JP2002508157A

JP2002508157A - 本態性高血圧症におけるｇタンパク質関連変異体

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Publication number: JP2002508157A
Application number: JP2000527662A
Authority: JP
Inventors: ロビン・フェルダー; ペドロ・ホセ
Original assignee: ロビン・エイ・フェルダー; ペドロ・ホセ
Priority date: 1998-01-12
Filing date: 1999-01-12
Publication date: 2002-03-19
Anticipated expiration: 2019-01-12
Also published as: JP4652566B2; US20050089871A1; US9074016B2; EP1045918A1; JP5340242B2; CA2318479A1; WO1999035279A1; EP1045918B1; JP2011036253A; EP1045918A4; DE69939367D1; DK1045918T3; US20100313286A1; US6660474B1; ATE405661T1; CA2318479C; AU2223899A; EP2009109A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、本態性高血圧症の素因を有する個体を同定するための診断試験、およびその試験の実施のための遺伝子学的、細胞学的、生化学的な手段を提供する。本発明は、抗高血圧剤の発明を容易にするための抗高血圧性について物質をスクリーニングする方法も提供する。これらの目的に関し多様な手段が提供される。本発明はさらに、本態性高血圧症患者の腎細胞におけるナトリウム輸送を正常化する組成物および方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本明細書に記載の本発明につながる研究は、アメリカ国立衛生研究所の補助金
ＮＩＨ：ＤＫ３９３０.ＨＬ.２３０８１により一部資金を受けた。従って、米国
政府が本発明になんらかの権利を有し得る。

【０００２】 (技術分野) 本発明は、本態性高血圧、より詳細にはこの疾患を診断および治療する方法に
おける遺伝マーカーの使用に関する。

【０００３】 (背景技術) 本態性高血圧すなわち原因不明の高血圧は、アメリカ合衆国における白人の２
５−３０％が冒される疾患である。高血圧症を治療せずに放置すると、心臓疾患
、卒中、心筋梗塞および末期腎臓病に至る。高血圧患者は、通常病気だと感じな
いので、末期の臓器不全が始まるまでしばしば診断を受けず、治療しないまま放
置する。従って、高血圧はヒトにおける心臓血管の罹患率および死亡率の主な原
因である。多くの高血圧患者は、高塩分の食事が血圧を上昇させ、またはすでに
上昇した血圧を悪化させるという点で塩分に敏感である。高血圧を発症させる性
質を測定する方法がわかれば、心臓血管疾患の減少に重要な影響を与えるだろう
。

【０００４】ヒトにおいて遺伝的要因が血圧の変動性の３０−４０％を占めると考えられて
いる(Ward R. (1990) In Hypertension: Pathophysiology, Diagnosis and Mana
gement, Laragh JH. And Brenner BM eds., (Raven Press, Ltd., New York, NY
), pp81-100)。しかしながら、別の意見では、１つの主要遺伝子が４０％を占め
た状態で、高血圧の遺伝率は８０％であると示唆された(Cavalli Sporza LL., B
oomer WF. In The Genetics of Human Population (1971), (WH Freeman Co., S
outh San Francisco, CA) pp534-536)。単一の主要遺伝子が、血圧に作用して、
有意な程度に、血圧制御において副次的役割を果たす多くの他の遺伝子に優性で
あるのかも知れない。

【０００５】高血圧の発症と持続における腎臓の中心的役割は充分に確立された。正常な腎
臓を高血圧ラットに移植すると、その血圧は正常化する。一方、高血圧のラット
の腎臓を正常血圧のラットに移植すると、高血圧を発症する。従って、高血圧は
腎臓に従うようである。また、大部分のヒトの高血圧遺伝子の型は、腎臓におけ
るナトリウムの高い再吸収に関連することがわかっている。腎臓のナトリウム排
出および血圧を調節する多くのホルモン性システムがあるが、ドーパミンの腎臓
パラクリン機能が長期の血圧調節における重要なメカニズムとして充分に確立さ
れている。高血圧におけるナトリウムに対する近位尿細管の結合性の増加は、ド
ーパミンの欠陥的な腎臓のパラクリン作用により引き起こされる。ドーパミンは
ナトリウムの再吸収を減少させる。従って、ドーパミン作用の欠陥がナトリウム
再吸収の増加および高血圧をまねく。

【０００６】ドーパミンは、Ｇタンパク質結合受容体のロドプシン様ファミリーに属する細
胞表面受容体のある種類によってその機能を発揮する；これらの受容体は通常７
つの膜貫通ドメインを有する。ＣＮＳおよびいくつかの内分泌器におけるドーパ
ミン受容体は、２つの主な種類、Ｄ１様受容体およびＤ２様受容体に分類される
。ＣＮＳ以外の腎臓などの臓器においては、Ｄ１様受容体はＤＡ１受容体と呼ば
れ、Ｄ２様受容体はＤＡ２受容体と呼ばれている。ドーパミン受容体がＣＮＳの
内または外で独占的に発現はしないので、これらの区別はおそらくもはや必要で
はない。しかしながら、神経組織と腎臓組織とにおいてＤ１受容体の異なる調節
がある。Ｄ１受容体遺伝子の２つのエキソンが神経組織では転写されるのに対し
、第２エキソンのみが腎臓組織では転写される。短いおよび長いＤ１転写物の異
なる発現は、活性化因子タンパク質の組織特異的発現がＤ１受容体遺伝子の５’
非コード領域におけるプロモータからの転写を行うためである。Ｄ２様ドーパミ
ン受容体のサブタイプは各々、いくつかのイソ形を有する。しかしながら、特定
のイソ形が末梢神経で特異的に発現されることはない。参照、Jose, et al., Ph
armac. Ther. 80:149-182(1998)。

【０００７】２つのＤ１様受容体：Ｄ１およびＤ５受容体は、哺乳動物において発現し、各
々げっ歯類のＤ１ＡおよびＤ１Ｂとして知られている。２つの付加的Ｄ１様受容
体、Ｄ１ＣおよびＤ１Ｄは、非哺乳類において発現する。Ｄ１様受容体はアデニ
リルシクラーゼの刺激に関係している。Ｄ１Ａ受容体はまた、ホスホリパーゼＣ
活性を刺激するが、アデニリルシクラーゼの刺激に対して補助的である。Ｄ１様
受容体は、まだクローン化されてなく、百日咳毒素非感受性のＧタンパク質、Ｇ
ｑを通してホスホリパーゼＣ(ＰＬＣ)に結合し、Ｄ１およびＤ５受容体とは異な
るようである(Jose et al, Pharmacol. Ther. 80:149-182(1998)。３つのＤ２様
受容体は哺乳動物において発現する：Ｄ２、Ｄ３およびＤ４受容体である。Ｄ２
様受容体はアデニリルシクラーゼおよびＣａ²⁺チャネルの阻害に関連する。Ｄ２
およびＤ３受容体はＮＧ１０８−１５細胞における電位依存性カリウム電流を減
少すると報告されているが、Ｄ２様受容体はまたＫ＋チャネルを刺激する。シナ
プス前神経に存在するＤ２およびＤ３受容体の両方がまた、ドーパミンおよびノ
ルエピネフリン両方の放出を減少するのに役立ち得る。

【０００８】すべての哺乳動物のドーパミン受容体は、最初に脳からクローン化され、腎臓
および尿路において発現することがわかった。ドーパミン受容体サブタイプは、
腎臓血管系、糸球体および尿細管に従って特徴的に発現をする。腎臓血管系、糸
球体および尿細管において、このサブタイプは、腎臓血行動態、電解質および水
の輸送、およびレニン分泌を調節する。外因性ドーパミンは低用量で、腎臓血管
抵抗力を低下させ、腎臓の血流を増加するが、糸球体濾過値に変動的な効果を有
する。付加的な腎臓効果には、血行動態および細管メカニズムにより生じる溶質
および水の排出の増加がある。近位尿細管のドーパミンを産生する能力とこれら
の細管における受容体の存在は、ドーパミンが自己分泌またはパラクリン方法で
作用し得ることを示唆している。外因性腎臓ドーパミンはいくつかのネフロンセ
グメント(近位細管、ヘンレの髄質の厚い上行性の脚(mTAL)、皮質性集合管(ＣＣ
Ｄ))における作用により溶質と水の排出を増加する。各ネフロンセグメントにお
けるドーパミンの阻害効果の大きさは、穏やかであるが、ネフロンに沿った多数
の部位の作用により、溶質および水の排出が著しく増加する。ドーパミンの腎臓
効果は溶質(例えば、ナトリウム、リン酸塩)またはタンパク質負荷の条件下にお
いて最も明らかである。Ｄ１様受容体、おそらくＤ１サブタイプの受容体は、腎
臓を血管拡張し、管腔膜におけるナトリウム/水素交換体活性の阻害および側底膜におけるナトリウム/カリウムＡＴＰ分解酵素活性の阻害により近位尿細管におけるナトリウム輸送を阻害する。Ｄ１様受容体はまたｍＴＡＬおよびＣＣＤに
おけるナトリウム輸送を減少させる。腎臓における主な機能的Ｄ１様受容体は、
Ｄ１受容体である。シナプス前Ｄ２様受容体はまた血管拡張性である。シナプス
後Ｄ２様受容体は単独で、腎臓近位ナトリウム輸送を刺激し、ＣＣＤにおけるバ
ソプレシン作用を阻害する。しかしながら、Ｄ１様受容体とともに、シナプス後
Ｄ２様受容体は相乗的に作用して、近位尿細管においてナトリウム輸送を阻害す
る。近位尿細管における主なＤ２様受容体は、Ｄ３受容体であり、ＣＣＤにおけ
る主なＤ２様受容体は、Ｄ４受容体である。おそらくＤ３サブタイプのシナプス
後Ｄ２受容体がレニン分泌を阻害する能力は、レニン分泌に対するＤ１様受容体
の刺激効果を中和し、相乗的作用をもたらして、ナトリウム補充状態におけるナ
トリウム排出を増加する(Jose et al., 前出)。

【０００９】結果、長年の熱心な努力により、本態性高血圧の病因について多くのことがわ
かったにもかかわらず、血圧を制御する単一の主要遺伝子は発見されていない。
従って、血圧の調節に関する主要遺伝子の発見が、本態性高血圧を引き起こすメ
カニズムを理解するのに重要であり、重要な新しい診断法および治療法を導くで
あろう。

【００１０】 (本発明の要約) キナーゼは、リン酸基のタンパク質への付加を触媒する酵素である。Ｇタンパ
ク質結合受容体キナーゼ(ＧＲＫ)は、セリンおよびスレオニン残基におけるＧタ
ンパク質結合受容体タンパク質をリン酸化するタンパク質キナーゼのファミリー
である。ＧＲＫはアレスチンと呼ばれる他のタンパク質とともに、ホルモン性反
応の相同的脱感作を媒介する。参照、Premont, et al., FASEB J. 9:175-182(19
95)。６つのＧＲＫ、つまりＧＲＫ１−ＧＲＫ６が同定された。参照、Premont,
et al., 前出.;Palczewski, Protein Sci. 3:1355-1361(1994); および Inglese
, et al, J. Biol. Chem. 268:23735-23738(1993)。ＧＲＫ４は最もわかっていないＧＲＫファミリーのメンバーである。Premont et al., J. Biol. Chem. 271
:6403-6410(1996)は、精巣にその実質的存在を測定し、ＧＲＫ１を除くいかなる
ＧＲＫのなかで最も分布していない。Premontの文献は、どのような具体的な型の精巣細胞がＧＲＫ４を発現するのかわからないことを認めているが、ＧＲＫ４
が、ＬＨ／ＣＧ受容体、性腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体、および卵胞刺激
ホルモン受容体および種々の嗅覚受容体を含む多くの受容体のいずれにも結合し
得ると推測する。後に、Gros, J. Clin. Invest. 99(9):2087-2093(1997)は、高
血圧者のリンパ球におけるアデニリルシクラーゼ活性化の減少におけるＧＲＫ２
の活性を示唆した。Grosはまた、ＧＲＫ活性の増加がＧＲＫ２発現の増加のみに
関連し、他のＧＲＫの活性が変わらないことを観察した。

【００１１】出願人はいくつかの重要な発見をした。第１にＧＲＫ４イソ形発現は、腎臓、
特に近位尿細管および皮質集合管細胞において有意な程度に生じる。第２に、い
くつかの既知のＧＲＫ４の多形性型および３つの以前知られていなかった多形性
高血圧者に多い。第３に、本態性高血圧者に関すると知られている近位尿細管細
胞におけるＤ１受容体/アデニリルシクラーゼ共役欠損が、限定しないが、Ｄ１受容体の過剰リン酸化に関係することである。

【００１２】本発明の実際上の態様は、３つの基本的領域、つまり診断、薬剤の発見、治療
に分類される。従って、本発明の第１の態様は、本態性高血圧にかかりやすい個
体を同定する方法に関する。該方法は、個体から単離したＤ１受容体およびＧＲ
Ｋ４を発現する腎臓細胞のサンプルを用いて行い得る。該方法において、細胞を
アッセイして、例えばリン酸化またはパルミトイル化などのＤ１受容体の翻訳後
修飾の範囲を測定する。正常血圧者から単離した細胞に関する受容体の翻訳後修
飾の変化は、本態性高血圧の素因を示唆している。別法として、ＧＲＫ遺伝子ま
たはその断片を分析して、本態性高血圧に関連のＧＲＫ４を検出するために、核
酸サンプルを個体から単離する。本発明において本態性高血圧に関連するとして
同定した具体的な変異体には、次のものが含まれる：Ｒ６５Ｌ、Ａ１４２Ｖ、Ａ
４８６Ｖ、２つ二重変異体Ｒ６５ＬとＡ４８６ＶおよびＲ６５ＬとＡ１４２Ｖお
よび３重変異体Ｒ６５ＬとＡ１４２ＶとＡ４８６Ｖ。本態性高血圧に関連の他の
変異体ＧＲＫ４をさらに同定することは、単に、本態性高血圧と診断された個体
から単離したＧＲＫ４を分析し、ＧＲＫ４遺伝子の配列を分析することにより行
い得る。さらに本発明において、非腎臓細胞におけるこれらのＧＲＫ４の発現に
より、これらの非腎臓細胞がドーパミン作動性シグナルを正常というより“適切
に”形質導入し得ないことが明らかになった。

【００１３】本発明の関連態様は、Ｒ６５ＬとＡ１４２Ｖの二重変異、Ｒ６５ＬとＡ４８６
Ｖの二重変異、またはＲ６５ＬとＡ１４２ＶとＡ４８６Ｖの３重変異を有するＧ
ＲＫ４タンパク質をコードする単離および精製された核酸に関する。前出の変異
を含有するＧＲＫ４遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチ
ドも開示されている。さらに本態性高血圧に関連の変異を含有するＧＲＫ４遺伝
子の断片をハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー、またはプライマ
ー対が開示されている。好ましいプライマーは、ＧＲＫ４遺伝子のエキソン３、
５、８、１４または１６に特異的にハイブリダイズし、ＧＲＫ４遺伝子のヌクレ
オチド４３１−５０３(エキソン３)、５９４−６９７(エキソン５)、８５７−９
９５(エキソン８)、１６６２−１７９８(エキソン１４)または１９３７−１９９
１(エキソン１６)を含むＤＮＡ配列を増幅するのに有用である。

【００１４】本発明の別の態様は、抗高血圧活性のための物質を、ＧＲＫ４の立体配座およ
び／または活性において変化をもたらすそれらの能力により試験する様々なシス
テムに関する。これらのシステムは、例えば、本態性高血圧に関連の野生型また
はイソ形または変異体などのＧＲＫ４タンパク質と、検出しようとする抗高血圧
剤との相互作用があるとＧＲＫ４タンパク質の立体配座的変化を引き起こす薬剤
との間の複合体から、ＧＲＫ４およびＧＲＫ４基質を含有する再構築されたシス
テムまでの範囲に及ぶ。ＧＲＫ４とＧＲＫ４基質間の相互作用を測定し得るいか
なるシステムも、潜在的な抗高血圧剤のスクリーニングに使用し得る。従って、
システムは、人工膜、例えば脂質ミセルなどの細胞様部分から全細胞までに及ぶ
。好ましい全細胞には、Ｄ１受容体遺伝子(またはその機能的断片)で形質導入さ
れた細胞および野生型または変異体のＧＲＫ４遺伝子および不死化されたヒト近
位細管細胞がある。これら種々のシステムに生じるＧＲＫ４活性の変化は、例え
ばいかなる２次メッセンジャー成分または(限定するわけではないが)アデニリル
シクラーゼにより発生するｃＡＭＰ、Ｇタンパク質活性、ナトリウム輸送体また
はポンプ活性などの終末点およびリン酸化またはパルミトイル化などの翻訳後修
飾などの細胞活性における卵管通気を測定することにより検出し得る。本態性高
血圧に関連のＧＲＫ４タンパク質をコードするトランスジーンを含有するトラン
スジェニック動物などのインビボシステムも開示されている。該システムにおい
て、トランスジーンは腎臓細胞において発現して、トランスジェニック動物に本
態性高血圧の状態を起こす。

【００１５】本発明のさらに別の態様は、インビトロまたはインビボの近位尿細管細胞にお
いてナトリウム輸送を減少(ナトリウム利尿を増加)する方法に関する。この治療
を適用する基本的な目的は、ＧＲＫ４活性を変えることである。一つの好ましい
方法は、高血圧者の腎臓細胞においてＧＲＫ４の発現を減少または防止する１つ
または複数の薬剤を投与することを含む。ＧＲＫ４のｍＲＮＡまたはＤＮＡは、
転写または翻訳を防止するアンチセンスＲＮＡまたは優性阻害変異体などのオリ
ゴヌクレオチドで攻撃される。ＧＲＫ４のｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡを開裂す
るリボザイムも有用である。他の治療の適用には、ＧＲＫ４活性(阻害または刺激のいずれか)を阻害するかまたは高めるなど、変更する薬剤が含まれる。

【００１６】いかなる特定の作用理論にも拘束されるわけではないが、出願人の考えでは、
ヒト被験者において腎欠陥は高血圧のなんらかの原因であり、ＧＲＫ４変異は特
に、Ｄ１受容体の直接または間接のリガンド非依存性セリン過剰リン酸化を引き
起こし、Ｇタンパク質/エフェクター複合体の結合をはずす。結果、ドーパミンのナトリウム利尿作用が低下され、腎臓がナトリウムと水分の適切な平衡を保て
なくなり、ナトリウムの滞留と血圧の上昇をもたらす。特に、正常血圧の被験者
からではなく、高血圧の被験者から得た近位尿細管は、ドーパミンＤ１受容体の
アデニリルシクラーゼによる欠損結合を示す。欠損結合はＤ１受容体のリガンド
非依存性リン酸化に関連する。出願人は、少なくとも６つの変異した遺伝子をキ
ナーゼ型４(ＧＲＫ４)関連Ｇタンパク質に発見し、該遺伝子は高血圧の被験者に
おけるＤ１受容体のリガンド非依存性リン酸化を調節する。

【００１７】図面の簡単な説明図１は、正常血圧者からではなく高血圧者からの近位尿細管細胞においてＤ１
様アゴニストがＧＲＫ活性を刺激することを示すグラフである。図２は、ＧＲＫ４の発現を防止すると、高血圧者からの近位尿細管細胞の能力
が正常値に回復し、Ｄ１様アゴニストによって生じるｃＡＭＰ産生物を増加する
ことを示すグラフである。図３は、休眠近位尿細管細胞におけるＤ１受容体のリン酸化は、正常血圧の被
験者より高血圧者において大きく、Ｄ１様アゴニスト刺激に反応しないことを示
すグラフである。ＧＲＫ４発現が防止される場合、Ｄ１受容体のリン酸化は停止
する。図４は、正常血圧者ではなく高血圧者でＤ１様アゴニスト刺激に対する反応に
おいて、近位尿細管におけるＧＲＫ４ガンマ/∂の発現が増加することを示すグラフである。図５は、ＧＲＫ４ガンマの変異により、ＧＲＫ４ガンマおよびＤ１受容体を過
発現するチャイニーズハムスターの卵巣細胞においてＤ１様アゴニスト刺激に反
応するＤ１受容体の能力が減少することを示すグラフである。

【００１８】 (本発明を実行する最適な方法) ヒトＧＲＫ４遺伝子転写の構造は、多量の選択的スプライシングを受けて、Ｇ
ＲＫ４タンパク質の４つの型をコードする４つの異なるＧＲＫ４のｍＲＮＡの型
を産生する。選択的スプライシングはＧＲＫ４のアミノおよび／またはカルボキ
シル末端領域で生じ、４つのイソ形を産生する。

【００１９】ＧＲＫ４は初め、Ambrose, et al., Hum. Mol. Genet. 1:697-703(1993)において報告され、次いでPremont et al., J. Biol. Chem. 271(11):6403-6410(199
6)においてより広範囲に特徴付けられた。Premontにおいて、ＧＲＫ４は精巣においてのみ非常に豊富で、ＧＲＫ４のｍＲＮＡは脳細胞および骨格筋肉において
わずかに存在すると報告されている。ＧＲＫ４遺伝子はプロモータ領域を除いて
、約７５キロベース(ｋＤａ)に及び、１６エキソンから構成されている。ＧＲＫ
４の最長型は、無傷のアミノおよびカルボキシル末端の選択的エキソン配列を有
し、ＧＲＫ４アルファと呼ばれた。推測されるタンパク質配列は、予測分子量６
６.５ｋＤａを有する５７８アミノ酸を含有する。次に短い型、ＧＲＫ４ベータは、コドンから構成されるアミノ酸末端の選択的エキソンのみを欠失し、分子量
６２.５ｋＤａを有する５４６アミノ酸を含有する。ＧＲＫ４ガンマは、４６コドンであるカルボキシル末端の選択的エキソンのみを欠失するイソ形である。従
って、このイソ形は５３２アミノ酸を含有し、予測分子量６１.２ｋＤａを有する。ＧＲＫ４ガンマは正式にはＧＲＫ４Ａと呼ばれていた。参照、Sallese et a
l., Biochem. Biophys. Res. Commun. 199:848-854(1994)。ＧＲＫ４デルタは予
測分子量５７.６ｋＤａを有する５００アミノ酸を含有し、最短のイソ形である。ＧＲＫ４デルタは両方の選択的エキソンを欠失する。ＧＲＫデルタは初めＩＴ
１１およびＧＲＫ４Ｂと呼ばれていた。参照、Sallese et al., 前出、およびAm
brose, et al., 前出。さらに最近、２つの付加的イソ形が発見された、つまり：エキソン１３および１５を欠失し、予測分子量５３.６ｋＤａを有する４６６アミノ酸を含有するＧＲＫ４イプシロンと、エキソン２、１３および１５を欠失
し、予測分子量４９.９ｋＤａを有する４３４アミノ酸を含有するＧＲＫ４ゼータである。

【００２０】また、ＧＲＫ４の５つの単一ヌクレオチド多形性、つまり：Ｒ６５Ｌ(ＣＧＴ −ＣＴＴ)；Ａ１４２Ｖ(ＧＣＣ−ＧＴＣ)；Ｖ２４７Ｉ(ＧＴＡ−ＡＴＡ)；Ａ４８６Ｖ(ＧＣＧ−ＧＴＧ)およびＤ５６２Ｇ(ＧＡＣ−ＧＧＣ)が知られている。参
照、Premont, et al., 前出。出願人は、Ｒ６５Ｌ、Ａ１４２ＶおよびＡ４８６
Ｖの多形性が本態性高血圧に関係することを発見した。出願人はまた、高血圧者
に多い３つの付加的多形性を発見した、つまり：二重変異体、Ｒ６５ＬとＡ１４
２ＶおよびＲ６５ＬとＡ４８６Ｖ；および３重変異体Ｒ６５ＬとＡ１４２ＶとＡ
４８６Ｖ。表１は、６つのＧＲＫ４イソ形のアミノ酸配列と対応するヌクレオチ
ド配列を示す。本態性高血圧に関連の多形において変化するアミノ酸および対応
するヌクレオチドは、太字で示されている。イプシロンおよびゼータのイソ形の
５’非翻訳領域の配列は示されていない。

【００２１】

【表１】表１：

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【００２２】本発明の第１の態様は、本態性高血圧症になりやすいまたは素因がある危険性
の個体、または誰がそうであるかをスクリーニングする方法に関する。本態性高
血圧症は、未知の病因の高血圧症として定義される。完全に特徴付けされている
いくつかの高血圧症と異なり、本態性高血圧症の既知の原因はない。ＧＲＫ４遺
伝子、その基本的機能およびＤ１受容体との相互作用と、本態性高血圧症との間
の関連または関係の同定は、個体のスクリーニングを可能にし、彼等が測定され
た高血圧症に関する遺伝的基礎を有するかどうか、または彼等が正常血圧である
場合その素因を有するかどうかを決定できる。患者が正常血圧であるが(偽の低血圧読取を導く種々の条件がある)、高血圧症の臨床的証拠もある場合(終末器官
疾病のような)、高血圧症変異のスクリーニングが、高血圧症の存在の確認に使用できる。このように、本態性高血圧症の素因を有するとして同定された個体は
、次いで血圧をより綿密にモニターし、食事療法などの方法で、疾病の初期の段
階において処置される。

【００２３】このような診断法の一つは、個体からの、Ｄ１受容体を有しＧＲＫ４を発現す
る腎細胞の単離を必要とする。本方法の実施に有用な腎細胞は、腎近位尿細管細
胞および皮質集合管細胞を含む。それらは、尿サンプルから簡便に得られる。次
いで細胞内のＤ１受容体の翻訳後修飾の程度を測定する。正常血圧の個体から単
離された細胞と比べたＤ１受容体の翻訳後修飾における変化は、ＧＲＫ４活性の
変化によりもたらされると考えられ、それは、本態性高血圧症の素因の指標であ
る。パルミトイル化およびリン酸化のような数個の翻訳後事象が、このような細
胞内で起こり得る。高血圧症個体から単離されたこのような細胞内のＤ１受容体
は、過リン酸化として知られる事象を示す。この期間までに、結合したリン分子
を有するＤ１受容体の量が増加することを意味する。翻訳後修飾は、Ｄ１受容体
とＤ１受容体抗体による免疫沈降およびホスホセリン抗体に対する免疫ブロット
、または放射活性パルミチン酸による細胞の標識およびＤ１受容体抗体との免疫
沈降のような、標準法にしたがって検出および測定できる(Ng et al., Eur. J.
Pharmacol. 267:7-19 (1994))。

【００２４】他のこのような方法は、核酸サンプル、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを個体か
ら得、個体のＧＲＫ４遺伝子の核酸配列を変異に関して分析することを必要とす
る。それによる変異の存在が、個体の本態性高血圧症に対する素因の指標である
。核酸サンプルは、ＧＲＫ４のＤＮＡが遍在するため、任意の細胞タイプから得
ることができる。血液からのＤＮＡ抽出物は、特に適当な源である。ＧＲＫ４α
番号付けに関して、本方法で同定される好ましいＧＲＫ４変異体は、アミノ酸残
基６５でＡｒｇ→Ｌｅｕ(Ｒ６５Ｌ)、アミノ酸残基１４２でＡｌａ→Ｖａｌ(Ａ１４２Ｖ)、アミノ酸残基４８６でＡｌａ→Ｖａｌ(Ａ４８６Ｖ)、二重変異体Ｒ６５Ｌ、Ａ１４２ＶおよびＲ６５Ｌ、Ａ４８６Ｖ、および三重変異体Ｒ６５Ｌ、
Ａ１４２Ｖ、Ａ４８６Ｖを含む。ＧＲＫ４対立遺伝子は、本態性高血圧症の変異
に関して、直接またはクローニングに続いてスクリーニングし得る。クローニン
グは、例えば、ゲノムＤＮＡの適当な断片サイズへの消化、および得られる断片
のベクターへのライゲートによる、慣用法を使用して連続できる。一方、ポリメ
ラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を、ＧＲＫ４遺伝子の特異的エキソン、例えば、エキソ
ン３、５、８、１４および１６で行い得る。このようなプライマーの例は、表２
に示す。ＰＣＲは、野生型または変異のＧＲＫの任意の配列で行うことができる
。ＰＣＲはまた、ＧＲＫ４のｍＲＮＡでも行うことができる。このように、当業
者は、ＧＲＫ４対立遺伝子の増幅のためのプライマーまたはプライマー対が、全
てのイソ形および多形性(表１に示すような)において同一のヌクレオチド配列に
基づいて設計し得るか、またはそれらは活性化変異をもたらす特異的ヌクレオチ
ド置換を含む配列に基づき得る。本発明のこの態様の実施に有用な他のプライマ
ーは、ヌクレオチド４３１−５０３(エキソン３)、ヌクレオチド５９４−６９７
(エキソン５)、ヌクレオチド８５７−９９５(エキソン８)、ヌクレオチド１６６
２−１７９８(エキソン１４)、およびヌクレオチド１９３７−１９９１(エキソン１６)を含むＤＮＡ配列を増幅する。

【００２５】

【表８】 ^* GenBank Accession #U33153からU33168 ＧＲＫ４対立遺伝子は、クローン化対立遺伝子または増幅断片のヌクレオチド
配列を決定し、それを正常対立遺伝子のヌクレオチド配列と比較することにより
、正常対立遺伝子と異なる核酸配列の存在に関して試験する。他の既知の方法は
、活性化対立遺伝子の存在の確認について、より完全であるが、まだ幾分は間接
的な試験を提供する。これらの方法は、一本鎖確認分析(ＳＳＣＡ)、変性勾配ゲ
ル電気泳動(ＤＧＧＥ)、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、対立遺伝子特異的オリゴヌク
レオチド(ＡＳＯ)、E. coli mutSタンパク質のようなヌクレオチドミスマッチを
認識するタンパク質の使用、および対立遺伝子特異的ＰＣＲを含む。これらの方
法は、Orita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766-2770 (1989); Shef
field et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:232-236 (1989); Finkelstein e
t al., Genomics 7:167-172 (1990)およびKinszler et al., Science 251:1366-
1370 (1991); Conner et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80:278-282 (1983);
Modrich, Ann. Rev. Genet. 25:229-253 (1991); およびRano & Kidd, Nucl. A
cids Res. 17:8392 (1989)に各々記載されている。対立遺伝子特異的ＰＣＲに関
して、その３'末端で特定のＧＲＫ４変異にハイブリダイズするプライマーを使用する。ＧＲＫ４変異が存在しない場合、増幅産物は検出されない。増幅産物の
検出は、ＥＰＡ０３３２４３５に記載のように、Amplification Refractory Mut
ation System (ARMS)により行い得る。

【００２６】最初の３つの方法(ＳＳＣＡ、ＤＧＧＥおよびＲＮａｓｅ保護アッセイ)におい
て、新規電気泳動バンドが出現する。ＳＳＣＡは、一本鎖分子内塩基対形成の変
化によりもたらされる配列変化のために異なって移動するバンドを検出する。Ｒ
Ｎａｓｅ保護は、２個またはそれ以上の小さい断片への変異ポリヌクレオチドの
開裂を含む。ＤＧＧＥは、変性勾配ゲルを使用して、野生型配列と比較した変異
配列の移動速度の差異を検出する。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドアッセ
イにおいて、特異的配列を検出するオリゴヌクレオチドを設計し、アッセイを、
ハイブリダイゼーションシグナルの存在または非存在の検出により行う。ｍｕｔ
Ｓアッセイにおいて、タンパク質は、変異体と野生型配列の間のヘテロ二本鎖の
ヌクレオチドミスマッチを含む配列とのみ結合する。

【００２７】本発明のミスマッチは、二つの鎖が１００％相補的でないハイブリダイズした
核酸二本鎖である。完全な相同性の欠如は、欠失、挿入、反転または置換による
ものであり得る。ミスマッチ検出は、遺伝子またはそのｍＲＮＡ生産物における
点突然変異の検出に使用できる。これらの方法は配列決定よりも感受性が低いが
、多数のサンプルについて行うのに簡便である。ミスマッチ開裂法の例は、ＲＮ
ａｓｅ保護法である。本発明の実施において、この方法は、ヒト野生型ＧＲＫ４
遺伝子コード配列に相補的な標識リボプローブの使用を含む。リボプローブおよ
び腫瘍組織から単離されたｍＲＮＡまたはＤＮＡは、共にアニール(ハイブリダイズ)され、続いて二本鎖ＲＮＡ構造内のあるミスマッチを検出できる酵素ＲＮａｓｅＡで消化される。ミスマッチがＲＮａｓｅＡで検出された場合、それ
はミスマッチの部位を開裂する。このように、アニールＲＮＡ調製物が電気泳動
ゲルマトリックスで分離するとき、ミスマッチがＲＮａｓｅＡにより検出およ
び開裂されている場合、ＲＮＡ生産物は、リボプローブの完全長二本鎖ＲＮＡお
よびｍＲＮＡまたはＤＮＡより短いように見える。リボプローブは、ＧＲＫ４の
ｍＲＮＡまたは遺伝子の完全長である必要はなく、いずれかのセグメントであり
得る。リボプローブがＧＲＫ４のｍＲＮＡまたは遺伝子のセグメントのみを含む
場合、ミスマッチに関して全ｍＲＮＡをスクリーンするために、これらのプロー
ブの多くを使用することが望ましい。

【００２８】同様の形態で、ＤＮＡプローブは酵素的または化学的な開裂を介してミスマッ
チの検出に使用できる。例えば、Cotton et al., (1988), Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 85:4397; Shenk et al., (1975), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:989
; およびNovack et al., (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:586参照。

【００２９】あるいは、ミスマッチは、マッチした二本鎖と比べてミスマッチ二本鎖の電気
泳動移動性のシフトにより検出できる。例えば、Cariello, (1988), Human Gene
tics 42:726参照。リボプローブまたはＤＮＡプローブのいずれかで、変異を含んでいるはずの細胞性ｍＲＮＡまたはＤＮＡをＰＣＲプローブハイブリダイゼー
ションを使用して増幅できる。ＧＲＫ４遺伝子のＤＮＡにおける変化は、特に、
変化が欠失および挿入のような正味の再配置である場合、サザンハイブリダイゼ
ーションを使用してまた検出できる。

【００３０】ＰＣＲの使用により増幅されているＧＲＫ４遺伝子のＤＮＡ配列は、また対立
遺伝子特異的プローブを使用してスクリーニングし得る。これらのプローブは核
酸オリゴマーであって、既知の変異を担持する各々ＧＲＫ４遺伝子配列の領域を
含む。例えば、一つのオリゴマーは約３０ヌクレオチド長であり得、ＧＲＫ４遺
伝子配列の部分に対応する。このような対立特異的遺伝子プローブの１組を使用
することにより、ＰＣＲ増幅生産物をスクリーニングし、ＧＲＫ４遺伝子におけ
る先に同定された変異の存在を同定する。対立遺伝子特異的プローブと増幅ＧＲ
Ｋ４配列とのハイブリダイゼーションは、例えば、ナイロンフィルター上で行う
ことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での特定のプ
ローブへのハイブリダイゼーションは、ＤＮＡサンプル中の対立遺伝子特異的プ
ローブと同じ変異の存在を示す。このような対立遺伝子特異的の例は、表３に示
す。

【表９】＊ＧＲＫ４、GenBank Accession # U33054に基づく

【００３１】ＧＲＫ４のコード領域の外側の変異は、イントロンのような非コード領域およ
びＧＲＫ４遺伝子の近くまたはその中の調節配列の試験により検出できる。非コ
ード領域の変異は重要であるという先の指摘は、ノーザンブロット実験によるも
のであって、対照個体と比較して、高血圧症患者における異常サイズまたは多数
のメッセンジャーＲＮＡ分子が示される。

【００３２】ＧＲＫ４のｍＲＮＡ発現の変化は、当分野で既知の方法で検出できる。これら
は、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ増幅およびＲＮａｓｅ保護を含む。減少した
ｍＲＮＡ発現は、野生型ＧＲＫ４遺伝子の変化を示す。野生型ＧＲＫ４遺伝子の
変化は、また野生型アンギオテンシノーゲンの変化に関するスクリーニングによ
り検出できる。例えば、ＧＲＫ４に免疫反応性のモノクローナル抗体は、組織の
スクリーニングに使用できる。同源抗原の欠失は、ＧＲＫ４遺伝子変異を示す。
変異対立遺伝子に特異的な抗体は、また変異ＧＲＫ４遺伝子生産物の検出にも使
用する。このような免疫学的アッセイは、当分野で既知の簡便な形態で行うこと
ができる。これらは、ウエスタンブロット、免疫組織学的アッセイおよびＥＬＩ
ＳＡアッセイを含む。変化したＧＲＫ４を検出する任意の手段を野生型ＧＲＫ４
遺伝子の変化の検出に使用できる。変異ＧＲＫ４遺伝子産物の発見は、野生型Ｇ
ＲＫ４遺伝子の変化を示す。

【００３３】出願人は、上記の６個のＧＲＫ４変異体以外のＧＲＫ４変異体が、本態性高血
圧症に関連することを推測する。このような変異体のインビトロでの同定は、変
異体挿入のＤ１受容体含有細胞がドーパミン作動性シグナルを伝達し得なくする
変異体の能力を測定することによりなされる。このことは、ドーパミン受容体が
Ｇタンパク質ユニットの活性化をしないか、またはナトリウム輸送体を阻害する
ために必要な細胞質性二次メッセンジャーの産生をしないことを意味する。ドー
パミン作動性の伝達の欠失は、特に、Ｄ１受容体／アデニリルサイクラーゼ(ＡＣ)またはＧタンパク質結合欠陥、および上記のタイプの翻訳後修飾でとりわけ明白である。これらの減少の測定は、ドーパミンまたはそのアゴニストの刺激に
対する能力：(ａ)アデニリルサイクラーゼ活性またはｃＡＮＰ産生または活性化
タンパク質キナーゼＡ、(ｂ)活性化ホスホリパーゼＣまたは活性化タンパク質キ
ナーゼＣ、(ｃ)ホスホリパーゼＡ２活性および(ｄ)Ｇ−タンパク質活性またはナ
トリウム／水素交換体またはナトリウム／カリウムＡＴＰａｓｅのようなナトリ
ウム輸送タンパク質の阻害の測定で行える。

【００３４】本態性高血圧症に関連する他のＧＲＫ４は、本態性高血圧症に罹患している個
体から得られまたはクローン化されたＧＲＫ４遺伝子の配列決定により、簡単に
同定できる。

【００３５】野生型ＧＲＫ４または本態性高血圧症と関連するＧＲＫ４は、抗高血圧症活性
について多くの異なるタイプの物質のスクリーニングのための種々のシステムに
包含し得る。一般に、ＧＲＫ４およびＧＲＫ４基質を含むシステム、およびＧＲ
Ｋ４の立体配座または活性(およびその変化)を測定できるシステムを、抗高血圧
症活性の物質のスクリーニングのために使用し得る。このように、本発明のこの
態様の最も広い意味においては、細胞全体を必要としない。システムは、本質と
して人工的であり得、例えば、脂質ミセル内に入れられている。分子相互作用を
研究するための無細胞システムの説明としては、Hammond et al., Nature 327:7
30-732 (1987)を参照。しかし細胞全体が好ましく、ＧＲＫ４基質として、Ｄ１受容体またはその機能的断片である。“機能的断片”なる用語は、リン酸化、パ
ルミトイル化またはインビトロの他の手段で翻訳後修飾されている受容体の一部
を意味する。本発明の好ましい方法は、ＧＲＫ４核酸で形質転換した細胞の使用
を含む。一般に、哺乳類、細菌および昆虫細胞を含む種々の細胞のタイプを使用
できる。チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、ヒト胚腎(ＨＥＫ)繊維芽( ＬＴＫ)細胞、ＭＤＣＫおよびＬＬＣＰ細胞のような哺乳類細胞が好ましい。ＣＨＯ細胞は、それらがインビボで近位尿細管と同じように行動すると予測される
ため、より好ましい。ＧＲＫ４およびＤ１受容体核酸での細胞の形質転換は、標
準法にしたがって行い得る。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY
(1989)およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wil
ey & Sons (1994)参照。

【００３６】本出願のこの態様のより好ましい具体的態様において、本方法は、正常血圧ま
たは高血圧症の動物、例えば、ヒトから単離した細管細胞を使用して調製した不
死化腎近位尿細管を使用して行う。一般に、細管細胞は、皮質を小切片(例えば、１mm³)に切断して腎臓から単離し、容器の適当な生育表面(例えば、コラーゲン被覆Ｔ−フラスコ)に置く。接着が容器の転倒により認められたら(例えば、室
温で約３０分)、容器を起し、適当な培地を添加する。好ましい培地は、物質(wt
/ml)：インシュリン(５マイクログラム)、トランスフェリン(５マイクログラム)
、セレニウム(５ナノグラム)、ヒドロコルチゾン(３６ナノグラム)、トリヨード
チロニン(４ピコグラム)および表皮成長因子(１９ナノグラム)を添加したダルベ
ッコ最小必須およびＦ−１２培地である。組織をインキュベートし、約３日間、
９５％空気、５％ＣＯ₂で分配しないままにした。Detrisac, et al., Kidney In
t. 25:383-390 (1984)。あるいは、皮質の切片を、コラゲナーゼで消化させ、連
続的に２１２および１４０マイクロメーターにふるって、培養前に４０マイクロ
メーターふるいで濃縮し得る。Courjault-Gautier et al., J. Am. Soc. Nephro
l. 5:1949-1963 (1994)参照。“不死化”なる用語は、細胞が培養においていつまでも生育することを意味する。単離の腎近位尿細管細胞を、ＳＶ４０ウイルス
、例えば、ＳＶ４０ｔｓＡ変異体ウイルスで感染させ、次いで、感染約７−８週
間後の過成長を得ることにより不死化し得る。これらの細胞は、ＧＲＫ４タンパ
ク質が機能するインビボ環境をより密接に模倣している利点を提供する。高血圧
症患者からの不死化細胞は、しばしば抗高血圧症活性のための薬剤のスクリーニ
ングに使用できる細胞について殆ど無限の供給を提供する。

【００３７】抗高血圧症特性を有すると推定される物質または薬剤は、物質または薬剤のＧ
ＲＫ４システムへの添加によるＧＲＫ４の立体配座または活性の変化の測定によ
り同定し得る。ＧＲＫ４活性は、アデニレートキナーゼ活性の測定のように間接
的に、または培養に添加したリン酸化可能な物質のリン酸化の程度の測定のよう
に直接的に測定し得る。ＧＲＫ４活性化または不活性化変異体、例えば、各々Ｇ
ＲＫ４活性の増加またはＧＲＫ４活性の減少を導くＧＲＫ４の変異体または多形
性は興味深い。ＧＲＫ４活性の変化は、Ｄ１受容体により例示されるＧタンパク
質結合受容体の機能の変化を導くことができる。ＧＲＫ４は、レニン−アンギオ
テンシン系、カリクレイン−キニン、エンドセリン、房および脳のナトリウム排
泄増加性ペプチド、セロトニン、バソプレッシン、カルシウム検出受容体および
上皮ナトリウムチャンネルのような本態性高血圧症に関与する他のタンパク質の
機能を調節し得る。

【００３８】他のタイプのスクリーニング薬剤は、ＧＲＫ４タンパク質、例えば野生型また
はイソ形または本態性高血圧症に関与する変異体と、検出する抗高血圧症剤との
相互作用によりＧＲＫ４タンパク質の立体配座的変化をもたらす薬剤との間の複
合体を含む。複合薬剤の選択は、立体配座的分析を行う方法に依存する。このよ
うな分析は、分光測光法、フルオレッセンス、核磁気共鳴、エバネッセント波法
および原子間力顕微鏡により行い得る。

【００３９】さらに別のタイプのスクリーニング剤およびプロトコールは、本態性高血圧症
のトランスジェニック動物モデルの使用を含み、動物は本発明の野生型ＧＲＫ４
または変異ＧＲＫ４をコードする核酸を発現する。変異ＧＲＫ４の発現は、高血
圧症により特徴付けられる表現型を明らかにし、動物が急性または慢性のナトリ
ウム負荷を排出する能力を減少させる。トランスジェニックモデルはまた、ＧＲ
Ｋ４の発現および活性における、血圧を減少することが示されている高カルシウ
ム、高カリウムおよび高マグネシウムのような食事操作の効果の試験にも使用で
きる。明らかに、排出システムを有する動物は、本態性高血圧症のモデルとして
使用できる。マウスのような齧歯類が好ましい。

【００４０】トランスジェニック動物は、当分野で既知の方法により製造できる。トランス
ジェニック動物の製造に適用できる方法は、動物の核ＤＮＡ内へのトランスジー
ンの挿入である。これらのトランスジェニック動物は、例えば、米国特許４,８７３,１９１；５,８４９,５７８；５,７３１,４８９；５,６１４,３９６；５,４
８７,９９２；５,４６４,７６４；５,３８７,７４２；５,３４７,０７５；５,２
９８,４２２；５,２８８,８４６；５,２２１,７７８；５,１７５,３８４；５,１
７５,３８３；４,８７３,１９１および４,７３６,８６６ならびにBurke and Ols
on, Methods in Enzymology 194:251-270 (1991), Capecchi, Science 244:1288
-1292 (1989), Davies et al., Nucleic Acids Research 20(11):2693-2698 (19
92), Dickinson et al., Human Molecular Genetics 2(8):1299-1302 (1993), H
uxley et al., Genomics 9:742-750 (1991), Jakobovits et al., Nature 362:2
55-261 (1993), Lamb et al., Nature Genetics 5:22-29 (1993), Pearson and
Choi, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:10578-10582 (1993), Rothstein, Methods i
n Enzymology 194:281-301 (1991), Schedl et al., Nature 362:258-261 (1993
), およびStrauss et al., Science 259:1904-1907 (1993)に明示の当分野で既知の標準法を使用して構築される。更に、公開国際特許出願ＷＯ９４／２３０４
９、ＷＯ９３／１４２００、ＷＯ９４／０６９０８およびＷＯ９４／２８１２３
は、これらに関する更なる関連の教示を提供する。

【００４１】当分野で既知の方法を、標的遺伝子トランスジーンを動物に挿入し、トランス
ジェニック動物の創始系を製造する。このような方法は、前核マイクロインジェ
クション(Hoppe, P. C. and Wagner, T. E., 1989, 米国特許４,８７３,１９１)
；生殖細胞系へのレトロウイルス仲介遺伝子移入(Van der Putten et al., Proc
. Natl. Acad. Sci., USA 82:6148-6152 (1985))；胚幹細胞への遺伝子標的化(T
hompson et al., Cell 56:313-321 (1989))；胚のエレクトロポレーション(Lo.
Mol. Cell. Biol. 3:1803-1814 (1983))および精子仲介遺伝子移入(Lavitrano e
t al., 1989, Cell 57:717-723 (1989))を含むが、これらに限定されない。これ
らの方法に関する一般的総説は、Gordon, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cyt
ol. 115:171-229 (1989)参照。

【００４２】本発明は、全細胞にＧＲＫ４トランスジーンを担持するトランスジェニック動
物、および全てではないが、いくつかの細胞にトランスジーンを担持する動物、
即ち、モザイク動物を提供する。トランスジーンは、単一トランスジーンまたは
、例えば、頭と頭のタンデム、頭と尾のタンデムのコンカタマーとして統合され
得る。トランスジーンはまた、例えば、Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 89:6232-6236 (1992)の教示にしたがって、特定の細胞タイプに選択的に挿
入し、その中で活性化され得る。当業者は、このような細胞タイプ特異的活性化
に必要な調節配列は、目的の特定の細胞タイプに依存することを認める。標的遺
伝子トランスジーンが内因性標的遺伝子の染色体部位に統合されるのが望ましい
とき、遺伝子標的化が好ましい。簡単に述べると、このような方法を用いるとき
、目的の内因性標的遺伝子と相同的なあるヌクレオチド配列を含むベクターを、
染色体配列との相同的組換えを介して、内因性標的遺伝子のヌクレオチド配列に
統合し、機能を中断する目的で設計する。トランスジーンはまた、例えば、Gu e
t al., Science 265:103-106 (1994)の教示にしたがって、特定の細胞タイプに選択的に挿入し、そしてその細胞タイプのみで目的の内因性遺伝子を不活化し得
る。このような細胞タイプ特異的不活性化に必要な調節配列は、目的の特定の細
胞タイプに依存し、当業者には明らかである。

【００４３】トランスジェニック動物を産生したら、組換え標的遺伝子およびタンパク質の
発現を、標準法を使用してアッセイし得る。最初のスクリーニングは、動物組織
の分析のためにサザンブロット分析またはＰＣＲ法を使用して達成し得、トラン
スジーンの統合が起きているかをアッセイする。トランスジェニック動物の組織
内のトランスジーンのｍＲＮＡ発現のレベルは、また動物から得た組織のノーザ
ンブロット分析、インシチュハイブリダイゼージョン、およびＲＴ−ＰＣＲを含
むが、これらに限定されない方法を使用して評価し得る。標的遺伝子発現組織の
サンプルは、また、目的の標的遺伝子トランスジーン遺伝子生産物に特異的な抗
体を使用して、標的細胞化学的に評価し得る。

【００４４】標的遺伝子ｍＲＮＡまたは標的遺伝子トランスジーンペプチド(標的遺伝子産物エピトープを指向する抗体を使用して、免疫細胞化学的に検出)を容易に検出可能なレベルで発現する標的遺伝子トランスジェニック動物を、次いで更に評価
し、本態性高血圧症の特徴的症状を示す動物を同定する。

【００４５】好ましい具体的態様において、ＧＲＫ４トランスジーンを適当なベクターに挿
入し、テトラサイクリン感受性プロモーターに操作不可能的に結合し、次いで、
胚性幹(ＥＳ)細胞に導入する。ＥＳ細胞は、次いで遺伝的に変えたＥＳ細胞を宿
主胚盤胞にマイクロインジェクションすることにより、または桑実胚共培養によ
り再導入する。創始系動物を得、次いで、ＧＲＫ４トランスジーンに同型接合の
動物を使用する。Thompson, et al., Am. J. Physiol. 269:E793-E803 (1995)参
照。

【００４６】治療様相は、標的ＧＲＫ４活性をナトリウム尿排泄亢進まで増加させることを
伴うか、またはそうでなければナトリウムと水の適当なバランスに関する正常性
に近づく。例えば、ＧＲＫ４発現は、ＲＮＡレベルまたはＤＮＡレベルで、腎細
胞のＧＲＫ４の発現を変える薬を投与することにより予防できる。このような薬
剤は、好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、優性阻害変異体ＤＮＡ分
子、およびＧＲＫ４ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、またはＧＲＫ４ＤＮＡの結合
によりＧＲＫ４発現を減少するまたは防止するリボザイムのようなオリゴヌクレ
オチド分子である。アンチセンスオリゴヌクレオチドの高血圧者への投与は、米
国特許５,８５６,０９９；５,８５６,１０３；５,７８３,６８３；５,８４０,７
０８；および５,５９１,６００；５,８４９,９０３；５,１３５,９１７；５,０９８,８９０；および５,０８７,６１７に記載の製剤および媒体にしたがって行うことができる。現在当分野で既知のアンチセンス法は、また、Uhlmann et al.
, Chem. Rev. 90:543-584 (1994); Oligodeoxynucleotides: Antisense Inhibit
ors of Gene Expression (Cohen, ed. 1989); Delivery Strategies for Antise
nse Oligonucleotide Therapeutics, CRC press (Saghir Akhtar, et. 1995); およびStein, C. A., and Cohen, Jack S., "Oligodeoxynucleotides as Inhibi
tors of Gene Expression: A Review," Cancer Research, 48:2659-2668 (1988)
にも記載されている。

【００４７】合成アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列とハイブリダ
イズし、所望の効果、例えば、ｍＲＮＡ分子の翻訳の遮断を発揮するのに十分な
長さでなければならない。しかし、相対的に小さいオリゴヌクレオチドを使用す
るのが有利である。なぜなら、それらは、細胞にインビボでより効率的に取りこ
まれ、より多い数のアンチセンスオリゴヌクレオチドが標的ｍＲＮＡの位置に送
達されるようである。好ましくは、十分な特異性を達するために、アンチセンス
オリゴヌクレオチドは少なくとも１５ヌクレオチド長、好ましくは２０ヌクレオ
チド長でなければならない。好ましいアンチセンスは、５'ＣＡＣＧＡＴＧＴＴＣＴＣＧＡＧＣＴＣＣＡＴ３'(塩基２５５−２７５に相補的)および５'ＣＴＣＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＣＧＣＣＧ３')塩基２４３−２６０に相補的)である。

【００４８】上記のような小さいオリゴヌクレオチドは、雑多なヌクレアーゼの分解に非常
に感受性である。更に、このような分子は、不十分な膜貫通のために、細胞内に
入ることができないことがある。この理由のために、当業者は、一般に、安定性
および膜貫通を増加する種々の方法で修飾したオリゴヌクレオチドを合成する。
修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、本発明で好ましい。“アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドアナログ”なる用語は、下記のような、このような修飾
オリゴヌクレオチドを意味する。

【００４９】本発明のオリゴヌクレオチドは、簡便には既知の方法の固相法を使用して合成
し、本明細書に記載の配列をコードする標的ＧＲＫのＤＮＡまたはＲＮＡの予め
選択した配列と相補的および／または特異的にハイブリダイズできるように設計
する。核酸合成装置は商品として入手可能であり、その使用は、妥当な長さの所
望のオリゴヌクレオチドの製造に有効であるとして当業者に理解されている。

【００５０】ＧＲＫ４ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡの分解を触媒する、例えば、ハンマー
ヘッドまたはハリピンタイプのリボザイムを設計でき、標準法にしたがって製造
できる。治療的使用のリボザイムの設計、製造および製剤に関する詳細な教示は
、例えば、米国特許５,８５６,４６３(およびその中に引用されている刊行物)参
照。

【００５１】ＧＲＫ４活性はまた、タンパク質に直接作用することにより完全にまたは部分
的に発現されたＧＲＫ４タンパク質の触媒活性、例えば、リン酸化または非リン
酸化作用を変化(例えば、阻害または促進)する薬理的アンタゴニストのような薬
剤の投与により標的化できる。他の治療的作用は、ＧＲＫ４タンパク質とペプチ
ド様薬剤の直接の結合を伴う。これらの方法および薬剤の全ては、ＧＲＫ４を発
現する腎細胞におけるＤ１受容体／ＡＣ結合の正常化をもたらし、その結果、腎
近位尿細管におけるナトリウム輸送を減少させる。

【００５２】本発明を、以下の詳細な実施例を参照して更に記載する。これらの実施例は説
明の目的のみで提供され、特記しない限り、本明細書に記載の本発明の限定を意
図するものではない。

【００５３】実施例組織培養ヒト腎を、腎癌腫のため片側の腎を摘出した患者から新鮮な外科的標本として
得た。患者記録を調べて、正常血圧（ｎ＝９）と本態性高血圧症（ｎ＝１４）と
に分類した。収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ未満で弛緩期血圧が９０ｍｍＨｇ未満
の者を正常血圧者とした。収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ以上で弛緩期血圧が９０
ｍｍＨｇ以上の者および／または抗高血圧剤服用者を高血圧者とした。

【００５４】組織学的に確認された正常な腎切片からの腎近位尿細管細胞の培養物（０．０
７５％タイプＩコラーゲンで被覆した２４ウエルプラスチック管における５ｘ１
０⁵細胞／ウエル）を、３７℃で９５％Ｏ₂／５％ＣＯ₂中でインキュベートし、デルベッコ修飾イーグル培地とハムＦ１２培地との１：１の混合物からなる血清
を含まない培地で生育した。この培地には、セレニウム（５ｎｇ／ｍｌ）、イン
スリン（５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾ
ン（３６ｎｇ／ｍｌ）、トリヨードチロシン（４ｐｇ／ｍｌ）、表皮成長因子（
１０ｎｇ／ｍｌ）（５）が補充されている。半コンフルエント（９０−９５％）
のときは、細胞を継代培養して（６−８継代）、トリプシンＥＤＴＡ（０．０５
％、０．０２％）を使用する実験プロトコールに用いた。この培養条件は、腎近
位尿細管細胞の特性を保持するヒト腎近位尿細管の成長に役立つ。Sanada, H. e
t al., J. Invest. Med. 45: 277A (1997)。

【００５５】光学顕微鏡による免疫組織化学 HISTOCHOICE中に不死した培養物における腎の組織および細胞について免疫組織化学的検査を、Sanada, H. et al.（前出）に記載のように行った。アフィニティー・カラム精製ポリクローナル・ヒトＤ₁受容体抗体が合成ペプチド配列ＧＳＧＥＴＱＰＦＣ（アミノ酸２９９−３０７）に対して生じる。参照、Sanada,
H. et al.（前出）。２種の市販（Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz
, CA）のＧＲＫ４イソ形抗体を使用した。１つのＧＲＫ４抗体がαイソ形とβイ
ソ形の両方を認識し、他の１つが両αβイソ形を認識した。これらの抗体の特異
性はすでに報告されている。Sanada, H. et al.（前出）および Guyton A. C. C
irculatory Physiology III, Arterial Pressure and Hypertension, W. B. Sau
nders Co., Philadelphia, PA (1980)。

【００５６】免疫組織化学的検査によると、ＧＲＫ４α／βおよびＧＲＫ４α／σのイソ形
発現が腎の近位および遠位の尿曲細管のみでみられた（ヘレン係蹄、皮質および
髄質の集合管、糸球体、腎動脈ではみられなかった）。ＧＲＫ４α／σは管腔膜
および基底膜の両方でみられたが、ＧＲＫ４α／βは管腔膜のみでみられた。こ
れら２種のＧＲＫ４の腎発現について、高血圧者と正常者とで差異がなかった（
表示せず）。ＧＲＫ４α／βおよびＧＲＫ４α／σの発現は、培養物の腎近位尿
細管細胞において持続した（写真は示さず）。

【００５７】ＧＲＫ活性の測定ＧＲＫ活性を Benovic, Methods Enzymol. 200: 351-362 (1991)に従って測定し
た。腎近位尿細管抽出物の調製は、氷冷の融解緩衝液中での均質化によった。こ
の緩衝液は、２５トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ＥＤＴＡ、５ＥＧＴＡ、ロイペ
プシン（１０μｇ／ｍｌ）、アプロチニン（２０μｇ／ｍｌ）および１ＰＭＳＦ
を含む。粗均質物を３０，０００ｇで３０分間遠心分離した。ペレットの抽出を
２００ｍＭのＮａＣｌで３０分間行い、３０，０００ｇで３０分間遠心分離した
。上澄み液をＧＲＫアッセイおよびイムノブロッティグに用いた。２０μｇのタ
ンパク質抽出液を、ロドプシン強化桿外側セグメントとともに、１０ｍＭのＭｇ
Ｃｌ₂および０．１ｍＭのＡＴＰ（γ³²Ｐ−ＡＴＰ含有）中でインキュベートした。白色光で１５分間室温でのインキュベーション後、反応を氷冷の融解緩衝液
で停止し、３０，０００ｇで１５分間遠心分離した。ペレットをラエムリ緩衝液
に再懸濁し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに掛けた。ゲルにオートラジオグラフィを
行い、リン酸化ロドプシンの定量を、密度計測と適当なサイズでの切除バンドの
放射活性計測で行った。また、ＧＲＫ活性の測定をＧＲＫイソ形抗体の存在およ
び不存在で行った。

【００５８】図１は、Ｄ₁様アゴニストであるフェノルドパムがＧＲＫ活性に対する作用を有さないことを示す。これは、正常血圧者からの腎近位尿細管細胞におけるロド
プシンのリン酸化により調べられた。このデータによると、基質としてロドプシ
ンを使用し得るＧＲＫ（すなわち、ＧＲＫ２、ＧＲＫ３、ＧＲＫ４α、ＧＲＫ５
、ＧＲＫ６）は、血圧が正常であるとき、腎近位尿細管細胞におけるＤ₁受容体の脱感作に関与しない。また、培養物中の腎近位尿細管細胞におけるＤ₁受容体およびＧＲＫ４の発現は、高血圧者と正常血圧者とで類似していた（データは示
さず）。しかし、高血圧者からの腎近位尿細管細胞において、フェノルドパムが
ＧＲＫ活性を増加した。さらに、腎近位尿細管細胞における基本的ＧＲＫ活性は
、高血圧者において正常血圧者におけるよりも大きかった。これらの研究から高
血圧における腎近位尿細管細胞でのＧＲＫの異常な機能がわかる。

【００５９】フェノルドパムによりつくられたＧＲＫ活性の増加（高血圧における）は、Ｇ
ＲＫ２、ＧＲＫ３およびＧＲＫ４α／σに対する抗体によって遮断され、これら
のＧＲＫの１つまたはすべての活性がＧＲＫ４活性のフェノルドパム仲介増加に
関与し得ることを表す。Tiberi et al., J. Biol. Chem. 271: 3771-3778 (1996
)。しかし、ＧＲＫ２およびＧＲＫ３の偏在的発現は、げっ歯類およびヒトの本態性高血圧の病因において認識されている腎の特徴と適合しない。Guyton, W. B
. Saunders Co. Phil., PA (1980); Guidi et al., J. Am. Soc. Nephrol 7: 11
31-1138 (1996)。ＧＲＫ２のコード領域の配列には、高血圧者と正常血圧者との
間に差異がみられなかった（データは表示せず）。このことから、高血圧患者の
リンパ球のおけるＧＲＫ２活性の増加が高血圧にとって二次的であり（Gros et
al., J. Clin. Invest. 99: 2087-2093 (1997))、遺伝的および誘発された高血圧のげっ歯類おけるＧＲＫ５の活性および発現の増加について示唆されていたこ
とと同様である。Ishizaka et al., J. Biol. Chem. 272: 32482-32488 (1997) 。

【００６０】ｃＡＭＰ蓄積の測定細胞をダルベッコ・リン酸緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ）で２回洗い、次いで各ウエル
に１ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチンを加えた。細胞を３７℃で３
０分間、薬剤とともに、または薬剤なしでインキュベートした。薬剤は、ドパミ
ンおよびＤ₁様受容体アゴニスト、フェノルドパム、Ｄ₁様受容体アンタゴニスト
、ＳＣＨ２３３９０（Research Biochemicals International, Natick, MA）、およびフォルスコリン（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）である。次いで、細胞をＤ−ＰＢＳで２回洗い、−８０℃に冷凍して、さらに０．１ＮのＨＣｌ
で分解した。ｃＡＭＰの濃度を放射免疫検定法で測定した。Sanada, H. et al.,
（前出）、Kinoshita, S. J. Chlin. Invest. 84: 1849-1856 (1989)。タンパク
質の濃度をＢＣＡタンパク質アッセイ・キットで測定した。

【００６１】ＧＲＫ４活性の増加が高血圧での腎近位尿細管細胞におけるＤ１受容体の非共
役に関与しているかどうかを確認するために、アンチセンス・オリゴヌクレオチ
ドによるＧＲＫ４翻訳の阻害後のｃＡＭＰに対するＤ１様アゴニスト刺激作用を
調べた。図２からわかるように、Ｄ１様アゴニストのフェノルドパムによるｃＡ
ＭＰの蓄積は、高血圧者よりも正常血圧者の腎近位尿細管細胞において大きい。
センス／スクランブルまたはアンチセンスのいずれのＧＲＫ４オリゴヌクレオチ
ドも基底性またはフォルスコリン刺激ｃＡＭＰ産生に作用しなかった。フェノル
ドパムのみに比べると、センスまたはスクランブルのいずれのＧＲＫ４オリゴヌ
クレオチドもいずれのグループでのｃＡＭＰ蓄積に作用しなかった。しかし、ア
ンチセンスＧＲＫ４オリゴヌクレオチドはフェノルドパムの能力を高め、高血圧
者由来の細胞でのｃＡＭＰの蓄積を促進し（正常血圧者からでは、しない）、そ
の値は、フェノルドパムで処置された正常血圧者の細胞で見られる値とほぼ同じ
であった。

【００６２】免疫沈降近位管細胞を、運搬物、フェノルドパム、センス、スクランブルまたはアンチ
センスのプロピン／ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド（５ｎＭ）ととも
に、上記のようにインキュベートした。膜を氷冷融解緩衝液（ＰＢＳと、１％Ｎ
Ｐ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ，１ｍＭのＥＤ
ＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭバナジン酸ナトリウム、１ｍＭのＰＭＳＦ、１
０μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイペプシン）で溶解した。溶解物
を、ＩｇＧ精製アンチＤ₁受容体抗体とともに氷上１時間、そしてタンパク質Ａアガロースとともに１２時間ゆすりながら４℃でインキュベートした。ＳＤＳポ
リアクリルアミド・ゲル電気泳動により分離したタンパク質を、ニトロセルロー
ス膜上に電気泳動で移した。移行ブロット・シートを、１０ｍＭトリスＨＣｌ、
ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％ツィン２０中で５−１０％の脂肪
なし乾燥乳で阻害し、希釈の親和性精製ポリクローナル・アンチホスホセリン抗
体（Zymed Lab, San Francisco, CA）とともにインキュベートした。Sanada, H.
et al.（前出）。オートラジオグラムおよび免疫ブロットをＥＣＬシステム（A
mersham, Arlington Heights, Il）で可視化し、エンシトメトリーで定量した。
Sanada, H. et al.（前出）。

【００６３】次の検討は、アンチセンスＧＲＫ４オリゴヌクレオチドの示差作用がＤ₁受容体のリン酸化まで及ぶかどうかである。図３からわかるように、腎近位尿細管細
胞でのセリン−リン酸化Ｄ₁受容体の基底レベルは、正常血圧者よりも高血圧者で高く、高血圧者でのＧＲＫ活性の基底レベルの増加に相関する（図１に示す）
。フェノルドパムは、セリン−リン酸化Ｄ₁受容体の量を正常血圧者で増加せしめたが、高血圧者では増加せしめない。このことは、以前の報告 Sanada, H. et
al.（前出）に一致する。センスまたはスクランブルのいずれのＧＲＫ４オリゴ
ヌクレオチドは、両グループの対象者のフェノルドパム処置細胞におけるＤ₁受容体のリン酸化に作用しなかった。一方、ＧＲＫ４アンチセンス処置は、高血圧
者からのフェノルドパム処置腎近位尿細管細胞におけるＤ₁受容体のリン酸化を、基底値より低いレベルまでほとんど消失せしめた。ＧＲＫ４アンチセンス処置
は、正常血圧者からのフェノルドパム処置腎近位尿細管細胞におけるＤ₁受容体のリン酸化も下げたが、基底値よりは高かった。高血圧者の腎近位尿細管細胞に
おいてＧＲＫ４に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドによりＤ₁受容体のリン酸化がほとんど完全に抑制されることから、高血圧のおけるＤ₁受容体のリン酸化および脱感作に関与する主要なＧＫＲがＧＲＫ４であって、このネフロン
切片で発現される他のＧＲＫでないことがわかる。

【００６４】遺伝子型決定ホモ接合性ＧＲＫ４遺伝子変異体の発生率が高血圧者で約６０％および一般人
で１６％であるという当初の観察に基づくと、能力分析（能力：０.８、α：０.
０５、効果：４５％）がグループにつき１４−２１のサンプルサイズで、グルー
プ間の有意な差違が検出できる。従って、さらに高血圧者１８名および正常血圧
者１１名の末梢血によるＤＮＡを入手した。少なくとも２人の研究者で全志願者
を検査し、医療記録を検討した。高血圧症の病歴および潜在的高血圧症の臨床徴
候をもたず、降圧剤薬物治療を行なっておらず、血管拡張療法または血圧に影響
し得る他の薬剤を受けず、および最近の３回の診療訪問で収縮期血圧が１４０mm
Ｈgより低く、弛緩期血圧が９０mmＨより低い状態であった者を正常圧として、被検者を分類した。高血圧症の患者らは、顕著であり持続的な血圧上昇(収縮期血圧１６０mmＨg以上で弛緩期血圧が９５mmＨg以上)を少なくとも３回の機会で有していた。高血圧者 (腎臓由来のＤＮＡ：ｎ＝１４、末梢血由来のＤＮＡ：ｎ
＝１８)は全員２０歳以上であった。各個体の本態性高血圧の後期発症についての先天性な問題を除去するため、正常血圧者(腎臓由来のＤＮＡ：ｎ＝９、末梢血由来のＤＮＡ：ｎ＝１１)は全員４５歳以上であった。

【００６５】培養中の腎臓近位尿細管細胞および腎組織または任意の末梢白血球から、ゲノ
ムＤＮＡを抽出した(塩析法)。多形性ヌクレオチドを含むＧＲＫ４のエキソンを
、表２で示すプライマーで増幅した。反応混合物２０μlは、それぞれ、１ＸＰ
ＣＲ緩衝液、０.２mＭの各ｄＮＴＰ、１.２５mＭＭｇＣｌ₂、０.２μＭの各プライマー、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ０.５単位およびゲノムＤＮＡ５０ngを含んでいた。反応混合物を９４℃で５分間変性し、次いで、９４℃の３０秒間変
性、５５℃のリアニール３０秒間および７２℃の３０秒伸長を３０サイクル行
なった。７２℃での５分間の最終伸長でＰＣＲが完了した。ＰＣＲ産物２μlを
バイオダインＢ＋膜上にスポットした。下記の野生型および変異体の対立遺伝子
特異的オリゴヌクレオチドプローブそれぞれについてドットブロットを行った( 表４)。プローブ標識化、膜調製、ハイブリダイゼーション、および洗浄条件は公知の手順である。Song et al., Clin. Chem. 43:1857-1861 (1997)参照。任意
の被検者２５０人の１８０１位ヌクレオチドは変異体(Ｇ)であった。９９３位の
多形性ヌクレオチドの頻度は高血圧者と正常血圧者で違いがないことも判明した
。従って、調査の結果、４４８、６７９、１７１１位の３つのみ(表４)の多形性
部位が存在する。サンガー・ジデオキシ連鎖停止法でｃＤＮＡ配列を決定した。

【００６６】表４．正常血圧者および高血圧者のＧＲＫ４変異体

【表１０】

【００６７】対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを使用したドットブロット分析で遺伝子
型を決定した。高血圧者の４名は２つの部位(６５位および１４２位アミノ酸)で
相同性があった。高血圧者のＲ６５Ｌ、Ａ１４２Ｖおよび/またはＡ４８６Ｖのホモ接合性変異体の頻度(５３％、３２中の１７)は、正常血圧者で示されたもの
(５％、２０中の１)と有意に異なっていた(Ｘ²＝１０.５６、Ｐ＝０.００１２) 。ホモ接合性変異体Ａ１４２Ｖの頻度もまた、高血圧者(３４％、３２中の１１)
および正常血圧者(０％、２０中の０)で有意に異なっていた(Ｘ²＝６.７８、Ｐ＝０.００９２)。

【００６８】ヒト腎臓由来ＧＲＫ４のｃＤＮＡの配列決定、さらに、腎臓および末梢白血球
細胞由来のＤＮＡ中の５つの多形性部位の遺伝子型決定から、３つの変異体が明
らかになった：ヌクレオチド４４８、ＣＧＴからＣＴＴ(アミノ酸Ｒ６５Ｌ)、ヌ
クレオチド６７９、ＧＣＣからＧＴＣ(アミノ酸Ａ１４２Ｖ)、およびヌクレオチ
ド１７１１、ＧＣＧからＧＴＧ(アミノ酸Ａ４８６Ｖ)(オートラジオグラフは示していない)の変異体が、正常血圧者より高血圧者で頻繁に現われた(表４)。高血圧者におけるＲ６５Ｌ、Ａ１４２Ｖ、および/またはＡ４８６Ｖのホモ接合性変異の頻度(５３％，３２中の１７)は、正常血圧者で示されたもの(５％，２０中の１)と有意な違いがあり(Ｘ²＝１０.５６，Ｐ＝０.００１２)(表4)、無作為成人被検者５０人でみられたものと異なっていた(Ｘ²＝１０.９９，Ｐ＝０.００
０９)。この血圧不明の無作為集団の中で、１６％がＲ６５Ｌおよび／またはＡ４８６Ｖでホモ接合性であり、および５０％がＲ６５ＬまたはＡ４８６Ｖの何れ
かでヘテロ接合性であった；ホモ接合性対立遺伝子の頻度１６％は、本態性高血
圧症の発生率に近い（Lifton R P. Science 272:676-680 (1996)）。ＧＲＫ４Ａ１４２Ｖ位のホモ接合性変異も、それ自体は、高血圧症 (３４％、３２中の１
１) の方が正常血圧者(０％、２０中の０)より頻繁であった(Ｘ²＝６.７８，Ｐ＝０.００９２)。

【００６９】ＧＲＫ４αは、リン酸化ロドプシンにレポートされる唯一のＧＲＫ４イソ形で
ある(Sallese et al., J. Biol. Chem. 272:10188-10195 1997))が、我々の研究
では、フェノルドパムによるＤ1アゴニスト刺激は、正常血圧者の腎臓近位尿細管細胞中のＧＲＫ活性を増強しなかった(図１)。従って、ＧＲＫ４αはＤ1受容体の脱感作に関与していないと結論した。その確信によると、ロドプシンを普通
はリン酸化しないＧＲＫ４イソ形(例えばＧＲＫ４γ)(Premont et al., J. Biol
. Chem. 271:6403-6410 (1996); Sallese et al., supra.; and Virlon et al.,
Endocrinol. 139:2784-2795 (1998))は、高血圧症で活性となり得る。たしかに
ＧＲＫ活性中のＤ1様アゴニスト介在増加は、高血圧者の腎臓近位尿細管細胞中のＧＲＫ４αδの膜発現の増加と関連があることが分かったが、正常血圧者(図４)では関連しない。

【００７０】トランスフェクションおよび細胞培養ラットＤ1(rＤ1)またはヒトＤ1(hＤ1)受容体ｃＤＮＡを、発現ベクターｐＰＵ
Ｒ(Clontech, Palo Alto, CA)またはｐｃＤＮＡ３.１/Ｚｅｏ(Invitrogen, Carl
sbad, CA)中で、それぞれ、ＥｃｏＲ１およびＸｂａＩ部位でサブクローン化した。得られた作成物を使用し、ｐＴｅＴ−オフレギュレータープラスミドを発現するＣＨＯ細胞を、安定してトランスフェクトした(Clontech, Palo Alto, CA
)。この操作にリン酸化カルシウムを使用した。Yamaguchi et al., Mol. Pharma
col. 49:373-378 (1996)参照。ヒト腎臓皮質由来ｍＲＮＡのＲＴ/ＰＣＲから得られた、ＧＲＫ４γおよびＧＲＫ４δのcＤＮＡを、pＴｅｔ-オフ応答プラスミ
ド中へ入れサブクローン化した(ｐＴＲＥ−ｒＤ１またはｐＴＲＥ−ｈＤ1とｐＴ
Ｋ−Ｈｙｇをそれぞれ２０：１の割合で混合した)(Clontech, Palo Alto, CA)。

【００７１】ＧＲＫ４α遺伝子の変異が他の機能的結果を有するかどうか測定するために、
Ｄ1様アゴニストの効果を、Ｄ1受容体および野生型または変異体ＧＲＫ４α cＤ
ＮＡの両方をトランスフェクトする、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞
中のｃＡＭＰ産物について調べた。ＧＲＫ４δを対照として使用した。ＧＲＫ４α欠損下におけるＣＨＯ細胞中の投与応答カーブは、ＨＥＫ-２９３細胞(低い
内因性ＧＲＫ活性を有する細胞)で示されるものと類似していた。Premont et al
, 前出。野生型ＧＲＫ４αの発現は、Ｄ1アゴニストのｃＡＭＰ産物を刺激する能力を減少させた(図５)。しかし、Ｄ1アゴニスト活性の阻害は、ＧＲＫ４α変異体Ｒ６５Ｌおよび/またはＡ４８６Ｖよりも大きくなった。野生型または変異体のＧＲＫ４αの効果は、Ｄ1受容体またはＧＲＫ４αの何れかの発現量の違いからではない(データは示していない)。野生型ＧＲＫ４αまたはその変異体は、
フォルスコリンの能力に作用せず、ＧＲＫ４αとＤ1受容体の相互作用の特異性を表わすｃＡＭＰ蓄積を刺激する。フェノルドパムの作用はＤ1受容体に対して選択的であり、フェノルドパム効果は、Ｄ1様アンタゴニストＳＣＨ２３３９０によって遮蔽されたことによるからである(データは示していない)。他の研究で
は、野生型ＧＲＫ４δは、野生型ＧＲＫ４αによって誘発されたＤ1受容体の脱感作と比較し、Ｄ1様アゴニスト介在のｃＡＭＰ蓄積に対して効果がない(データ
は示していない)。腎臓近位尿細管細胞の機能的研究およびＣＨＯ細胞の発現研究では、ＧＲＫ４αの活性増加が、Ｄ1受容体リガンドの能力の減少の原因であり、高血圧症でエフェクター酵素およびイオン輸送タンパク質と結合することを
提唱する。言いかえると、高血圧者における腎臓近位尿細管中のＤ1受容体の脱感作は、腎臓の能力増強につながり、塩化ナトリウムの負荷を除去する。腎臓の
塩化ナトリウム排出の不足は、高血圧症の進行に極めて重要であると考えられる
。 Guyton, A.C., Circulatory Physiology III. Arterial Pressure and Hyper
tension, W.B. Saunders Co.,, Philadelphia, PA (1980); Guidi et al., J. A
m. Soc. Nephrol. 7:1131-1138 (1996)。確かに、腎臓ナトリウム輸送を調節する遺伝子は、血圧の調製に重要であると記されている。Lipton, R.P. Science 2
72:676-680 (1996)およびKaret & Lifton, Recent Prog. Horm. Res. 52:263-27
6 (1997)。

【００７２】物質または薬剤を生物体中へ注入し、引き起こされたＧＲＫ４活性の減少が抗
高血圧療法として役立ち得るかどうかを調べるために、自発性高血圧症ラット( ＳＨＲ)でさらなる実験を行なった。６匹の雌ラット(４週齢、体重１００g)を左
一側性腎摘出し、２週間そのままにしておいて、手術から回復させた。回復後、
単独のアウトレットカテーテルを装備する３０日浸透圧ミニポンプを、ホスホロ
チオネート/プロピン介在アンチセンスＧＲＫ４オリゴヌクレオチド(５nＭ、１マイクロリットル/時間)またはスクランブルＧＲＫ４オリゴヌクレオチドで充填
し、残された左腎臓の腎皮質中へ移植する。カテーテルのアウトレットを残され
た腎臓の腎皮質中のほぼ１mm深さに挿入し、スーパーグルーで固定した。ラット
を手術から回復させ、血圧と尿出量を毎日測定した(容量と電解液)。３０日後、
ラットを屠殺し、残された腎臓をＧＲＫ４のウエスタンブロット分析に使用した
。我々の研究によると、血圧は、スクランブルＧＲＫ４オリゴヌクレオチド(ｎ＝３)を処置したラットのときと比較して、ＧＲＫ４(ｎ＝３)にアンチセンスオリゴヌクレオチドを処置したラットで減少した。さらに、ウエスタンブロット分
析で、アンチセンスオリゴヌクレオチドは腎臓ＧＲＫ４の発現を減少させること
を証明した。

【００７３】結果として、この例では、本態性高血圧者由来の腎臓近位尿細管細胞における
Ｄ1受容体/アデニリルシクラーゼ共役で欠損が示された。ヒト本態性高血圧症の
腎臓近位尿細管細胞のＧＲＫ活性の増加は、ＧＲＫ４の活性化ミスセンス変異に
よるものであり、この効果はトランスフェクトされた細胞モデルで再現された。
その上、ＧＲＫ４の翻訳を防止し、高血圧症におけるＤ1受容体のアデニリルシクラーゼに対する結合を正常化した。さらに何れの特定の理論に拘束されること
を意図することなく、出願人は、ホモ接合性アミノ酸変異は、Ｄ1受容体のリガンドに依存しないセリン-リン酸化を引き起こし、Ｇタンパク質/エフェクター複
合体からその結合解離をもたらすと考える。腎臓近位尿細管中のＤ1受容体の脱感作は、ドーパミンのナトリウム排泄作用を低下し、最終的にナトリウム保持お
よび高血圧症となる。これらの結論は、ＧＲＫ４に対するアンチセンスオリゴヌ
クレオチドを自発性高血圧症ラットの腎臓内に注入すると、腎臓内でＧＲＫ４濃
度が減少し、平均動脈血圧が低下するという上記実験の結果に対応している。従
って、ＧＲＫ４の濃度または活性を変える物質または薬剤は、降圧性薬物治療の
新規段階を表わす。

【００７４】ドーパミンＤＩＡ受容体とＧプロテイン/エフェクター酵素複合体とのネフロンセグメント特異的欠損結合は、自発性高血圧症ラット(ＳＨＲ)の腎臓ナトリウ
ム保持の原因となり得る。腎臓近位尿細管中でナトリウム輸送を阻害する外因性
および腎臓内因性のドーパミンの能力減少は、ＳＨＲと正常圧対照(ウィスター-
キョート(ＷＫＹ)ラット)とのＦ２交配において高血圧症を同様におこす。同様の欠損がダール塩過敏性ラットで判明した。さらに重要なことに、本態性高血圧
症のヒトでも判明した。従って、高血圧症ヒト由来の腎臓近位尿細管の初期の培
養は、腎臓Ｄ1様受容体とアデニリルシクラーゼ(ＡＣ)の欠損結合を有しており、同様な結合欠損が高血圧症齧歯動物でもみられた。これらのインビトロデータ
は、欠損Ｄ1様受容体を証明するインビボ研究（Ｇタンパク質/エフェクター酵素
複合体は、相同性または異種性脱感作、受容体下方制御、Ｇタンパク質またはエ
フェクター酵素“欠損”またはＤ1様受容体の１次配列における変異によらない）に一致する。むしろ、Ｄ1様受容体の脱共役は、Ｄ-l受容体(腎臓中の主要なＤ
1様受容体)のリガンドに依存しない過リン酸化の結果であり、限られた器官およ
びネフロンの発現を伴うＧＲＫ４イソ形のホモ接合性変異体の結果である。

【００７５】産業上の利用可能性本発明の診断検査は、個体をスクリーニングし、その本態性高血圧症の素因を
同定できるであろう。これらの検査の実施に関する、遺伝、細胞および生化学的
手段も提供する。本発明は、薬剤を発見するための手段および方法も提供し、お
よび抗高血圧性の活性または特性を有する物質を同定する。組成物および方法は
、それぞれ本態性高血圧症を有する個体の腎細胞中のナトリウム輸送を正常化す
るものであり、この疾患の処置手段を提供する。

【００７６】本明細書で引用したすべての特許および非特許の刊行物は、本発明の属する当
業者の技術のレベルを示している。すべての出版物または特許出願は、出典明示
により本明細書の一部とすることを具体的に個々に示したのと同様に、出典表示
より本明細書の１部とする。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、正常血圧の被験者からではなく高血圧の被験者からの近
位尿細管細胞においてＤ１様アゴニストがＧＲＫ活性を刺激することを示すグラ
フである。

【図２】図２は、ＧＲＫ４の発現を防止すると、高血圧者からの近位尿細
管細胞の能力が正常値に回復し、Ｄ１様アゴニストによって生じるｃＡＭＰ産生
物を増加することを示すグラフである。

【図３】図３は、休眠近位尿細管細胞におけるＤ１受容体のリン酸化は、
正常血圧の被験者より高血圧者において大きく、Ｄ１様アゴニスト刺激に反応し
ないことを示すグラフである。ＧＲＫ４発現が防止される場合、Ｄ１受容体のリ
ン酸化は停止する。

【図４】図４は、正常血圧者ではなく高血圧者でＤ１様アゴニスト刺激に
対する反応において、近位尿細管におけるＧＲＫ４ガンマ/∂の発現が増加することを示すグラフである。

【図５】図５は、ＧＲＫ４ガンマの変異により、ＧＲＫ４ガンマおよびＤ
１受容体を過発現するチャイニーズハムスターの卵巣細胞においてＤ１様アゴニ
スト刺激に反応するＤ１受容体の能力が減少することを示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ペドロ・ホセアメリカ合衆国22079バージニア州メイソン・ネック、スプリングフィールド・ドライブ6721番Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA10 CA01 CA03 CA04 CA11 CA12 DA02 EA04 GA11 GA18 GA23 HA14 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ61 QQ79 QR07 QR48 QR77 QR80 QS36 QS39 QX01 QX02 4B065 AA90X AA93X AA93Y AB01 BA02 BA06 CA29 CA46

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｒ６５Ｌ変異、Ａ１４２Ｖ変異、Ｒ６５ＬとＡ４８６Ｖの二
重変異またはＲ６５ＬとＡ１４２とＡ４８６Ｖの三重変異を有するＧＲＫ４タン
パク質をコードする単離された精製核酸。
【請求項２】Ｒ６５Ｌ変異、Ａ１４２Ｖ変異、Ａ４８６Ｖ変異、Ｒ６５Ｌ
とＡ１４２Ｖの二重変異、Ｒ６５ＬとＡ４８６の二重変異またはＲ６５ＬとＡ１
４２とＡ４８６Ｖの三重変異をコードする配列を有するＧＲＫ４遺伝子に特異的
にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
【請求項３】ＧＲＫ４遺伝子のエキソン３、５、８、１４または１６にハ
イブリダイズし、そして、該遺伝子のヌクレオチド４３１−５０３（エキソン３
）、５９４−６９７（エキソン５）、８５７−９９５（エキソン８）、１６６２
−１７９８（エキソン１４）、１９３７−１９９１（エキソン１６）を含むＤＮ
Ａ配列を増幅するのに有用であるオリゴヌクレオチド。
【請求項４】本態性高血圧症の素因を有する個体を同定する方法であって
、該個体からＤ１受容体を有しＧＲＫ４を発現する腎細胞を得て、該細胞をアッセイして、概Ｄ１受容体の翻訳後修飾の程度を測定する（なお、
該Ｄ１受容体の翻訳後修飾における変化が、正常血圧の個体から単離され、Ｄ１
受容体を有しＧＲＫ４を発現する腎細胞におけるＤ１受容体の翻訳後修飾の程度
と比較して、本態性高血圧症の素因の指標となる）、ことを含む方法。
【請求項５】該細胞を該Ｄ１受容体のパルミトイル化の程度についてアッ
セイする、請求項４の方法。
【請求項６】該細胞を該Ｄ１受容体のリン酸化の程度についてアッセイす
る、請求項４の方法。
【請求項７】該細胞を該Ｄ１受容体の過リン酸化についてアッセイする、
請求項４の方法。
【請求項８】該腎細胞が腎近位尿細管細胞または皮質集合管細胞である、
請求項４の方法。
【請求項９】本態性高血圧症の素因を有する個体を同定する方法であって
、個体から核酸のサンプルを得て、該サンプルからの、ＧＲＫ４をコードする核酸またはその断片を、ＧＲＫ４発
現細胞にドーパミン作動性シグナルを翻訳せしめないようなＧＲＫ４変異につい
て、分析する（なお、ＧＲＫ４の該変異は本態性高血圧症の素因についての指標
である）、ことを含む方法。
【請求項１０】ＧＲＫ４の該変異が、ＧＲＫ４の該変異を発現する該細胞
におけるＤ１受容体／アデニリルシクラーゼ共役欠損を起す、請求項９の方法。
【請求項１１】ＧＲＫ４の該変異が、ＧＲＫ４の該変異を発現する該細胞
におけるＤ１受容体／Ｇタンパク質共役欠損を起す、請求項９の方法。
【請求項１２】該核酸のサンプルがＤＮＡのサンプルである、請求項９の
方法。
【請求項１３】該核酸のサンプルがＲＮＡのサンプルである、請求項９の
方法。
【請求項１４】該核酸のサンプルがゲノムＤＮＡのサンプルである、請求
項９の方法。
【請求項１５】該核酸のサンプルがｃＤＮＡのサンプルである、請求項９
の方法。
【請求項１６】ＧＲＫ４をコードする核酸の断片を分析する、請求項９の
方法。
【請求項１７】ＧＲＫ４核酸を変異Ｒ６５Ｌについて分析する、請求項９
の方法。
【請求項１８】ＧＲＫ４核酸を変異Ａ１４２Ｖについて分析する、請求項
９の方法。
【請求項１９】ＧＲＫ４核酸を変異Ａ４８６Ｖについて分析する、請求項
９の方法。
【請求項２０】ＧＲＫ４核酸を変異Ｒ６５Ｌ、Ａ４８６Ｖについて分析す
る、請求項９の方法。
【請求項２１】ＧＲＫ４核酸を変異Ｒ６５Ｌ、Ａ１４２Ｖについて分析す
る、請求項９の方法。
【請求項２２】ＧＲＫ４核酸を変異Ｒ６５Ｌ、Ａ１４２、Ａ４８６Ｖにつ
いて分析する、請求項９の方法。
【請求項２３】該検出工程がＰＣＲでなされる、請求項９の方法。
【請求項２４】本態性高血圧症に関連するＧＲＫ４の変異を検出する方法
であって、高血圧の個体からの核酸サンプルを得て、該サンプル由来のＧＲＫ４をコードする遺伝子の配列を決定する、ことを含む方法。
【請求項２５】ＧＲＫ４およびＧＲＫ４基質を含み、ＧＲＫ活性を測定す
る再構築システム。
【請求項２６】該ＧＲＫ４基質がＤ１受容体またはその機能的断片である
、請求項２５の再構築システム。
【請求項２７】該ＧＲＫ４および該ＧＲＫ４基質を発現する全細胞である
、請求項２６の再構築システム。
【請求項２８】該全細胞が、Ｄ１受容体をコードする第１異種性遺伝子お
よび高血圧に関連のＧＲＫ４タンパク質をコードする第２異種性遺伝子でトラン
スフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項２５の再構築
システム。
【請求項２９】該ＧＲＫ４タンパク質が本態性高血圧症と関連している、
請求項２５の再構築システム。
【請求項３０】高血圧に関連するＧＲＫ４タンパク質と、抗高血圧活性に
ついて分析する物質との相互作用において概ＧＲＫ４タンパク質の検出可能な立
体配座的変化を提供する薬剤との複合体。
【請求項３１】不死化ヒト腎近位尿細管細胞。
【請求項３２】高血圧のヒトから得られる単離された精製腎近位尿細管細
胞。
【請求項３３】不死化された、請求項３２の高血圧のヒトから得られる単
離された精製腎近位尿細管細胞。
【請求項３４】腎細胞中で発現されるＧＲＫ４タンパク質をコードし、該
ＧＲＫ４タンパク質を産生するトランスジーンを含有するニ倍性ゲノムを含むト
ランスジェニック動物（なお、該トランスジーンの発現によって、概トランスジ
ェニック動物において発揮される本態性高血圧症の状態が、腎細胞が該ＧＲＫ４
タンパク質を発現しない正常血圧の動物と比較される）。
【請求項３５】該腎細胞が、該ＧＲＫ４タンパク質を発現しない腎細胞の
正常血圧の動物に比して、低いナトリウム拒否能力を持つ、請求項３４のトラン
スジェニック動物。
【請求項３６】げっ歯類である、請求項３４のトランスジェニック動物。
【請求項３７】マウスである、請求項３４のトランスジェニック動物。
【請求項３８】推定の抗高血圧剤を同定する方法であって、少なくとも１つの候補薬剤を請求項２５の再構築システムに加え、ＧＲＫ４活性を検出する（該活性は推定の抗高血圧物質の指標である）、ことを含む方法。
【請求項３９】ＧＲＫ４活性を検出する該工程が、アデニレート・シクラ
ーゼ活性を測定することを含む、請求項３８の方法。
【請求項４０】ＧＲＫ４活性を検出する該工程が、リン酸塩を付加し得る
基質およびリン酸塩源を該培地に加えて該基質のリン酸化を測定することを含む
、請求項３８の方法。
【請求項４１】推定の抗高血圧剤を同定する方法であって、少なくとも１つの候補薬剤を請求項３０の複合体に接触せしめ、該ＧＲＫ４の立体配座的変化が起きたかどうかを検出する（該活性は推定の降
圧物質の指標である）、ことを含む方法。
【請求項４２】該検出が、分光測定、蛍光、核磁気共鳴、エバネセント波
法または原子間力顕微鏡で行う、請求項４１の方法。
【請求項４３】推定の抗高血圧剤を同定する方法であって、少なくとも１つの候補薬剤を、高血圧動物から単離の、Ｄ１受容体およびＧＲ
Ｋ４を発現する不死化腎細胞に加え、該細胞のドーパミン作動性シグナルの形質導入の変化を検出する（ドーパミン
作動性シグナルの形質導入の変化は推定の抗高血活性の指標である）、ことを含む方法。
【請求項４４】推定の抗高血圧剤を同定する方法であって、該薬剤を投与した請求項３４の第１トランスジェニック動物と、該薬剤を投与
していない請求項３４の第２トランスジェニック動物との電解質出力を比較する
（推定の抗高血圧剤の同定は、該第１トランスジェニック動物の電解質出力が該
第２トランスジェニック動物に比して増加することでなされる）、ことを含む方法。
【請求項４５】ナトリウム利尿を増加する方法であって、本態性高血圧症
の個体に、ＧＲＫ４と相互作用する薬剤を投与して、該個体におけるナトリウム
利尿を増加することを含む方法。
【請求項４６】該薬剤が、該高血圧個体の腎細胞におけるＧＲＫ４の発現
を変化する、請求項４５の方法。
【請求項４７】該薬剤が、ＧＲＫ４のｍＲＮＡまたはＤＮＡに結合するア
ンチセンスＲＮＡを含む、請求項４５の方法。
【請求項４８】該薬剤が、ＧＲＫ４のｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡを開裂
するリボチームを含む、請求項４５の方法。
【請求項４９】該薬剤が、優性阻害変異ＤＮＡ分子を含む、請求項４５の
方法。
【請求項５０】該薬剤がＧＲＫ４タンパク質に結合する、請求項４５の方
法。
【請求項５１】インビトロおよびインビボでＧＲＫ４のｍＲＮＡに特異的
にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
【請求項５２】アンチセンスＲＮＡ分子である、請求項５１のオリゴヌク
レオチド。
【請求項５３】優性阻害変異ＤＮＡ分子である、請求項５１のオリゴヌク
レオチド。
【請求項５４】ＧＲＫ４のｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡを開裂するリボチ
ーム。