisser Läsionen oft durch das Vorhandensein von mehr als einem abweichenden Zelltyp (10) kompliziert und ist für empfindliche und heikle anatomische Bereiche ungeeignet. Diese Nachteile chirurgischer Exzision von Hautläsionen haben zur Entwicklung nicht-mechanischer Verfahren, wie etwa Elektrokauterisierung, Elektro-Ablation, Kryochirurgie mit flüssigem Stickstoff und Lasern geführt.
Eine derzeit breit verwendete Technik setzt auf die Hautläsion gerichtete Laserenergie ein, um eine Ablation des unerwünschten Gewebes zu verursachen. Wie bekannt ist, ist Laserchirurgie aufgrund der Kauterisierungseffekte der intensiven Energie und der Fähigkeit zum sorgfältigen Fokussieren des Laserstrahls (11), wodurch weniger Schmerzen und Vernarbung hervorgerufen werden als durch Skalpell- oder Rasierklingen-Exzisionstechniken, weniger traumatisch für angrenzendes Gewebe. Es bleiben jedoch die Probleme von mit der zur Gewebsablation erforderlichen intensiven Hitze zusammenhängenden Schmerzen und Narbenbildung, schlechte Ergebnisse bei Versuchen zur Laserbehandlung gewisser Läsionen, wie etwa melanozytären und kongenitalen Naevi (11), und die Wichtigkeit des Entfernens statt Ablatierens des abnormalen Gewebes zur histologischen Analyse zur Ermittlung von Charakter und Ausmaß der Läsion.
Proteolytische Enzyme bei der Behandlung von Hautläsionen
Die US-Patente 4,226,854 an Klein et al.; 5,505,943 und 6,017,531 an Fortney et al.; 5,106,621 an Rowan et al. und 5,840,283 an Sorenson et al. lehren die Verwendung von Proteasen zur Erzielung von Entfernung oder Permeierung abnormaler, devitalisierter oder nekrotischer Haut. Rowan et al. ( US-Patent 5,106,621 ) offenbaren eine Cysteinprotease aus Ananas, Ananain, in einem pharmazeutischen Präparat zur topischen Anwendung und Debridement von Brandwunden oder vereitertem Gewebe. Gleichartig beschreiben Fortney et al. ( US-Patente 5,505,943 und 6,017,531 ) die Verwendung der bakteriellen Protease Vibriolysin für das Debridement von nach Verbrennung entstandenem nekrotischem Gewebe und nekrotisierter Haut durch topische Anwendung in einem Lösungs- oder Salbenpräparat. Sorenson et al. ( US-Patent 5,840,283 ) beschreiben die topische Anwendung proteolytischer Enzyme als Permeationserleichterungsmittel bei der Behandlung erkrankten Nagel-, Klauen- oder Hufgewebes. Die kommerziell erhältliche Wundsalbe Travase^TM ( US-Patent 3,409,719 an Noe et al.) setzt ebenfalls proteolytische Aktivität, vorgefunden in Bacillus subtilis-Filtrat, zum Debridement von nach Verbrennung entstandenem nekrotischem Gewebe und Dekubitus-Eitergewebe ein. Bei all diesen und anderen gleichartigen Verfahren ist die proteolytische Aktivität auf das Entfernen nichtvitalisierten Gewebes gerichtet und wird durch individuelle topische Anwendungen mit Gaze oder Schwamm erzielt, ohne das Vorsehen einer Steuerung der Niveaus oder Dauer der Enzymaktivität oder des Sammelns von Zellen aus dem behandelten Bereich.
Das US-Patent 5,958,406 an de Faire et al. beschreibt die Verwendung einer multifunktionellen Krustentier-Protease zur Behandlung und Verhütung bakterieller, Pilz- und viraler Infektionen, Blutgerinnsel, mit Zellhaftung zusammenhängender Erkrankung (wie etwa HIV und Autoimmunerkrankungen) und Hautläsionen und -infektionen (wie etwa Akne, Pruritis (Juckreiz) und Narben). Das Proteasepräparat wird durch verschiedene Verfahren verabreicht: topisch, in einer wässrigen oder nicht wässrigen Trägersubstanz; parenteral, oral oder in Zäpfchen für systemische Anwendungen; okular, in Tropfen, Salbe oder Aerosol; und in kutaner oder subkutaner Injektion, für Hautläsionen wie etwa Narben, Akne und Furunkel. Es wird jedoch keine Steuerung der Enzymaktivität nach Anwendung, oder ein Mittel zur Verschaffung von Zellen von den behandelten Geweben erwähnt.
Das US-Patent 5,976,556 an Norton et al. beschreibt die topische Anbringung proteolytischer Enzyme zur Exfoliation von Haut und Behandlung abnormaler Zustände und Erkrankungen der Haut, wie etwa Warzen, Altersflecken, Melasmen, Akne, Schuppenflechte usw. Die Kontrolle der Enzymaktivität wird durch die Einschränkung von Enzymen auf Säureproteasen bewirkt, die in ihrem sauren Puffer bei Anwendung aktiv sind, und durch die von dem normalen pH-Wert-Regulierungsmechanismus der Epidermis hervorgerufene langsame Entsäuerung inaktiviert werden. Es ist keine andauernde Überwachung oder Kontrolle von Enzymaktivität vorgesehen, und das Verschaffen von Zellen von dem behandelten Gewebe wird nicht erwähnt.
Das US-Patent 6,146,626 an Markert et al. beschreibt die Herstellung eines proteolytischen Enzymgemischs, das Collagenase und Elastase von Clostridium histolyticum zur Anwendung bei der Wundheilung und Verschaffung von Zellen aus ganzem Gewebe oder Gewebsfragmenten umfasst. Bedingungen für die topische Anwendung des Enzyms an Brandwunden und die Isolierung von Zellen aus einer Vielfalt von Human- und anderem tierischem Gewebe werden diskutiert. Die beschriebene Verfahrensweise betrifft jedoch eher die Präparierung von Zellen zur Gewebekultur aus Gewebefragmenten als die therapeutische Anwendung von Zellentfernung aus lebendem Gewebe. Weiterhin wird keine Vorkehrung für das Sammeln von Zellen aus lebendem Gewebe in situ getroffen.
Autolyse von Proteasen
Proteolytische Enzyme, die Proteine sind, sind an sich Substrate zum Eigenaufschluss, oder Autolyse, wodurch sie die Effektivität aktivier, protease-basierter Präparate begrenzen. Beispielsweise verliert eine kommerziell erhältliche Serinprotease, die aus Bakterien der Art Bacillus gewonnen ist (Subtilisin A, hergestellt von Novo Nordisk Bioindustry Japan K.K.) ihre enzymatische Aktivität zu etwa 70 %, wenn sie 24 Stunden lang in einer wässrigen Lösung bei pH-Wert 7,0 auf 25 °C gehalten wird. Klinische Anwendungen, die proteolytische Enzyme einsetzen, sollten Mittel zur Verhinderung und Kontrolle katalytischer Inaktivierung aufgrund von Autolyse vorsehen.
Die meisten Proteasen zeigen katalytische Aktivität innerhalb eines definierten, und oft beschränkten physikalisch-chemischen Milieus (pH-Wert, Temperatur, Ionenstärke, Lösungsmittelpolarität, usw.). Die spezifische Natur mancher Proteasen kann ausgenutzt werden, um Autolyse während Lagerung und Anwendung des Enzyms zu verhindern und um die Deaktivierung der Enzyme nach der Verwendung zuzulassen.
Eine Herangehensweise ist die Lagerung des Enzyms in einem lyophilisierten Zustand, um in einem aktivierten Puffer mit geeignetem pH-Wert, Ionenstärke usw. gerade vor oder zur Zeit der Abgabe an das bzw. die behandelnden Gewebe verdünnt zu werden. Die Enzymstabilität wird verbessert, wenn es trocken ist, jedoch ist die Löslichkeit und selbst Verteilung des Enzymfeststoffs in dem aktivierenden Puffer schwierig, was zu einer schlechten Kontrolle über die Enzymaktivität am Abgabepunkt führt.
Ein anderes Verfahren zur Verlängerung und Steuerung von Enzymaktivität ist die Trennung von Enzympräparaten von ihren aktivierenden Puffern bis zur Verwendung. Diese Trennung kann physikalisch bewerkstelligt werden, indem das Enzym und der aktivierende Verdünner in getrennten Abteilungen gelagert werden, wobei das Enzym in einem stabilisierten Präparat gehalten wird. Das US-Patent 6,228,323 an Asgharian et al. beschreibt eine Vorrichtung zur Lagerung und Abgabe proteolytischer Enzympräparate, die zur Abgabe von Kontaktlinsenreinigungsmittel vorgesehen sind. Die Enzympräparate sind durch Polyole, wie etwa PEG-400, in einer konzentrierten Form stabilisiert und werden bei Abgabe in vorbestimmten Verhältnissen mit den aktivierenden Verdünnungsmitteln gemischt. In dem US-Patent 5,409,546 an Nakagawa et al. wird ein Metallchelator mit dem Enzym-Grundpräparat gemischt, wodurch die zur katalytischen Aktivität erforderlichen Kationen entfernt werden und die Haltbarkeit verlängert wird. Das Einbringen von Kationen in den Verdünner stellt die enzymatische Aktivität wieder her, die ebenfalls zur Reinigung von Kontaktlinsen gedacht ist.
Eine gleichartige Herangehensweise an die Verhinderung von Autolyse und Destabilisierung von Enzympräparaten ist in dem US-Patent 6,117,433 an Edens et al. beschrieben. Die Auswirkung von Polyolen auf die Enzymaktivität wird im einzelnen erörtert, wie auch andere enzymstabilisierende Verfahren, wie etwa nicht- optimaler pH-Wert, hohe Salzkonzentrationen usw. Die stabilisierten Enzyme, oder andere biologisch aktive Substanzen, sind zur Abgabe mit einer geeigneten Menge aktivierenden Verdünners gedacht, zur topischen Anwendung, wie etwa bei Kosmetikpräparaten, auf Haut oder anderen Außenflächen. Es findet keine Erwähnung statt von der Entfernung und dem Zurückbehalten von Zellen von behandelten Hautläsionen oder einer Vorrichtung zur kontrollierten Anwendung einer Proteaselösung an einem definierten und isolierten Gebiet.
Es besteht somit ein breit anerkannter Bedarf an einem Verfahren zur kontrollierten enzymatischen Entfernung und Zurückbehalten von Zellen von Außenflächen der Haut, das frei von den obigen Einschränkungen ist, und es wäre sehr wünschenswert, darüber zu verfügen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung, wie in Anspruch 1 definiert, bereitgestellt, zum Fließenlassen einer Lösung, die eine effektive Menge mindestens einer Protease enthält, über einen und in Kontakt mit einem Hautbereich, wobei die Vorrichtung einen ersten Behälter zum Enthalten der Lösung, die die wirksame Menge der mindestens einen Protease enthält, umfasst; und einen Applikator, der in Fluidkommunikation mit dem ersten Behälter ist und dazu gestaltet und konstruiert ist, das Fließen der die wirksame Menge der mindestens einen Protease enthaltenden Lösung über den und in Kontakt mit dem Hautbereich einzuschränken.
Gemäß weiteren Merkmalen in den nachstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst die Vorrichtung weiter einen zweiten Behälter zum Enthalten der mindestens einen Protease in einer ersten Lösung, worin die mindestens eine Protease im Wesentlichen katalytisch inaktiv ist; und einen dritten Behälter zum Enthalten einer zweiten Lösung, wobei die zweite Lösung so gewählt ist, dass sie die mindestens eine Protease beim Mischen mit der ersten Lösung katalytisch aktiviert; wobei der zweite Behälter und der erste Behälter in Fluidkommunikation mit dem dritten Behälter sind.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den nachstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist die aktivierende Lösung so gewählt, dass sie die mindestens eine Protease beim Vermischen damit katalytisch aktiviert.
Gemäß einem zusätzlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung bereitgestellt zum Fließenlassen einer Lösung, die eine wirksame Menge mindestens einer Protease enthält, über einen und in Kontakt mit einem Hautbereich, wobei die Vorrichtung einen Aufnahmebehälter zur Aufnahme eines Behälters, der die wirksame Menge der mindestens einen Protease enthaltenden Lösung enthält, umfasst; und einen Applikator, der in Fluidkommunikation mit dem Aufnahmebehälter-Behälter ist, wenn er von dem Aufnahmebehälter aufgenommen ist, und so gestaltet und konstruiert ist, dass er das Fließen der die wirksame Menge der mindestens einen Protease enthaltenden Lösung über den und in Kontakt mit dem Hautbereich einschränkt.
Nach noch einem anderen zusätzlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung bereitgestellt zum Fließenlassen einer Lösung, die eine wirksame Menge mindestens einer Protease enthält, über einen und in Kontakt mit einem Hautbereich, wobei die Vorrichtung einen ersten Aufnahmebehälter zur Aufnahme eines ersten Behälters, der die mindestens eine Protease in einer ersten Lösung enthält, worin die mindestens eine Protease im Wesentlichen katalytisch inaktiv ist, umfasst; einen zweiten Aufnahmebehälter zur Aufnahme eines zweiten Behälters, der eine zweite Lösung enthält, wobei die zweite Lösung so gewählt ist, dass sie beim Mischen mit der ersten Lösung die mindestens eine Protease katalytisch aktiviert; eine Mischkammer, die in Fluidkommunikation mit dem ersten und zweiten Behälter ist, wenn diese von dem ersten und zweiten Aufnahmebehälter aufgenommen sind, wobei die Mischkammer zum Mischen der ersten und zweiten Lösung dient, um die Lösung zu erhalten, die die wirksame Menge der mindestens einen Protease enthält; und einen Applikator, der in Fluidkommunikation mit der Mischkammer ist und dazu gestaltet und konstruiert ist, dass er das Fließen der die wirksame Menge der mindestens einen Protease enthaltenden Lösung über den und in Kontakt mit dem Hautbereich einschränkt.
Gemäß noch einem zusätzlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung bereitgestellt zum Fließenlassen einer Lösung, die eine wirksame Menge mindestens einer Protease enthält, über einen und in Kontakt mit einem Hautbereich, wobei die Vorrichtung einen ersten Aufnahmebehälter zur Aufnahme eines ersten Behälters, der die mindestens eine Protease enthält, umfasst; einen zweiten Aufnahmebehälter zur Aufnahme eines zweiten Behälters, der eine Lösung enthält, die so gewählt ist, dass sie die mindestens eine Protease beim Mischen mit der mindestens einen Protease katalytisch aktiviert; einen Mechanismus zum Mischen der mindestens einen Protease mit der Lösung, um die Lösung zu erhalten, welche die wirksame Menge der mindestens einen Protease enthält; und einen Applikator, der dazu gestaltet und konstruiert ist, dass er das Fließen der die wirksame Menge der mindestens einen Protease enthaltenden Lösung über den und in Kontakt mit dem Hautbereich einschränkt.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den nachstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst die Vorrichtung eine Pumpe zum Fließenlassen der wirksamen Menge mindestens einer Protease von dem ersten Behälter, wenn er von dem Aufnahmebehälter aufgenommen ist, zu dem Applikator.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den nachstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird das Fließenlassen der wirksamen Menge von mindestens einer Protease von dem ersten Behälter zu dem Applikator durch Schwerkraft bewerkstelligt.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den nachstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst die Vorrichtung weiter einen Wärmeregler zum Erhitzen und/oder Kühlen der die wirksame Menge der mindestens einen Protease enthaltenden Lösung.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den nachstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst die Vorrichtung weiter einen Mischer zum Mischen der die wirksame Menge der mindestens einen Protease enthaltenden Lösung.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den nachstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst die Vorrichtung weiter einen Filter zum Filtrieren der die wirksame Menge der mindestens einen Protease enthaltenden Lösung.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den nachstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst die Vorrichtung weiter einen Zellsammler, der in Fluidkommunikation mit dem Applikator steht.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den nachstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst der Zellsammler einen Filter zum Sammeln der Zellen.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den nachstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst der Zellsammler eine Durchlaufzentrifuge zum Sammeln der Zellen.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in den nachstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst der Applikator ein Gehäuse mit einer der Haut zugewandten Öffnung, mindestens einem Einlass und mindestens einem Auslass, wobei der mindestens eine Einlass und mindestens eine Auslass zum Fließenlassen der die wirksame Menge der mindestens einen Protease enthaltenden Lösung dort hindurch und über einen durch die der Haut zugewandte Öffnung definierten Hautbereich dienen.
Die vorliegende Erfindung befasst sich erfolgreich mit den Mängeln der derzeit bekannten Konfigurationen durch Bereitstellung einer Vorrichtung zur gesteuerten, nicht-chirurgischen Entfernung und Rückgewinnung von Zellen von Hautläsionen. Ein synergetischer Effekt proteolytischer Digestierung der intrazellulären Matrix und „Abstreif"-Flusses wird durch Behandeln eines definierten Gebiets mit einem gesteuerten, kontinuierlichen Strom proteolytischer Enzymlösung erzielt, der eine sanfte, jedoch wirksame Gewebserosion verursacht. Isolierte Zellen von den Hautläsionen können zwecks histologischer Analyse und/oder Zellkulturen aus dem Proteaselösungsstrom gesammelt werden, wodurch ein Verfahren „enzymatischer Biopsie" geboten wird. Die Proteaselösung kann mit Anästhetika, Koagulantien, Antikoagulantien und Antibiotika ergänzt werden, um Unbehagen, Erythem, Blutung, Infektions- und Narbenbildungsrisiko zu verringern, die herkömmlich mit der chirurgischen Behandlung von Hautläsionen einhergehen. Weiterhin kann die Abgabe präziser Niveaus katalytischer Aktivität durch die kontrollierte Aktivierung stabiler, inaktivierter Enzym-Grundlösungen und -pulver kurz vor der Anwendung gewährleistet werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die Erfindung wird hierin, nur als Beispiel, unter Verweis auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben. Unter spezifischer Bezugnahme auf die Zeichnungen im Einzelnen wird betont, dass die gezeigten Besonderheiten nur als Beispiel und zum Zweck veranschaulichender Erörterung der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dienen und im Verlauf der Bereitstellung dessen vorgelegt werden, was für die nützlichste und leicht verständliche Beschreibung der Grundsätze und konzeptionellen Aspekte der Erfindung gehalten wird. In dieser Hinsicht wird kein Versuch unternommen, strukturelle Einzelheiten der Erfindung detaillierter darzulegen, als für ein grundlegendes Verständnis der Erfindung notwendig ist, wobei die Beschreibung, zusammengenommen mit den Zeichnungen, es den Fachleuten deutlich macht, wie die mehreren Formen der Erfindung in der Praxis ausgeführt werden können.
In den Zeichnungen ist:
1 eine Querschnittsansicht einer Vorrichtung in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
2 eine Querschnittsansicht einer Vorrichtung in Übereinstimmung mit einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
3 eine Querschnittsansicht einer Vorrichtung in Übereinstimmung mit noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
4 eine Querschnittsansicht einer Vorrichtung in Übereinstimmung mit noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
5 eine Querschnittsansicht einer Vorrichtung in Übereinstimmung mit einer zusätzlichen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
6 eine Querschnittsansicht einer Vorrichtung in Übereinstimmung mit noch einer zusätzlichen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
7 eine Querschnittsansicht einer Vorrichtung in Übereinstimmung mit noch einer zusätzlichen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
8 eine vergrößerte Querschnittsansicht des Proteaselösungsapplikators und Eingriffsmechanismus nach der vorliegenden Erfindung;
9 eine vergrößerte Unteransicht (der der Haut zugewandten Fläche) des Proteaselösungsapplikators, einschließlich der Proteaselösungs-Einlass- und Auslassöffnungen nach der vorliegenden Erfindung;
10 eine Querschnittsansicht einer Vorrichtung in Übereinstimmung mit den Lehren der vorliegenden Erfindung, die bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung auf Haut verwendet wurde; und sind die
11A-B Fotografien histologischer Schnitte unbehandelter Schweinehaut und mit einem Fluss proteolytischer Enzyme unter Verwendung der Applikatorvorrichtung von 10 nach der vorliegenden Erfindung behandelter Schweinehaut.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung betrifft Vorrichtungen zur kontinuierlichen topischen Anwendung einer ein proteolytisches Enzym enthaltenden Lösung. Spezifisch kann die vorliegende Erfindung zur gesteuerten Entfernung und Rückgewinnung von Zellen von der Oberfläche der Haut verwendet werden. Höchstspezifisch kann die vorliegende Erfindung zur nicht-chirurgischen, enzymatischen Behandlung und Biopsie von Hautläsionen, wie etwa Altersflecken, Melasmen, Keratosen, Naevi, Keloiden, hypertrophischen Narben, Schuppenflechte und Tätowierungen verwendet werden.
Grundsätze und Betrieb von Vorrichtungen zur gesteuerten Entfernung und Rückgewinnung von Zellen von der Oberfläche der Haut nach der vorliegenden Erfindung können unter Verweis auf die Zeichnungen und begleitenden Beschreibungen besser verstanden werden.
Vor der detaillierten Erläuterung mindestens einer Ausführungsform der Erfindung ist zu verstehen, dass die Erfindung in ihrer Anwendung nicht auf die Einzelheiten des Aufbaus und der Anordnung der in der folgenden Beschreibung ausgeführten oder in den Zeichnungen veranschaulichten Bauteile beschränkt ist. Die Erfindung ist zu anderen Ausführungsformen oder zur Praktizierung oder Durchführung auf verschiedene Arten und Weisen in der Lage. Es ist auch zu verstehen, dass die hierin eingesetzte Ausdrucksweise und Terminologie dem Zweck der Beschreibung dient und nicht als einschränkend angesehen werden sollte.
Wie in den 1-9 gezeigt, wird gemäß der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung bereitgestellt zum Fließenlassen und Sammeln einer Lösung, die eine wirksame Menge an Protease enthält, über einen und in Kontakt mit einem Hautbereich, hierin nachstehend als Vorrichtung 80 bezeichnet.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Vorrichtung 80 ist in 1 veranschaulicht. Die Vorrichtung 80 gemäß dieser Ausführungsform umfasst einen ersten Behälter 10 zum Enthalten einer Lösung, die eine wirksame Menge mindestens einer Protease enthält. Der erste Behälter 10 kann aus haltbarem, inertem, nicht-porösem Material zur wiederholten Verwendung, wie etwa Glas, Metall oder Kunststoff, konstruiert sein. Der erste Behälter 10 kann zwischen Anwendungen mittels dem Fachmann in der Technik bekannter Verfahren keimfrei gemacht werden, einschließlich durch feuchte oder trockene Hitze, oder durch die Verwendung antiseptischer Mittel, Gas oder Strahlung. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der erste Behälter 10 aus nicht- haltbarem Einwegmaterial konstruiert, wie etwa Metallfolie, Kunststoff- oder folienlaminiertem oder imprägniertem Karton oder Papier, zur Einmalanwendung, sterilisiert und versiegelt zur Lagerung. Die Abmessungen des ersten Behälters 10 können geeignet sein, um ein Volumen an Proteaselösung zu enthalten, das ausreichend ist, um einen einzigen enzymatischen Chirurgieeingriff zu vollziehen, oder kleiner, was ein Nachfüllen während des Eingriffs erforderlich macht. Der erste Behälter 10 hat typischerweise ein Volumen von etwa einem Liter, kann jedoch von 100 Millilitern bis zu mehreren Litern variieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Mischer 12 zum Mischen der Proteaselösung in Fluidkommunikation mit dem ersten Behälter 10, um eine inkonsistente Verteilung der Bestandteile der Proteaselösung zu verhindern. Der Mischer 12 kann äußerlich zu dem ersten Behälter 10 oder darin befindlich sein. Das Mischen kann durch eine Drehbewegung, wie etwa von einem Flügelrad oder einer Schaufel in einer Kammer, oder durch eine oszillierende Schaukel- oder Drehbewegung, wie etwa die einer schaukelnden oder rotierenden Plattform, vollzogen werden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der erste Behälter 10 in Fluidkommunikation mit einem Wärmeregler 14, zum Heizen und/oder Kühlen der Proteaselösung auf optimale Temperatur zur Aktivierung katalytischer Aktivität. Der Wärmeregler 14 kann eine Strahlungs- oder Konvektions-beheizte offene Kammer sein, welche den Fluss der Proteaselösung aufnimmt, oder bevorzugt ein erhitztes und/oder gekühltes Fluidbad oder massiver Block, der ein Fluidkommunikationselement aufnimmt, wie etwa Glas- oder Kunststoffschläuche, wodurch ein direkter Fluidkontakt des Proteasestroms mit dem Wärmeregler 14 eliminiert wird und das Risiko der Kontamination der Proteaselösung mit unerwünschten Verunreinigungen reduziert wird.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „in Fluidkommunikation" hauptsächlich auf die Fähigkeit selektiven oder nichtselektiven Transfers fluider und/oder semi-fluider Substanzen zwischen den spezifizierten Elementen. Ein solcher Transfer kann beispielsweise durch Kanäle, Schläuche, Membranen, Leitungen, Poren und/oder Kapillaren vollzogen werden.
In noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der erste Behälter 10 in Fluidkommunikation mit einem Filter 16, der zur Sterilisation der Proteaselösung vor deren Anwendung dient. Der Filter 16 ist bevorzugt ein verschlossenes (außer den Einlass- und Auslassöffnungen), sterilisiertes Gehäuse, das ein Filtrierelement enthält, das Teilchen ausschließt, die beispielsweise größer als 0,25 Mikron sind, wodurch einfache bakterielle Verunreinigung eliminiert wird. Ein solcher kommerziell erhältlicher Filter wird unter den Namen Complete Sterifil System (Sigma Chemical Company, Inc.) vertrieben. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der erste Behälter 10 in Fluidkommunikation mit einer Pumpe 18, die zum Fließenlassen der Proteaselösung von dem ersten Behälter 10 zu einem Applikator 24 (der hierin nachstehend detaillierter beschrieben ist) unter positivem Druck dient. Somit wird die Proteaselösung mit ausreichender Kraft zu der Behandlungsstelle zugeführt, um zusätzlich zu der enzymatischen Digestierung von Matrixproteinen eine mechanische „Abstreif"-Wirkung zu bewirken. Die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellte, neue Kombination einer gerichteten, mechanischen Kraft und enzymatischen Aufbrechung des Läsionsgewebes ermöglicht das Entfernen von Zellen und Gewebe von den behandelten Oberflächen. Die Pumpe 18 kann eine Luftpumpe, eine kolbengetriebene Fluidpumpe, Spritzenpumpe oder ein Flügelrad sein. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Pumpe 18 bevorzugt eine peristaltische Pumpe mit verstellbarer Geschwindigkeit, die durch Druck auf ein flexibles Fluidkommunikationselement wirkt, wodurch direkter Fluidkontakt mit der Proteaselösung und darauffolgendes Verunreinigungsrisiko eliminiert werden. Die verstellbare Geschwindigkeit ermöglicht weiterhin eine Kontrolle über die Intensität des auf die dermatologische Läsion angewendeten Flusses der Proteaselösung. Eine solche kommerziell erhältliche peristaltische Pumpe wird unter dem Namen Masterflex Economy (Aldrich Chemical Company, Inc.) vertrieben. In einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Fließenlassen der Proteaselösung durch Schwerkraft bewirkt, unterstützt durch Anheben des ersten Behälters 10 im Wesentlichen über andere Elemente, die damit in Fluidkommunikation stehen.
Der Applikator 24 ist mit dem ersten Behälter 10 in Fluidkommunikation und ist dazu gestaltet und konstruiert, den Fluss der Proteaselösung über den und in Kontakt mit dem Hautbereich, der behandelt wird, einzuschränken. Der Applikator 24 umfasst zwei Öffnungen, die Einlassöffnung 20 dient zur Aufnahme der Proteaselösung aus dem ersten Behälter 10, und die Auslassöffnung 22, die zum Entfernen der Proteaselösung und Zellen von der behandelten dermatologischen Läsion dient. Der Applikator 24 umfasst weiter eine ausgesparte, der Haut zugewandte Fläche 28, die von dem nach unten vorspringenden Außenrand des Applikators 24 umschlossen wird, wodurch ein umgrenztes, örtliches Behandlungsgebiet erzeugt wird, das ein proteolytischer Aktivität Aussetzen benachbarten Gewebes verhindert. Eine derzeit bevorzugte Ausführungsform des Applikators 24 ist in den 8 und 9 veranschaulicht. Die Einlassöffnung 20 und Auslassöffnung 22 stellen eine gerichtete Fluidbewegung für den Fluss der Proteaselösung bereit, wodurch ein mechanischer „Abstreif"-Effekt ermöglicht wird, der die enzymatische Unterbrechung der intrazellulären Matrix und das Entfernen von Zellen von der behandelten Läsionsfläche verbessert. Der Applikator 24 kann durch von anwesenden Bedienungspersonen oder dem behandelten Subjekt ausgeübtem Druck in Richtung auf die Haut, durch Gewicht, Klebeverbindung an benachbarte Hautflächen, die für den zu behandelnden Körperteil, der die Läsion trägt, geeignet sind, an der Hautfläche zum Eingriff kommen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Applikator 24 einen Eingriffsmechanismus 26, der zwei oder mehr flexible Elemente umfasst, die verstellbar verbunden sind, um das Umgreifen eines zylindrischen Körperteils (wie etwa Gliedmaß oder Torso) und das Anlegen von Druck in Richtung auf die Haut durch Anspannen zu gestatten, wie etwa einen Gurt mit Schnalle oder eine Befestigungsvorrichtung mit Zahnriemen.
Der Applikator 24 kann aus haltbarem, nicht-porösem Material konstruiert sein, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Glas, Metall, Kunststoff oder Gummi, und kann wiederverwendbar oder bevorzugt einmalverwendbar sein. Der Applikator 24 ist bevorzugt fähig zur Sterilisation durch Gas, Chemikalien, feuchte oder trockene Hitze, oder Strahlung und wird zur Anwendung versiegelt und sterilisiert geliefert. In einer alternativen Ausführung ist der Applikator 24 eine „Push-pull"-Kanüle, wie sie typisch in Gewebeperfusionstechniken eingesetzt wird [siehe beispielsweise Arancibia, S. (1987), „Push-pull" perfusion technic in neuroendocrinology. Ann. Endocrinol. (Paris) 48:; 410-18], die ein Einlassrohr umfasst, das innerhalb eines breiteren Auslassrohrs eingelassen ist, wodurch ein örtlich begrenzter Fluss von Proteaselösung erzeugt wird, der auf den Außendurchmesser des breiteren Auslassrohrs begrenzt ist.
Nach der vorliegenden Erfindung umfasst die Vorrichtung 80 bevorzugt weiter einen Zellsammler 30, der in Fluidkommunikation mit dem ersten Behälter 10 und Applikator 24 ist, und der zur Aufnahme der Proteaselösung und von der behandelten Läsionsfläche entfernter Zellen dient, und zum Vorsehen des Abfließens abzuführenden Fluids oder des Rückführens von Fluid durch die Vorrichtung 80. Gesammelte Zellen werden somit histologischer Untersuchung und/oder Zellkulturverfahrensweisen zugänglich gemacht. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Zellsammler 30 einen Filter 32 zum Sammeln und Abscheiden von Zellen, die von der dermatologischen Läsion entfernt wurden. Der Sammler 30 und Filter 32 werden vorzugsweise als steriles, modulares Einwegelement, wie etwa das Complete Sterifil System (Sigma, Israel), geliefert. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die spezifisch in 2 illustriert ist, wird die Abscheidung des Fluids und zellulärer Anteile in dem Zellsammler 30 durch die Durchlaufzentrifuge 40 bewerkstelligt. Durchlaufzentrifugierung verschafft eine erhöhte Flüssigkeitshandhabungskapazität, wobei der Proteaselösungsausfluss bei Eintreffen aus dem Applikator 24 rasch entfernt wird und Läsionszellen zur Untersuchung und/oder zum Kultivieren konzentriert werden.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist zu würdigen, dass durch den Zellsammler 30 gesammelte Läsionszellen während der Abscheidung von der Fluidkomponente des an dem Zellsammler 30 eintreffenden Proteaseflusses Proteaseaktivität ausgesetzt sind. Die Erhaltung der morphologischen und metabolischen Integrität und daher des diagnostischen Werts der Zellen kann zum Teil von der Einschränkung ihres länger anhaltenden Kontakts mit Protease abhängen. Somit ist in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung der Zellsammler 30 so konstruiert, dass er das Entfernen und/oder die Probeentnahme gesammelter Zellen mitten in dem Prozess zulässt. Dies kann durch periodisches Einstellen des Fließenlassens von Proteaselösung durch den Applikator 24, Entfernen des Filterelements von Filter 32, und Ersetzen durch ein frisches Filterelement bewerktstelligt werden. Alternativ kann der gesamte Zellsammler 30 während des Betriebs durch eine frische Zellsammlereinheit ersetzt werden. Wo die Durchlaufzentrifuge 40 das Mittel zur Zellsammlung ist, kann der Zentrifugenbetrieb periodisch eingestellt werden, um das Entfernen der gesammelten Zellen vom Zentrifugenrotor zuzulassen. Bevorzugter stellt die Zentrifuge einen kontinuierlichen Ablauf konzentrierter Zellen zur Untersuchung und/oder Zellkultur bereit.
Es ist anzumerken, dass der Fluidablauf aus dem Zellsammler 30 großenteils noch aktive Proteaselösung enthält, die frei von den Zell- und Gewebetrümmerfraktionen ist, die durch den Filter 32 und/oder die Zentrifuge 40 entfernt wurden, welche Lösung zur Wiederverwendung rückgeführt werden kann. Somit wird in einer bevorzugten Ausführungsform der Fluidablauf vom Zellsammler 30 wieder in den Fluss mindestens einer Proteaselösung „stromaufwärts" von Applikator 24 und Pumpe 18 eingebracht. Die Fluidkommunikation zwischen dem Zellsammlerabfluss und dem Strom von Proteaselösung kann durch eine Einwegventilverbindung bewerkstelligt werden, wodurch ein unidirektionales Fließen von Fluid hin zu dem Applikator 24 gewährleistet wird. Somit wird durch Wiederverwenden des Abflusses von Zellsammler 30 eine erhebliche Betriebsersparnis erzielt, wodurch das pro Behandlung erforderliche Proteaselösungsvolumen effektiv reduziert wird.
Zusätzliche Ausführungsformen der enzymatischen Chirurgievorrichtung 80 sind in den 3-7 abgebildet; in jedem Fall sind der Wärmeregler 14, Filter 16, die Pumpe 18, der Applikator 24 und Zellsammler 30 im Wesentlichen wie in den vorangehenden Abschnitten beschrieben.
In einer in 3 veranschaulichten Ausführungsform umfasst die Vorrichtung 80 zusätzlich zu dem ersten Behälter 10 einen zweiten Behälter 34 und einen dritten Behälter 36, die zum Enthalten einer ersten, im Wesentlichen inaktiven Proteaselösung beziehungsweise einer zweiten, Protease-Aktivierungslösung dienen. Somit kann die Proteaselösung vor der Verwendung in einer stabilisierten, inaktiven Form hergestellt und gelagert werden, wobei sie erst nach dem Vermischen mit der Aktivierungslösung in dem ersten Behälter 10 eine wesentliche katalytische Aktivität erhält.
In noch einer weiteren, in 4 veranschaulichten Ausführungsform umfasst die Chirurgievorrichtung 80 den ersten Behälter 10 und den zweiten Behälter 38 zum Enthalten einer ersten, im Wesentlichen inaktiven Protease beziehungsweise einer zweiten, aktivierenden Lösung. Somit kann in dem ersten Behälter 10 untergebrachtes pulverisiertes, lyophylisiertes und/oder anderes, nicht-wässriges, stabilisiertes Proteasepräparat bzw. -präparate bis zur Verwendung gelagert werden, wodurch Autolyse und Verlust an katalytischer Aktivität auf ein Mindestmaß zurückgeführt werden. Der erste 10 und zweite 38 Behälter stehen in Fluidverbindung, wodurch sie bei Mischen ihrer Inhalte durch den Mischer 12 eine katalytisch aktive Proteaselösung ergeben.
Die 5-7 bilden die enzymatische Chirurgievorrichtung 80 ab, die dazu gedacht ist, vorbereitete Behälter oder Ampullen mit Protease, Proteaselösung und/oder Proteaseaktivierungslösung aufzunehmen. In einer in 5 veranschaulichten Ausführungsform ist ein Aufnahmebehälter 42 dazu gestaltet, den modularen Behälter oder die Ampulle 44 aufzunehmen, der bzw. die katalytisch aktive Proteaselösung enthält, Fluidkommunikation mit dem Applikator 24, dem Zellsammler 30 und zusätzlichen „stromabwärts" befindlichen Elementen der Vorrichtung 80 zu bewerkstelligen. Somit kann die Vorrichtung 80 mit standardisierter, zuvor hergestellter, gelagerter Proteaselösung bzw. -lösungen betrieben werden, wodurch die Einfachheit der Anwendung und Genauigkeit der abgegebenen Proteaseaktivität erhöht und das Risiko der Verunreinigung behandelter Hautflächen reduziert wird.
Wie hierin in der Beschreibung und in dem nachstehenden Anspruchsabschnitt verwendet, verweisen die Begriffe „Behälter" und „Ampulle" austauschbar auf einen separaten, abgeschlossenen Behälter, der zur Erstellung von Fluidkommunikation mit anderen Behältern, Aufnahmebehältern oder Vorrichtungen in der Lage ist. Solche Behälter oder Ampullen enthalten typischerweise Fluide oder fluidartige Substanzen und können zum präzisen Eingriff durch einen komplementären Aufnahmebehälter oder Gehäuse gestaltet sein. Versiegelte Behälter oder Ampullen verschaffen praktische, standardisierte Mittel zur Herstellung und Lagerung aktiver Lösungen und Reagentien zum Betrieb, beispielsweise, der enzymatischen Chirurgievorrichtung 80.
In noch einer anderen, in 6 veranschaulichten Ausführungsform nimmt der erste Aufnahmebehälter 46 den ersten modularen Behälter bzw. Ampulle 48 auf, der bzw. die inaktivierte, stabilisierte Proteaselösung enthält, während der zweite Aufnahmebehälter 50 den zweiten modularen Behälter bzw. Ampulle 52 aufnimmt, der bzw. die eine proteaseaktivierende Lösung enthält. Der erste Aufnahmebehälter 46 und der zweite Aufnahmebehälter 50 stehen in Fluidkommunikation mit einer Mischkammer 54, die zur Bereitstellung von Fluidkontakt und Mischen der Inhalte des ersten Behälters 48 und zweiten Behälters 52 dient, wodurch die stabilisierte, inaktivierte Protease aktiviert wird. Ein Mischer 12, wie vorangehend beschrieben, kann in der Mischkammer 54 angeordnet werden.
In einer anderen, in 7 veranschaulichten Ausführungsform nimmt der erste Aufnahmebehälter 48 den ersten modularen Behälter bzw. Ampulle 60 auf, der bzw. die stabilisiertes, inaktiviertes Proteasepräparat in Pulver-, lyophylisierter und/oder anderer nicht-wässriger Form enthält. Der zweite Aufnahmebehälter 62 nimmt den zweiten Behälter bzw. Ampulle 64 auf, der bzw. die die Aktivierungslösung enthält. Der erste Aufnahmebehälter 58 und zweite Aufnahmebehälter 62 sind in Fluidkommunikation mit dem Mischmechanismus 56, wodurch ein Kontakt zwischen und effektives Dispergieren des nicht-wässrigen Proteasepräparats in der Aktivierungslösung vorgesehen wird.
Die Fähigkeit von Proteasen, die Integrität von Dermalgewebe sanft zu unterbrechen, hat zur therapeutischen Verwendung proteolytischer Enzyme als Adjunkt oder Alternative zu mechanischer oder laserchirurgischer Behandlung von Hautläsionen geführt. Damit solche enzymatische Behandlung die oben erwähnten Nachteile chirurgischer, elektrochirurgischer, kryochirurgischer und laserchirurgischer Verfahren (Schmerzen, Narbenbildung, traumatischer Stress, Hyperpigmentierung und Zerstörung benachbarten Gewebes) überwindet, ist es wünschenswert, dass das proteolytische Verfahren eine breite Vielfalt von in Hautläsionen vorgefundenen Proteinen rasch und gründlich hydrolysiert; auf physiologischem pH-Wert und Temperatur funktioniert; mit zusätzlichen Therapien (z.B. Anästhetika, Reinigungsmitteln, topischen Antibiotika) kompatibel ist; und nicht die normale Wundheilung stört oder Hauteinpflanzung kompliziert. Zusätzlich ist es wichtig, Mittel zur Beibehaltung und Erhaltung der Lebensfähigkeit der isolierten, entfernten Zellen zur histologischen Untersuchung oder Zellkultur vorzusehen; örtlich begrenzte und umgrenzte Anwendung der Protease zu gestatten und für Stabilität der Enzymrezepturen gegenüber den Auswirkungen von pH-Wert, Temperatur und Autoproteolyse zu sorgen. Diese und andere günstige Erwägungen werden, erstmals in einer integrierenden Herangehensweise, von der vorliegenden Erfindung angegangen. Somit umfassen von der vorliegenden Erfindung bereitgestellte Nutzen sanfte enzymatische Gewebsentfernung, verbessert durch mechanische „Abstreif"-Wirkung des örtlich gerichteten Proteaseflusses, überlegene Schmerzreduzierung und Wundheilung, die durch den Einschluss von Anästhetika, Koagulantien/Antikoagulantien und Antibiotika in der Proeaselösung verschafft werden, und Verfügbarkeit der entfernten Hautzellen von den behandelten Läsionen zur histologischen Untersuchung und/oder Zellkultur. Zusätzlich gewährleisten die Steuerung von Temperatur, pH-Wert und Durchflussmenge des Stroms der Proteaselösung, sowie das Vorsehen des vor Ort Aktivierens stabilisierter Enzympräparate, die Abgabe präziser, effektiver Niveaus katalytischer Aktivität an die Läsionsfläche.
Proteasen werden im Debridement nicht-lebensfähigen Gewebes (6) und Konditionierung von durch CO₂-Laserchirurgie (4) und Alterung beschädigter Haut breit angewendet ( US-Patent 5,976,556 an Norton et al.), unter Ausnutzung der Fähigkeit des Enzyms, Proteinkomponenten extrazellulärer Matrix zu digestieren, ohne gesundes Gewebe zu beschädigen. Die Auswahl geeigneter Enzympräparate, Anwendungsverfahren und Behandlungsumfangs haben die Entfernung von Trümmerstückchen und nicht-lebensfähigem Gewebe hervorgehoben. Da Collagen, Elastin, Fibrinin und Proteoglycan in der extrazellulären Matrix der Haut überwiegen und bei abnormalen Bedingungen, wie etwa Keloiden, Narben, Warzen und Fibrosen, von noch größerer Bedeutung sind, sind Enzyme des Typs Collagenase, Elastase und Hyaluronidase, und Kombinationen davon, am meisten zur Behandlung dermatologischer Läsionen eingesetzt worden. Die Behandlungsverfahren bei diesen Enzymen sind jedoch auf topische Anwendung und intradermale Injektion begrenzt gewesen.
Somit lehrt Pinnell ( US-Patent 4,645,668 ) die Behandlung und Verhütung von Akne und hypertrophischen Narben, Keloiden, Falten und Zellulitis durch wiederholte intradermale Injektionen von Proteasen, prinzipiell Collagenase, mit zusätzlicher Hyaluronidase. Der Autor erzielte eine erhebliche Auflösung der meisten behandelten Läsionen, was die Effizienz von Proteasedigestierung von Matrixgewebe andeutet, und berichtete von wenigen, falls überhaupt, negativen Auswirkungen. Es waren jedoch wiederholte intradermale Injektionen, über einen Zeitraum von Wochen, erforderlich, um die gewünschten Effekte zu erzielen. Zusätzlich zu dem Unbehagen und langwierigen Charakter solch eines Behandlungsplans wird kein Zurückbehalten von Zellen von den Läsionen ermöglicht, was herkömmliche, chirurgische Biopsieverfahren vor der enzymatischen Behandlung erforderlich macht. Gleichermaßen lehren de Faire et al. ( US-Patent 5,958,406 ) die Behandlung einer Vielzahl von Zuständen, die mit Zellhaftung zusammenhängenden Prozessen zusammenhängen, mit multifunktioneller Enzym-Krillprotease, die Chymotrypsin, Trypsin, Elastase, Collagenase und Exo-Peptidase-Aktivität umfasst. Die Behandlung dermaler und innerlicher Läsionen durch topische, parenterale, Aerosol-, systemische, intramuskuläre und intradermale Abgabe der Proteasezusammensetzungen wird angesprochen. Die intradermale Injektion von Proteasen wird für die Behandlung von Narben- und Keloidläsionen empfohlen. Somit ist das Sammeln oder Zurückbehalten von Zellen aus dem behandelten Gebiet nicht möglich, und, wie bei anderen dermatologischen Enzymbehandlungsprotokollen, wird keine Steuerung der Proteaseaktivität nach der Verabreichung ermöglicht.
Topische Anwendung oder Injektion von Proteasen bietet wenig Kontrolle über das in situ verbleibende Niveau katalytischer Aktivität, wobei autoproteolytische und normale dermale lytische und saure Prozesse unvorhersagbaren Abbau verursachen. Obwohl viele Protokolle für topische oder intradermale Abgabe von Proteasen von individuellen, empirischen Ergebnissen zur Ermittlung der Behandlungsdauer abhängen, ist vorgeschlagen worden, dass topische Behandlungsanwendung saurer Proteasen, die mit dem normalen pH-Wert menschlicher Haut kompatibel sind, eine größere Kontrolle über aktive Enzym-Dosierung gewährleisten kann ( US-Patent 5,976,556 an Norton et al.). In der vorgenannten Erfindung, wie auch bei anderen topischen Proteaseanwendungen, verbleibt keine ständige Kontrolle der Enzymaktivität nach der Behandlung.
Ein Verfahren zur Entfernung von Zellen von einem Hautbereich eines mit einer dermatologischen Läsion behafteten Subjekts kann durch Fließenlassen einer Lösung, die eine wirksame Menge mindestens einer Protease enthält, über den und in Kontakt mit dem Hautbereich bewerkstelligt werden, wodurch die Zellen von dem Hautbereich des Subjekts entfernt werden. Durch Kombinieren der enzymatischen Digestierung intrazellulärer Matrixproteine und mechanisches Aufbrechen der Läsionsfläche durch eine Fluidkraft werden Zellen des behandelten Hautbereichs herausgelöst und können durch den Strom mindestens einer Proteaselösung entfernt werden. Nicht-enzymatisches Debridement, unter Einsatz eines topischen Präparats, das Tanninsäure und Aloe vera enthält, ist zur Behandlung von Läsionen wie etwa Keratosen, Sommersprossen, Hautgeschwüren, Papillom, Flecken und gutartigen Naevi vorgeschlagen worden ( US-Patent 5,420,114 an Clodman et al.). Weiterhin bietet die Anwendung der Proteaselösung mittels Fließenlassen auf die Läsionsfläche eine präzise Lokalisierung und Steuerung der Größenordnung und Dauer enzymatischer Aktivität, durch Manipulation von Enzymkonzentrationen, pH-Wert, Temperatur, Hydrophobizität/Hydrophilizität der Enzymlösungen, Intensität des Fließens, Dauer und Ort des Kontakts mit der Proteaselösung während der Behandlung. Wie vorangehend beschrieben, stellt die enzymatische Chirurgievorrichtung 80 der vorliegenden Erfindung solche diverse Steuerung der Proteasebehandlung beispielsweise durch den Mischer 12, den Wärmeregler 14, die Pumpe 18 und den Applikator 24 bereit.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Protease" auf jedes biologisch aktive Molekül, typischerweise ein Polypeptid, das enzymatische Peptidhydrolaseaktivität, einschließlich Endopeptidase- und/oder Exopeptidaseaktivität, besitzt.
Die Protease ist, jedoch nicht beschränkt auf, Vibriolysin, Krillprotease, Chymotrypsin, Trypsin, Collagenase, Elastase, Dipase, Proteinase K, multifunktionelle Clostridium-Protease und Bacillus subtilis-Protease. Diese stellen üblicherweise in therapeutischen Verfahren eingesetzte Proteasen dar, haben ein geringes Auftreten unerwünschter Nebenwirkungen gezeigt und sind in reiner, gereinigter oder gentechnisch erzeugter Form komerziell erhältlich [Esperase, Subtilisin A, Savinase, Durazyme (Novo Nordisk Bioindustry Japan K.K.), Protease N „Amano", Protease S „Amano" (Amano Pharmaceutical K.K.), Bioprase (Nagase Seik-agaku Kogyo K.K.) und Purified Collagenase (Advance Biofactures, Lynbrook, NY)]. Multifunktionelle Clostridium-Protease und Krillprotease sind durch einen Fachmann leicht herzustellen ( US-Patente 6,416,626 an Markert et al. beziehungsweise 5,958,406 an de Faire et al.). Andere Proteasen, die ausgewählt werden können, sind Papain, Bromelain, Plasminogenaktivator, Plasmin, Mast zellenprotease, lysosomale Hydrolase, Streptokinase, Pepsin und gleich welche oder alle Pilz-, bakteriellen, pflanzlichen oder tierischen Proteasen. Die Proteaselösung kann eine einzige Protease oder bevorzugt eine Mehrzahl von Proteasen enthalten. Die Proteaselösung kann auch ein oder mehrere Glycosamonoglycane abbauendes Enzym enthalten, wie etwa, jedoch nicht beschränkt auf, verschiedene lysosomale Hydrolasen, die gewisse Endoglycosidasen (Heparanase und CTAP bauen Heparansulfat und zu einem geringeren Ausmaß Heparin ab, und Hyaluronidase aus Schaf- oder Rinderhoden bauen Hyaluorinsäure und Chondroitinsulfat ab), vreschiedene Exoglycosidasen (z.B. β-Glucoronidase), und Sulfatasen (Iduronatsulfatase), die generell in Abfolge wirken, um die verschiedenen Glucosaminoglycane abzubauen. Bakterielle Lyasen, wie etwa Heparinase I, II und III von Flavobacterium heparinum spalten heparinartige Moleküle, Chondroitinase ABC von Proteus vulgaris, AC von Arthrobacter aurescens oder Flavobacterium heparinum, B und C von Flavobacterium heparinum bauen Chondroitinsulfat ab.
Herkömmliche mechanische und nicht-mechanische Verfahren zur Behandlung und Entfernung von Hautläsionen, wie etwa Rasierklingen- oder Skalpell-Exzision, CO₂-Laserchirurgie, Kryochirurgie, Elektrokauterisierung und Elektroablation gehen einher mit Schmerzen, Stresstrauma, Blutungen, Narbenbildung, Verunreinigung, Hyperpigmentierung und Aufbrechen benachbarten und darunterliegenden Gewebes. Die sanftere proteolytische Digestierung von Hautläsionen und Wunden hat gezeigt, dass sie ein überlegenes Heilen solcher Läsionen verschafft, bei vermindertem Auftreten von Narbenbildung, Blutungen und Verunreinigung. In der Tat werden Proteasepräparate üblicherweise zur Förderung der Heilung und Verringerung der Narbenbildung von CO₂-Laserchirurgiewunden verwendet (4).
Von noch größerem Vorteil ist dann die Kombination zusätzlicher topischer, nicht-Protease-Substanzen, die in der Lage sind, unerwünschte Nebenwirkungen zu verringern. Schmitt et al. ( US-Patent 4,122,158 ) lehrt die Anwendung eines Biopolymers, das Protease, antibakterielle, antibiotische und antifungale Substanzen enthält, zur Behandlung und Verhütung von Narbenbildung und Verunreinigung bei Brandwunden. Sogar die potentiell mit der enzymatischen Entfernung von Zellen von Hautläsionen zusammenhängenden schwachen Grade von Blutung, Schmerz und Narbenbildung können durch das gleichzeitige Anwenden geeigneter Substanzen mit der Proteaselösung gelindert werden. Die Enzymchirurgievorrichtung 80 der vorliegenden Erfindung ist gut geeignet zur Abgabe von Lösungen, die zusätzliche aktive Substanzen enthalten, die mit der Proteaseaktivität vereinbar sind, entweder durch ihren Einschluss in die Lösung oder Protease in dem ersten Behälter 10, zweiten Behälter 34 oder 38, dritten Behälter 36, Behälter oder Ampulle 44, ersten Behälter oder Ampulle 48, zweiten Behälter 52, ersten Behälter oder Ampulle 60 und/oder zweiten Behälter oder Ampulle 64. Somit kann die Proteaselösung mindestens eines von einem Lokalanästhetikum, einem Koagulans und einem Antikoagulans enthalten. Die Proteaselösung kann auch eine wirksame Menge eines Antibiotikums enthalten.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Lokalanästhetikum" auf jedes innerhalb eines vorgeschriebenen Bereichs (z.B. nicht systemisch) angewendeten Mittels, das eine erhebliche Verringerung oder Inhibierung der Aktivität nociceptiver Substanzen, Rezeptoren und/oder Nervenbahnen bewirkt. Nicht-einschränkende Beispiele üblicherweise verwendeter Lokalanästhetika sind Cyclo-Oxygenaseinhibitoren (z.B. Ibuprofen, Indomethacin und Ketorolac), 5-Hydroxytryptaminrezeptorantagonisten (z.B. Amytryptylin), Bradykininrezeptorantagonisten und Histaminrezeptorantagonisten.
Wie hierin verwendet, soll eine „wirksame Menge" von Antibiotika die Menge von Antibiotikum umfassen, um mindestens 50 %, bevorzugt 75 % und meistbevorzugt 100 % des Mikrobenwachstums in einer dermatologischen Läsion des Subjekts, das behandelt wird, erheblich zu verhindern und zu inhibieren, wobei solche wirksame Menge durch einen Fachmann festgelegt wird.
Eine Vorkonditionierung der dermatologischen Läsionsfläche kann eine überlegene Effizienz anschließender Proteasebehandlung verschaffen. Normale Epidermis besteht aus Lagen abgestorbener Schuppenzellen, die eine effektive mechanische Barriere verschaffen, die die darunterliegenden lebensfähigen Hautlagen schützen. Yu et al. ( US-Patente 4,105,783 und 4,363,815 ) beschreiben die Entfernung abgestorbener Zellen von dem keratinreichen Stratum corneum mit keratinolytischem, entschuppenden Mittel, wie etwa Hydroxy- oder Ketosäuren niedriger Molmasse, und deren Ester. Solche Exfoliation der Haut wird auch durch Kosmetikpräparate erzielt, die dermabrasive Mittel, Linderungsmittel, Detergentien, Adstringentien und Hauterweichungsmittel enthalten. Somit kann die Oberfläche der Läsion durch Fließenlassen von Reinigungs-, Erweichungs-, adstringierender, Exfoliations- oder dermabrasiver Mittel vorbehandelt werden. Die Vorrichtung 80 ist für diese Anwendung gut geeignet, wobei sie nur das Vorsehen einer geeigneten Vorbehandlungslösung in dem ersten Behälter 10, zweiten Behälter 34 oder 38, dritten Behälter 36, Behälter oder Ampulle 44, ersten Behälter oder Ampulle 48, zweiten Behälter 52, ersten Behälter oder Ampulle 60 und/oder zweiten Behälter oder Ampulle 64 erfordert.
Es wird gewürdigt werden, dass Autolyse und Verlust funktioneller Enzymkonzentration von katalytisch aktiven Präparaten von Proteasen einen erheblichen Nachteil der therapeutischen Verabreichung von Enzymen in topischen, injizierten und/oder anderen Zusammensetzungen darstellt. Die aktive Haltbarkeit der Protease ist begrenzt, und eine präzise Steuerung der Enzymaktivität an der Verabreichungsstelle ist praktisch unerreichbar, sobald die Injektion oder topische Anwendung vollzogen sind. Eine Anzahl von Erfindungen hat die Lagerung biologisch aktiver Substanzen, einschließlich Enzymen, in Kontakt mit Substanzen oder unter Bedingungen, die ihre native Aktivität begrenzen, effektiv Inaktivität und Stabilisation, vorgeschlagen, bis sie mit einer im Wesentlichen adäquaten Menge Aktivierungssubstanz oder Bedingungen, die ausreichen, um die biologische Aktivität wiederherzustellen, in Kontakt gebracht werden. Beispielsweise lehren Edens et al. ( US-Patent 6,117,433 ) die Stabilisierung biologisch aktiver Substanzen, wie etwa Vitamine, Enzyme und Antibiotika, in hohen Konzentrationen durch Herstellung in wasseraktivitätssenkenden Mitteln, wie etwa Salzen, Polyolen, Maskierungsmitteln, wie etwa EDTA, Phyat oder Gluconat, oder Antioxidantien, wie etwa Sulfiten, Glutathion, Cystein oder Ascorbinsäure. Kristallisierte Zusammensetzungen biologisch aktiver Substanzen, typischerweise stabiler als wässrige Präparate, werden mit viskos machenden Substanzen gemischt, um die Ausfällung zu verlangsamen und die Homogenität der biologisch aktiven Zusammensetzung zu gewährleisten. Die Offenbarung beschreibt weiter ein Spendersystem für solche stabilisierten Rezepturen, wobei die biologisch aktive Substanz durch Verdünnung mit einer wässrigen Zusammensetzung aktiviert wird. Das US-Patent 5,409,546 an Nakagawa et al. beschreibt die Stabilisierung von Vibrio-Protease für Kontaktlinsenreinigerzusammensetzung durch Zusatz von Polyolen und die Spezifikation eines definierten Temperaturbereichs (Zimmertemperatur bis etwa 58 °C), worin das Enzym die katalytische Aktivität behält. Rowan et al. ( US-Patent 5,106,621 ) lehrt die Wiederherstellung katalytischer Aktivität einer Pflanzencysteinprotease zur Behandlung von Brandwunden durch Zusatz von Cystein zur Regeneration von Thiogruppen. Keines der vorgenannten Beispiele betrifft jedoch die Verabreichung von Proteasen zur Behandlung lebender Zellen, noch verschaffen sie eine andauernde, präzise Steuerung der Aktivierung der katalytischen Aktivität an der Einsatzstelle.
Somit kann die Protease kurz vor dem Fließenlassen der Lösung, die die wirksame Menge der mindestens einen Protease enthält, über den und in Kontakt mit dem behandelten Hautbereich aktiviert werden. Das Verfahren, wobei die Protease aktiviert wird, kann bewirkt werden durch: (a) Halten der Protease auf einer ersten Temperatur, wobei die Protease im Wesentlichen katalytisch inaktiv ist, und Erhitzen und/oder Abkühlen der mindestens einen Protease auf eine zweite Temperatur, wobei die mindestens eine Protease katalytisch aktiv ist; und/oder (b) Vorsehen der Protease in Pulverform und Mischen des Pulvers mit einer Lösung, worin die Protease katalytisch aktiv ist; und/oder (c) Vorsehen der Protease in einer ersten Lösung, worin die Protease im Wesentlichen katalytisch inaktiv ist, und Mischen der ersten Lösung mit einer zweiten Lösung, um eine gemischte Lösung zu erhalten, worin die Protease katalytisch aktiv ist. Die zweite Lösung kann sich von der ersten Lösung in Bezug auf pH-Wert, Ionenkonzentration, freie Metalle-Konzentration, Hydrophilizität und Hydrophibizität unterscheiden. Beispielsweise bildet 1 die enzymatische Chirurgievorrichtung 80 in Fluidkommunikation mit dem Wärmeregler 14 ab, wodurch das Füllen des ersten Behälters 10 mit Protease auf sub-optimalen, stabilisierenden Temperaturen ermöglicht wird, wobei die katalytische Aktivität durch Anheben der Temperatur der Proteaselösung nur kurz vor der Anwendung an der Läsionsstelle wiederhergestellt wird. Typischerweise sind Enzyme Substanzen, die bei Temperaturen unter 10 °C, bevorzugt 4 °C, im Wesentlichen inaktiviert sind. Die Aktivierung von katalytischer Enzymaktivität kann durch Erhitzen und/oder Kühlen der Proteaselösung auf optimale Temperatur, typischerweise im Bereich von 30 bis 40 °C, bevorzugt 37 °C, vollzogen werden.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Hydrophilizität" auf die polare Natur einer Lösung oder Verbindung, wobei er deren Tendenz, von anderen Lösungen oder Verbindungen, die erhebliche Dipolmomente aufweisen, angezogen zu werden, andeutet. Gleichermaßen bezieht sich der Begriff „Hydrophobizität" auf die nicht-polare Natur einer Mischung oder Lösung, wobei er deren Tendenz, von anderen Mischungen oder Lösungen, die erhebliche Dipolmomente aufweisen, abgestoßen zu werden oder damit unvermischbar zu sein, andeutet.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Inaktivierung" auf die reversible oder irreversible Unterdrückung oder Verlust katalytischer Aktivität, beispielsweise, Inaktivierung, die proteolytische Enzyme unfähig zur Katalysierung der Hydrolyse von Peptidbindungen macht.
Es ist zu würdigen, dass viele Enzyme gem dem physiologischen Milieu, an das sie angepasst sind, als sauer, neutral oder basisch bezeichnet werden. Beispielsweise weisen die Verdauungsenzyme Pepsin und Chymotrypsin, die im sauren Mileu des Magens katalytisch aktiv sind, niedrige (pH-Wert 3-5) pH-Optimalwerte auf. Im Milieu der Haut aktive Enzyme haben typischerweise pH-Optimalwerte dichter an dem milderen Säuremantel der Haut (pH-Wert 5,5-6,5). Somit kann die Autolyse der Protease der vorliegenden Erfindung vor der Anwendung durch Halten der Protease auf einem nicht-optimalen pH-Wert inhibiert werden, und Mischen der Enzymlösung mit einer Aktivierungslösung, wodurch der optimale pH-Wert effektiv kurz vor der Verabreichung an der behandelten Läsion erzielt wird. Somit können bei einer Vorrichtung, wie in den 3 und 6 veranschaulicht, inaktive stabilisierte Proteaselösungen in dem zweiten Behälter 34 und/oder ersten Behälter oder Ampulle 48 in nicht-optimalem pH-Wert hergestellt werden, und die Aktivierungslösung des dritten Behälters 36 und/oder zweiten Behälters oder Ampulle 52 stellt beim Mischen kurz vor der Verabreichung an der behandelten Läsion den optimalen pH-Wert für katalytische Aktivität wieder her. Ein optimaler pH-Wert für katalytische Aktivität kann gewählt werden, der sich dem mild sauren normalen pH-Wert von Säugerhaut annähert. Gleichermaßen können Proteaselösungen durch Chelierung von katalytisch kritischen Metallionen, wie etwa Ca⁺⁺ oder Mg⁺⁺, beispielsweise mit EDTA inaktiviert und stabilisiert werden. Die Aktivierung kann dann durch Vorsehen einer Konzentration des kritischen Metallions in der Aktivierungslösung erzielt werden, die ausreicht, um nach dem Mischen effektive und/oder optimale Metallionkonzentrationen zu erzielen. Alternativ, oder zusätzlich, können Proteasen durch Herstellung in Lösungen mit verringerter Wasserverfügbarkeit stabilisiert und inaktiviert werden, wie beispielsweise in hohen Salz- und Polyolkonzentrationen. Die Wiederherstellung der katalytischen Aktivität kurz vor dem Fließenlassen der Proteaselösung an der Behandlungsstelle wird durch ausreichende wässrige Verdünnung durch die Aktivierungslösung vollzogen. Es ist anzumerken, dass aus verschiedenen Spezies (z.B. Meeres-, thermophile, halophile, euthermische, Säuger-, kryophile Spezies usw.) extrahierte Enzyme oft breit variierende und artspezifische Optimalwerte von pH, Temperatur, Metall-prosthetischer Gruppe und Ionenkonzentration, und polare Wechselwirkungen (Hydrophobizität/Hydrophilizität) aufweisen.
Protease kann in einer nicht-fluiden Pulverform vorgesehen werden und kurz vor der Anwendung mit einer Aktivierungslösung gemischt werden, um katalytische Aktivität zu erzielen. Die Funktionsfähigkeit getrockneter Enzympräparate ist in der Technik geläufig, und viele Proteasen ausgezeichneter Reinheitsgrade sind in lyophilisierter Form kommerziell erhältlich, beispielsweise Proteinase K (Sigma-Aldrich, Israel), Chlostridopeptidase A (Sigma-Aldrich) und Elastase (Fluka Chemical Company Inc.). Es ist jedoch oft schwierig, pulverisierte, lyophilisierte oder granulierte Enzympräparate in Verdünnerlösungen homogen zu dispergieren. Somit können in einer Vorrichtung, wie in 4 veranschaulicht, ein pulverisiertes oder lyophilisiertes Proteasepräparat bzw. -präparate in dem ersten Behälter 10 gehalten werden, in dem Mischer 12 kurz vor der Abgabe an der Behandlungsstelle mit Aktivierungslösung aus dem zweiten Behälter 38 in Kontakt gebracht und zu Homogenität gemischt werden. Alternativ kann die pulverisierte oder lyophilisierte inaktivierte Protease in einer Vorrichtung, wie in 7 veranschaulicht, in einem separaten Behälter oder Ampulle 80 vorgesehen sein und wird durch die Wirkung des Mischmechanismus 56 kurz vor der Abgabe an der Behandlungsstelle mit der in dem Behälter bzw. der Ampulle 64 vorgesehenen Aktivierungslösung in Kontakt gebracht und darin dispergiert. Somit können die Vorteile stabilisierter, nicht-wässriger pulverisierter oder lyophilisierter Proteasepräparate verwirklicht werden, während die Nachteile schlechten Auflösens in Verdünnern und unpräziser Steuerung der Enzymaktivität bei Abgabe vermieden werden.
Es ist zu würdigen, dass katalytische Aktivität von Enzymen durch Aktivatoren und Inhibitoren modifiziert werden kann. Eine solche Art der Regulierung der Enzymaktivität ist reversible Inhibierung, bewirkt durch die Wechselwirkung von Substratanaloga oder Regelmolekülen, die Veränderungen in Substratbindung und/oder Enzymkinetik verursachen, wodurch die katalytische Aktivität effektiv reduziert wird [siehe beispielsweise Enzymes (Kapitel 3), in: Molecular Cell Biology 1986: Darnell, J., Lodish, H. und Baltimore, D., Hrsg., Scientific American Books, Inc.]. Da solche reversible Inhibierung enzymatischer Aktivität konzentrationsabhängig ist, wird die Wiederherstellung katalytischer Aktivität durch Inkontaktbringen des inhibierten Enzympräparats mit geeigneten Volumina von Verdünner, der frei von Inhibitoren ist, erzielt. Somit kann eine Stabilisierung der Proteaselösungen durch den Einschluss einer wirksamen Menge reversiblen Enzyminhibitors/-inhibitoren bewerkstelligt werden. Die Aktivierung des stabilisierten Proteasepräparats wird durch Verdünnung mit adäquaten Volumina von Aktivierungslösung, die frei von Inhibitor und/oder Inhibitoraktivität ist, bewerkstelligt.
Gleichermaßen sorgt die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung für eine präzise und genaue Steuerung der Beendigung enzymatischer Aktivität an der Behandlungsstelle und in den gesammelten Zellen. Durch Manipulation jedes der vorgenannten Verfahren (pH-Wert, Ionenkonzentration, freie Metall-Konzentration, Hydrophilizität/Hydrophobizität, Wasserverfügbarkeit und reversible Inhibition) bewerkstelligte Inaktivierung von Proteaseaktivität kann durch, anschließend an das Fließenlassen von Protease, Anwendung wirksamer Mengen proteasefreier Lösung(en), die beispielsweise Metallchelatbildner, Puffer mit nicht-optimalem pH-Wert und reversible Proteaseinhibitoren enthalten, bewrkstelligt werden.
Es ist zu würdigen, dass viele dermatologische Läsionen abnormale Hautzellen und intrazelluläre Matrix enthalten. Beispielsweise werden psoriatische Plaques von abnormalem Ephithelzellenumschlag verursacht, das Collagen von Keloiden und hypertropischen Narben ist durch abnormale Vernetzung gekennzeichnet, Warzen sind das Ergebnis von Papovavirus-Infektionen von Epidermiszellen, und verschiedene Typen oft hyperpigmentierter, hyperplastischer Zellen umfassen die vielen Arten von Naevi (Muttermalen), Keratosen und Altersflecken. Während das proteolytische Aufbrechen der intrazellulären Matrix mit anschließender Resorption des nicht-lebensfähigen Gewebes der Gegenstand früherer enzymatischer Verfahren war, werden bei der vorliegenden Erfindung die abnormalen Zellen dermatologischer Läsionen entfernt, wodurch eine überlegene Behandlung dieser Hauterkrankungen bewerkstelligt wird. Somit kann ein kontrolliertes Fließenlassen von Proteaselösung angewendet werden, um Erkrankungen der Hautoberfläche zu behandeln, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Warzen, Altersflecke, Melasmen, Akne, Keratosen, Naevi, Keloide, hypertrophische Narben, Schuppenflechte und Tätowierungen.
Es ist zu würdigen, dass die Kombination mechanischen „Abstreifens" und enzymatischer Einwirkung eines Stroms von Proteaselösung auf der Hautoberfläche zur Entfernung von Hautzellen und Trümmerstückchen zu ästhetischen Zwecken geeignet ist. Somit kann gesteuertes Fließenlassen einer Proteaselösung zur kosmetischen Behandlung ästhetisch unerwünschter Teile der Hautoberfläche verwendet werden.
Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung kann auch zur Behandlung und/oder Entfernung von Zellen von der Oberfläche von Gewebe in einem Patienten, oder von während chirurgischer Eingriffe zeitweilig freiliegender innerer Gewebe verwendet werden. Markert et al. ( US-Patent 6,146,626 ) beschreiben die Entnahme von Zellen zur Gewebskultur von inneren Organen, einschließlich Leber, Milz, Herz und Skelettmuskel, Binde- und Nervengewebe, Drüsengewebe, Endothel und andere, die durch Digestierung mit Clostridium-Collagenase und -Elastaseenzymen bewerkstelligt werden. De Faire et al. ( US-Patent 5,958,406 ) beschreiben die Behandlung und Verhütung von Infektion in inneren Organen und Körperhohlräumen durch Injektion oder Anwendung von Präparaten, die multifunktionelle Krill-Proteaseaktivität enthalten.
Ein Verfahren zum Entfernen und Sammeln von Zellen von einer Oberfläche eines lebensfähigen Gewebes kann durch Fließenlassen einer Lösung, die eine wirksame Menge mindestens einer Protease enthält, über die und in Kontakt mit der Oberfläche, wodurch Zellen von der Oberfläche des lebensfähigen Gewebes entfernt werden, und Sammeln der Zellen bewerkstelligt werden. Das Fließenlassen von Proteaselösung kann mittels eines offenen chirurgischen Einschnitts auf die Gewebeoberfläche angewendet werden. Proteasebesprühung, Entfernung und/oder Probeentnahme zur Biopsie einer Gewebsfläche oder -flächen können mittels der oben erwähnten „Push-pull"-Kanüle in einem geschlossenen, faseroptisch gelenkten chirurgischen Eingriff vorgesehen werden. Beispiele solcher Eingriffe sind Arthroskopie, Zystoskopie, Endoskopie, Cholecystoskopie, Laparoskopie, Colonoskopie und Myringoskopie.
Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff „Behandlung" die Verringerung oder Linderung mindestens eines mit der behandelten Erkrankung zusammenhängenden oder dadurch verursachten Symptoms. Beispielsweise kann die Behandlung die Verringerung mehrerer Symptome einer Erkrankung oder die vollständige Beseitigung einer Erkrankung sein.
Die Bedeutung des Erhaltens von Zellen von dermatologischen Läsionen ist nicht zu überschätzen. Behandlung ohne Ermitteln einer genauen Diagnose kann die Läsion entfernen, wird jedoch unnötige Narbenbildung, Rezidive und finanzielle Härten hervorrufen. Von besonderer Bedeutung ist die Ermittlung von Zelltyp(en), die Naevi und Keratosen umfassen, aufgrund des weitverbreiteten Vorkommens dieser Läsionen bei Erwachsenen und ihrem Potential zur bösartigen Umwandlung (Sosis, A., Benign Tumors of the Skin, in: Skin Diseases: Diagnosis and Management in Clinical Practice (1982), Binnick, S.A., Hrsg., Addison-Wesley Publishing Co., USA, 166-230). Wie vorangehend erwähnt, haben frühere Verfahren nicht-chirurgischer Behandlung von Hautläsionen, wie etwa Laserchirurgie, Elektrochirurgie und chemische oder enzymatische Ablation, keinerlei Mittel zum Erhalten von Zellen von den Läsionen bereitgestellt, was die Verwendung herkömmlicher chirurgischer Biopsietechniken zur genauen Diagnose erforderlich machte.
Es wird gewürdigt, dass das Begrenzen der enzymatischen Aktivität auf einen Strom von Proteaselösung, der auf die Läsionsoberfläche gerichtet ist, statt einer topischen Anbringung von Cremes oder intradermaler Injektion, die Gelegenheit zum Zurückbehalten der von der behandelten Läsion entfernten Zellen bietet. Somit kann ein Verfahren zum Entfernen und Sammeln von Zellen von einem Hautbereich eines mit einer dermatologischen Läsion behafteten Subjekts durch Fließenlassen einer Lösung, die eine wirksame Menge mindestens einer Protease enthält, über den und in Kontakt mit dem Hautbereich, wodurch die Zellen von dem Hautbereich des Subjekts entfernt werden; und Sammeln der Zellen bewerkstelligt werden. Die Produkte von Proteasedigestierung an der Behandlungsstelle, wobei die Stelle durch den Außenumfang der der Haut zugewandten Fläche 28 von Applikator 24 definiert ist, können durch die Auslassöffnung 22 entfernt werden und werden zu dem Zellsammler 30 befördert, der in Fluidkommunikation mit dem Applikator 24 ist. Das Abscheiden des Fluids und der Zellkomponenten von dem Ausfluss von Proteaselösung von Applikator 24 kann durch Filtrieren vollzogen werden, oder, in einer anderen Ausführungsform, durch Durchlaufzentrifugierung, wie vorangehend beschrieben. Kleinvolumige Durchlaufzentrifugen, die üblicherweise zur Abscheidung von Blutkomponenten verwendet werden (beispielsweise die Ortho-PAT^® System, Haemonetics Corporation, Braintree, MA), sind kommerziell erhältlich und werden leicht durch Fluidkommunikation an eine Vorrichtung der vorliegenden Erfindung angepasst, wie in 2 veranschaulicht. Alternativ kann die Zellsammlung durch Rückhalten an einer Kolonne bewerkstelligt werden, die in der Lage ist, Zellen durch Wechselwirkung mit proteinartigen, Poly- und/oder Oligosaccharid- oder anderen Zelloberflächenkomponenten zu adsorbieren.
Bekannte Zellabscheidungen beziehen mehrere Techniken ein, wovon manche auf spezifischen Affinitäten basiert sind. Andere Zellabscheidetechniken stützen sich auf mehr zufällige Mechanismen, wie etwa Einfangen von Zielzellen in Trägern verschiedener Herkunft und Struktur. Siehe beispielsweise Wigzell und Anderson, J. Exp. Med. 129: 23-36, 1969; Rutishauser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 70, 1973; Wysocki und Sato, Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 2844-2848, 1978; Antoine et al. Immunochem. 15, 1987. Siehe auch US-Patent 6,008,040 an Datar. Das grundlegende Verfahren der Affinitätsabscheidung bringt das Erzeugen von Kontakt zwischen abzuscheidenden Zellgemischen und einer Trägermatrix mit sich, um es den Zielzellen zu ermöglichen, sich vorzugsweise an bzw. in dem Träger anzuheften, zu binden, adsorbieren oder gefangen zu werden, wonach dann die unerwünschten Zellen weggewaschen werden, oder umgekehrt. Spezifische Affinitätstechniken verwenden monoklonale Antikörper, um spezifische Marker an den Membranen von Zellen zu erkennen und die Zielzellen „anzuziehen", um sich an die monoklonalen Antikörper zu binden. Spezifische Affinitäts "anziehungen" von Zielzellen können auch durch hydrophobe oder hydrophile Wechselwirkungen, Metallaffinitäten, Ionenaustauscher und dergleichen auftreten. Somit kann die Zellsammlung bewerkstelligt werden durch Passierenlassen des Ausflussstroms von dem Applikator 24 durch den Zellsammler 30 und Inkontaktbringen mit einer Vorrichtung, z.B. einer zellbindenden Kolonne, die zum Rückhalten der Zellen und deren Abscheiden von dem Ausflussstrom in der Lage ist.
Eine Zusammensetzung, die mindestens eine Protease und mindestens eine Substanz enthält, gewählt aus: einem Lokalanästhetikum, einem Koagulans und einem Anti-Koagulans, kann vorgesehen sein. Beispielsweise kann eine pharmazeutische Zusammensetzung einen pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff und, als aktive Bestandteile, mindestens eine Protease und eines oder mehrere von folgenden ein Lokalanästhetikum, ein Koagulans und ein Antikoagulans umfassen. Die Zusammensetzung kann weiter eine wirksame Menge eines Antibiotikums enthalten.
Wie hierin verwendet, ist der Begriff „Koagulans" definiert als jedes Mittel, das die Gerinnung oder Koagulation von Blut fördert, das in sicherer Weise an einer dermatologischen Läsion angewendet werden kann. Ein Beispiel eines solchen koagulierenden Materials, das Gelatine, Thrombin und Kalzium umfassdt, ist in dem US-Patent 6,045,570 an Epstein et al. beschrieben. Gleichermaßen verweist der Begriff „Antikoagulans" auf jedes Mittel, das die Gerinnung oder Koagulation von Blut verzögert, inhibiert oder verhindert, das in sicherer Weise an einer dermatologischen Läsion angewendet werden kann, wie etwa Heparine, Cumarine oder andere Mittel, die thrombolytische Aktivität besitzen.
Der Ausdruck „wirksame Menge" soll die Menge der mindestens einen Protease umfassen, die ausreicht, um das Fortschreiten einer dermatologischen Läsion des Subjekts, das behandelt wird, ausreichend zu entfernen oder erheblich zu reduzieren. Eine wirksame Menge kann auf einer individuellen Basis ermittelt werden und ist zumindest teilweise auf der Erwägung der Schwere der zu behandelnden Symptome und der Aktivität der ausgewählten spezifischen Protease begründet. Somit kan eine wirksame Menge der mindestens einen Protease durch einen Fachmann in der Technik ermittelt werden, unter Einsatz solcher Faktoren, wie vorangehend beschrieben, unter Anwendung von nicht mehr als routinemäßigem Experimentieren im Gesundheitswesen.
Wie hierin in der Beschreibung und in dem nachstehenden Anspruchsabschnitt verwendet, bezieht sich der Ausdruck „pharmazeutisch akzeptabler Träger" auf ein pharmazeutisch akzeptables Material, Zusammensetzung oder Trägerstoff, wie etwa ein flüssiger Füllstoff, Verdünner, Lösungsmittel oder Verkapselungsmaterial, das beim Tragen oder Befördern einer Verbindung bzw. Verbindungen der vorliegenden Erfindung in oder zu dem Subjekt beteiligt ist, sodass sie ihre beabsichtigte Funktion erfüllen kann. Jeder Träger muss „akzeptabel" in dem Sinn sein, dass er mit den anderen Inhaltsstoffen der Rezeptur kompatibel ist und dem Patienten nicht schadet. Einige Beispiele von Materialien, die als pharmazeutisch akzeptable Träger dienen könenn, umfassen: Zucker, wie etwa Laktose, Glukose und Sucrose; Stärken, wie etwa Maisstärke und Kartoffelstärke; Cellulose und deren Derivate, wie etwa Natriumcarboxymethylcellulose, Ethylcellulose und Celluloseacetat; pulverisierter Tragant; Malz; Gelatine; Talk; Öle, wie etwa Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Distelöl, Sesamöl, Olivenöl, Maisöl und Sojaöl; Glykole, wie etwa Propylenglykol; Polyole, wie etwa Glyzerin, Sorbitol, Mannitol und Polyethylenglykol; Ester, wie etwa Ethyloleat und Ethyllaurat; Agar agar; Puffermittel, wie etwa Magnesiumhydroxid und Aluminiumhydroxid; Algininsäure; Fruchtsäuren, pyrogen-freies Wasser; isotonische Salzlösung; Ringer-Lösung; Ethylalkohol; Phosphatpufferlösungen und andere in pharmazeutischen Rezepturen eingesetzte nicht-toxische kompatible Substanzen.
Die oben erwähnten pharmazeutischen Zusammensetzungen können als Lösungen rezepturiert sein, die typischerweise ein pharmazeutisch akzeptables wässriges oder organisches Lösungsmittel beinhalten. Die Ausdrücke „pharmazeutisch akzeptables wässriges Lösungsmittel" und „pharmazeutisch akzeptables organisches Lösungsmittel" verweisen auf ein Lösungsmittel, das in der Lage ist, die aktive Verbindung darin dispergiert oder gelöst aufzuweisen, und akzeptable Sicherheitseigenschaften besitzt (z.B. Irritations- und Sensitivierungmerkmale). Wasser ist ein typisches wässriges Lösungsmittel. Beispiele für geeignete organische Lösungsmittel umfassen: Propylenglykol, Butylenglykol, Polyethylenglykol (200-600), Polypropylenglykol (425-2025), Glycerol, 1,2,4-Butantriol, Sorbitolester, 1,2-6-Hexantriol, Ethanol, Isopropanol, Butandiol und Mischungen davon. Diese Lösungen können 0,01 % bis etwa 50 % der aktiven Verbindung enthalten, bevorzugter etwa 0,1 % bis etwa 20 %; und etwa 1 % bis etwa 80 % eines akzeptablen wässrigen oder organischen Lösungsmittels, bevorzugter etwa 1 % bis etwa 40 %.
Zusätzliche Gegenstände, Vorteile und neue Eigenschaften der vorliegenden Erfindung werden einer Person mit gewöhnlichem Fachwissen in der Technik bei Überprüfung der folgenden Beispiele, die nicht einschränkend sein sollen, deutlich. Zusätzlich findet jede der verschiedenen Ausführungsformen und Aspekte der vorliegenden Erfindung, wie hierin vorangehend umrissen und wie in dem nachstehenden Anspruchsabschnitt beansprucht, experimentelle Unterstützung in den nachfolgenden Beispielen.
BEISPIELE
Es wird nun auf die nachfolgenden Beispiele Bezug genommen, die zusammen mit den obigen Beschreibungen die Erfindung auf nicht einschränkende Weise veranschaulichen.
BEISPIEL 1
Enzymatische Epidermisentfernung
Gestaltung und Fabrikage einer Applikatorvorrichtung zur Behandlung eines Hautoberflächengebiets von 9 mm Durchmesser: Eine Applikatorvorrichtung zur Behandlung von Hautbereichen von 9 mm Durchmesser wurde gestaltet, wie in 10 beschrieben. Die Applikatorvorrichtung wurde in einer Werkstatt hergestellt, mit speziellem Nachdruck auf Herstellung der mit der Haut in Kontakt kommenden Fläche aus Silikon zur Gewährleistung von Flexibilität und wirksamer Abdichtung.
Kurzgefasst, unter Bezugnahme auf 10, umfasst die in diesem Experiment verwendete Applikatorvorrichtung ein Gehäuse 100 mit einem Einlass 102 und einem Auslass 104. Durch den Einlass 102 eintretendes Fluid wird durch eine erste Röhrenstruktur 106 zu einer Behandlungszone 107 geleitet, die von einer etwas konischen Silikonstruktur 114 mit einer der Haut zugewandten Öffnung 108 von 9 mm Durchmesser definiert wird. Eine innerhalb der ersten Röhrenstruktur 106 positionierte zweite Röhrenstruktur 110 wird verwendet, um Fluid von der Behandlungszone 107 zum Auslass 104 zu leiten. Ein O-Ring 112 wird zur Begrenzung des Flusses auf die beabsichtigte Richtung innerhalb der ersten Röhrenstruktur 106 verwendet. Ein Schraubenmechanismus 116 gestattet ein Verstellen der Höhe der Öffnung 118 der zweiten Röhrenstruktur 110 in Bezug zu der der Haut zugewandten Öffnung 108 der Behandlungszone 107. Eine Pumpe (nicht dargestellt) wird zum Lenken von Fluid von einem Behälter (nicht dargestellt) in den Einlass 102 verwendet. Ein Ablaufrohr (nicht dargestellt) wird zum Abführen von Fluid von Auslass 104 verwendet.
Enzymatische Epidermis-Entfernung: Unter Verwendung der Applikatorvorrichtung von 10 wurde eine Enzymlösung, die Collagenase (1 mg/ml, Sigma Kat. Nr. C0130) und Thermolysin (0,5 mg/ml, Sigma Type x, Kat. Nr. P1512) in 0,1 M PBS-Puffer, pH-Wert 7,5, enthielt, auf einer frisch von einem erwachsenen weiblichen großen weißhäutigen (1 Jahr alt, 90 kg) Schwein erhaltenen Hautprobe angebracht, die auf einer flachen Halterung montiert und mit 70 % (v/v) wässrigem Ethanol vorgereinigt war, bei einer Durchflussmenge von 3-4 ml/Stunde für 3 Stunden auf Zimmertemperatur angewendet.
Anschließend an diese Behandlung und Ablösung der Applikatorvorrichtung wurde makroskopisch vollständige Haarentfernung von dem behandelten Gebiet, einhergehend mit der Bildung glatter, kraterartiger Entfernung von Hautvolumen beobachtet. Die Hautprobe wurde unmittelbar in neutral gepuffertem Formalin (4 % v/v) 48 Stunden lang fixiert. Die Haut wurde dann mit destilliertem Wasser gespült, in Alkohol dehydriert und in Paraffin eingebettet. Gefärbte histologische serielle Schnitte (Dicke 0,8 μm) wurden dann in einer Ebene parallel zur Epidermis-Dermis-Richtung, auf Objektträgern montiert, mit Haematoxillin-Eosin gefärbt und unter dem Lichtmikroskop untersucht. Die Untersuchung der Ränder des behandelten Gebiets deutete klar enzymatische Epidermisentfernung von dem behandelten Gebiet (11B) verglichen mit unbehandelter Haut (11A) an.
Es wird gewürdigt, dass gewisse Merkmale der Erfindung, die deutlichkeitshalber im Kontext separater Ausführungsformen beschrieben sind, auch in Kombination in einer einzigen Ausführungsform vorgesehen sein können. Umgekehrt können verschiedene Merkmale der Erfindung, die der Kürze halber im Kontext einer einzigen Ausführungsform beschrieben sind, auch separat oder in jeder geeigneten Unterkombination vorgesehen werden.
Obwohl die Erfindung in Zusammenhang mit verschiedenen Ausführungsformen davon beschrieben worden ist, ist es evident, dass den Fachleuten in der Technik viele Alternativen, Modifikationen und Variationen deutlich sein werden. Dementsprechend ist beabsichtigt, all solche Alternativen, Modifikationen und Variationen, die in die Reichweite der beigefügten Ansprüche fallen, mit einzuschließen. Zusätzlich soll das Zitieren oder Identifizieren einer Referenz in dieser Anmeldung nicht als Einräumen dessen interpretiert werden, dass solche Referenz als Stand der Technik für die vorliegende Erfindung verfügbar ist.
LISTE DER ANGEFÜHRTEN REFERENZEN

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Claims

Vorrichtung (80) zum Entfernen von Zellen von einem Hautbereich eines Subjekts, umfassend: (a) einen ersten Behälter (10), der eine Lösung enthält, die eine wirksame Menge mindestens einer Protease enthält; und (b) einen Applikator (24) in Fluidkommunikation mit dem ersten Behälter (10) zur Einschränkung des Fließens der Proteaselösung über den und in Kontakt mit dem Hautbereich, wobei der Applikator (24) umfasst: (i) eine Einlassöffnung (20) zur Aufnahme der Proteaselösung von dem ersten Behälter; (ii) eine mit der Einlassöffnung (20) in Wirkverbindung stehende erste Schlauchstruktur zum Lenken des Fließens der Proteaselösung von der Einlassöffnung (20) zu einer Behandlungszone des Hautbereichs, sodass fließende Proteaselösung enzymatisch und mechanisch das Entfernen von Zellen von dem Hautbereich verusacht; gekennzeichnet durch: (iii) eine in der ersten Schlauchstruktur positionierte zweite Schlauchstruktur zum verstellbaren Lenken der fließenden Proteaselösung und der entfernten Zellen weg von der Behandlungszone, wobei ein mit der zweiten Schlauchstruktur in Wirkverbindung stehender Schraubmechanismus die Einstellung der Höhe der Öffnung der zweiten Schlauchstruktur in Bezug zu einer der Haut zugewandten Öffnung der Behandlungszone gestattet; und (iv) eine mit der zweiten Schlauchstruktur in Wirkverbindung stehende Auslassöffnung (22) zum Entfernen der fließenden Proteaselösung und der entfernten Zellen aus der zweiten Schlauchstruktur, wodurch die Zellen von dem Hautbereich des Subjekts entfernt werden.
Vorrichtung von Anspruch 1, weiter eine Pumpe (18) zum Bewirken des Fließens der Proteaselösung von dem ersten Behälter zu dem Applikator (24) umfassend.
Vorrichtung von Anspruch 1, wobei das Fließen der Proteaselösung von dem ersten Behälter zu dem Applikator (24) durch Schwerkraft bewirkt wird.
Vorrichtung von Anspruch 1, weiter einen Thermoregler (14) zum Erwärmen und/oder Kühlen der Proteaselösung umfassend.
Vorrichtung von Anspruch 1, weiter einen Mischer (12) zum Mischen der Proteaselösung umfassend.
Vorrichtung von Anspruch 1, weiter einen Filter (16) zum Filtrieren der Proteaselösung umfassend.
Vorrichtung von Anspruch 1, weiter umfassend: einen zweiten Behälter (34), der die mindestens eine Protease in einer ersten Lösung enthält, worin die mindestens eine Protease im Wesentlichen katalytisch inaktiv ist; und einen dritten Behälter, der eine Proteaseaktivierungslösung enthält, wobei die Aktivierungslösung die katalytische Aktivität der mindestens einen Protease beim Mischen mit der ersten Lösung aktiviert; wobei der zweite Behälter (34) und der erste Behälter (10) in Fluidkommunikation mit dem dritten Behälter sind.
Vorrichtung von Anspruch 1, weiter einen zweiten Behälter (34) zum Enthalten einer Proteaseaktivierungslösung umfassend, wobei die Aktivierungslösung die katalytische Aktivität der mindestens einen Protease beim Mischen damit aktiviert.
Vorrichtung von Anspruch 1, weiter einen Zellsammler (30) in Fluidverbindung mit dem Applikator (24) zur Aufnahme der fließenden Proteaselösung und der entfernten Zellen von der Auslassöffnung (22) umfassend.
Vorrichtung von Anspruch 9, wobei der Zellsammler (30) einen Filter (16) zum Sammeln der entfernten Zellen von dem Hautbereich des Subjekts umfasst.
Vorrichtung von Anspruch 9, wobei der Zellsammler (30) eine Durchlaufzentrifuge (40) zum Sammeln der entfernten Zellen von dem Hautbereich des Subjekts umfasst.
Vorrichtung von Anspruch 1, weiter einen Eingreifmechanismus (26) zum Angreifenlassen des Applikators (24) an dem Hautbereich des Subjekts umfassend.
Vorrichtung von Anspruch 1, weiter einen Aufnahmebehälter zur Aufnahme des ersten Behälters (10) umfassend.
Vorrichtung von einem der Ansprüche 1 bis 6 oder 8 bis 13, wobei: der erste Behälter (48) eine erste Lösung enthält, die eine wirksame Menge mindestens einer Protease in einer im Wesentlichen katalytisch inaktiven Form enthält; wobei die Vorrichtung weiter umfasst: einen ersten Aufnahmebehälter (46) zur Aufnahme des ersten Behälters (48); einen zweiten Behälter (52), der eine Proteaseaktivierungslösung enthält, wobei die Aktivierungslösung die katalytische Aktivität der mindestens einen Protease beim Mischen mit der ersten Lösung aktiviert; einen zweiten Aufnahmebehälter (50) zur Aufnahme des zweiten Behälters (52); eine Mischkammer (54) in Fluidkommunikation mit dem ersten (48) und zweiten (52) Behälter, wenn sie von dem ersten (46) und dem zweiten (50) Aufnahmebehälter aufgenommen sind, wobei die Mischkammer zum Mischen der ersten Lösung und der Aktivierungslösung dient, sodass die mindestens eine Protease katalytisch aktiv in Lösung wird; wobei die Einlassöffnung (20) die aktive Proteaselösung von der Mischkammer erhält.
Vorrichtung von Anspruch 14, wobei die mindestens eine Protease in einer nicht-wässrigen, katalytisch inaktiven Form vorliegt.