JP2002510466A - Ｄｎａ配列決定のための方法、試薬溶液およびキット - Google Patents
Ｄｎａ配列決定のための方法、試薬溶液およびキットInfo
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Abstract
(57)【要約】
置換基で標識した、例えば、染料で標識したddＮＴＰ、および熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用するＤＮＡ配列決定反応の効率を改良する溶液を開示する。その溶液の成分には、有効な濃度のマンガンイオンおよび金属イオン緩衝液化合物が含まれる。そのような溶液の使用もまた記載する。
Description
【０００１】発明の分野 本発明は、ＤＮＡ配列決定における使用のための緩衝溶液、およびそのような
溶液の使用に関する。
溶液の使用に関する。
【０００２】発明の背景 以下は、関連技術の論議であって、これらはいずれも、掲示する請求の範囲に
対して先行技術であると認めるものではない。
対して先行技術であると認めるものではない。
【０００３】 ＳangerによるＤＮＡ配列決定、またはチェーンターミネーション法は、数年 間、一般に使用されている。配列決定すべき試料を４つの部分に分け、各々の部
分を適当なプライマーにハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシ
ヌクレオチドを使用して、そのプライマーを伸張するのがよい。反応混合物にお
ける様々なジデオキシヌクレオチドの取り込みは、ＤＮＡフラグメントの収集が
１つのヌクレオチドで互いに異なって得られるよう、鎖伸張反応を連続位置で終
わらせる。Ｔ７ ＤＮＡ ポリメラーゼまたはＥ coli ＤＮＡ ポリメラーゼは、 そのような手順で使用されることが多い。ＴaborおよびＲichardson(Ｐroc. Ｎa
tl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ ８６：４０７６−４０８０（１９８９）)は、Ｔ７ Ｄ
ＮＡ ポリメラーゼまたはＥ coli ＤＮＡ ポリメラーゼを使用するＤＮＡ配列決
定において補因子として作用する、マグネシウムイオンに代えてのマンガンイオ
ンの置換が、これらのポリメラーゼのジデオキシヌクレオチド(ddＮＴＰ)に対す
る識別力を減少させることを示しており、Ｊ. Ｂiol. Ｃhem. ２６５：８３２２
−８３２８（１９９０）では、Ｔ７ ＤＮＡ ポリメラーゼを使用して一定強度の
ジデオキシ末端フラグメントを生成するための、マンガンイオンおよびピロホス
ファターゼの使用を記載している。しかしながら、これらの酵素は、染料で標識
したddＮＴＰを配列決定反応において使用する場合、最適に作用しない。
分を適当なプライマーにハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシ
ヌクレオチドを使用して、そのプライマーを伸張するのがよい。反応混合物にお
ける様々なジデオキシヌクレオチドの取り込みは、ＤＮＡフラグメントの収集が
１つのヌクレオチドで互いに異なって得られるよう、鎖伸張反応を連続位置で終
わらせる。Ｔ７ ＤＮＡ ポリメラーゼまたはＥ coli ＤＮＡ ポリメラーゼは、 そのような手順で使用されることが多い。ＴaborおよびＲichardson(Ｐroc. Ｎa
tl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ ８６：４０７６−４０８０（１９８９）)は、Ｔ７ Ｄ
ＮＡ ポリメラーゼまたはＥ coli ＤＮＡ ポリメラーゼを使用するＤＮＡ配列決
定において補因子として作用する、マグネシウムイオンに代えてのマンガンイオ
ンの置換が、これらのポリメラーゼのジデオキシヌクレオチド(ddＮＴＰ)に対す
る識別力を減少させることを示しており、Ｊ. Ｂiol. Ｃhem. ２６５：８３２２
−８３２８（１９９０）では、Ｔ７ ＤＮＡ ポリメラーゼを使用して一定強度の
ジデオキシ末端フラグメントを生成するための、マンガンイオンおよびピロホス
ファターゼの使用を記載している。しかしながら、これらの酵素は、染料で標識
したddＮＴＰを配列決定反応において使用する場合、最適に作用しない。
【０００４】 Ｓangerの配列決定の使用における主な改良点は、ジデオキシヌクレオチド(dd
ＮＴＰ)をデオキシヌクレオチドと同じぐらい効率よく取り込み、それによって 、前者の濃度を減少させることができるようにし、配列決定の過程を穏やかに促
進する、一群の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの発見であった(欧州特許第６５５ ５０６ Ｂ１号)。
ＮＴＰ)をデオキシヌクレオチドと同じぐらい効率よく取り込み、それによって 、前者の濃度を減少させることができるようにし、配列決定の過程を穏やかに促
進する、一群の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの発見であった(欧州特許第６５５ ５０６ Ｂ１号)。
【０００５】 ヌクレオチド結合ドメインにおけるフェニルアラニンをチロシンで置換して、
エキソヌクレアーゼ活性を減少または喪失させた熱安定性 Ｐol Ｉ ファミリー のポリメラーゼが特に有利である。そのようなポリメラーゼは、Ｐerkin−Ｅlme
r ＣorporationのＡＢＤ部門により商標 ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＦＳという名で、お
よびＡmersham Ｌife Ｓcienceにより商標 ＴＨＥＲＭＯ ＳＥＱＵＥＮＡＳＥと
いう名で市販されており、これらは両方とも、変異したＴhermus aquaticus 酵 素である。
エキソヌクレアーゼ活性を減少または喪失させた熱安定性 Ｐol Ｉ ファミリー のポリメラーゼが特に有利である。そのようなポリメラーゼは、Ｐerkin−Ｅlme
r ＣorporationのＡＢＤ部門により商標 ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＦＳという名で、お
よびＡmersham Ｌife Ｓcienceにより商標 ＴＨＥＲＭＯ ＳＥＱＵＥＮＡＳＥと
いう名で市販されており、これらは両方とも、変異したＴhermus aquaticus 酵 素である。
【０００６】 フェニルアラニン置換のためにチロシンを含むＰol Ｉ ファミリーのＤＮＡポ
リメラーゼおよび32Ｐで標識したジデオキシヌクレオチドを使用する際、Ｔabor
およびＲichardson(Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ ９２：６３３９−６３
４３（１９９５）)は、反応混合物におけるマグネシウムに代えてのマンガンの 置換には、Ｅ. coli ＤＮＡ ポリメラーゼ ＩＦ７６２ＹおよびＴaq ＤＮＡ ポ リメラーゼ Ｆ６６７ＹによるddＮＴＰの使用に対して有意な効果がないことを 報告した。
リメラーゼおよび32Ｐで標識したジデオキシヌクレオチドを使用する際、Ｔabor
およびＲichardson(Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ ９２：６３３９−６３
４３（１９９５）)は、反応混合物におけるマグネシウムに代えてのマンガンの 置換には、Ｅ. coli ＤＮＡ ポリメラーゼ ＩＦ７６２ＹおよびＴaq ＤＮＡ ポ リメラーゼ Ｆ６６７ＹによるddＮＴＰの使用に対して有意な効果がないことを 報告した。
【０００７】 発明の要約 置換基で標識した、例えば、染料で標識したddＮＴＰおよび熱安定性 Ｐol Ｉ
ファミリーのＤＮＡポリメラーゼを使用する場合の配列決定反応から得られた 結果は、特定濃度のマンガンおよび酒石酸または等価金属イオン緩衝液を加える
ことにより改良することができる。改良した結果は、バンド強度(ピークの高さ)
における変化がマンガンイオンなしに同じ染料で標識したddＮＴＰを使用する場
合に通常得られるより少ないものとして観測される。
ファミリーのＤＮＡポリメラーゼを使用する場合の配列決定反応から得られた 結果は、特定濃度のマンガンおよび酒石酸または等価金属イオン緩衝液を加える
ことにより改良することができる。改良した結果は、バンド強度(ピークの高さ)
における変化がマンガンイオンなしに同じ染料で標識したddＮＴＰを使用する場
合に通常得られるより少ないものとして観測される。
【０００８】 従って、本発明は、０.５mＭ〜３.０mＭの濃度でのマンガンイオンおよび５m Ｍ〜５０mＭの濃度での金属イオン緩衝液を含んでなる溶液を提供する。マンガ ンの濃度は、０.５mＭ〜１.０mＭ、または０.５mＭ〜２.０mＭ、または０.５mＭ
〜２.５mＭであるのが好ましく、金属イオン緩衝液の不存在下には約０.８mＭで
あるのが最も好ましく、金属イオン緩衝液の存在下には約１.５mＭであるのが最
も好ましい。好ましくは、その溶液中のマンガン濃度は、重合反応混合物におい
て３.０mＭ未満である。金属イオン緩衝液の濃度は、５mＭ〜５０mＭであるのが
好ましい。
〜２.５mＭであるのが好ましく、金属イオン緩衝液の不存在下には約０.８mＭで
あるのが最も好ましく、金属イオン緩衝液の存在下には約１.５mＭであるのが最
も好ましい。好ましくは、その溶液中のマンガン濃度は、重合反応混合物におい
て３.０mＭ未満である。金属イオン緩衝液の濃度は、５mＭ〜５０mＭであるのが
好ましい。
【０００９】 その溶液は、pＨ ６〜８.５、例えば、約pＨ ８にpＨ緩衝するのが好ましい。
そのpＨは、溶液を、もしあれば、他の必要とされる試薬と組み合わせた場合、 配列決定反応と適合できるよう選択する。「pＨ緩衝液」とは、溶液中のヒドロ ニウムイオン、Ｈ3Ｏ+(または解離部分)の濃度を調節する物質をいう。pＨ緩衝 液は、希釈または添加または溶液からの酸もしくは塩基の減少に応じてのイオン
濃度の変化を阻止することにより、溶液中のヒドロニウムイオンまたは解離部分
の濃度を調節する。第三級アミン緩衝液のような、第一級アミノ基を欠くpＨを 調節するための緩衝液(金属イオン緩衝液とは区別する)が好ましいpＨ緩衝剤で ある。例には、ＨＥＰＰＳ[Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)ピペラジン−Ｎ−(３−
プロパンスルホン酸)]、ＭＥＳ[(２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸)]、Ｐ
ＩＰＥＳ[ピペラジン−Ｎ,Ｎ−ビス(２−エタンスルホン酸)]、ＭＯＰＳ[(３−(
Ｎ−モルホリノ)プロパンスルホン酸)]、ＨＥＰＥＳ[Ｎ−２−ヒドロキシエチル
ピペラジン−Ｎ'−２−エタンスルホン酸]が含まれる。緩衝液化合物は、その溶
液を使用すべき配列決定反応を妨害しない化合物であるのが好ましい。好ましく
は、その溶液は水溶液である。
そのpＨは、溶液を、もしあれば、他の必要とされる試薬と組み合わせた場合、 配列決定反応と適合できるよう選択する。「pＨ緩衝液」とは、溶液中のヒドロ ニウムイオン、Ｈ3Ｏ+(または解離部分)の濃度を調節する物質をいう。pＨ緩衝 液は、希釈または添加または溶液からの酸もしくは塩基の減少に応じてのイオン
濃度の変化を阻止することにより、溶液中のヒドロニウムイオンまたは解離部分
の濃度を調節する。第三級アミン緩衝液のような、第一級アミノ基を欠くpＨを 調節するための緩衝液(金属イオン緩衝液とは区別する)が好ましいpＨ緩衝剤で ある。例には、ＨＥＰＰＳ[Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)ピペラジン−Ｎ−(３−
プロパンスルホン酸)]、ＭＥＳ[(２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸)]、Ｐ
ＩＰＥＳ[ピペラジン−Ｎ,Ｎ−ビス(２−エタンスルホン酸)]、ＭＯＰＳ[(３−(
Ｎ−モルホリノ)プロパンスルホン酸)]、ＨＥＰＥＳ[Ｎ−２−ヒドロキシエチル
ピペラジン−Ｎ'−２−エタンスルホン酸]が含まれる。緩衝液化合物は、その溶
液を使用すべき配列決定反応を妨害しない化合物であるのが好ましい。好ましく
は、その溶液は水溶液である。
【００１０】 「置換基で標識したddＮＴＰ」または「置換基で標識したジデオキシヌクレオ
チド三リン酸」または「置換基で標識したジデオキシヌクレオチド」という語は
、共有結合した検出可能な基を有して、３'−ヒドロキシル官能基を欠く、２'−
デオキシリボヌクレオチドアナログを意味し、従って、それは、ＤＮＡポリメラ
ーゼにより触媒される鎖延長を終わらせるものである。本発明において使用する
置換基で標識したddＮＴＰには放射性同位体が存在し得るが、置換基の検出可能
な基は、ddＮＴＰ構造にさらなる原子または基を与えることから、放射性同位体
、例えば、32ＰをもつddＮＴＰ構造における原子の置換より成るものではない。
置換基の標識は染料標識であるのが好ましく、蛍光染料標識であるのがより好ま
しい。染料標識は、分光光度法により検出可能な化学基であり、特性波長の光の
発光または反射であるのが好ましい。そのようなヌクレオチドおよび適当な染料
標識は、例えば、Ｌeeら、１９９２、Ｎucl. Ａcad. Ｒes. ２０：２４７１−２
４８３(ＤＮＡ配列決定における染料ターミネーターの取り込みに対する染料お よびdＮＴＰの効果を記載している)；１９９４年７月２６日に発行された、Ｐro
berら、米国特許第５,３３２,６６６号(並びに関連特許第５,２４２,７９６号お
よび同第５,３０６,６１８号)(レポーターで標識した(例えば、染料で標識した)
鎖ターミネーターを使用するＤＮＡ配列決定のための方法および試薬を記載して
いる)；およびＢergotら、国際特許出願 ＰＣＴ／ＵＳ９０／０５５６５，ＷＯ
９１／０５０６０(一組のローダミン染料、およびＴaq ＤＮＡ ポリメラーゼを マグネシウムもしくはマンガンと共に、または修飾したＴ７ ＤＮＡ ポリメラー
ゼをマンガンと共に使用するＤＮＡ配列決定でのそれらの使用を記載している) に記載されているように、当業界で十分知られている。以下の記述において、「
染料で標識した」という用語は一般に使用されるが、しかしながら、本発明の緩
衝溶液はまた、他の検出可能な置換基で標識したddＮＴＰでの向上も与え得るこ
とを認識すべきである。それゆえ、本発明の様々な態様には、さらなる置換基で
標識したddＮＴＰの使用が含まれる。
チド三リン酸」または「置換基で標識したジデオキシヌクレオチド」という語は
、共有結合した検出可能な基を有して、３'−ヒドロキシル官能基を欠く、２'−
デオキシリボヌクレオチドアナログを意味し、従って、それは、ＤＮＡポリメラ
ーゼにより触媒される鎖延長を終わらせるものである。本発明において使用する
置換基で標識したddＮＴＰには放射性同位体が存在し得るが、置換基の検出可能
な基は、ddＮＴＰ構造にさらなる原子または基を与えることから、放射性同位体
、例えば、32ＰをもつddＮＴＰ構造における原子の置換より成るものではない。
置換基の標識は染料標識であるのが好ましく、蛍光染料標識であるのがより好ま
しい。染料標識は、分光光度法により検出可能な化学基であり、特性波長の光の
発光または反射であるのが好ましい。そのようなヌクレオチドおよび適当な染料
標識は、例えば、Ｌeeら、１９９２、Ｎucl. Ａcad. Ｒes. ２０：２４７１−２
４８３(ＤＮＡ配列決定における染料ターミネーターの取り込みに対する染料お よびdＮＴＰの効果を記載している)；１９９４年７月２６日に発行された、Ｐro
berら、米国特許第５,３３２,６６６号(並びに関連特許第５,２４２,７９６号お
よび同第５,３０６,６１８号)(レポーターで標識した(例えば、染料で標識した)
鎖ターミネーターを使用するＤＮＡ配列決定のための方法および試薬を記載して
いる)；およびＢergotら、国際特許出願 ＰＣＴ／ＵＳ９０／０５５６５，ＷＯ
９１／０５０６０(一組のローダミン染料、およびＴaq ＤＮＡ ポリメラーゼを マグネシウムもしくはマンガンと共に、または修飾したＴ７ ＤＮＡ ポリメラー
ゼをマンガンと共に使用するＤＮＡ配列決定でのそれらの使用を記載している) に記載されているように、当業界で十分知られている。以下の記述において、「
染料で標識した」という用語は一般に使用されるが、しかしながら、本発明の緩
衝溶液はまた、他の検出可能な置換基で標識したddＮＴＰでの向上も与え得るこ
とを認識すべきである。それゆえ、本発明の様々な態様には、さらなる置換基で
標識したddＮＴＰの使用が含まれる。
【００１１】 「金属イオン緩衝液」という語は、溶液中のＭn2+のような遊離金属イオンの 濃度を調節する物質を意味する。緩衝液は、希釈または添加または溶液からのそ
のイオンの減少に応じての遊離イオン濃度の変化を阻止することにより、溶液中
の種(例えば、金属イオン)の濃度を調節する。そのような緩衝液は、例えば、ジ
カルボン酸、例えば、アルキルが１、２、３、４、５、６、７、または８個の炭
素原子からなる直鎖または分枝鎖である、酒石酸のようなアルキルジカルボン酸
であり得る。ジカルボン酸の他の例には、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレ
イン酸、グルタル酸、アジピン酸、フマル酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、
およびフタル酸が含まれる。他の金属イオン緩衝液には、例えば、クエン酸、Ｅ
ＤＴＡ(エチレンジアミン四酢酸)、ニトリロ三酢酸、ジエテントリアミン五酢酸
、Ｎ−ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸
、ジチオトレイトール、およびＮ,Ｎ−ビスヒドロキシエチルグリシンが含まれ る。金属イオン緩衝液は、pＨ緩衝液(すなわち、溶液中の遊離Ｈ+の濃度を調節 する化合物)の存在下に使用するのがよい。マンガンイオンは、普通、塩、例え ば、硫酸マンガン(ＭnＳＯ4)、塩化マンガン(ＭnＣl2)、または酢酸マンガンに 由来する。
のイオンの減少に応じての遊離イオン濃度の変化を阻止することにより、溶液中
の種(例えば、金属イオン)の濃度を調節する。そのような緩衝液は、例えば、ジ
カルボン酸、例えば、アルキルが１、２、３、４、５、６、７、または８個の炭
素原子からなる直鎖または分枝鎖である、酒石酸のようなアルキルジカルボン酸
であり得る。ジカルボン酸の他の例には、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレ
イン酸、グルタル酸、アジピン酸、フマル酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、
およびフタル酸が含まれる。他の金属イオン緩衝液には、例えば、クエン酸、Ｅ
ＤＴＡ(エチレンジアミン四酢酸)、ニトリロ三酢酸、ジエテントリアミン五酢酸
、Ｎ−ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸
、ジチオトレイトール、およびＮ,Ｎ−ビスヒドロキシエチルグリシンが含まれ る。金属イオン緩衝液は、pＨ緩衝液(すなわち、溶液中の遊離Ｈ+の濃度を調節 する化合物)の存在下に使用するのがよい。マンガンイオンは、普通、塩、例え ば、硫酸マンガン(ＭnＳＯ4)、塩化マンガン(ＭnＣl2)、または酢酸マンガンに 由来する。
【００１２】 「ジカルボン酸」という語は、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、
酒石酸、グルタル酸、アジピン酸、フマル酸、フタル酸、グルタミン酸、または
アスパラギン酸といったような、２つのカルボン酸基を含む、いずれかの低級ア
ルキル、ヒドロキシアルキル、またはアミノアルキル化合物を意味する。
酒石酸、グルタル酸、アジピン酸、フマル酸、フタル酸、グルタミン酸、または
アスパラギン酸といったような、２つのカルボン酸基を含む、いずれかの低級ア
ルキル、ヒドロキシアルキル、またはアミノアルキル化合物を意味する。
【００１３】 関連態様において、本発明は、好ましくは、上に指定した濃度での、または上
に指定した濃度まで容易に希釈される濃度での、マンガンおよび金属イオン緩衝
液を含め、ＤＮＡ配列決定に必要な試薬が含まれる、ＤＮＡ配列決定のためのキ
ットを提供する。適当には、そのキットには、ポリメラーゼのヌクレオチド結合
ドメインにおいて、変異していないＤＮＡポリメラーゼにおいてフェニルアラニ
ンにより占有される位置と似た位置に(例えば、Ｔhermus aquaticus ＤＮＡ ポ リメラーゼ Ｉにおける６６７の位置に)チロシンを含む、Ｐol Ｉ ファミリーの
ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性
ポリメラーゼ、好ましくは、変異させて、６６７の位置にあるフェニルアラニン
をチロシンで置換し、エキソヌクレアーゼ活性を実質的に取り除いた、例えば、
エキソヌクレアーゼ活性が１％未満しか残っていないＴhermus aquaticus ポリ メラーゼである。適当には、そのキットにはまた、染料で標識したddＮＴＰ、例
えば、ddＡＴＰ、ddＣＴＰ、ddＧＴＰおよびddＴＴＰも含まれる。
に指定した濃度まで容易に希釈される濃度での、マンガンおよび金属イオン緩衝
液を含め、ＤＮＡ配列決定に必要な試薬が含まれる、ＤＮＡ配列決定のためのキ
ットを提供する。適当には、そのキットには、ポリメラーゼのヌクレオチド結合
ドメインにおいて、変異していないＤＮＡポリメラーゼにおいてフェニルアラニ
ンにより占有される位置と似た位置に(例えば、Ｔhermus aquaticus ＤＮＡ ポ リメラーゼ Ｉにおける６６７の位置に)チロシンを含む、Ｐol Ｉ ファミリーの
ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性
ポリメラーゼ、好ましくは、変異させて、６６７の位置にあるフェニルアラニン
をチロシンで置換し、エキソヌクレアーゼ活性を実質的に取り除いた、例えば、
エキソヌクレアーゼ活性が１％未満しか残っていないＴhermus aquaticus ポリ メラーゼである。適当には、そのキットにはまた、染料で標識したddＮＴＰ、例
えば、ddＡＴＰ、ddＣＴＰ、ddＧＴＰおよびddＴＴＰも含まれる。
【００１４】 マンガンおよび金属イオン緩衝液は、便利には、必ずしもではないが、分けて
保存して、配列決定反応を行いたい時だけ混合する。このように、ＤＮＡ配列決
定のためのキットは、第一成分として、pＨをpＨ ６〜pＨ ９、好ましくは約pＨ
８に調節するための緩衝剤、デオキシヌクレオチドおよび染料で標識したddＮ ＴＰと一緒に金属イオン緩衝液を、そして第二成分として、pＨをpＨ ３〜pＨ ７、好ましくは約pＨ ６に調節するための緩衝剤、例えば、２−(Ｎ−モルホリ ノ)エタンスルホン酸と一緒にマンガンイオンを含むのが好ましい。そのキット において、ＤＮＡポリメラーゼにはまた、ジデオキシ結合ドメインにおいて、変
異していないポリメラーゼにおいてフェニルアラニンにより占有される位置と似
た位置にチロシンを含む、好ましくはＤＮＡ Ｐol Ｉ ポリメラーゼ、最も好ま しくは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼも含まれる。そのキットはまた、ピロホスフ
ァターゼ、例えば、Ｔhermus aquaticus 由来のピロホスファターゼのような無 機ピロホスファターゼも含み得る。ポリメラーゼおよびピロホスファターゼは、
便利には、そのキットの第一成分に含まれる。そのキットはまた、他の金属イオ
ンの源、例えば、マグネシウム、および便利には、そのような金属イオンの塩も
含み得る。これらのさらなる任意の金属イオンは、便利には、そのキットの第二
成分である。
保存して、配列決定反応を行いたい時だけ混合する。このように、ＤＮＡ配列決
定のためのキットは、第一成分として、pＨをpＨ ６〜pＨ ９、好ましくは約pＨ
８に調節するための緩衝剤、デオキシヌクレオチドおよび染料で標識したddＮ ＴＰと一緒に金属イオン緩衝液を、そして第二成分として、pＨをpＨ ３〜pＨ ７、好ましくは約pＨ ６に調節するための緩衝剤、例えば、２−(Ｎ−モルホリ ノ)エタンスルホン酸と一緒にマンガンイオンを含むのが好ましい。そのキット において、ＤＮＡポリメラーゼにはまた、ジデオキシ結合ドメインにおいて、変
異していないポリメラーゼにおいてフェニルアラニンにより占有される位置と似
た位置にチロシンを含む、好ましくはＤＮＡ Ｐol Ｉ ポリメラーゼ、最も好ま しくは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼも含まれる。そのキットはまた、ピロホスフ
ァターゼ、例えば、Ｔhermus aquaticus 由来のピロホスファターゼのような無 機ピロホスファターゼも含み得る。ポリメラーゼおよびピロホスファターゼは、
便利には、そのキットの第一成分に含まれる。そのキットはまた、他の金属イオ
ンの源、例えば、マグネシウム、および便利には、そのような金属イオンの塩も
含み得る。これらのさらなる任意の金属イオンは、便利には、そのキットの第二
成分である。
【００１５】 マンガンイオンおよび金属イオン緩衝液の濃度は、それらを直接混合して、配
列決定反応に必要とされる濃度を与えることができるもの、またはそれらを容易
に希釈して、必要とされる濃度を与えることができるものである。マンガンイオ
ンを含む第二成分は約pＨ ６に緩衝するが、２つの成分を一緒に加えることから
得られる混合物は約８のpＨ、例えば、pＨ ７〜pＨ ９を有する。
列決定反応に必要とされる濃度を与えることができるもの、またはそれらを容易
に希釈して、必要とされる濃度を与えることができるものである。マンガンイオ
ンを含む第二成分は約pＨ ６に緩衝するが、２つの成分を一緒に加えることから
得られる混合物は約８のpＨ、例えば、pＨ ７〜pＨ ９を有する。
【００１６】 さらなる態様において、本発明は、ＤＮＡ配列決定反応を、反応混合物におい
て、染料で標識したddＮＴＰ、および０.５mＭ〜３mＭの濃度でのマンガンの存 在下に、そして好ましくはまた、５mＭ〜５０mＭの濃度での金属イオン緩衝液、
例えば、酒石酸の存在下にも行うことを含んでなる、ＤＮＡを配列決定する方法
を提供する。
て、染料で標識したddＮＴＰ、および０.５mＭ〜３mＭの濃度でのマンガンの存 在下に、そして好ましくはまた、５mＭ〜５０mＭの濃度での金属イオン緩衝液、
例えば、酒石酸の存在下にも行うことを含んでなる、ＤＮＡを配列決定する方法
を提供する。
【００１７】 さらなる態様において、本発明は、金属イオン緩衝液を、pＨを約pＨ ８に調 節するための緩衝剤、デオキシヌクレオチド、および染料で標識したddＮＴＰと
一緒に含む溶液を提供する。好ましくは、その溶液はまた、熱安定性 Ｐol Ｉ ファミリーのＤＮＡポリメラーゼ、より好ましくは、ヌクレオチド結合部位にお
けるフェニルアラニンを置換したチロシンを有するポリメラーゼも含む。
一緒に含む溶液を提供する。好ましくは、その溶液はまた、熱安定性 Ｐol Ｉ ファミリーのＤＮＡポリメラーゼ、より好ましくは、ヌクレオチド結合部位にお
けるフェニルアラニンを置換したチロシンを有するポリメラーゼも含む。
【００１８】 本発明の他の特徴および利点は、その好ましい態様に関する以下の記述から、
および請求の範囲から明らかである。
および請求の範囲から明らかである。
【００１９】 図面の簡単な説明 図１は、重合工程をマンガンおよび金属イオン緩衝液の存在下に行った例示的
な配列決定に関して、自動化蛍光ＤＮＡ配列決定装置(ＡＢＩ ３７３型 機器)か
ら得られたＤＮＡ配列決定の結果を示す。
な配列決定に関して、自動化蛍光ＤＮＡ配列決定装置(ＡＢＩ ３７３型 機器)か
ら得られたＤＮＡ配列決定の結果を示す。
【００２０】 図２は、マンガンが反応混合物に含まれていなかったことを除き、図１に示す
結果に対応するＤＮＡ配列決定の結果を示す。
結果に対応するＤＮＡ配列決定の結果を示す。
【００２１】 図３は、以下の実施例で利用する、４つの染料で標識したジデオキシヌクレオ
チドの構造を示す。その構造を各々ローマ数字で識別し、これは、実施例１にお
ける溶液の調製で言及される。
チドの構造を示す。その構造を各々ローマ数字で識別し、これは、実施例１にお
ける溶液の調製で言及される。
【００２２】 好ましい態様の説明 本発明の製剤および配列決定反応におけるそれらの使用を説明するために、以
下の実施例を供する。これらの実施例は、本発明の範囲を何ら限定しようとする
ものではない。
下の実施例を供する。これらの実施例は、本発明の範囲を何ら限定しようとする
ものではない。
【００２３】 実施例１ 溶液の調製 以下の「前混合(pre-mix)」プロトコルにおいて、試薬は全て、２つの溶液： 試薬混合物Ａおよび試薬混合物Ｂに含まれる。
【００２４】 試薬混合物Ａ 以下の試薬を組み合わせて、試薬混合物Ａ １０mlを製造した(各々のddＮＴＰ
の隣のローマ数字は、図３に示す結合標識を表わす)： １Ｍ ＨＥＰＰＳ Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)ピペラジン−Ｎ'−(３−プロパ
ンスルホン酸) pＨ ８.０ ２.５ml； Ｔhermo Ｓequenase ＤＮＡ ポリメラーゼ ５０,０００単位； Ｔhermoplasma acidophilum 無機ピロホスファターゼ ２単位； １００mＭ dＡＴＰ １００μl； １００mＭ dＴＴＰ １００μl； １００mＭ dＣＴＰ １００μl； １００mＭ dＩＴＰ ５００μl； １００μＭ 染料で標識したddＡＴＰ(Ｉ) ９.３７５μl； １００μＭ 染料で標識したddＣＴＰ(II) ９０μl； １００μＭ 染料で標識したddＧＴＰ(III) ６.７５μl； １００μＭ 染料で標識したddＴＴＰ(IV) １６５μl； ５０mＭ ＥＤＴＡ １０μl； グリセロール １ml； 容量を脱イオンＨ2Ｏで１０mlとした。
の隣のローマ数字は、図３に示す結合標識を表わす)： １Ｍ ＨＥＰＰＳ Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)ピペラジン−Ｎ'−(３−プロパ
ンスルホン酸) pＨ ８.０ ２.５ml； Ｔhermo Ｓequenase ＤＮＡ ポリメラーゼ ５０,０００単位； Ｔhermoplasma acidophilum 無機ピロホスファターゼ ２単位； １００mＭ dＡＴＰ １００μl； １００mＭ dＴＴＰ １００μl； １００mＭ dＣＴＰ １００μl； １００mＭ dＩＴＰ ５００μl； １００μＭ 染料で標識したddＡＴＰ(Ｉ) ９.３７５μl； １００μＭ 染料で標識したddＣＴＰ(II) ９０μl； １００μＭ 染料で標識したddＧＴＰ(III) ６.７５μl； １００μＭ 染料で標識したddＴＴＰ(IV) １６５μl； ５０mＭ ＥＤＴＡ １０μl； グリセロール １ml； 容量を脱イオンＨ2Ｏで１０mlとした。
【００２５】 試薬混合物Ｂ 以下の試薬を組み合わせて、試薬混合物Ｂ １０mlを製造した。 １Ｍ ＭＥＳ ２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸 pＨ ６.０ １０μl； １Ｍ ＭgＣl2 ２００μl； １Ｍ ＭnＳＯ4 ７５μl； 容量を脱イオンＨ2Ｏで１０mlとした。
【００２６】 実施例２ ＤＮＡ配列決定 試薬混合物Ａ ４μl、試薬混合物Ｂ ４μl、Ｍ１３mp １８ ＤＮＡ ２００ng 、プライマー(Ｍ１３−４０ Ｆorward ５'−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡ
Ｃ) ５ピコモル、および全容量２０μlとする脱イオン水を一緒に混合して、熱 サイクラーに９６℃で３０秒、５０℃で１５秒、および６０℃で４分を２５サイ
クルかけた。循環させた後、１.５Ｍ 酢酸ナトリウムおよび２５０mＭ ＥＤＴＡ
を含む溶液 ４μlを加えた。その溶液を混合して、エタノール ４体積(１００μ
l)を加えた。氷上で１５−２０分間インキュベーションし、続いて、遠心分離す
ることにより、ＤＮＡを沈殿させた。上清を取り除き、ペレットを７０％ エタ ノールで洗浄して、負荷染料を含むホルムアミド ４μlに再縣濁させた。次いで
、再縣濁させたＤＮＡを自動化蛍光ＤＮＡ配列決定装置(ＡＢＩ ３７３型 機器)
で操作した。ＤＮＡ配列の機械から得られた結果を図１に示す。マンガンが反応
混合物に含まれていなかった場合の対応する結果を図２に示す。
Ｃ) ５ピコモル、および全容量２０μlとする脱イオン水を一緒に混合して、熱 サイクラーに９６℃で３０秒、５０℃で１５秒、および６０℃で４分を２５サイ
クルかけた。循環させた後、１.５Ｍ 酢酸ナトリウムおよび２５０mＭ ＥＤＴＡ
を含む溶液 ４μlを加えた。その溶液を混合して、エタノール ４体積(１００μ
l)を加えた。氷上で１５−２０分間インキュベーションし、続いて、遠心分離す
ることにより、ＤＮＡを沈殿させた。上清を取り除き、ペレットを７０％ エタ ノールで洗浄して、負荷染料を含むホルムアミド ４μlに再縣濁させた。次いで
、再縣濁させたＤＮＡを自動化蛍光ＤＮＡ配列決定装置(ＡＢＩ ３７３型 機器)
で操作した。ＤＮＡ配列の機械から得られた結果を図１に示す。マンガンが反応
混合物に含まれていなかった場合の対応する結果を図２に示す。
【００２７】 明細書中に挙げた特許および刊行物は全て、本発明に関係する当業者のレベル
を示すものである。この開示に引用した文献に記載されている内容は全て、個々
に引用して明細書に取り込んだと同様に、本明細書に全て含まれる。
を示すものである。この開示に引用した文献に記載されている内容は全て、個々
に引用して明細書に取り込んだと同様に、本明細書に全て含まれる。
【００２８】 当業者は、本発明が、目的を行って、挙げた結果および利点、さらにはまた、
その点で固有のものを得るのに十分適用されることを容易に理解する。現在、好
ましい態様の典型として本明細書中に記載する溶液、キット、方法、および具体
的な化合物は例示的なものであって、本発明の範囲を限定しようとするものでは
ない。その点での変化および他の使用が当業者に生じ、これらは、請求の範囲に
より定義される本発明の精神に包含される。
その点で固有のものを得るのに十分適用されることを容易に理解する。現在、好
ましい態様の典型として本明細書中に記載する溶液、キット、方法、および具体
的な化合物は例示的なものであって、本発明の範囲を限定しようとするものでは
ない。その点での変化および他の使用が当業者に生じ、これらは、請求の範囲に
より定義される本発明の精神に包含される。
【００２９】 本発明の範囲および精神を逸脱することなく、置換および修飾を変えることは
、本明細書中に開示する本発明となし得ることが当業者に容易に明らかである。
例えば、当業者は、様々に異なった金属イオン緩衝液、pＨ緩衝液、染料標識、 および／またはマンガンの濃度、さらにはまた、さらなる反応またはキット成分
を使用して、本発明を行い得ることを認識する。
、本明細書中に開示する本発明となし得ることが当業者に容易に明らかである。
例えば、当業者は、様々に異なった金属イオン緩衝液、pＨ緩衝液、染料標識、 および／またはマンガンの濃度、さらにはまた、さらなる反応またはキット成分
を使用して、本発明を行い得ることを認識する。
【００３０】 本明細書中に説明として記載する本発明は、適当には、本明細書中に具体的に
は開示していない、いずれかの要素、限定の不存在下に行い得る。このように、
例えば、本明細書中の各々の例において、「…を含んでなる」、「本質的には、
…からなる」および「…からなる」という用語はいずれも、残り２つの用語のい
ずれかで置換することができる。使用した用語および表現は、記述用語として使
用するものであって、限定するものではなく、そのような用語および表現の使用
において、記載する特徴またはその一部の均等物を排除しようとする意図はなく
、様々な変更が請求する本発明の範囲内で可能であることが認識される。このよ
うに、本発明を好ましい態様および任意の特徴により具体的に開示したが、本明
細書中に開示する概念の変更および変化は、当業者により利用され得ること、そ
してそのような変更および変化は、下記請求の範囲により定義した本発明の範囲
内であると考えられることを理解すべきである。
は開示していない、いずれかの要素、限定の不存在下に行い得る。このように、
例えば、本明細書中の各々の例において、「…を含んでなる」、「本質的には、
…からなる」および「…からなる」という用語はいずれも、残り２つの用語のい
ずれかで置換することができる。使用した用語および表現は、記述用語として使
用するものであって、限定するものではなく、そのような用語および表現の使用
において、記載する特徴またはその一部の均等物を排除しようとする意図はなく
、様々な変更が請求する本発明の範囲内で可能であることが認識される。このよ
うに、本発明を好ましい態様および任意の特徴により具体的に開示したが、本明
細書中に開示する概念の変更および変化は、当業者により利用され得ること、そ
してそのような変更および変化は、下記請求の範囲により定義した本発明の範囲
内であると考えられることを理解すべきである。
【００３１】 加えて、本発明の特徴または態様をＭarkushグループおよび別の他のグループ
分けという観点から開示する場合、当業者は、Ｍarkushグループまたは他のグル
ープのいずれかの個々のメンバーまたはサブグループという観点から、それによ
って、本発明もまた記載されることを認識する。
分けという観点から開示する場合、当業者は、Ｍarkushグループまたは他のグル
ープのいずれかの個々のメンバーまたはサブグループという観点から、それによ
って、本発明もまた記載されることを認識する。
【００３２】 このように、さらなる態様は、本発明の範囲内および以下の請求の範囲内であ
る。
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 800 Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ Ａｖｅｎｕ ｅ， Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ 1327，Ｐｉｓｃａ ｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ 08855−1327，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 ジョゼフ・エイ・マモーン アメリカ合衆国44134オハイオ州パーマ、 タキシード・アベニュー1107番 (72)発明者 バーナード・エフ・マカードル アメリカ合衆国44087オハイオ州トゥイン ズバーグ、ストーン・クリーク・レイン 1732番 (72)発明者 クリスティン・エム・フジャー アメリカ合衆国44109オハイオ州クリーブ ランド、メンフィス4110番 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 CA20 HA11 HA19 4B063 QA13 QQ42 QR08 QR13 QR42 QR50 QR62 QR66 QS25
Claims (24)
- 【請求項１】 ０.５mＭ〜３mＭの濃度でのマンガンイオン、５mＭ〜５０m Ｍの濃度での金属イオン緩衝液、および置換基で標識したジデオキシヌクレオチ
ドを含んでなる溶液。 - 【請求項２】 該置換基で標識したジデオキシヌクレオチドが、染料で標識
したジデオキシヌクレオチドである、請求項１に記載の溶液。 - 【請求項３】 pＨ ６〜８.５に緩衝した、請求項２に記載の溶液。
- 【請求項４】 該マンガンイオンが０.５mＭ〜２.０mＭの濃度である、請求
項２に記載の溶液。 - 【請求項５】 熱安定性 ＤＮＡ Ｐol Ｉ ポリメラーゼをさらに含んでなる
、請求項２に記載の溶液。 - 【請求項６】 該熱安定性 ＤＮＡ Ｐol Ｉ ポリメラーゼが、ヌクレオチド
結合ドメインにおけるフェニルアラニンを置換しているチロシンを有する、請求
項５に記載の溶液。 - 【請求項７】 ＤＮＡ配列決定反応を、置換基で標識したジデオキシヌクレ
オチド、０.５mＭ〜３mＭの濃度でのマンガン、および５mＭ〜５０mＭの濃度で の金属イオン緩衝液の存在下に行うという工程を含んでなる、ＤＮＡを配列決定
する方法。 - 【請求項８】 該置換基で標識したジデオキシヌクレオチドが、染料で標識
したジデオキシヌクレオチドである、請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 該ＤＮＡ配列決定反応をピロホスファターゼのさらなる存在
下に行う、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 該配列決定反応を熱安定性 ＤＮＡ Ｐol Ｉ ポリメラーゼ
の存在下に行う、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１１】 該熱安定性 ＤＮＡ Ｐol Ｉ ポリメラーゼが、ヌクレオチ
ド結合ドメインにおけるフェニルアラニンを置換しているチロシンを有する、請
求項１０に記載の方法。 - 【請求項１２】 金属イオン緩衝液を、pＨを約pＨ ８に調節するための緩 衝剤、および置換基で標識したジデオキシヌクレオチドと一緒に含んでなる第一
成分； マンガンイオンを、pＨを約pＨ ６に調節するための緩衝剤と一緒に含んでな る第二成分； を含んでなるキット。 - 【請求項１３】 該置換基で標識したジデオキシヌクレオチドが、染料で標
識したジデオキシヌクレオチドである、請求項１２に記載のキット。 - 【請求項１４】 熱安定性 ＤＮＡ Ｐol Ｉ ポリメラーゼをさらに含んでな
る、請求項１３に記載のキット。 - 【請求項１５】 該熱安定性 ＤＮＡ Ｐol Ｉ ポリメラーゼが、ヌクレオチ
ド結合ドメインにおけるフェニルアラニンを置換しているチロシンを有する、請
求項１４に記載のキット。 - 【請求項１６】 ピロホスファターゼをさらに含んでなる、請求項１３に記
載のキット。 - 【請求項１７】 金属イオン緩衝液を、pＨを約pＨ ８に調節するための緩 衝剤、第１の複数のデオキシヌクレオチド、および第２の複数の置換基で標識し
たジデオキシヌクレオチドと一緒に含んでなる溶液。 - 【請求項１８】 該置換基で標識したジデオキシヌクレオチドが、染料で標
識したジデオキシヌクレオチドである、請求項１７に記載の溶液。 - 【請求項１９】 チロシンがヌクレオチド結合部位におけるフェニルアラニ
ンを置換している、熱安定性 Ｐol Ｉ ファミリーのポリメラーゼをさらに含ん でなる、請求項１８に記載の溶液。 - 【請求項２０】 ＤＮＡ配列決定反応を、置換基で標識したジデオキシヌク
レオチドおよび０.５mＭ〜３mＭの濃度でのマンガンの存在下に行うという工程 を含んでなる、ＤＮＡを配列決定する方法。 - 【請求項２１】 該置換基で標識したジデオキシヌクレオチドが、染料で標
識したジデオキシヌクレオチドである、請求項２０に記載の方法。 - 【請求項２２】 該ＤＮＡ配列決定反応をピロホスファターゼのさらなる存
在下に行う、請求項２１に記載の方法。 - 【請求項２３】 該配列決定反応を熱安定性 ＤＮＡ Ｐol Ｉ ポリメラーゼ
の存在下に行う、請求項２１に記載の方法。 - 【請求項２４】 該熱安定性 ＤＮＡ Ｐol Ｉ ポリメラーゼが、ヌクレオチ
ド結合ドメインにおけるフェニルアラニンを置換しているチロシンを有する、請
求項２３に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US1238598A | 1998-01-23 | 1998-01-23 | |
| US09/012,385 | 1998-01-23 | ||
| PCT/US1999/001084 WO1999037810A1 (en) | 1998-01-23 | 1999-01-19 | A method, reagent solution and kits for dna sequencing |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002510466A true JP2002510466A (ja) | 2002-04-09 |
Family
ID=21754725
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000528716A Pending JP2002510466A (ja) | 1998-01-23 | 1999-01-19 | Ｄｎａ配列決定のための方法、試薬溶液およびキット |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1071812A4 (ja) |
| JP (1) | JP2002510466A (ja) |
| WO (1) | WO1999037810A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US7875440B2 (en) | 1998-05-01 | 2011-01-25 | Arizona Board Of Regents | Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules |
| US6780591B2 (en) | 1998-05-01 | 2004-08-24 | Arizona Board Of Regents | Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules |
| US7501245B2 (en) | 1999-06-28 | 2009-03-10 | Helicos Biosciences Corp. | Methods and apparatuses for analyzing polynucleotide sequences |
| CA2382063A1 (en) * | 1999-09-17 | 2001-03-22 | Shiv Kumar | Charge-modified nucleic acid terminators |
| CA2425663C (en) | 2000-10-11 | 2009-12-29 | Applera Corporation | Fluorescent nucleobase conjugates having anionic linkers |
| US7169560B2 (en) | 2003-11-12 | 2007-01-30 | Helicos Biosciences Corporation | Short cycle methods for sequencing polynucleotides |
| ATE463584T1 (de) | 2004-02-19 | 2010-04-15 | Helicos Biosciences Corp | Verfahren zur analyse von polynukleotidsequenzen |
| US7666593B2 (en) | 2005-08-26 | 2010-02-23 | Helicos Biosciences Corporation | Single molecule sequencing of captured nucleic acids |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2072238T3 (es) * | 1994-10-17 | 1997-01-16 | Harvard College | Adn-polimerasas que tienen un sitio de union con nucleotidos modificados para la secuenciacion de adn. |
| US5871929A (en) * | 1996-07-23 | 1999-02-16 | Barnes; Wayne M. | Suppression of pyrophosphorolysis in DNA sequencing and in other applications involving DNA replication |
-
1999
- 1999-01-19 WO PCT/US1999/001084 patent/WO1999037810A1/en not_active Application Discontinuation
- 1999-01-19 EP EP99904129A patent/EP1071812A4/en not_active Withdrawn
- 1999-01-19 JP JP2000528716A patent/JP2002510466A/ja active Pending
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1071812A4 (en) | 2002-05-15 |
| EP1071812A1 (en) | 2001-01-31 |
| WO1999037810A1 (en) | 1999-07-29 |
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