JP2002510965A - 呼吸欠損細胞におけるポリペプチド合成法 - Google Patents

呼吸欠損細胞におけるポリペプチド合成法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、(a)細胞の呼吸欠損突然変異体へ、(i)呼吸欠損を相補する、1個以上の第1の核酸配列、及び(ii)ポリペプチドをコードしている、第2の核酸配列を導入する工程;(b)これらの第1及び第2の核酸配列を含む細胞を、培地において、第1及び第2の核酸配列の発現に適した好気的条件下で、培養する工程;及び、(c)この細胞の培養培地からポリペプチドを単離する工程を含む、ポリペプチド合成法に関する。本発明は、更に呼吸欠損突然変異細胞の遺伝子の破壊法に関する。本発明は、更に呼吸欠損突然変異細胞、及びこのような突然変異細胞を得る方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 呼吸欠損細胞におけるポリペプチド合成法 発明の背景 発明の分野 本発明は、呼吸欠損突然変異細胞におけるポリペプチド合成法に関する。本発 明は同じく、呼吸欠損突然変異細胞における遺伝子の破壊法にも関する。更に本 発明は、呼吸欠損突然変異細胞及びこのような突然変異細胞を得る方法に関する 。 関連技術の説明 宿主細胞において組換えDNA分子を選別し、そして維持するための様々な方法 がある。ひとつの方法は、クローン化された野生型遺伝子による栄養要求性突然 変異体の補完(complementation)に関する。しかしながら、例えば、やはり栄養 要求性を補完するアミノ酸または核酸が存在する複合培地における補完DNAの維 持は困難である。別の方法は、野生型受容細胞中で選択することができるマーカ ー遺伝子、特に抗生物質耐性遺伝子のような耐性マーカー遺伝子を使用するもの である。抗生物質耐性遺伝子の使用においては、一般に培地中で高価な抗生物質 を使用し、そしてその後に所望の生成物からそれを除去することが必要である。 更なる方法は、組換えDNAクローニングベクターによって担持される遺伝子によ って抑制される致死的染色体標識の使用に関する。この方法は、細菌はうまく適 用されているが、他の宿主、例えば真菌に適用することは難しい。更にこの方法 では、転写活性化配列が起動する組換えDNA分子の発現を妨害することのないよ うなプラスミド担持リプレッサー遺伝子 の使用が必要である。 宿主細胞中に組換えDNA分子を有する発現ベクターの不安定性は、組換えDNA分 子の一貫した高レベルの発現に関する重大な問題点を引き起こしている。形質転 換体を継代培養する際に、この組換えDNA分子によってコードされた生成物の収 量は、劇的かつ予想できないほどに減少することがある。このことは、特に組換 えDNA分子の発現が、宿主細胞に悪い影響を及ぼす場合に、例えば発現された生 成物が細胞毒性である場合などに当てはまる。組換えDNA分子を含む形質転換体 の微生物培養は、培地中の実質的に全ての微生物細胞がこの組換えDNA分子を含 有するように選択されかつ維持されることが望ましい。 当該技術分野において、培養時の形質転換体の高レベルの発現および遺伝的安 定性の両方を保証する他の選択及び維持システムが特に必要である。 米国特許第4,902,620号は、ヘム生合成酵素(5-アミノレブリン酸シンターゼ) 遺伝子をヘム欠損細胞へ導入し5-アミノレブリン酸を生成することを開示してい る。 本発明の目的は、遺伝子の異種性発現において組換え細胞を選択しかつ維持す る新規方法を提供することである。 発明の要約 本発明は、以下の工程を含む、ポリペプチドの製造に関する: (a) 細胞の呼吸欠損突然変異体に、1個以上の第1の核酸配列及び第2の核酸配 列を含む核酸構築物を導入し、ここでこの第1の核酸配列は、発現時に呼吸欠損 を補完し、かつ第2の核酸配列は該ポリペプチドをコードしており; (b) 前述の第1及び第2の核酸配列を含む細胞を、第1及び第2 の核酸配列の発現に適した好気的条件下で、培地において培養し;そして (c) この細胞の培養培地から該ポリペプチドを単離する。 本発明は同じく、呼吸欠損突然変異細胞における遺伝子を破壊する方法にも関 する。本発明は更に、呼吸欠損突然変異細胞及びこのような突然変異細胞を得る 方法に関する。 図面の簡単な説明 図1は、プラスミドpSE04の制限地図を示す。 図2は、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)IFO4177の5-アミノ レブリン酸シンターゼ遺伝子を含む4.2kbゲノム断片の制限地図を示す。 図3は、アスペルギルス・オリザエIFO 4177の5-アミノレブリン酸シンターゼ 遺伝子のヌクレオチド配列及び推定されたアミノ酸配列を示す(各々、配列番号: 1及び2)。 図4は、プラスミドpAJOO5-1の制限地図を示す。 図5は、アスペルギルス・オリザエIFO 4177のポルホビリノーゲンシンターゼ (porphobilinogen synthase)遺伝子のヌクレオチド配列及び推定されたアミノ 酸配列を示す(各々、配列番号:3及び4)。 図6は、pSE52の構築を示す。 図7は、プラスミドpJaL394の制限地図を示す。 図8は、hemA欠損対立遺伝子のヌクレオチド配列及び推定されたアミノ酸配列 を示す(配列番号:15及び16)。 発明の詳細な説明 本発明は、以下の工程を含む、ポリペプチドの合成法に関する: (a) 細胞の呼吸欠損突然変異体に、1個以上の第1の核酸配列及び第2の核酸配 列を含む核酸構築物を導入し、ここで第1の核酸配列は、発現時に呼吸欠損を補 完し、そして第2の核酸配列は該ポリペプチドをコードしており; (b) 前述の第1及び第2の核酸配列を含む細胞を、第1及び第2の核酸配列の発現 に適した好気的条件下で、培地において培養し;そして (c) この細胞の培養培地から該ポリペプチドを単離する。 本発明の方法は、細胞が増殖のために酸素を必要とすることが唯一の必要条件 であるような、いずれかの適切な工業的発酵培地において細胞を選別するための 酸化的リン酸化の使用を基にしている。呼吸欠損突然変異細胞への1個以上の第1 の核酸配列の導入は、その呼吸欠損性を克服し、その結果、酸素存在下で増殖す る細胞の能力を基に選択することを可能にする。従って、1個以上の第1の核酸配 列を含むこれらの突然変異細胞は、培地中で培養することができ、その結果前述 の導入がうまくいかなかった突然変異細胞から選別することができる。 用語“酸化的リン酸化”とは、電子が、一連の電子伝達体により、NADHから、 FADH2に、さらにO2へと移動されたことによる、ATP形成を意味する。NADH及びFA DH2は、解糖、脂肪酸酸化、及びクエン酸回路において形成され、かつ各分子は 高い移動電位を伴う電子対を有するので、エネルギーが豊富な分子である。酸化 的リン酸化は、例えばミトコンドリア内膜又は原核細胞の形質膜に存在する呼吸 機構によって実行される。この呼吸機構は、シトクロムのような多くの電子伝達 体を含んでいる。これらの伝達体を介してのNADH又はFADH2からO2への順を追っ た電子の移動は、プロトン駆動力を生じるミトコンドリアマトリックスのプロト ンポンプによる送出に繋 がっている。ATPは、酵素複合体により、ミトコンドリアマトリックスへとプロ トンが戻される際に合成される。O2が最終の電子受容体として利用されるこのAT P合成過程は、呼吸と称される。これらの伝達体を介して電子を移動することが できない微生物が、呼吸欠損体である。 電子は、NADHからO2へと、いわゆるNADH-Qレダクターゼ(NADHデヒドロゲナー ゼとも称される)、シトクロムレダクターゼ、及びシトクロムオキシダーゼであ る、3種の大きいタンパク質複合体の鎖を介して移動される。これらの酵素の電 子を伝達する基は、フラピン、鉄−硫黄クラスター、ヘム、及び銅イオンである 。電子は、NADH-Qレダクターゼからシトクロムレダクターゼへと、還元型ユビキ ノンにより伝達される。ユビキノンは更に、FADH2からシトクロムレダクターゼ へと電子を伝達する。シトクロムcは、小さいタンパク質であり、シトクロムレ ダクターゼからシトクロムオキシダーゼへと電子を往復させる。 この第1の反応は、その補欠分子族として密に結合したフラビンモノヌクレオ チド(FMN)を含むフラビンタンパク質である、NADH-QレダクターゼによるNADHの 酸化である。2個の電子が、NADHからFMNへと移動され、還元型FMNH2を生成する 。その後これらの電子は、FMNH2から、NADH-Qレダクターゼ中の第2の補欠分子族 である一連の鉄−硫黄クラスターへと移される。NADH-Qレダクターゼ中の鉄−硫 黄クラスターの電子は、次に、補酵素Q(ユビキノンとしても公知)へと往復させ られる。ユビキノンは、長いイソプレノイド鎖(tail)を有するキノン誘導体であ り、これは1個の電子の受け取りによりユピキノールへと還元される。ユビキノ ールは同じくFADH2からの電子の侵入点でもある。 その後ユビキノールは、その2個の電子のうちの1個を、シトク ロムレダクターゼ中の鉄−硫黄クラスターへと移動する。シトクロムは、補欠分 子族としてヘムを含む電子伝達タンパク質である。シトクロムレダクターゼの機 能は、ユビキノールからシトクロムcへの電子の移動を触媒することである。シ トクロムレダクターゼは、シトクロムb及びc1、並びに鉄−硫黄クラスタータン パク質を含んでいる。シトクロムb、c1及びcの補欠分子族は通常ヘムとして公知 の鉄−プロトポルフィリンIXである。シトクロムbにおいては、ヘムは、タンパ ク質と共有結合しないが、シトクロムc及びc1においては、ヘムは、チオエステ ル結合を介してタンパク質へと共有結合している。シトクロムa及びa3は、ホル ミル基がメチル基の1個で置換されていて、かつ炭化水素鎖がビニル基の1個で置 換されている点で、シトクロムc及びc1のヘムとは異なる、ヘムAと称される異な る鉄−ポルフィリン補欠分子族を有している。ユビキノールは、その2個の電子 のうちの1個を、このレダクターゼ中の鉄−硫黄複合体へと移動し、これは次に 順次シトクロムc1及びcへと往復され、該複合体から外へと運ばれる。シトクロ ムbは、ユビキノールを鉄−硫黄クラスターと相互作用させることができる。 シトクロムa及びa3から形成されるシトクロムオキシダーゼは、還元型シトク ロムcから、最終受容体である分子酸素への電子の移動を触媒する。 本発明の方法において、呼吸欠損突然変異細胞は、呼吸過程の1種以上の段階 の欠損をもたらす1種以上の遺伝子が欠損している細胞か、あるいは、1個以上の 遺伝子の破壊により呼吸欠損となっている細胞かのいずれかであることができる 。これらの遺伝子は、電子伝達鎖の成分であるいずれかのタンパク質をコードし ている遺伝子、もしくは、フラビンの生合成、キノンの生合成又はヘムの生合成 に関る酵素をコードしている遺伝子を含むが、これらに限定され るものではない。 呼吸欠損突然変異体は、機能的シトクロム類が欠如しているために、酸化的リ ン酸化を行う能力を有しない。従って破壊は、絶対好気性生物の増殖を完全に排 除する。破壊後、この呼吸欠損突然変異体は、本質的に、当該欠損を補完しかつ 酸化的リン酸化を回復するために適当な物質が補充された培地においてのみ良好 に増殖するような栄養要求体である。 例えば、この呼吸欠損突然変異細胞は、更に、ヘム生合成遺伝子の活性化を媒 介しているアクチベーターをコードしている遺伝子のような、酸化的リン酸化に おいて重要な役割を果たす調節遺伝子又は関連経路の遺伝子が変更又は破壊され たような細胞でもある。例えば、サッカロミセス・セレビシエのコプロポルフィ リノーゲンオキシダーゼ遺伝子の誘導は、ヘム−欠損下でのCyp1pによって媒介 される活性化を介して一部生じる(Amilletらの論文、Current Genetics、28:503 -511(1995))。この遺伝子の破壊は、ヘム−欠損しており、そして最終的に呼吸 欠損であるような細胞を生じ得る。 更に、この突然変異細胞は、遺伝子の核酸残基の挿入、欠失又は置換のような 、当該技術分野において周知の方法を用いて、酸化的リン酸化に重要な遺伝子を 破壊することにより構築することができる。例えば、これらの遺伝子のひとつは 、相同領域の重複(duplication)を形成し、そしてこれらの重複領域の間にベク ターDNAを取りこむような、遺伝子に対し相同の核酸断片を含む組込みプラスミ ド(integrative plasmid)を該遺伝子へ挿入することにより破壊される。これは 、挿入されたベクターが、そのコード領域から該遺伝子プロモーターを分離する か、または非機能的遺伝子産物を生じるようにコード配列を妨害する場合に、遺 伝子発現を排除することができる。さらに、例えばプロモーターのような、酸化 的リン酸化に 重要な1又は複数の遺伝子の発現に必要又は有利である1又は複数の制御配列を 、修飾することができる。あるいは、遺伝子変換法によるか(例えば、Iglesias 及びTrautnerの論文、MolecuLar General Genetics、189:73-76(1983)を参照の こと)、または、遺伝子置換により、遺伝子発現を減少または排除することがで きる。後者の方法において、突然変異された遺伝子型は、選択マーカーと組合わ せて非複製(non-replicating)線状のDNA断片に導入される。このプラスミドの組 込みの選択は、該マーカーの選択によって行われる。遺伝子置換を導く組換え事 象のスクリーニングは、突然変異した遺伝子を獲得しているかどうかについてコ ロニーを試験することによって行われる。更に、酸化的リン酸化に重要な1種以 上の遺伝子発現の減少又は排除は、転位(transposition)及びUV又は化学物質に よる突然変異誘発を含むが、これらに限定されるものではない、当該技術分野に おいて周知の方法を用いるランダム突然変異誘発により達成することができる。 宿主細胞としての前述の呼吸欠損突然変異細胞の選択は、いくつかの要因に大 きく依存しているであろう。ひとつの要因は、1又は複数の第1の核酸配列を導入 するに先立っての突然変異細胞の増殖のために突然変異細胞の呼吸欠損を補完す る能力である。この突然変異細胞の呼吸欠損の補完は、例えばフェロプロトポル フィリン又はフェリプロトポルフィリン(ヘミン)のようなヘム原料などの物質 、又はヘムの生合成に関連した遺伝子の破壊を克服するためのヘモグロビンを培 地に補充することによって達成され得る。しかしながら、この選択は、培地への 物質の添加によって回復されるべき突然変異細胞の能力によって左右される。別 の重要な要因は、前述の第1の核酸配列が、宿主細胞において発現することがで きるかどうかである。更なる要因は、第2の核酸配列が宿主細胞において発現 することができるかどうかである。 この宿主細胞は、単細胞微生物、例えば原核細胞であるか、または、単細胞で ない微生物、例えば真核細胞であることができる。 有用な単細胞は、細菌細胞であり、これはバシラス(Bacillus)属の細胞、例え ば、バシラス・アルカロフィラス(Bacillus alkalophilus)、バシラス・アミノ リクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バシラス・ブレビス(Bacil lus brevis)、バシラス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バシラス・コ アギュランス(Bacillus coagulans)、バシラス・ラウタス(Bacillus lautus)、 バシラス・レンタス(Bacillus lentus)、バシラス・リシェニフォルミス(Bacill u slicheniformis)、バシラス・メガリウム(Bacillus megaterium)、バシラス・ ステアロテルモフィス(Bacillus stearothermophilus)、バシラス・サブチリス( Bacillus subtilis)、及びバシラス・チュリンジエンシス(Bacillus thurigiens is);又はストレプトマイセス(Streptomyces)属の細胞、例えば、ストレプトマ イセス・リビダンス(Streptomyces lividans)又はストレプトマイセス・ムリナ ス(Streptomyces murinus)のようなグラム陽性菌、もしくはE.コリ(E.coli)及 びシュードモナス(Psendomonas)属の種のようなグラム陰性菌を含むが、これら に限定されるものではない。好ましい実施態様において、細菌宿主細胞は、バシ ラス・レンタス、バシラス・リシェニフォルミス、バシラス・ステアロテルモフ ィス又はバシラス・サブチリス細胞である。 前述の宿主細胞は、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞又は真菌細胞のような真 核細胞であることができる。有用な哺乳類細胞は、チャイニーズ・ハムスター卵 巣(CHO)細胞、HeLa細胞、胎児ハムスター腎(13HK)細胞、COS細胞、又は例えばア メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATTC)から入手できるいくつかの 他の不滅化 した細胞株である。 好ましい実施態様において、宿主細胞は菌類(fungus)細胞である。本願明細書 において使用される“菌類”(fungus)とは、子嚢菌(Ascomycota)門、担子菌(Bac idiomycota)門、ツボカビ(Chytridiomycota)門、及び接合菌(Zygomycota)門(Ha wksworthらの定義による、Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi、 第8版、1995年、CAB International,University Press,Cambridge,UK)、更 には卵菌(Oomycota)門(Hawksworthらの前述の著書(1995年)の171頁から引用) 並びに全ての不完全菌類(mitosporic fungi)(Hawksworthらの前述の著書、(1995 年))である。子嚢菌門の代表的グループは、例えばニューロスポラ(Neurospora) 、ユーペニシリウム(Eupenicillium)(=ペニシリウム(Penicillium))、エメリセ ラ(Emericella)(=アスペルギルス(Aspergillus))、ユーロチウム(Eurotium)(= アスペルギルス(Aspergillus))、及び下記に列記する真の酵母を含む。担子菌門 の例は、菌じん類、サビキン類、及びクロポキン類を含む。ツボカビ門の代表的 グループは、例えばカワリミズカビ(Allomyces)、コウマクノウキン(Blastoclud rella)、ボウフラキン(coelomomyces)、及び水生菌である。卵菌門の代表的グル ープは、例えば、アクリア(Achlya)のようなミズカビ(Saprolegniomycetous)水 生菌(ミズカビ)を含む。不完全菌類の例は、アスペルギルス(Aspergillus)、 ペニシリウム(Penicillium)、カンジダ(Candida)、及びアルテルナリア(Alterna ria)を含む。接合菌門の代表的グループは、例えばクモノスカビ(Rhizopus)及び ケカビ(Mucor)を含む。 好ましい実施態様において、真菌宿主細胞は酵母細胞である。本願明細書にお いて使用される“酵母”とは、子嚢菌類(ascosporogenous)酵母(Endomycetales) 、担子菌類(basidiosporogenous)酵母 、及び不完全菌に属する酵母(Blastomycetes)を含む。子嚢菌類酵母は、スパー モフトラセー(Spermophthoraceae)科及びサッカロミセス(Saccharomycetaceae) 科に分けられる。後者は4つの亜科を有し、スキゾサッカロミセス(Schizosacch aromycoideae)亜科(例えばスキゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属)、 ナドソニオイデ(Nadsonioideae)、リポミコイデー(Lipomycoideae)亜科、及びサ ッカロミセス(Saccharomycoideae)亜科(例えばピキア(Pichia)、クルイベロミ セス(Kluyveromyces)及びサッカロミセス(Saccharomyces)属)である。担子菌類 酵母は、ロイコスポリジウム(Leucospolridim)属、ロドスポリジウム(Rhodospor idium)属、スポリジオボラス(Sporidiovolus)属、フィロバシジウム(Filobasidi um)属、及びフィロバシジエラ(Filobasidiella)属を含む。不完全菌に属する酵 母は、2つの科に分けられ、スポロボロミセス(Sporobolomycetaceae)科(例え ばスポロボロミセス(Sorobolomyces)属及びブレラ(Bullera)属)及びクリプトコ ッカス(Cryptococcaceae)科(例えばカンジダ(Candida)属)である。酵母の分類 は今後変更されることがあり得るので、本発明の目的のためには、酵母はBiolog y and Activities of Yeast(Skinner,F.A.、Passmore,S.M.及びDavenport, R.R.の編集、Soc.App.Bacteriol.Symposium Series、No.9,1980年)に記さ れたように定義する。酵母の生物学及び酵母遺伝子の操作は、当該技術分野にお いて周知である(例えば、Biochemistry and Genetics of Yeast、Bacil,M.、 Horecker,B.J.及びStopani,A.O.M.編集、第2版、1987年;The Yeasts、Rose ,A.H.及びHarrison,J.S.編集、第2版、1987年;並びに、The Molecular Biolo gy of the Yeast Saccharomyces、Strathernらの編集、1981年を参照のこと)。 より好ましい実施態様において、酵母宿主細胞は、カンジダ、ク ルイベロミセス、サッカロミセス、スキゾサッカロミセス、ピキア又はヤロウィ ア(Yarrowia)属の種の細胞である。 最も好ましい実施態様において、酵母宿主細胞は、サッカロミセス・カールス バージェンシス(Saccharomyces curlsbergensis)、サッカロミセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・ディアスタティカス(Saccharom yces diastaticus)、サッカロミセス・ダグラシ(Saccharomyces douglasii)、サ ッカロミセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)、サッカロミセス・ノルベ ンシス(Saccharomyces norbensis)又はサッカロミセス・オビフォルミス(Saccha romyces oviformis)細胞である。別の最も好ましい実施態様において、酵母宿主 細胞は、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)細胞である。別の 最も好ましい実施態様において、酵母宿主細胞は、ヤロウィア・リポリティカ(Y arrowia lipolytica)細胞である。 別の好ましい実施態様において、菌類宿主細胞は、糸状菌細胞である。“糸状 菌”とは、ユーミコタ(Eumycota)及び卵菌(Oomycota)亜門の糸状体を全て含む( 前述のHawksworthらの定義、1995年)。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカ ン、キトサン、マンナン及び他の複合多糖類で構成された菌糸壁によって特徴付 けられる。栄養増殖は菌糸の伸長によるものであり、かつ炭素異化作用は絶対好 気性である。対照的にサッカロミセス・セレビシエのような酵母の栄養増殖は、 単細胞期の葉状体の出芽により、かつ炭素異化作用は発酵性である。より好まし い実施態様において、糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム(Acremonium)、アスペ ルギルス(Aspergillus)、フサリウム(Fusarium)、フミコラ(Humicola)、ムコー ル(Mucor)、ミセリオフソラ(Myceliophthora)、ニューロスポラ(Neurospora)、 ペニシリウム(Penicillium)、シエラビア(Thielavia)、トリポク ラジウム(Tolypocladium)及びトリコデルマ(Trichoderma)属の種の細胞であるが 、これらに限定されるものではない。 なお一層好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞はアスペルギルス細胞で ある。別のなお一層好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞はアクレモニウ ム細胞である。別のなお一層好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞はフサ リウム細胞である。別のなお一層好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞は フミコラ細胞である。別のなお一層好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞 はムコール細胞である。別のなお一層好ましい実施態様において、糸状菌宿主細 胞はミセリオフソラ細胞である。別のなお一層好ましい実施態様において、糸状 菌宿主細胞はニューロスポラ細胞である、別のなお一層好ましい実施態様におい て、糸状菌宿主細胞はペニシリウム細胞である。別のなお一層好ましい実施態様 において、糸状菌宿主細胞はシエラビア細胞である。別のなお一層好ましい実施 態様において、糸状菌宿主細胞はトリポクラジウム細胞である。別のなお一層好 ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞はトリコデルマ細胞である。 最も好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモ リ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・フォエチダス(Aspergillus foetid us)、アスペルギルス・ジャポニカス(Aspergillus japonicus)、アスペルギルス ・ニガー(Aspergillus niger)又はアスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryz ae)細胞である。別の最も好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞は、フサ リウム・セレアリス(Fusarium cerealis)、フサリウム・クロックウェレンス(Fu sarium crookwellense)、フサリウム・グラミネアラス(Fusarium graminearum) 、フサリウム・オキシルポルム(Fusarium oxysporum)、フサリウム・サンブシナ ム(Fusarium sambucinum )、フサリウム・スルフォレウム(Fusarium sulphureum)、又はフサリウム・ベネ ナタム(Fusarium venenatum)細胞である。別の最も好ましい実施態様において、 糸状菌宿主細胞は、フミコラ・インソレンス(Humicora insolens)又はフミコラ ・ラヌギノサ(Humicora lanuginosa)細胞である。別の最も好ましい実施態様に おいて、糸状菌宿主細胞は、ムコール・ミエハイ(Mucor miehei)細胞である。別 の最も好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞は、ミセリオフソラ・サーモ フィラム(Myceliophthora thermophilum)細胞である。別の最も好ましい実施態 様において、糸状菌宿主細胞はニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa) 細胞である。別の最も好ましい実施態様において、糸状菌宿主細胞はペニシリウ ム・プルプロゲナム(Penicillium purpurogenum)細胞である。別の最も好ましい 実施態様において、糸状菌宿主細胞はシエラビア・テレストリス(Thielavia ter restris)細胞である。別の最も好ましい実施態様において、トリコデルマ細胞は 、トリコデルマ・ハリアナム(Trichoderma harrianum)、トリコデルマ・コニン ギ(Trichoderma koningii)、トリコデルマ・ロンギブラキアタム(Trichoderma l ongibrachiatum)、トリコデルマ・リセイ(Trichoderma reesei)又はトリコデル マ・ビリデ(Trichoderma viride)細胞である。 好ましい実施態様においては、電子伝達鎖の成分である1種以上のタンパク質 をコードし、かつ呼吸欠損を相補することが可能な突然変異体を生じるような1 個以上の第1の核酸配列が、該突然変異体へと導入される。これらのタンパク質 は、NADH-Qレダクターゼ、シトクロムレダクターゼ(シトクロムb及びc1を含む )、シトクロムc、及びシトクロムオキシダーゼ(シトクロムa及びa3を含む)を 含む。 別の好ましい実施態様においては、フラビンを産生することが可 能な突然変異体を生じるような1種以上のフラビン生合成酵素をコードしている1 個以上の第1の核酸配列が、該突然変異体へと導入される。 別の好ましい実施態様において、ユビキノンを産生することが可能な突然変異 体を生じるような1種以上のユビキノン(又はCoQ)生合成酵素をコードしている1 個以上の第1の核酸配列が、該突然変異体へと導入される。 別の好ましい実施態様において、ヘムを産生することが可能な突然変異体を生 じる1又は複数のヘム生合成酵素をコードしている1又は複数の第1の核酸配列が 、該突然変異体に導入される。ヘムは、プロトポルフィリンIX及び鉄のキレート 複合体であり、ヘモタンパク質の補欠分子族として利用される。プロトポルフィ リンIXは、4個のメチル基、2個のビニル基、及び2個のプロピオン酸基で置換さ れたポルフィリン環から成り、これは鉄原子を獲得し、ヘムを形成する。 本願明細書においては用語“ヘム生合成酵素”は、ヘムの生合成に関るいずれ かの酵素を意味すると定義される。このようなヘム生合成酵素の例は、5-アミノ レブリン酸シンターゼ(EC 2.3.1.37)、ポルホビリノーゲン・シンターゼ(EC 4.2 .1.24)、ポルホビリノーゲン・デアミナーゼ(EC 4.3.1.8)、ウロポルフィリノー ゲンIII・シンターゼ(EC 4.2.11.75)、ウロポルフィリノーゲンIII・デカルボキ シフラーゼ(EC 4.1.1.37)、コプロポルフィリノーゲンIII・オキシダーゼ(EC 1. 3.3.3)、プロトポルフィリノーゲンIX・オキシダーゼ(EC 1.3.3.4)、及びフェロ ケラターゼ(EC 4.99.1.1)を含むが、これらに限定されるものではない。5-アミ ノレブリン酸シンターゼは、グリシン及びスクシニル-CoAの縮合を触媒し、5-ア ミノレブリン酸を生成する。ポルホビリノーゲン・シンターゼ(5-アミノ レブリン酸デヒドラターゼ又は5-アミノレブリン酸デヒドラーゼとも称される) は、2個の5-アミノレブリン酸分子の縮合を触媒し、ポルホビリノーゲンを生成 する。ポルホビリノーゲン・デアミナーゼ(ヒドロキシメチルビラン・シンター ゼ又はウロI・シンターゼとも称される)は、ピロールポルホビリノーゲンの4分 子の重合(tetrapolymerization)を触媒し、プレウロポルフィリノーゲンを生成 する。ウロポルフィリノーゲンIII・シンターゼ(ウロIII・シンターゼ又はウロ III・コシンターゼとも称される)は、プレウロポルフィリノーゲンの第4番目 の環の転位、その後の閉環を触媒し、ウロポルフィリノーゲンIIIを生成する。 ウロポルフィリノーゲンIII・デカルボキシラーゼ(ウロD又はウロポルフィリノ ーゲン・デカルボキシラーゼとも称される)は、ウロポルフィリノーゲンIIIの4 個の全ての酢酸側鎖のメチル基への脱炭酸を触媒し、コプロポルフィリノーゲン IIIを生成する。コプロポルフィリノーゲンIII・オキシダーゼ(コプロポルフィ リノーゲナーゼとも称される)は、コプロポルフィリノーゲンIIIのA及びB環の2 位及び4位の2個のプロピオン酸基のビニル基への酸化的脱炭酸を触媒し、プロト ポルフィリノーゲンIXを生成する。プロトポルフィリノーゲンIX・オキシダーゼ は、プロトポルフィリノーゲンIXの6個の電子的酸化を触媒し、プロトポルフィ リンIXを生じる。フェロケラターゼ(フェロリアーゼ、ヘムシンターゼ、又はプ ロトヘムフェロリアーゼとも称される)は、鉄のプロトポルフィリンへの導入を 触媒し、ヘムを生成する。 あるいは、5-アミノレブリン酸の生合成は、tRNA-Gluが媒介した経路によりグ ルタミン酸から生じることもできる。このグルタミン酸経路は、多くの好気性細 菌、植物、及び光合成をすることが可能な生物において発見されている。グルタ ミン酸からの5-アミノレブ リン酸の生合成は、グルタミン酸-tRNAgluシンターゼ(EC 6.1.1.17)、グルタミ ン酸-tRNAglu・レダクターゼ、及びグルタミン酸1-セミアルデヒドアミノトラン スフェラーゼで触媒された、3種の酵素的工程に関連している。グルタミン酸-tR NAglu・シンテターゼ(グルタミン酸-tRNAgluシンターゼとも称される)は、ATP 及びマグネシウムイオンの存在下での、tRNAのグルタミン酸へのカップリングを 触媒する。グルタミン酸-tRNAglu・レダクターゼ(グルタミン酸-tRNAgluデヒド ロゲナーゼとも称される)は、NADPHの存在下において、tRNAが結合したグルタ ミン酸の還元を触媒し、グルタミン酸1-セミアルデヒドを生成する。グルタミン 酸1-セミアルデヒド・アミノトランスフェラーゼ(グルタミン酸1-セミアルデヒ ドアミノムターゼとも称される)は、グルタミン酸1-セミアルデヒドの5-アミノ レブリン酸への転換を触媒する。 前述の第1の核酸配列は、5-アミノレブリン酸シンターゼ、ポルホビリノーゲ ン・シンターゼ、ポルホビリノーゲン・デアミナーゼ、ウロポルフィリノーゲン ・シンターゼ、ウロポルフィリノーゲン・デカルボキシラーゼ、コプロポルフィ リノーゲン・オキシダーゼ、プロトポルフィリノーゲン・オキシダーゼ、フェロ ケラターゼ、及びグルタミン酸-tRNAglu・シンターゼ、グルタミン酸-tRNAglu・ レダクターゼ、及びグルタミン酸1-セミアルデヒド・アミノトランスフェラーゼ からなる群から選択されるヘム生合成酵素をコードしている配列であることが好 ましい。この第1の核酸配列は、いずれかの微生物原料から得ることができ、か つ宿主細胞に対し天然又は外来のものであることができる。このような第1の核 酸配列の原料の選択は、宿主細胞として使用されるヘム欠損突然変異細胞によっ て左右されるが、好ましい原料は、例えば酵母及び糸状菌のような菌類原料であ る。好ましい糸状菌原料は、アクレモニウム、アスペ ルギルス、フサリウム、フミコラ、ミセリオフソラ、ムコール、ニューロスポラ 、ペニシリウム、ファネロキエテ(Phanerochaete)、シエラビア、トリポクラジ ウム、及びトリコデルマ属の種を含むが、これらに限定されるものではない。好 ましい酵母原料は、カンジダ、クルイベロミセス、ピキア、サッカロミセス、ス キゾサッカロミセス、及びヤロウィア属の種を含むが、これらに限定されるもの ではない。 ヘム生合成酵素をコードしている第1の核酸配列は、下記のもののいずれかで あることができる: 1.5-アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子: a.サッカロミセス・セレビシエ(Urban-Grimalらの論文、European Journal of Biochemistiy、156:511-59(1986)); b.アスペルギルス・ニジュランス(Bradshawらの論文、Current Genetics、23: 501-507(1993)); c.ロドバクテル・スファロイデス(Rhodobacter sphaeroides)(Taiらの論文、 Gene、70:139-152(1988)); d.ロドバクテル・カプスラタス(capsulatus)(Hornbergerらの論文、Molecular General Genetic、211:371-378(1990));及び e.エッセリシヤ・コリ(Droletらの論文、Molecular General Genetics、216:3 47-352(1989))。 2.ポルホビリノーゲンシンターゼ遺伝子: a.サッカロミセス・セレビシエ(Myersらの論文、Journal of Biological Che mistry、262:16822-16829(1987)); b.スタフィロコッカス・アウレウス(Kafala及びSasarmanの論文、Canadian J ournal of Microbiology、40:651-657(1994)); c.ロドバクテル・スファロイデス(Delaunayらの論文、Journal of Bacteriolo gy、173:2712-2715(1991)); d.エッセリシヤ・コリ(Echelardらの論文、Molecular General Genetics、21 4:503-508(1988));及び e.バシラス・サブチリス(Hanssonらの論文、Journal of Bacteriology、173: 2590-2599(1991))。 3.ポルホビリノーゲンデアミナーゼ遺伝子 a.サッカロミセス・セレビシエ(Kengらの論文、Molecular General Genetics 、234:33-43(1992)); b.ヒト(Yooらの論文、Genomics、15:221-29(1993);Raichらの論文、Nucleic Acids Research、14:5955-5968(1986)); c.エッセリシヤ・コリ(Thomas及びJordan、Nucleic Acids Research、14:621 5-6226(1986));及び d.バシラス・サブチリス(Petricekらの論文、Journal of Bacteriology、172: 2250-2258(1990))。 4.ウロポルフィリノーゲンIIIシンターゼ遺伝子: a.サッカロミセス・セレビシエ(Amillet及びLabbe-Boisの論文、Yeast、11:4 19-424(1995)); b.バシラス・サブチリス(Hanssonらの論文、Journal of Bacteriology、173: 2590-2599(1991));及び c.エッセリシヤ・コリ(Jordanらの論文、Nucleic Acids Research、15:10583 (1987))。 5.ウロポルフィリノーゲンIIIデカルボキシラーゼ遺伝子: a.サッカロミセス・セレビシエ(Gareyらの論文、European Journal of Bioch emistry、205:1011-1016(1992));及び b.ヒト(Romeoらの論文、Journal of Biological Chemistry、261:9825-9831(1 986))。 6.コプロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ遺伝子: a.ヒト(Martasekらの論文、Proceedings of the National Acad emy of Sciences USA、911:3024-3028(1994)); b.エッセリシヤ・コリ(Troupらの論文、Journal of Bacteriology、176:673- 680(1994));及び c.サッカロミセス・セレビシエ(Zaagorecらの論文、Journal of Biological C hemistry、263:9718-9724(1986))。 7.プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ遺伝子: a.ヒト(Taketaniらの論文、Genomics、29:698-703(1995)); b.バシラス・サブチリス(Daileyらの論文、Journal of Biological Chemistry 、269:813-815(1994));及び c.エッセリシヤ.コリ(Sasamunらの論文、Canadian Journal of Microbiolog y、39:155-161(1993))。 8.フェロケラターゼ遺伝子: a.サッカロミセス・セレビシエ(Labbe-Bois、Journal of Biological Chemist ry、265:7278-7283(1990)); b.ウシ(Shibuyaらの論文、Biochimica Biophysica Acta、1231:117-120(1995 )); c.ブラディリゾビウム・ジャポニカム(Furustaci及びO'Brianの論文、Applie d Environmental Microbiology、59:2347-2351(1993)); d.エッセリシヤ・コリ(Frustaci及びO'Brianの論文、Journal of Bacteriolog y、175:2154-2156(1993));及び e.バシラス・サブチリス(Hansson及びHederstedt、Journal of Bacteriology 、174:8081-8093(1992))。 9.グルタミン酸-tRNAgluシンテターゼ遺伝子: a.メタノバクテリウム・サモアトトロフィカム(thermoautotrophicum)(Moore らの論文、Biochimica et Biophysica Acta、1305:113-116(1996)); b.サーマス.サーモフイラス(Nurekiらの論文、European Journal of Biochem istiy、204:465-472(1992)); c.バシラス・サブチリス(Bretonらの論文、Journal of Biological Chemistry 、265:18248-18255(1990)); d.バシラス・ステアロテルモフィラス(Bretonらの論文、Journal of Biologic al Chemistry、265:18248-18255(1990)); e.サッカロミセス・セレビシエ(Ludmerer及びSchimmelらの論文、Journal of Bacteriology、163:763-768(1985)); f.E.コリ(Bretonらの論文、Journal of Biological Chemistry、261:10610- 10617(1986))。 10.グルタミン酸-tRNAgluレダクターゼ遺伝子: a.大麦(Vothkenechtらの論文、Proceedings of the National Academy of Sc iences USA、93:9287-9291(1996)); b.緑膿菌(Hungererらの論文、Molecular and General Genetics、248:375-380 (1995)); c.E.コリ(Ikemiらの論文、Gene、121:127-132(1992)); d.バシラス・サブチリス(Petricekらの論文、Journal of Bacteriology、172: 2250-2258(1990)); e.メタノバクテリウム・サモアトトロフィカム(Hungererらの論文、Bioorg.M ed.Chem.、4:1089-1095(1996))。 11.グルタミン酸1-セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼ遺伝子: a.ネズミチフス菌(Elliottらの論文、Journal of Bacteriology、172:7071-70 84(1990)); b.大麦(Grimmの論文、Proceedings of the National Academy of Sciences U SA、87:4169-4173(1990)); c.E.コリ(Ikemiらの論文、Gene、121:127-132(1992))。 より好ましい実施態様において、前述の第1の核酸配列は、アスペルギルス種 から得られる。なお一層好ましい実施態様において、第1の核酸配列は、アスペ ルギルス・フィカム(ficuum)、アスペルギルス・フォエチダス、アスペルギルス ・ジャポニカス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ニジュランス、又 はアスペルギルス・オリザエから得られる。別のより好ましい実施態様において 、第1の核酸配列は、サッカロミセス種から得られる。なお一層好ましい実施態 様において、第1の核酸配列は、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス ・カールスバージエンス、サッカロミセス・ディアスタティカス、サッカロミセ ス・ダグラシ、サッカロミセス・クルイベリ、サッカロミセス・ノルベンシス、 又はサッカロミセス・オビフォルミスから得ることができる。 最も好ましい実施態様において、5-アミノレブリン酸シンターゼをコードして いる第1の核酸配列は、例えば配列番号:1に記された核酸配列であるアスペルギ ルス・オリザエ株A1560(IFO 4177)から得られる。この第1の核酸配列は、更に遺 伝子コードの縮重が配列番号:1とは異なる、配列番号:2に記されたアミノ酸配 列を有する5-アミノレブリン酸シンターゼをコードしている核酸配列であっても よい。別の最も好ましい実施態様において、ポルホビリノーゲンシンターゼをコ ードしている第1の核酸配列は、例えば配列番号:3に記された核酸配列であるア スペルギルス・オリザエ株A1560(IFO 4177)から得ることができる。この第1の核 酸配列は、更に遺伝子コードの縮重が配列番号:3とは異なる、配列番号:4に記 されたアミノ酸配列を有するポルホビリノーゲンシンターゼをコードしている核 酸配列であってもよい。本発明の第1の核酸配列は更に、配列番号:1及び配列番 号:3に記された両ゲノム配列に加え、対応するcDNA及びRNA配列を包含してい る。本願明細書において 使用した用語“核酸配列”は、合成DNAを含むこのような変種を全て包含すると 理解されるであろう。 プラスミドコピー数を最大にしようとして、例えば、プロモーターを切断/変 異させることにより、ヘム又は前駆体の不存在下での迅速な増殖を支持するため に導入されるべき多コピーのベクターを必要とする転写レベルを低下させること により、前述の第1の核酸配列の発現は損われるであろう。更に、該タンパク質 の活性の低下をもたらす第1の核酸配列によって発現されたタンパク質のアミノ 酸配列の突然変異を、コピー数を最大化するために使用することができる。例え ば、導入されたヘム生合成遺伝子の酵素活性を低下するいずれかの突然変異を使 用することができる。 前述のポリペプチドをコードしている第2の核酸配列は、該突然変異細胞に対 して生来的(native)又は異種性(heterologeus)であることができる。異種性ポリ ペプチドの場合、この異種性ポリペプチドをコードしている核酸配列は、いずれ かの原核生物、真核生物、又は他の原料、例えば古細菌から得ることができる。 本願明細書において、用語“ポリペプチド”は、特定の長さのコードされた生成 物を意味せず、従ってペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質を包含してい る。更に用語“ポリペプチド”は、コードされた生成物を形成するために結合し た2種以上のポリペプチドも包含している。更にポリペプチドは、1種以上がその 宿主細胞に対して異種であり得るような、少なくとも2種の異なるポリペプチド から得られた部分的又は完全なポリペプチド配列の組合せを含む、ハイブリッド ポリペプチドも含んでいる。ポリペプチドは更に、前述のポリペプチドの天然に 生じた対立遺伝子変異体及び遺伝子操作された変異体を含む。 これらのポリペプチドは、酵素、ホルモン、ホルモン変異体、受 容体又はそれらの一部、抗体又はそれらの一部、もしくはレポーターであること ができる。最も好ましい実施態様において、該ポリペプチドは、酸化還元酵素、 転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、又はリガーゼである。なお 一層好ましい実施態様において、該ポリペプチドは、アミノペプチダーゼ、アミ ラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ 、キチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、クチナーゼ 、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラ クトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グリコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、 グルタミナーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパー ゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキ シダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リ ボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼである。 本発明の方法は更に、用語“生来のポリペプチド”の範囲において、その発現 が宿主細胞に対して生来的でない遺伝要素の使用、又は宿主細胞に通常認められ ない態様で機能するように操作された天然の要素の使用を含むような、突然変異 細胞に対して生来的又は内因性のポリペプチドの組換え産物を包含している。例 えば生来のポリペプチドは、該ポリペプチドの発現を増強する様々なプロモータ ーの制御下に、もしくは、該細胞の外部への生来のポリペプチドの輸送を促進す る様々なシグナル配列の制御下に、該ポリペプチドをコードしている遺伝子を配 置すること、及び宿主細胞によって通常生成されるポリペプチドをコードしてい る遺伝子のコピー数を増加することなどにより、組換え産生することができる。 このポリペプチドは、更にヘモタンパク質であることができる。 本願明細書において“ヘモタンパク質”とは、補欠分子族としてヘムを含むタン パク質のグループのいずれかの一員と定義される。このヘムタンパク質は、グロ ブリン、シトクロム、酸化還元酵素、又はいずれか他の補欠分子族としてヘムを 含むタンパク質であることができる。ヘム含有グロブリンは、ヘモグロビン又は ミオグロビンを含む。ヘム含有シトクロムは、シトクロムP450、シトクロムb、 シトクロムC1、及びシトクロムcを含む。ヘム含有酸化還元酵素は、カタラーゼ 、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、ハロペルオキシダーゼ、及びペルオキシダー ゼを含むが、これらに限定されるものではない。好ましい実施態様において、酸 化還元酵素はカタラーゼである。別の好ましい実施態様において、酸化還元酵素 はオキシダーゼである。更なる好ましい実施態様において、酸化還元酵素はオキ シゲナーゼである。別の好ましい実施態様において、酸化還元酵素はハロペルオ キシダーゼである。別の好ましい実施態様において、酸化還元酵素は、ペルオキ シダーゼである。より好ましい実施態様において、このペルオキシダーゼは、コ プリヌス(Coprinus)の株、アルソロミセス(Arthromyces)の株、又はファネロセ テ(Phanerochaete)の株から得られる。なお一層好ましい実施態様において、こ のペルオキシダーゼは、コプリヌス・シネラウス(Coprinus cinereus)株、例え ばコプリヌス・シネラウスIFO 8371、コプリヌス・マクロリザス(Coprinus macr orhizus)の株、又はアルソロミセス・ラモサス(Arthromyces ramosas)の株から 得られる。別のより好ましい実施態様において、カタラーゼは、シタリジウム(S cytalidium)の株、アスペルギルスの株、又はフミコラの株から得られる。別の なお一層好ましい実施態様において、カタラーゼは、シタリジウム・テルモフィ ラム(Scytalidium thermophilum)の株、例えばシタリジウム・テルモフィラCBS 117.65、アスペルギルス・ニガーの株、 又はフミコラ・インソレンの株から得られる。 第1及び第2の核酸配列は、ある核酸構築物に含まれることが好ましい。本願明 細書における用語“核酸構築物”は、1本鎖又は2本鎖のいずれかの核酸分子であ り、天然の遺伝子から単離されたもの、又は天然には存在しない態様で結合し隣 接する核酸セグメントを含むように修飾されたものを意味すると定義される。用 語核酸構築物は、この核酸構築物が、コード配列の発現に必要な制御配列を全て 含む場合は、用語「発現カセット」と同義語である。本願明細書において定義さ れる用語“コード配列”とは、前述の制御配列の制御下にある場合に、mRNAに転 写され、かつポリペプチドに翻訳される配列である。このコード配列の境界は、 一般に5'-末端の翻訳開始コドンATG、及び3'-末端の翻訳終結コドンによって決 定される。コード配列は、DNA、cDNA、及び組換え核酸配列を含むが、これらに 限定されるものではない。 前述の第1の核酸配列は、第1の核酸配列のコピー数を増加するために、酵素の 発現を提供するか、もしくは発現を低下する様々な態様で操作することができる 。発現ベクターによっては、ベクターに挿入する以前の核酸配列の操作が望まし い、もしくは、必要であることがある。例えば、クローニング法又は突然変異誘 発などを使用する核酸配列の修飾の技術は、当該技術分野において周知である。 本願明細書において使用される用語“制御配列”は、第1の核酸配列のコード 配列の発現に必要であるか、もしくは、利点をもたらすような成分全てを含む。 この制御配列は、第1の核酸配列に対して天然であるか、他の原料から得るか、 もしくは天然又は外来の制御配列の組合せであることができる。外来の制御配列 は、通常コード配列に結合している天然の制御配列に関連した第1の核酸配列の 発現を増強するために、天然の制御配列と単純に置換するか、もしくは、これに 追加される。このような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプ チド配列、プロモーター、シグナル配列及び転写終結因子を含むが、これらに限 定されるものではない。制御配列の指示に従った発現に関して、本発明において 使用される第1の核酸配列は、第1の核酸配列のコード配列の発現が、該制御配列 と適合する条件下で達成されるように、制御配列に作用可能に連結されている。 本願明細書において定義された用語“コード配列”は、前述の制御配列の制御下 に置かれた場合に、mRNAに転写され、かつ生成物に翻訳される配列である。この コード配列の境界は、5'-末端の翻訳開始コドン及び3'-末端の翻訳終結コドンに よって決定される。コード配列は、DNA、cDNA、及び組換え核酸配列を含むが、 これらに限定されるものではない。 前述の第1の制御配列は、第1の核酸配列の発現のために宿主細胞によって認識 される核酸配列である適当なプロモーター配列であることができる。このプロモ ーター配列は、ヘム生合成酵素の発現を媒介する転写制御配列を含んでいる。こ のプロモーターは、突然変異体、切断された、又はハイブリッドプロモーターを 含む、選別された宿主細胞において、転写活性を示すいずれかのプロモーターで あることができる。このプロモーターは、宿主細胞と同種性又は異種性のいずれ かの遺伝子から得ることができる。 特に細菌宿主細胞において、第1の核酸配列の転写を指令する適当なプロモー ターの例は、E.コリのラクトース(lac)オペロン、ストレプトマイセス・コエリ コラー(streptomyces coelicolor)・アガラーセ(agarase)遺伝子(dagA)、バシラ ス・サブチリス・レバンスクラーゼ遺伝子(sacB)、バシラス・リシェニフォルミ ス・α−アミラーゼ遺伝子(amyL)、バシラス・ステアロテルモフィス・マルタ ーゼ性アミラーゼ遺伝子(amyM)、バシラス・アミノリクエファシエンス・α−ア ミラーゼ遺伝子(amyQ)、バシラス・リシェニフォルミス・ペニシリナーゼ遺伝子 (penP)、バシラス・サブチリスxylA及びxylB遺伝子、並びに真核生物のβ−ラク タマーゼ遺伝子から得られたプロモーター類(Villa-Kamaroffらの論文、Procee dings of the National Academy of Sciences USA、75:3727-3731(1978))、更 にはtacプロモーター(DeBoerらの論文、Proceedings of the National Academy of Sciences USA、80:21-25(1983))である。更にプロモーター類は、“組換え細 菌からの有用なタンパク質”(Scientific American、242:74-94(1980);及びSa mbrookらの論文、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第2版、コールド ・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1989年)において説明されている。 糸状菌宿主細胞において第1の核酸配列の転写の指示に適当なプロモーターの 例は、アスペルギルス・オリザエ・TAKAアミラーゼ、リゾムコール・ミエハイ・ アスパラギン酸プロテアーゼ、アスペルギルス・ニガー・中性α−アミラーゼ、 アスペルギルス・ニガー・酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー又 はアスペルギルス・アワモリ・グルコアミラーゼ(glaA)、リゾムコール・ミエハ イ・リパーゼ、アスペルギルス・オリザエ・アルカリ性プロテアーゼ、アスペル ギルス・オリザエ・トリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニジュラ ンス・アセトアミダーゼ、フサリウム・オキシスポラム・トリプシン様プロテア ーゼ(本願明細書に組み入れられている、米国特許第4,288,627号に開示されて いる)をコードしている遺伝子から得られたプロモーター類、並びにそれらの突 然変異体、切断された、及びハイブリッドプロモーターである。糸状菌宿主細胞 において使用するのに特に好ましいプロモーターは、 TAKAアミラーゼ、NA2-tpi(アスペルギルス・ニガー・中性α−アミラーゼ及び アスペルギルス・オリザエ・トリオースリン酸イソメラーゼをコードしている遺 伝子のプロモーターのハイブリッド)、及びglaAプロモーターである。 酵母宿主において、有用なプロモーターは、サッカロミセス・セレビシエ・エ ノラーゼ(ENO-1)遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ・ガラクトキナーゼ遺伝 子(GAL1)、サッカロミセス・セレビシエ・アルコールデヒドロゲナーゼ/グリセ ルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ADH2/GAP)、及びサッカロミセ ス・セレビシエ・3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子から得られる。酵母宿主 細胞のための他の有用なプロモーターは、Romanosらの論文(Yeast、8:423-488( 1992))に記載されている。哺乳類の宿主細胞において有用なプロモーターは、 シミアンウイルス40(SV4O)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、アデノウイルス、ウシ パピローマウイルス(BPV)などの、ウイルス性プロモーターを含む。 前述の第1の制御配列は、更に転写を終結するために該宿主細胞によって認識 された配列である、転写終結因子配列であることができる。この終結配列は、第 1の核酸配列の3'末端に操作できるように連結される。この終結配列は、第1の核 酸配列に対して天然であるか、もしくは、他の原料、すなわち、外来の終結因子 配列から得ることができる。選別された宿主細胞において機能するあらゆる終結 因子が、本発明において有用であろう。 糸状菌宿主細胞について好ましい終結因子は、アスペルギルス・オリザエTAKA アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー・グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニ ジュランス・アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー・α−グルコ シダーゼ、及びフサリウム・オキシサポラム・トリプシン様プロテアーゼをコー ドしている 遺伝子から得られる。 酵母宿主細胞のための好ましい終結因子は、サッカロミセス・セレビシエ・エ ノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエ・シトクロムC(CYC1)、又はサッカロミ セス・セレビシエ・グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードし ている遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のために有用な他の終結因子は、前述 のRomanosらの論文(1992年)に記されている。終結因子配列は、哺乳類宿主細 胞ついて、当該技術分野において周知である。 この第1の制御配列は、更に宿主細胞による翻訳にとって重要であるmRNAの非 翻訳領域である、適当なリーダー配列であることができる。このリーダー配列は 、第1の核酸配列の5'末端に操作できるように連結している。このリーダー配列 は、第1の核酸配列に対して天然であるか、もしくは、他の原料、すなわち、外 来のリーダー配列から得ることができる。選別された宿主細胞において機能する あらゆるリーダー配列が、本発明において有用であろう。 糸状菌宿主細胞にとって好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリザエ・TA KAアミラーゼ及びアスペルギルス・オリザエ・トリオースリン酸イソメラーゼを コードしている遺伝子から得られる。 酵母宿主細胞にとって適当なリーダーは、サッカロミセス・セレビシエ・エノ ラーゼ(ENO-1)遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ・3-ホスホグリセレートキ ナーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ・α-因子、及びサッカロミセス・ セレビシエ・アルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒ ドロゲナーゼ遺伝子(ADH2/GAP)から得られる。 第1の制御配列は、更に第1の核酸配列の3'末端に作用可能に連結され、かつ転 写された際に宿主細胞によって認識され、転写されたmRNAにポリアデノシン残基 を添加するような配列である、ポリア デニル化配列であることができる。このポリアデニル化配列は、第1の核酸配列 に対して生来的であるか、又は、他の原料、すなわち、外来のポリアデニル化配 列から得ることができる。選択された宿主細胞において機能するあらゆるポリア デニル化配列が、本発明において有用であろう。 糸状菌宿主細胞にとって好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・オ リザエ・TAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー・グルコアミラーゼ、アスペ ルギルス・ニジュランス・アントラニル酸シンターゼ、及びアスペルギルス・ニ ガー・α−グルコシダーゼをコードしている遺伝子から得られる。 酵母宿主細胞にとって有用なポリアデニル化配列は、Guo及びShermanの論文( Molecular Cellular Biology、15:5983-5990(1995))に記載されている。ポリア デニル化配列は、哺乳類宿主細胞については、当該技術分野において周知である 。 第1の制御配列は更に、発現されたタンパク質のアミノ末端に連結し、タンパ ク質を特定の細胞コンパートメントへの局在させるアミノ酸配列をコードしてい るシグナルペプチドコード領域であることができる。このシグナルペプチドコー ド領域は、第1の核酸配列に対して生来的であるか、もしくは、他の原料から得 ることができる。第1の核酸配列のコード配列の5'末端は、局在化されるタンパ ク質をコードしているコード領域のセグメントに、翻訳読み枠に天然に連結され たシグナルペプチドコード領域を本来備えることができる。あるいは、このコー ド配列の5'末端は、局在化されたタンパク質をコードしているコード配列の部分 に対して外来であるような、シグナルペプチドコード領域をコードしている核酸 を含むことができる。選択された宿主細胞においてタンパク質の局在化をもたら すことが可能なあらゆるシグナルペプチドコード領域が、本発明に おいて有用であろう。 更に第1の制御配列は、生化学活性を有する成熟ポリペプチドのアミノ末端に 位置するアミノ酸配列をコードしているプロペプチドコード領域であることがで きる。得られたポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド(又は一部の場 合はチモーゲン)として公知である。プロ酵素は一般に不活性であり、かつプロ 酵素由来のプロペプチドの触媒的又は自己触媒的切断により、成熟活性ポリペプ チドに転換され得る。本願明細書において生化学的活性のあるポリペプチドとは 、その天然の対応物の生化学活性を発揮する活性型で産生されたポリペプチドと 定義される。プロペプチド配列は、ヘム生合成酵素をコードしている第1の核酸 配列に対して生来的であるか、又は、他の原料、すなわち外来プロペプチド配列 から得ることができる。プロペプチドをコードしている核酸配列は、バシラス・ サブチリス・アルカリ性プロテアーゼ(aprE)、バシラス・サブチリス・中性プロ テアーゼ遺伝子(nprT)、サッカロミセス・セレビシエ・α−因子、及びミセリオ フソラ・サーモフィラム・ラッカーゼをコードしている遺伝子から得ることがで きる。 好ましい実施態様において、第2の核酸配列は、宿主細胞に導入され、1又は複 数の第2の制御配列に作用可能に連結されている。この第2の制御配列は、ポリペ プチドをコードしている第2の核酸配列に対して生来的であるか、もしくは、外 来原料から部分的又は全体的に得ることができる。この外来制御配列は、通常コ ード領域に結合される生来の制御配列に関連した所望のポリペプチドの増強され た産生を得るために、天然の制御配列と簡単に置換することができる。第2の制 御配列は、先に第1の制御配列に関連して例示した制御配列のいずれかであるこ とができる。 細胞の分泌経路に発現されたポリペプチドを向けることができる シグナルペプチドコード配列の場合、いくつかの可能性がある。細菌宿主細胞に とっての効果的なシグナルペプチドコード領域は、バシラス・NCIB 11837由来の マルトース性アミラーゼ遺伝子、バシラス・ステアロテルモフィス・α−アミラ ーゼ遺伝子、バシラス・リシェニフォルミス・サブチリシン遺伝子、バシラス・ リシェニフォルミス・β−ラクトアミナーゼ、バシラス・ステアロテルモフィス ・中性プロテアーゼ遺伝子(nprT,nprS,nprM)、並びにバシラス・サブチリス・ PrsA遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。更なるシグナルペ プチドは、Simonen及びPalvaの論文(Microbiological Reviews、57:109-137(19 93))に記載されている。 糸状菌宿主細胞のための効果的シグナルコード領域は、アスペルギルス・オリ ザエ・TAKAアミラーゼ遺伝子、アスペルギルス・ニガー・中性アミラーゼ遺伝子 、リゾムコール・ミエハイ・アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子、フミコラ・ ラヌギノサ・セルラーゼ遺伝子、又はリゾムコール・ミエハイ・リパーゼ遺伝子 から得られるシグナルペプチドコード領域である。 酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシ エ・α−因子及びサッカロミセス・セレビシエ・インベルターゼのための遺伝子 から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード領域は、前述のRomanosらの 論文(1992年)に記載されている。 これらの第1及び第2の核酸配列は、当該技術分野において周知の方法を用いて 、突然変異した宿主細胞に導入することができる。例えば、これらの配列は、こ れらの配列の1又は複数のコピーが単一の標的配列及び/又は複数の標的配列に 組込まれるような相同又は非相同的組換えによって、宿主ゲノムに導入しかつ組 込むことが できる。あるいは、これらの配列は、非組込み発現ベクター、例えば自律複製染 色体外プラスミドとして、導入しかつ維持することができる。 これらの第1及び第2の核酸配列は、両方の核酸配列の選択を強制するために、 好ましくは同じ核酸構築物に含まれるが、これらは異なる核酸構築物に含まれて もよい。各核酸構築物は、正確な位置での宿主細胞のゲノムへの相同的組換えに より、組込みを指示するために、組込み要素を含むことができる。正確な位置へ の組込みの可能性を増すために、この組込み要素は、例えば100〜1,500塩基対、 好ましくは400〜1,500塩基対、最も好ましくは800〜1,500塩基対のような、十分 な数の核酸を含むことが好ましく、これは、相同的組換えの可能性を増強するた めに、対応する標的配列と相同性が高い。この組込み要素は、宿主細胞のゲノム の標的配列と相同であるいずれかの配列であることができる。更に、この組換え 要素は、非コード又はコードの核酸配列であることができる。他方で、各核酸構 築物は、非相同的組込みにより、宿主細胞のゲノムに組込むことができる。 この核酸構築物は、適当なベクターに挿入することができるか、又は、第1及 び第2の核酸配列コード領域を、既に制御配列を含むベクターに直接挿入するこ とができる。この第1及び第2の核酸配列又は構築物は、個別のベクター上に含ま れることもできる。これらのベクターは、組換えDNA法を都合良く施すことがで き、かつ本発明の核酸配列の発現をもたらすことができるような、いずれかのベ クターであることができる。ベクターの選択は、典型的にはベクターとベクター が導入される宿主細胞との適合性によって決まるであろう。ベクターは、自律複 製ベクター、すなわち染色体外の物(entity)に存在するベクターであることがで き、その複製は、染色体 の複製とは無関係であり、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニクロモソーム 、又は人工の染色体である。あるいはベクターは、細胞に導入された場合に、ゲ ノムに組込まれ、かつそれが組込まれた染色体(複数)と共に複製されるもので あることができる。このベクターシステムは、単一のベクター、又は宿主細胞の ゲノムへ導入されたDNA全体を共に含む2個以上のベクターであることができる。 自律複製に関するベクターは、更に注目の宿主細胞においてベクターを自律的 に複製することができるような複製起点を含むことができる。細菌性の複製起点 の例は、E.コリにおける複製を可能にするプラスミドpBR322、pUC19、pACYC177 、及びpACYC184、並びにバシラス・において複製を可能にするpUB110、pE194、p TA106O、及びpAM β1の複製起点である。酵母宿主細胞において使用するための 複製起点の例は、2ミクロン複製起点、CEN6及びARS4の組合せ、並びにCEN3及びA RS1の組合せである。複製起点は、宿主細胞において、その機能的温度感受性を 生じる突然変異を有するものであることができる(例えば、Ehrlichの論文を参照 のこと、Proceedings of the National Academy of Sciences USA、75:1433(197 8))。 これらの核酸構築物、プロモーター、ターミネーター及び他の要素の連結、並 びにそれらの複製に必要な情報を含む適当なベクターへの挿入に使用する方法は 、当業者には周知である(例えば、前述のSambrookらの論文(1989)を参照のこと )。 細菌性宿主細胞の形質転換は、例えば、プロトプラスト形質転換(例えば、Ch ang及びCohenの論文を参照のこと、Molecular General Genetics、168:111-115( 1979))、コンピテント細胞の使用(例えば、Young及びSpizizinの論文、Journa l of Bacteriology、81:823-829(1961)、又はDubnau及びDavidoff-Abelsonの論 文、Jour nal of Molecular Biology、56:209-221(1971)を参照のこと)、電気穿孔法(例 えば、Shigekawa及びDowerの論文を参照のこと、Biotechniques、6:742-751(198 8))、又は接合(例えば、Koehler及びThorneの論文、Journal of Bacteriology 、169:5771-5278(1987)を参照のこと)によってもたらすことができる。 糸状菌細胞へ核酸配列を導入する当該技術分野における標準的方法は、プロト プラストの形成、このプロトプラストの形質転換、及びそれ自身公知の方法によ る形質転換されたプロトプラストの細胞壁の再形成に関する。アスペルギルス宿 主細胞の形質転換の適当な方法は、欧州特許第EP 238 023号及びYeltonらの論文 (Proceedings of the National Academy of Sciences USA、81:1470-1474(1984 ))に開示されている。フサリウム種の形質転換の適当な方法は、Malardierらの 論文(Gene、78:147-156(1989))又は同時係属出願である米国特許出願第08/269 ,449号に記されている。 酵母は、Becker及びGuarenteの論文(In Abelson,J.N.及びSimon,M.I.編集 、Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology、Methods in Enzymology、 194巻、182-187頁、Academic Press社、ニューヨーク);Itoらの論文、Journal of Bacteriology、153:163(1983);及び、Hinnenらの論文、Proceedings of th e National Academy of Sciences USA、75:1920(1978)に記された方法を用いて 形質転換することができる。 哺乳類細胞は、Graham及びVan der Ebの論文(Virology、52:546(1978))に記さ れたリン酸カルシウム沈殿法を用いた直接取りこみにより形質転換することがで きる。 本発明の方法において、細胞は、当該技術分野において公知の方法を用い、ポ リペプチド及びヘム生合成酵素の産生に適した栄養培地において培養される。例 えば、細胞は、適当な培地の中及びポリ ペプチドの発現及び/又は単離を可能にするような条件下で行われる、振盪フラ スコ培養、実験室又は工場の発酵槽中での小規模又は大規模発酵(連続発酵、バ ッチ発酵、供給バッチ(fed-batch)発酵、又は固相(solid state)発酵を含む)に よって培養することができる。この培養は、当該技術分野において公知の方法を 用いて、炭素及び窒素源、並びに無機塩を含有する、適当な栄養培地中で行われ る(例えば、Bennett,J.W.及びLaSure,L.編集、More Gene Manipulations in Fungi、Academic Press社、CA、1991年を参照のこと)。適当な培地は、商業的 業者から入手するか、もしくは、公表された組成を用いて調製することができる (例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログを参照の こと)。ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合は、このポリペプチドを培 地から直接回収することができる。ポリペプチドが分泌されない場合は、これは 細胞の溶菌液から回収される。 これらのポリペプチドは、当該技術分野において公知のポリペプチドに特異的 な方法を用いて検出することができる。これらの検出法は、特異的抗体の使用、 酵素生成物の産生、又は酵素基質の消失を含む。例えば、ポリペプチドが酵素活 性を持つ場合は、ポリペプチドの活性を測定するために、酵素アッセイを使用す ることができる。 得られるポリペプチドは、当該技術分野において公知の方法により回収するこ とができる。例えば、このポリペプチドは、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、 蒸発又は沈殿を含むが、これらに限定されるものではない常法に従い、栄養培地 から回収される。回収されたポリペプチドは、その後更に、例えば、イオン交換 クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ ラフィーなどのような、様々なクロマトグラフィー法により精製さ れる。 本発明は、更にヘム欠損突然変異細胞を破壊する方法に関する。 この方法は、下記の工程を含む: (a) ヘム欠損突然変異細胞中の遺伝子又はその一部を含む第3の核酸配列、及 び該遺伝子又はその一部内の第1の核酸配列を含む核酸構築物を導入することに より、ヘム欠損突然変異細胞中の遺伝子を置換し、ここでこの第1の核酸配列は 、ヘム生合成酵素をコードし、かつこの第1の核酸配列の導入が、ヘムを生成す ることが可能な突然変異体を生じさせ;そして (b) ヘム非含有及びヘム中間体非含有の培地において、第1の核酸配列の発現 に適した条件下で、第1及び第3の核酸配列を含む細胞を培養する。 細胞に対し外来性の遺伝子の破壊は、前述の方法のような遺伝子中の核酸残基 の導入、欠失又は置換のような、当該技術分野において周知の方法を用いて達成 することができる。第3の核酸配列は、標的遺伝子への組込みが、遺伝子を破壊 し、発現を低下または除去するような、いずれかの配列(欠失した又は標識され た対立遺伝子を生成することが望ましい)であることができる。この第3の配列 は、前述の第2の核酸配列のいずれかのサブシーケンス(subsequence)であること ができる。外来性遺伝子への組込みを確実にするために、この構築物は、先に記 した組込み要素を含むべきである。 本発明は更に、酸化的リン酸化に必須の少なくとも1種の遺伝子の修飾を含む 、第1の核酸配列をを含有する細胞の呼吸欠損突然変異体で、ここでこの突然変 異体が、同じ条件下で培養された細胞と比べて、呼吸欠損であるような突然変異 体に関する。好ましい実施態様において、この呼吸欠損突然変異体は、ヘム欠損 である。 本発明は更に、細胞の呼吸欠損突然変異体を得る方法に関し、こ れは、(a) 酸化的リン酸化に必須の遺伝子の少なくとも1種の修飾を含む核酸配 列を、該細胞に導入し;そして、(b)該核酸配列を含む工程(a)由来の細胞の突然 変異体を同定することを含み、ここでこの突然変異体が、該細胞と同じ条件下で 培養した場合に、呼吸欠損である。好ましい実施態様において、この突然変異体 は、ヘム欠損である。 本発明は、以下の実施例により更に説明されるが、これらは本発明の範囲を限 定するものとして構成されるものではない。実施例 実施例1アスペルギルス・オリザエ株A1560ゲノムDNAの抽出 アスペルギルス・オリザエ株A1560(IFO 4177)を、0.5%酵母抽出液−2%グル コース(YEG)培地25mlの中で、32℃で24時間、250rpmで増殖させた。その後菌糸 体を、Miracloth(カルビオケム社、ラ・ホヤ、CA)を通して濾過することによ り収集し、そして10mMトリス−1mM EDTA(TE)緩衝液25mlで洗浄した。過剰な緩衝 液を菌糸体から抜き取り、引き続き液体窒素中で凍結した。この凍結した菌糸体 を、電動式コーヒーミル(grinder)中で細かい粉末に粉砕し、かつ粉末を、使い 捨てのプラスチック製遠心管中のTE緩衝液20ml及び20%(w/v)ドデシル硫酸ナト リウム(SDS)5mlに加えた。この混合物を、混合を確実にするためにゆっくりと数 回逆さまにし、かつ等量のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(2 5:24:1 v/v/v)で2回抽出した。酢酸ナトリウム(3M溶液)を添加し、最終濃度を0 .3Mとした後、更に2.5倍容の氷冷したエタノールを添加し、核酸を沈殿した。次 に、管を15,000×gで30分間遠心分離することによって、核酸をペレットとした 。このペレットを30分間風乾し、その後、TE緩衝液0.5mlに再懸濁した。DNase− 非含有リボヌクレ アーゼAを添加して、濃度を100μg/mlとし、この混合物を37℃で30分間インキュ ベーションした。その後、プロテイナーゼKを濃度200μg/ml添加し、この混合物 を更に1時間37℃でインキュベーションした。最後に、この混合物を、フェノー ル:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1 v/v/v)で2回抽出し、その後 DNAを先に記したように酢酸ナトリウム及びエタノールで沈殿した。このDNAペレ ットを、真空で乾燥し、TE緩衝液に再懸濁し、かつ使用時まで4℃で保存した。実施例2プラスミドpSE04の構築 実施例1に記されたものと同じ方法を用いて、アスペルギルス・ニジュランス 株A26(Fungal Genetics Stock Center、カンサスシティー、KS)からゲノムDNA を得た。アスペルギルス・ニジュランスA26ゲノムDNAを含む増幅反応液から得た PCR断片の連結により、プラスミドpSE04を構築した。この増幅反応液は、以下の 成分を含んだ:アスペルギルス・ニジュランスA26ゲノムDNAを50ng、dATP、dCTP 、dGTP及びdTTP(ベーリンガーマンハイム社、インディアナポリス、IN)を各々 100μM、プライマーALAS3d 5’TTTATGATGGAGGCCCTTCTCCAGCAGTCTC 3’(配列番号 :5)及びALAS4e 5’CTATGCATTTAAGCAGCAGCCGCGACTGG 3’(配列番号:6)を50ピコ モル、Taq DNAポリメラーゼ(パーキンエルマー社、ブランチバーグ、NJ)を2ユ ニット、及び1×Taq DNAポリメラーゼ緩衝液(パーキンエルマー社、ブランチバ ーグ、NJ)。この反応液を、95℃で1分間、55℃で1分間、及び72℃で90秒間の各 30サイクルにプログラムされたパーキンエルマーサーマルサイクラー(パーキン エルマー社、ブランチバーグ、NJ)中でインキュベーションした。2kbのPCR産物 を、40mMトリス酢酸−1mM EDTAニナトリウム(TAE)緩衝液による1.1%低 融点アガロースゲル(FMC社、ロックランド、MB)を用いて電気泳動した後、切 り出して単離し、かつ製造業者の指示に従いpCRIIベクター(インビトロゲン社 、サンディエゴ、CA)にサブクローニングし、pSE04を生成した(図1)。実施例3アスペルギルス・オリザエ株A1560のDNAライブラリー及びALAシンター ゼ(hemA)クローンの同定 アスペルギルス・オリザエ株A1560ゲノムDNAライブラリーを、製造業者の指示 に従ってバクテリオファージクローニングベクターλZipLox(ライフテクノロジ ー社、ゲティスバーグ、MD)を用い、組換えバクテリオファージのプレーティン グ及び精製のための宿主としてE.コリY1090ZL細胞を、並びに個々のpZL1-hemAク ローンの切り出しにはE.コリDH1OBzipを用いて構築した。実施例1において記し たように調製した細胞DNA全体を、Tsp5O9Iにより部分的に消化し、かつ1%アガ ロースゲルで、50mMトリス−50mMホウ酸−1mM EDTAニナトリウム(TBE)緩衝液に よりサイズ分画した。サイズ範囲4〜7kbに移動したDNA断片を切り出し、かつPre p-a-Gene試薬(バイラドラボラトリー社、ヘラクレス、CA)を用いてゲルから溶 出した。この溶出したDNA断片を、EcoRIで切断しかつ脱リン酸化したλZipLoxベ クターアームで連結し、かつこの連結混合物を、市販のパッケージング抽出物( ストラータジーン社、ラホヤ、CA)を用いて、パッケージングした。このパッケ ージングしたDNAライブラリーを、E.コリYlO9OZL細胞に導入し、かつ増幅した。 増幅されなかったゲノムライブラリーは1×106pfu/mlを含む。 バクテリオファージDNAの7×104プラークは、2枚の円形のNytran Plus膜(シ ュレイヒャー・シュエル社、キーン、NH)に移し、かつ実施例2に記載されたプ ラスミドpSEO4由来のアスペルギル ス・ニジュランスhemAゲノムDNAのPCR増幅により調製したジゴキシゲニン(DIG) で標識したプローブでプロービングした。この増幅反応液は、以下の成分を含ん だ:1×DIGプローブ合成混合液(ベーリンガーマンハイム社、インディアナポリ ス、IN)、dATP、dCTP、dGTP及びdTTPを各々100μM、実施例2に記されたプライマ ーALAS3d及びプライマーALAS4eを50ピコモル、Taq DNAポリメラーゼを2ユニット 、及び1×Taq DNAポリメラーゼ緩衝液。この反応液を、95℃で1分間、55℃で1分 間、及び72℃で2分間の各30サイクルにプログラムしたパーキンエルマーサーマ ルサイクラー中でインキュベーションした。変性したプローブを、このハイブリ ダイゼーション緩衝液に2ng/mlの濃度で添加し、かつプレハイブリダイゼーショ ンした膜と一晩インキュベーションした。プレハイブリダイゼーション及びハイ ブリダイゼーションを、5×SSC、0.1%サルコシル、0.02%SDS、1%Genius阻害 剤(ベーリンガーマンハイム社、インディアナポリス、IN)、及び30%ホルムア ルデヒドの中で、42℃で行った。これらの膜を、5×SSC-0.1%SDSで2回洗浄し、 引き続き2×SSC-0.1%SDSで2回洗浄した。各洗浄は、室温で15分かけて行った。 洗浄した膜を、室温で約2時間コダックX-OMAT ARフィルムに露し、その後コニカ QX-70自動フィルム処理装置で製造業者の指示に従い現像した。初代プラークを 精製し、かつ二次スクリーニングを行った。5種のクローンを同定し、かつ製造 業者の指示に従いpZL誘導体に切断した(ベセスダリサーチラボラトリー社、ゲ イサースバーグ、MD)。これらのpZL誘導体を、E.コリDH5 αのpSE11、pSE13、p SE15、pSE17、及びpSE20と称した。これらのクローンは、図2に示した制限地図 の4.2kb領域に重なりかつ長さが及ぶことがわかった。実施例45- アミノレブリン酸シンターゼ(hemA)プローブによるアスペルギルス ・オリザエ株A1560ゲノムDNAのサザンハイブリダイゼーション 実施例1に記したように調製したアスペルギルス・オリザエ株A1560ゲノムDNA( 10μg)を、BamHI又はEcoRIのいずれかで消化した。これらの断片を、1%アガロ ース-TBEゲル電気泳動により分離した。DNAを、製造業者の指示に従いTurboBlot 装置(シュレイヒャーシュエル社、キーン、NH)を用い、0.4N NaOH中で、Nytra n Plus膜に転移した。この膜を、Hybaid炉(ラブネット社、ウッドリッジ、NJ) の中で、5×SSC、0.1%サルコシル、0.02%SDS、1%Genius阻害剤、及び50%ホ ルムアルデヒドの中で、42℃で、プレハイブリダイゼーションした。ハイブリダ イゼーションは、hemAクローンpSE17を鋳型とし、プライマーhemA5’5'-TCATTTA AATGATGGAGTCTCTTCTCC-3'(配列番号:7)及びプライマーhemA3’5'-TCTTAATTAATC AGCTCACATGCGGG-3'(配列番号:8)を用いた以外は、実施例3に記されたPCR増幅に よって生成したDIG-標識したhemAプローブにより達成した。DIG-標識したhemAプ ローブ(1ngプローブ/ml溶液)を、新鮮なハイブリダイゼーション緩衝液に添加し 、かつ前述の膜を一晩42℃インキュベーションした。引き続き、この膜を、2回 、5×SSC−0.1%SDSで、各々室温で15分間洗浄し、その後同じ条件で、2×SSC− 0.1%SDSで2回洗浄した。この洗浄した膜を、コダックX-OMAT ARフィルムを、室 温でおよそ2時間露し、その後コニカQX-70自動フィルム処理装置を製造業者の指 示に従って用いて現像した。 アスペルギルス・オリザエhemAプローブによるアスペルギルス・オリザエゲノ ムDNAのサザンブロットハイブリダイゼーションは、1個の遺伝子コピー数に一致 したハイブリダイゼーションシグナル を示した。BamHIのレーンに認められた1.7kbバンドを、制限地図から予想した( 図2)。実施例5アスペルギルス・オリザエA1560の5-アミノレブリン酸シンターゼ(hem A)遺伝子の特徴 実施例3に示したE.コリDH5 α pSE17に、以下の方法に従ったDNA塩基配列決定 を行った。DNA塩基配列決定を、M13リバース(48)プライマー及びM13フォワード( -20)プライマー(ニューイングランドバイオラド社、ビバリー、MA)並びに配列 決定されるDNAに対する独自のプライマーを用いたダイ−ターミネーター化学(Gi eseckeらの論文、Journal of Virol Methods、38:47-60(1992))によるプライマ ーウォーキング法を用いて、両鎖について、アプライドバイオシステムモデル37 3A自動DNAシークエンサー(アプライドバイオシステム社、フォスターシティー 、CA)を用いて行った。 クローン化された遺伝子のヌクレオチド配列は、図3に示された1911個のヌク レオチドのオープンリーディングフレームを明らかにした(配列番号:1)。この コード配列は、cDNAクローニング及び配列分析によって確認したところ、いかな るイントロンも含まなかった。このことは5'末端に1個のイントロンを含むアス ペルギルス・ニジュランスhemA遺伝子とは対照的であった(Bradshawらの論文、C urrent Genetics、23:501-507(1993))。 アスペルギルス・オリザエ株A1560遺伝子産物の推定されたアミノ酸配列は、 図3に示した(配列番号:2)。このヌクレオチド配列は、分子量68kDaである、ア ミノ酸636個の予想されたタンパク質をコードしている。この酵素はミトコンド リアに位置しているので、そのN-末端は、ミトコンドリアのリーダー配列を含む ことが予想された。実際に、この初めの35個のアミノ酸は、セリン、トレオニ ン、リシン、及びアルギニン残基が豊富であり、ミトコンドリアのリーダーとし ての機能に一致している。実施例6PCR によるゲノムポルホビリノーゲンシンターゼ遺伝子(hemB)プローブ の作成 縮重したPCRプライマーを、アスペルギルス・オリザエに由来する126bp hemB 断片に隣接するアミノ酸配列(Jesper Vindの論文、1994年、Ph.D.Dissertatio n、University of Copenhagen、コペンハーゲン、デンマーク)、並びに酵母及 びヒトのhemBクローンの相同領域(Myersらの論文、Journal of Biological Chem istiy、262:16822-16829(1987);Wetmurらの論文、Proceedings of the Nationa l Academy of Sciences USA、83:7703-7707(1986))を基にデザインした。これら のオリゴヌクレオチドプライマーを、アプライドバイオシステムモデル394 DNA/ RNAシンセサイザーを用いて合成した。以下に示したセンス及びアンチセンスプ ライマーを用いて、鋳型としてpJVi6O(前述のVindの論文、(1994))を用いて、he mB断片をPCR増幅した。 センス:5'-GT(AGCT)GC(AGCT)CC(AGCT)(AT)(CG)(AGCT)GA(CT)ATGATGGA-3'(配列 番号:9) アンチセンス:5'-GC(AG)TC(AGCT)CG/T(AG)AA(AGCT)CC(AG)TA-3'(配列番号:10) このPCR反応液(50μl)は、10mMトリス-HCl pH8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0 .01%(w/v)ゼラチン、dATP、dCTP、dGTP及びdTTPを各々200μM、500ngのpJVi6O 、及び前述のPCRプライマーを各々50ピコモル含んだ。この反応液を、95℃で3分 間インキュベーションし、かつ80℃に冷やした。その後Taqポリメラーゼ5ユニッ トを添加した。この反応液を、95℃で30秒間、45℃で1分間、及び 72℃で1分間で各35サイクルにプログラムしたパーキンエルマー9600サーマルサ イクラーにおいてインキュベーションした。最後のサイクルの後、反応液を72℃ で5分間インキュベーションした。予想された126bpのhemB PCR産物を、pCRIIベ クターにクローニングし、プラスミドpAJOO5-1を生成した(図4)。実施例7アスペルギルス・オリザエ株A1560DNAライブラリー及びポルホビリノ ーゲンシンターゼ(hemB)クローンの同定 アスペルギルス・オリザエ株A1560ゲノムDNAライブラリーを、実施例3のよう に構築した。 プラーク8×104のバクテリオファージDNAを、2枚の円形Nytran Plus膜(シュ レイヒャー・シュエル社、キーン、NH)に移し、かつMertz及びRashtchianの論 文(Analytical Biochemistry、221:160-165(1994))に従って、pAJ005-1のhemB断 片(実施例6を参照のこと)を増幅することによって得た、32P-標識したPCR産物 でプロービングした。この増幅反応液(50μl)は、以下の成分を含んだ:10mMト リス-HCl pH8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.01%(w/v)ゼラチン、dATP、dCTP、 dGTP及びdTTPを各々0.04mM、32P-dCTP 5μl(3000Ci/mmol、3.3μM;アマシャム 社、アーリントンハイツ、IL)、並びにセンスプライマー5'-GTGGCTCCGAGTGATAT -3'(配列番号:11)及びアンチセンスプライマー5'-GCATCGCGAAAAGGACCG-3'(配列 番号:12)を各々50ピコモル。この反応液を、95℃で3分間加熱し、その後Taqポ リメラーゼ5ユニットを添加した。その後この反応液を、95℃で1分間、55℃で1 分間、及び72℃で1分間の各30サイクルにプログラムしたパーキンエルマーサー マルサイクラー中でインキュベーションした。この反応液を、セファデックスG5 0カラム(ファルマシア社、アラメダ、CA)を通し、取り込まれていない ヌクレオチドを除去し、かつその後変性し、ハイブリダイゼーション緩衝液に添 加した。変性したプローブ(106cpm/ml)を、ハイブリダイゼーション緩衝液に添 加し、かつプレハイブリダイゼーションした膜と一晩インキュベーションした。 プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを、5×SSC、50mMリン 酸ナトリウムpH7、5×デンハルト溶液、0.01%(w/v)SDS、5mM EDTA pH8、10μg/ ml変性したサケ精巣DNA、及び50%ホルムアルデヒドの中で、42℃で行った。こ れらの膜を、42℃で15分かけて、0.1×SSC、0.1%SDSで4回洗浄した。陽性シグ ナルを発する初代プラークを、二次スクリーニングし、製造業者の指示に従い精 製した。陽性シグナルを発する10種のゲノムクローンを、製造業者の指示に従い 、pZL誘導体として、λZipLoxベクターから切り出し(ベセスダリサーチラボラ トリー社、ベセスダ、MD)、並びにHattori及びSakakiの論文(Analytical Bioch emistry、152:232-237(1986))の方法に従い塩基配列決定した。このpZL誘導体を 、pAJ007-1からpAJ007-10と称した。クローンE.コリDH5 αのpAJ007-6は、制限 地図を基にした3.7kbゲノム断片を含み、更に分析した。実施例8ポルホビリノーゲンシンターゼ(hemB)遺伝子の特性決定 実施例7に記したE.コリDH5 α pAJOO7-6について、実施例7に記した方法に従 い、DNA塩基配列決定を施した。 クローニングしたアスペルギルス・オリザエA1560 hemB遺伝子のヌクレオチド 配列は、図5に示した推定分子量40kDaの374個のアミノ酸のポリペプチド(配列 番号:4)をコードしている、図5に示した1308個のヌクレオチドのオープンリー ディングフレーム(配列番号:3)を明らかにした。このヌクレオチド配列は、 コンセンサス配列のスプライシング部位に挟まれた48bpの予想されるイント ロンを含み、かつUnklesの論文(1992年、Applied Molecular Genetics of Filam entous Fungi、第2章、J.R.Kinghorn及びG.Turner編集、Blackie Academic an d Professional Publications)によって予想された内部コンセンサス配列を含む 。3'スプライシング部位(TAG)は、Metの254bp下流に位置し、5'スプライシング 部位(GTCCGC)は、3'スプライシング部位の46bp上流に位置し、かつ内部コンセン サス配列(TCTAAC)は、5'スプライシング部位の30bp下流に位置した。この5'非翻 訳領域は、-377及び-233の位置に2個のCAATモチーフを含み、かつ転写調節にお いて重要な役割を果たす(Gurrらの論文、1987年、In Kinghorn,J.R.(編集)、G ene Structure in Eukaryoric Microbes、93-139頁、IRL Press、オックスフォ ード)。これに加えて、いくつかの予想されるTATA様ボックスが、3'非翻訳領域 に見つけられた(-117、-208、-650)。予想されたように、hemBは、植物以外の生 物では細胞質であるので、これはN-末端にリーダー配列を含むようには見えなか った(Bottemley及びMuller-Eberhardの論文、Seminars in Hematology、25:282- 302(1988))。実施例9hemA Δ::pyrG対立遺伝子を含むpSF52の構築 プラスミドpSES2を、図6に示したようにhemAΔ::pyrG対立遺伝子を含むように 構築した。特に、アスペルギルス・オリザエpyrG遺伝子並びに5'及び3'の両方の フランキングDNAを含み、pyrGマーカーの組換え及び除去を促進するようにデザ インされた直接反復を含む4.1kb断片を、Expand PCRキット(ベーリンガーマン ハイム社、インディアナポリス、IN)を製造業者の指示に従って使用し、そして 以下に示したプライマーhemAdel.A及びhemAdel.Bを用い、pJaL 394から増幅した : hemAdel.A:5'-ATCCATTGAAGCATCCAGGGTTATTGTCTC-3'(配列番号:13) hemBdel.A:5'-GGATTGACGAAGCAGAGGATGACGATGAGC-3'(配列番号:14) このExpand PCR増幅は、94℃で2分間、62℃で30秒間、及び68℃で3分間の1サ イクル;各サイクルの後30秒間の延長を伴う、94℃で15秒間、62℃で30秒間、及 び68℃で3分間の10サイクル;94℃で15秒間、62℃で30秒間、及び72℃で5分間の 15サイクル;並びに、4℃の浸漬サイクルにプログラムし、パーキンエルマーGen eAmp PCRシステム9600において実施した。 この産物は、製造業者の指示に従いpCRII(インビトロゲン社、サンディエゴ 、CA)にクローニングし、pSE4Oを生成し、かつそのオープンリーディングフレ ーム(ORF)のヌクレオチド配列を、2種の独立したクローンにおいて確認した。py rG遺伝子を含むpSE40のEcoRI断片を、pSE17のEcoRI部位に連結し、これをhemA遺 伝子の3'フランキング配列のpyrG遺伝子に置き、pSE41を生成した。pSE41は、平 滑末端を生じる酵素MluNI及びEco47IIIで消化し(hemA ORFの445bp断片から取り 出す)、ゲルで精製し、かつ再度連結し、プラスミドpSE48bを生成した。この欠 失を含むhemA遺伝子の領域を塩基配列決定し、hemAΔ::pyrG対立遺伝子の性質を 確認した。図7に示されたように、配列決定は、hemA欠失が、該遺伝子のコード 配列を除去し、かつリーディングフレームを破壊することを明らかにした(配列 番号:15及び16)。この対立遺伝子は、製造業者の指示に従いExpand PCRキット を用い、かつ以下に示したプライマーSE48up及びSE48dwnを用いて、前述と同じ 条件下で、pSE48bからPCR増幅した: SE48up:5'-AATGGTCAAAACTGGCTCCTAC-3'(配列番号:17) SE48dwn:5'-TGTACCTGTTCTTGGGCTGTC-3'(配列番号:18) その後このPCR増幅した断片を、pCR2.1(インビトロゲン社、サンディエゴ、C A)にサブクローニングし、pSE52を生成し、制限エンドヌクレアーゼSacI及びNo tIによりhemAΔ::pyrG対立遺伝子を含む6.3kb断片の単離を行った。6.3kbのSacI -NotI断片は、hemA遺伝子のゲノムコピーによる相同組換えを促進する、約700bp の5'及び3'の両方のフランキングDNAを含んでいた。実施例10hemA Δ::pyrG対立遺伝子断片によるアスペルギルス・オリザエの形質 転換 野生型hemA遺伝子をhemAΔ::pyrG欠失対立遺伝子と置換するために、アスペル ギルス・オリザエHowB425を、SacI-NotIで切断された6.3kbのhemAΔ::pyrG断片 約20μgで形質転換した。この形質転換は、プロトプラストにより、濃度2×107 プロトプラスト/mlで行った。プロトプラスト100μlを、34℃で、10μg DNA、 及び60% PEG4000-10mM HEPES-10mM CaCl2溶液200μlと共に、30分間インキュベ ーションした。SPTC(40% PEG4000、0.8Mソルビトール、0.05M トリスpH8.0、0.0 5MCaCl2)3mlを添加し、かつこのプロトプラストを、2.5mM又は5mMのいずれかの5 -アミノレブリン酸を補った最小培地の上に直接接種した。5-アミノレブリン酸 栄養要求性を、5-アミノレブリン酸非含有最小培地上での初代形質転換体の34℃ での増殖を評価することによって決定した。これらの条件下での増殖が不十分と 判定された菌株は、単一のコロニーの単離のために線状に接種した。この精製し た単一のコロニー単離体に、その後、一次スクリーニングにおいて記したものと 同じ条件を用いて、5-アミノレブリン酸栄養要求性二次スクリーニングを行った 。 欠失対立遺伝子を伴うアスペルギルス・オリザエHowB425の形質 転換体を265コロニー得た。5-アミノレブリン酸非含有最小培地上での240の初代 形質転換体のスクリーニングでは、増殖が不充分であるとみなされたのは15株で あった。二次スクリーニングにおいて11株が最小培地上で非常に増殖不良を示し 、かつ6株SE29-70、29-86、29-87、29-180、29-192及び29-197を、更なる単一の コロニーの精製及びサザン分析のために選択した。 6種の各形質転換体からのゲノムDNA(10μg)を、実施例1に記したように調製し 、かつBamHIで消化した。これらの断片を、1%アガロース-TBEゲル上で電気泳動 し、分離した。DNAを、製造業者の指示に従いTurboBlot装置(シュレイヒャー・ シュエル社、キーン、NH)を用い、0.4N NaOH中で、HybondNナイロン膜(アマシ ャム社、アーリントンハイツ、IL)に移した。この膜を、Hybaid炉(ラブネット 社、ウッドリッジ、NJ)において、5×SSC、0.1%サルコシル、0.02%SDS、1%G enius阻害剤、及び50%ホルムアルデヒド中で、42℃で2時間、プレハイブリダイ ゼーションした。プローブを、以下に示したプライマーhemAdelup1及びhemAdeld wn1を用いて、pSE17のPCR増幅により調製した: hemAdelup1:5'-AGGCCTCTTGGGTTATGAATG-3'(配列番号:19) hemAdeldwn1:5'-TGACCTGGAGATTAGACATAG-3'(配列番号:20) この増幅反応液(100μl)は、以下の成分を含んだ:1μgのpSE17、50ピコモル のhemAdelup1プライマー、50ピコモルのhemAdeldwn1プライマー、dATP、dCTP、d GTP、及びdTTPを各200μl、1×Taqポリメラーゼ緩衝液(パーキンエルマー社、 ブランチバーグ、NJ)、及び5ユニットのTaqポリメラーゼ(パーキンエルマー社 、ブランチバーグ、NJ)。この反応液を、以下のようにプログラムされたパーキ ンエルマーモデル480サーマルサイクラーにおいてインキュベーションした:サ イクル1−95℃で5分間、55℃で2分間、及 び72℃で5分間;サイクル2−30〜95℃で1分間、55℃で1分間、及び72℃で1分間 ;並びに4℃の浸漬サイクル。 このPCR産物DNAを、ゲルで単離し、QiaPureカラム(キアゲン(Qiagen)社、チ ャストウォース、CA)を用いて精製し、エタノール沈殿し、かつ25μlのTE中に 再度溶解した。α−32P-dCTP-標識したプローブを、製造業者の指示に従い、Pri me-It IIキット(インビトロゲン社、サンディエゴ、CA)及び2.5μlの精製した DNAを用いて、ランダムプライミングすることにより調製した。この標識したプ ローブを、G50ミディカラム(ファイブプライム・スリープライム社、ボールダ ー、CO)を用いて精製した。この精製したプローブ(2μl、〜1×106cpm)を、最 初に0.5N NaOH中で37℃で2分間変成し、その後前述の新鮮なハイブリダイゼーシ ョン溶液10mlに添加した。一晩42℃でハイブリダイゼーションした後、この膜を 、2×SSC、0.1%SDSで、10分間室温で洗浄し、引き続き0.2×SSC、0.l%SDSで、 10分間室温で洗浄し、最後に2回、0.1×SSC、0.1%SDSで、68℃で15分間洗浄し た。この洗浄した膜を、2×SSCですすぎ、かつコダックXomat ARフィルムに露し た。 これらの菌株のサザン分析は、5株はhemAΔ::pyrG対立遺伝子のみを含み、か つ1株は野生型及びhemAΔ::pyrG対立遺伝子の両方を含むことを示した。菌株SB2 9-70、29-87及び29-197の胞子の精製を2回行い、最小培地上では増殖できない、 5-アミノレブリン酸栄養要求性を示す単離体を得た。実施例115- アミノレブリン酸又はヘミンの補充による致死的hemA欠失表現型の 救済 5-アミノレブリン酸又はヘミンのいずれかがhemA欠失表現型を救済する能力は 、増殖培地の補充によって示された。 5-アミノレブリン酸(ポルフィリンプロダクツ社、ローガン、UT)の250mM保 存溶液を、水を溶媒として調製し、0.22ミクロンフィルターで滅菌し、−20℃で 暗所保存し、使用直前に調製した培地に添加又は注入した。濃度が0.005mg/ml〜 0.3mg/mlの範囲の5-アミノレブリン酸を、最小寒天培地又はYEG液体培地に添加 した(1リットルにつき酵母抽出物5g及びグルコース20g)。 ヘミンの10mg/ml保存溶液を、50mM NaOHを溶媒として新たに調製し、0.22ミク ロンフィルターで滅菌し、使用時まで氷上で保存した。濃度が0.05mg/ml〜0.2mg /mlの範囲のヘミンを、最小寒天培地に添加した。 結果は、5-アミノレブリン酸を、30μM(5.0μg/ml)と低い濃度で最小寒天培地 に添加した場合は、この栄養要求性表現型を救済するのに十分であることを示し た。液体YEG培地における増殖には、わずかに高い濃度が必要であった(1mMまで) 。 結果は更に、ヘミンを最小培地に添加した場合には、試験したあらゆる欠損菌 株の増殖も支持することができなかったことを示した。これらのヘミン濃度は、 野生型hemA遺伝子を含む株の増殖を阻害しなかった。別の増殖培地でヘミン添加 の条件は、hemA表現型の救済を可能にした。実施例12野生型hemAによる形質転換体のhemAの欠失表現型の救済 形質転換体の救済は、第1の単一のコロニー単離体アスペルギルス・オリザエ 株SE29-70から調製したプロトプラストにおいて行った。 実施例8に記された方法に従い、アスペルギルス・オリザエ株SE29-70のプロト プラストを、4.2kbゲノムhemA領域を含むpSE17、又はNA2-tpiプロモーターに融 合したhemA ORFを含むpSE31のいず れかの10μgで、形質転換し、かつ5-アミノレブリン酸非含有の最小培地に接種 し、34℃でインキュベーションした。形質転換されたコロニーは、2日間インキ ュベーションした後明確になったが、多くの比較的小さい“未発達の”コロニー であった。真の形質転換体は、更なる日数インキュベーションした後のより大き いサイズ及び良く胞子を形成する能力によって区別することができた。pSE17に より200コロニーを得、かつpSB31により299コロニーを得る一方で、“DNAの無い ”対照プレートではわずかに28コロニーが明確になった。形質転換の効率は、20 〜30形質転換体/μg DNAの範囲であった。 更なる分析のために選択した全てのコロニーは、5-アミノレブリン酸原栄養体 であることがわかった。DNAを、8種のpSE17形質転換体から単離し(菌株SB40-1-7 、9及び10と称される)、並びに実施例10に記された方法に従って行ったサザン分 析は、これらがhemA欠失対立遺伝子に加えて、無傷のhemA遺伝子の少なくとも1 個のコピーを含むことを明らかにした。このデータは、hemA欠失表現型が、野生 型hemA遺伝子で形質転換されることによって救済できることを確認している。 微生物の寄託 以下の菌株が、ブダペスト条約に従い、the Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Laboratory(NRRL)( 1815 University Street,Peoria,Illinois 61604,USA)に寄託されている。 菌株 受託番号 寄託日 E.コリ DH5α(pSE17) NNRL B-21563 1996年4月22日 E.コリ DH5α(pAJ007-6) NRRL B-21564 1996年4月22日 これらの菌株は、37連邦法施行規則(C.F.R.)第1.14項及び35米国成文法(U.S.C .)第122項の下で資格を与えられた特許局長によって決定が成されるまでの本特 許出願の審査期間中に、培養物が入手できることを保証にする条件の下で寄託さ れている。これらの寄託物は、本出願の対応特許又はその継続特許が出願された 国において外国特許法によって必要とされる場合に入手できる。しかしながら、 寄託物の利用可能性は、政府通知により付与された特許権の減損において本発明 の実施許諾を構成するものではないことは理解されなければならない。 本願明細書に記載されかつ請求された発明は、ここに明らかにされた具体的な 実施態様は、本発明のいくつかの態様を例証することが意図されているので、こ れらの実施態様によって範囲が制限されるものではない。あらゆる同等の実施態 様が、本発明の範囲内であることが意図されている。実際に、本願明細書に示さ れかつ記載されたものに加え、本発明の様々な修飾が、前述の説明から、当業者 には明らかであろう。このような修飾は更に、添付された請求の範囲内に納まる ことが意図されている。 本願明細書に引用された様々な参照文献、それらの内容は、その全体が参照と して組み入れられている。
【手続補正書】特許法第184条の8第1項 【提出日】平成11年4月15日(1999.4.15) 【補正内容】 請求の範囲 1. ポリペプチド製造法であって: (a) 細胞の呼吸欠損突然変異体を培養し、ここで該突然変異体細胞は1又は複 数の第1の核酸配列及び第2の核酸配列を含んで成る核酸構築物を含み、ここで前 記第1の核酸配列は、発現の際に呼吸欠損を補完し、そして第2の核酸配列は前記 ポリペプチドをコードしており、前記培養を前記の第1及び第2の核酸配列の発現 に適した好気的条件下で行い;そして (b) この細胞の培養培地から前記ポリペプチドを単離する; 工程を含んで成る方法。 2. 前記第1の核酸配列が、電子伝達鎖の成分であるタンパク質をコードして いる、請求項1記載の方法。 3. 前記成分が、NADH-Qレダクターゼである、請求項2記載の方法。 4. 前記成分が、シトクロムレダクターゼである、請求項2記載の方法。 5. 前記成分が、シトクロムbである、請求項4記載の方法。 6. 前記成分が、シトクロムc1である、請求項4記載の方法。 7. 前記成分が、シトクロムcである、請求項2記載の方法。 8. 前記成分が、シトクロムオキシダーゼである、請求項2記載の方法。 9. 前記成分が、シトクロムaである、請求項8記載の方法。 10.前記成分が、シトクロムa3である、請求項8記載の方法。 11.前記第1の核酸配列が、ユビキノンの生合成に関連した酵素をコードして いる、請求項1記載の方法。 12.前記第1の核酸配列が、フラビンの生合成に関連した酵素を コードしている、請求項1記載の方法。 13.前記第1の核酸配列が、ヘムの生合成に関連した酵素をコードしている、 請求項1記載の方法。 14.前記第1の核酸配列が、5-アミノレブリン酸シンターゼ、ポルホビリノー ゲン・シンターゼ、ポルホビリノーゲン・デアミナーゼ、ウロポルフィリノーゲ ン・シンターゼ、ウロポルフィリノーゲン・デカルボキシラーゼ、コプロポルフ ィリノーゲン・オキシダーゼ、プロトポルフィリノーゲン・オキシダーゼ、フェ ロキレターゼ、グルタミン酸-tRNAgluシンターゼ、グルタミン酸-tRNAgluレダク ターゼ、及びグルタミン酸-1-セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼからな る群から選択された酵素をコードしている、請求項13記載の方法。 15.前記第1及び第2の核酸配列が、同じベクター上に含まれる、請求項1記載 の方法。 16.前記第1の核酸配列が第1のベクター上に含まれ、そして第2の核酸配列が 第2のベクター上に含まれている、請求項1記載の方法。 17.前記ポリペプチドが、該細胞に生来のものであるか又は異種性のものであ る、請求項1記載の方法。 18.前記ポリペプチドが、酵素、ホルモン、ホルモン変異体、受容体もしくは その部分、抗体もしくはその部分、又はレポーターである、請求項1記載の方法 。 19.前記酵素が、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメ ラーゼ、又はリガーゼである、請求項18記載の方法。 20.前記酵素が、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カル ボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、シクロデキストリ ン・グリコシルトランスフェラーゼ、ク チナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、 β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グリコシ ダーゼ、グルタミナーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ 、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、 ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解 酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼである、 請求項19記載の方法。 21.前記細胞が、細菌又は菌類細胞である、請求項1記載の方法。 22.前記細菌細胞が、バシラス(Bacillus)、シュードモナス(Pseudomonus)、 ストレプトマイセス(Streptomyces)、又はE.コリ(E.coli)細胞である、請求項21 記載の方法。 23.前記菌類細胞が、糸状菌細胞である、請求項21記載の方法。 24.前記糸状菌細胞が、アクレモニウム(Acremonium)、アスペルギルス(Asper gillus)、フサリウム(Fusarium)、フミコラ(Humicola)、ミセリオフソラ(Myceli ophthora)、ムコール(Mucor)、ニューロスポラ(Neurospora)、ペニシリウム(Pen icillium)、シエラビア(Thielavia)、トリポクラジウム(Tolypocladium)、又は トリコデルマ(Trichoderma)細胞である、請求項23記載の方法。 25.前記菌類細胞が、酵母細胞である、請求項21記載の方法。 26.前記酵母細胞が、カンジダ(Candida)、クルイベロミセス(Kluyveromyces) 、サッカロミセス(Saccharomyces)、スキゾサッカロミセス(Schzosaccharomyces )、ピキア(Pichia)、又はヤロウィア(Yarrowia)細胞である、請求項25記載の方 法。 27.細胞の酵素欠損突然変異体の遺伝子を破壊する方法であって、 (a) 該遺伝子又はその一部を含む第3の核酸配列及び該遺伝子又はその一部内 の第1の核酸配列を含んで成る核酸構築物を導入することによる、呼吸欠損突然 変異細胞の遺伝子を置換し、ここでこの第1の核酸配列は、発現時に呼吸欠損を 補完するものであり;そして (b) 前記第1及び第3の核酸配列を含む細胞を、第1の核酸配列の発現に適した 好気性の条件下で、培地において培養する; 工程を含んで成る方法。 28.酸化的リン酸化に必須の遺伝子の少なくとも1個の修飾を含む、第1の核酸 配列を含む細菌又は糸状菌類細胞の呼吸欠損突然変異体であって、ここで該突然 変異体が同じ条件下で培養した場合の細胞と比較して呼吸欠損である、突然変異 体。 29.ヘム欠損である、請求項28記載の呼吸欠損突然変異体。 30.細胞の呼吸欠損突然変異体を獲得する方法であって、 (a) 該細胞に、酸化的リン酸化に必須の遺伝子の少なくとも1個の修飾を含む 核酸配列を導入し;そして (b) 該核酸配列を含む工程(a)の細胞の突然変異体を同定し、ここでこの突然 変異体は該細胞と同じ条件下で培養された場合に呼吸欠損である 工程を含んで成る方法。 31.前記突然変異体がヘム欠損突然変異体である、請求項30記載の方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C12P 21/02 C12N 15/00 ZNAA (81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE, DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF ,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE, SN,TD,TG),AP(GH,GM,KE,LS,M W,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY ,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),AL,AU ,BB,BG,BR,CA,CN,CU,CZ,EE, GE,HU,IL,IS,JP,KP,KR,LC,L K,LR,LT,LU,LV,MG,MK,MN,MX ,NO,NZ,PL,RO,SG,SI,SK,TR, TT,UA,UZ,VN,YU,ZW (72)発明者 チェリー,ジョエル アール. アメリカ合衆国,カリフォルニア 95616 デービス,アンダーソン ロード 916 (72)発明者 エルロド,スーザン エル. アメリカ合衆国,カリフォルニア 95616 デービス,ホイッティア ドライブ 2415

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1. ポリペプチド製造法であって: (a) 細胞の呼吸欠損突然変異体へ、1又は複数の第1の核酸配列及び第2の核酸 配列を含む核酸構築物を導入し、ここでこの前記第1の核酸配列は、発現の際に 呼吸欠損を補完し、そして第2の核酸配列は前記ポリペプチドをコードしており ; (b) 前述の第1及び第2の核酸配列を含む細胞を、第1及び第2の核酸配列の発現 に適した好気的条件下で、培地において培養し;そして (c) この細胞の培養培地から前記ポリペプチドを単離する; 工程を含んで成る方法。 2. 前記第1の核酸配列が、電子伝達鎖の成分であるタンパク質をコードして いる、請求項1記載の方法。 3. 前記成分が、NADH-Qレダクターゼである、請求項2記載の方法。 4. 前記成分が、シトクロムレダクターゼである、請求項2記載の方法。 5. 前記成分が、シトクロムbである、請求項4記載の方法。 6. 前記成分が、シトクロムc1である、請求項4記載の方法。 7. 前記成分が、シトクロムcである、請求項2記載の方法。 8. 前記成分が、シトクロムオキシダーゼである、請求項2記載の方法。 9. 前記成分が、シトクロムaである、請求項8記載の方法。 10.前記成分が、シトクロムa3である、請求項8記載の方法。 11.前記第1の核酸配列が、ユビキノンの生合成に関連した酵素をコードして いる、請求項1記載の方法。 12.前記第1の核酸配列が、フラビンの生合成に関連した酵素をコードしてい る、請求項1記載の方法。 13.前記第1の核酸配列が、ヘムの生合成に関連した酵素をコードしている、 請求項1記載の方法。 14.前記第1の核酸配列が、5-アミノレブリン酸シンターゼ、ポルホビリノー ゲン・シンターゼ、ポルホビリノーゲン・デアミナーゼ、ウロポルフィリノーゲ ン・シンターゼ、ウロポルフィリノーゲン・デカルボキシラーゼ、コプロポルフ ィリノーゲン・オキシダーゼ、プロトポルフィリノーゲン・オキシダーゼ、フェ ロキレターゼ、グルタミン酸-tRNAgluシンターゼ、グルタミン酸-tRNAgluレダク ターゼ、及びグルタミン酸-1-セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼからな る群から選択された酵素をコードしている、請求項13記載の方法。 15.前記第1及び第2の核酸配列が、同じベクター上に含まれる、請求項1記載 の方法。 16.前記第1の核酸配列が第1のベクター上に含まれ、そして第2の核酸配列が 第2のベクター上に含まれている、請求項1記載の方法。 17.前記ポリペプチドが、該細胞に生来のものであるか又は異種性のものであ る、請求項1記載の方法。 18.前記ポリペプチドが、酵素、ホルモン、ホルモン変異体、受容体もしくは その部分、抗体もしくはその部分、又はレポーターである、請求項1記載の方法 。 19.前記酵素が、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメ ラーゼ、又はリガーゼである、請求項18記載の方法。 20.前記酵素が、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カル ボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチ ナーゼ、シクロデキストリン・グリコシルトランスフェラーゼ、クチナーゼ、デ オキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクト シダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グリコシダーゼ、グル タミナーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、 マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダ ーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌ クレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼである、請求項19記載 の方法。 21.前記細胞が、細菌又は菌類細胞である、請求項1記載の方法。 22.前記細菌細胞が、バシラス(Bacillus)、シュードモナス(Pseudomonus)、 ストレプトマイセス(Streptomyces)、又はE.コリ(E.coli)細胞である、請求項21 記載の方法。 23.前記菌類細胞が、糸状菌細胞である、請求項21記載の方法。 24.前記糸状菌細胞が、アクレモニウム(Acremonium)、アスペルギルス(Asper gillus)、フサリウム(Fusarium)、フミコラ(Humicola)、ミセリオフソラ(Myceli ophthora)、ムコール(Mucor)、ニューロスポラ(Neurospora)、ペニシリウム(Pen icillium)、シエラビア(Thielavia)、トリポクラジウム(Tolypocladium)、又 はトリコデルマ(Trichoderma)細胞である、請求項23記載の方法。 25.前記菌類細胞が、酵母細胞である、請求項21記載の方法。 26.前記酵母細胞が、カンジダ(Candida)、クルイベロミセス(Kluyveromyces) 、サッカロミセス(Saccharomyces)、スキゾサッカロミセス(Schzosaccharomyces )、ピキア(Pichia)、又はヤロウィア(Yarrowia)細胞である、請求項25記載の方 法。 27.細胞の酵素欠損突然変異体の遺伝子を破壊する方法であって 、 (a) 該遺伝子又はその一部を含む第3の核酸配列及び該遺伝子又はその一部内 の第1の核酸配列を含んで成る核酸構築物を導入することによる、呼吸欠損突然 変異細胞の遺伝子を置換し、ここでこの第1の核酸配列は、発現時に呼吸欠損を 補完するものであり;そして (b) 前記第1及び第3の核酸配列を含む細胞を、第1の核酸配列の発現に適した 好気性の条件下で、培地において培養する; 工程を含んで成る方法。 28.酸化的リン酸化に必須の遺伝子の少なくとも1個の修飾を含む、第1の核酸 配列を含む細胞の呼吸欠損突然変異体であって、ここで該突然変異体が同じ条件 下で培養した場合の細胞と比較して呼吸欠損である、突然変異体。 29.ヘム欠損である、請求項28記載の呼吸欠損突然変異体。 30.細胞の呼吸欠損突然変異体を獲得する方法であって、 (a) 該細胞に、酸化的リン酸化に必須の遺伝子の少なくとも1個の修飾を含む 核酸配列を導入し;そして (b) 該核酸配列を含む工程(a)の細胞の突然変異体を同定し、ここでこの突然 変異体は該細胞と同じ条件下で培養された場合に呼吸欠損である 工程を含んで成る方法。 31.前記突然変異体がヘム欠損突然変異体である、請求項30記載の方法。
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