JP2002504225A - 抗コレステロール抗体を用いるアテローム性動脈硬化の診断および治療方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 アテローム性動脈硬化の診断および治療のための、抗コレステロール抗体の使用法が記載される。本発明の一態様においては、アテローム性動脈硬化病変から採取された試料を、ＨＤＬ分子を除く、ＶＬＤＬ、ＩＤＬおよびＬＤＬの量についてアッセイするために抗コレステロール抗体が使用される。別の態様においては、抗コレステロール抗体は、リポ蛋白質分子およびリポソームの融合を促進する融合原(fusiogen)として、体内からのコレステロールのクリアランスを促進するために使用される。

Description

【発明の詳細な説明】 抗コレステロール抗体を用いるアテローム性動脈硬化の診断および治療方法 本発明は抗体の分野、特に抗コレステロール抗体に関する。より詳しくはアテ ローム性動脈硬化およびコレステロール関連疾患の診断および治療に関する。 発明の背景 動脈硬化は動脈壁の肥厚化および硬化を表す総称的な用語であり、米国および 西洋社会における死亡原因の大部分を占める。動脈硬化の一種がアテローム性動 脈硬化で、これはほとんどの冠状動脈疾患、大動脈瘤および下肢動脈疾患を引き 起こす大動脈の障害で、脳血管障害にも大きく関与する。アテローム性動脈硬化 は米国の男女６５歳以上および未満の両方で、死亡原因の圧倒的な首位である。 E.L.Bierman,"Atherosclerosis and Other Forms of Arteriosclerosis"Ch.208, p.1106 in Harrison's Principles of Internal Medicine,13th edition,eds.K. J.Isselbacher,et al.(McGraw-Hill,Inc.NY 1994)。アテローム性動脈硬化とコレステロール アテローム性動脈硬化は、動脈壁病変におけるコレステロールの侵入および泡 沫細胞の出現により特徴付けられる。その後、増殖性病変を形成する血小板、マ クロファージ、平滑筋細胞および成長因子に関連する複雑な連続的変化が続く。 これらは血管を歪め、硬くする。血漿コレステロール濃度の高い個体は、アテロ ーム性動脈硬化およびその合併症の発症率が高い。W.F．Ganong，Review of Me dical Physiology, 17th edition,p.281(Appleton & Lange Norwalk,CT 1995)。コレステロール代謝 コレステロールは腸で吸収され、粘膜に形成されたキロミクロンへ取り込まれ る。キロミクロンがそのトリグリセリドを脂肪組織へ放出した後、キロミクロン の残存物は肝臓へコレステロールをもたらす。肝臓や他の組織もコレステロール を合成する。肝臓のコレステロールの中には、遊離型および胆汁酸として胆汁に 排出されるものがある。胆汁のコレステロールの中には、腸で再吸収されるもの もある。肝臓のコレステロールのほとんどは超低比重リポ蛋白質へ取り込まれ、 その全てがリポ蛋白質複合体中を循環する。 内因的に生成されるコレステロールの運搬システムは、超低比重リポ蛋白質（ ＶＬＤＬ）、中間比重（intermediate-density）リポ蛋白質（ＩＤＬ）、低比重 リポ蛋白質（ＬＤＬ）および高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）により形成される。こ れら蛋白質の蛋白質成分はアポ蛋白質と呼ばれる。主たるアポ蛋白質はアポＥ、 アポＣおよびアポＢである。アポＢは、外因性脂肪運搬システムの特徴を持つア ポＢ−４８および内因性システムの特徴を持つアポＢ−１００という２つの形態 を有する。ＶＬＤＬは肝臓で形成され、肝臓の脂肪酸および炭水化物から形成さ れるトリグリセリドを肝外組織へ運搬する。そのトリグリセリドがリポ蛋白質リ パーゼにより大量に除去された後、それはＩＤＬとなる。ＩＤＬはリン脂質を放 出し、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼの作用により、ＨＤＬ のコレステロールから形成されるコレステロールエステルを取り込む。ＩＤＬの 中には肝臓に取り込まれるものもある。残りのＩＤＬはその後、より多くのトリ グリセリドおよび蛋白質を放出し、ＬＤＬとなる。この変化の間、それらはアポ Ｅを放出するがアポＢ−１００は残存する。 ＬＤＬはコレステロールを組織へ提供する。肝臓やほとんどの肝外組織では、 ＬＤＬは被覆小胞のレセプターを介したエンドサイトーシスにより取り込まれる 。レセプターはＬＤＬのアポＢ−１００成分を認識する。それらはアポＥとも結 合するがアポＢ−４８とは結合しない。ＬＤＬはまたマクロファージおよび他の 細胞にある複数の低親和性システムにより取り込まれる。高濃度ＨＤＬ血漿で過 負荷されたとき、マクロファージはコレステロールエステルで満たされ、アテロ ーム性動脈硬化病変の初期に現れる泡沫細胞を形成する。マクロファージや関連 細胞のＬＤＬレセプターはスカベンジャーレセプターと呼ばれている。W.F.Gano ng,pp.277-279;M.J.Malloy,et al.,"Agents Used in Hyperlipidemia,"ch.34,p. 522,in Basic and Clinical Pharmacology,ed.B.G.Katzung(Appleton & Lange N orwalk,CT 1995)。 細胞を離れたコレステロールは、ＨＤＬすなわち肝臓や腸で合成されるリポ蛋 白質に吸収される。ＨＤＬの中には、アポＥを含み他の細胞のＬＤＬレセプター と結合するものもある。こうして、ある細胞から別の細胞へコレステロールを運 搬する。W.F.Ganong,pp.277-279。コレステロールと免疫応答 ７０年以上にわたって、コレステロールと反応する抗体の誘導について記載す る文献が散発的に報告されてきた。初期の研究は、コレステロール含有リポソー ムの補体溶解など（Swartz G.M.,C.R.Alving,et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85:1902;Watanabe,T.,et al.,1991,Infect.Immun.59:2200;Aniagolu,J.,et al.,1995,J.Immunol Methods,182:85;Wassef,N.M.,et al.,1989,J.Immunol.143; 2990;Alving,C.R.,et al.,1989,Bichem.Soc.Trans.17:637）、そのような抗体を 定量するために間接的な方法を使用しており、より最近の研究では、抗原として のコレステロールに抗体が直接結合することを実証するために複数のイライザ法 が開発された（Swartz,G.M.,C.R.Alving,et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:1902;Watanabe,T.,et al.,1991,Infect.Immun.59:2200;Aniagolu,J.,G.M.Swa rtz,J.Dijkstra,J.W.Madsen,J.J.Raney,and S.J.Green,1995,J.Immunol Methods 182:85;Wassef,N.M.,C.R.Alving,et al.,1989,J.Immunol.143;2990;Alving,C.R .,et al.,1989,Bichem.Soc.Trans.17:637、およびAlvingの米国特許第４，８８ ５，２５６号も参照）。様々な種類のコレステロール結合体（コレステロールま たはコレステロールエステルの蛋白質結合体、ポリリシンとコレステロールエス テルの複合体、リン酸とコレステロールの共有結合体、およびポリリシンとコレ ステロールの複合体）またはコレステロール含有物質（ＬＤＬ、ＨＤＬ、マイコ プラズマ、コレステロールリッチリポソーム(cholesterol-rich-liposome)）は 、コレステロールに特異性を有し（Wadsworth,A.,et al.,1935,J.Immunol.29:13 5;Klopstock,A.,et al.,1964,J.Immunol.92:515;Sato,J.,et al.,1972,Immunoch em.9:585;Sato,J.,et al.,1976,Biomedicine 24:385;Sato,J.,et al.,1976,Jap. J.Exp.Med.46:213;Hara,L.,et al.,1979,Chem.Phys.Lipids 23:7;Swartz,G.M.,e t al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:1902.;Watanabe,T.,et al.,1991,Infec t.Immun.59:2200）、視覚的には他 体を誘導できる。実験動物やヒトのほとんどが、敏速に検出できるコレステロー ルに対する自然発生抗体を有することが実証され（Wassef,N.M.,C.R.Alving,et al.,1989,J.Immunol 143;2990;Alving,C.R.,1989,Biochem.Soc.Trans.17:637） 、コレステロール代謝やアテローム性動脈硬化におけるこれら抗体のインビボで の役割が問題になっている。 コレステロールに対する自己抗体は、アテローム性動脈硬化の発達に影響を与 えると考えられている。コレステロール依存補体活性化は、アテローム性動脈硬 化の病理に対する可能性のあるメカニズムとして関係付けられている（Alving,C .R.,et al.,1991,Crit.Rev.Immunol.10:441.Libby,P.,et al.,1991,Lab.Invest. 64:5に総説がある）。他の研究では、ｂ−リポ蛋白質またはコレステロールエス テルのアルブミンもしくはｂ−リポ蛋白質結合体によるウサギの免疫化が、高コ レステロール食により誘発される、上昇した血清コレステロール濃度およびアテ ロ Bailey,J.M.,1967,Rev.Atheroscl.9:204;Bailey,J.M.,et al.,1967,in The Reti culoendothelial System and Atherosclerosis.N:R.Di Luzio,et al.,eds,Plenu m Press,New York,p.433）。最近では、ＬＤＬレセプター欠損ウサギをマロンジ アルデヒド修飾ＬＤＬで免疫化したところ、アテローム性動脈硬化病変が２０％ 減少したことが報告されている（Palinski,W.,et al.,1995,Proc.Natl.Acad.Sci .USA 92:821）。しかし、これらの研究の大部分では、コレステロールまたはコ レステロールエステルに対する免疫応答が誘導されたか否かについて明らかでな い。一人の研究者は、アルブミン結合体のコレステロールエステル部分に対する 抗体が誘導されることを報告している（Bailey,J.M.,1967,Rev.Atheroscl.9:204 ）。しかし、抗コレステロール抗体の生物学的影響に付いては、まだ知られてい ない。 循環から過剰なコレステロールを除去する手段を提供することが、本発明の目 的である。 さらに、疾病進行の初期段階でアテローム性動脈硬化病変を造影する非侵襲性 手段を提供することも、本発明の目的である。 さらに、血液、血清、またはアテローム性動脈硬化病変から採取した試料など の生物学的試料をＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬの分子の量および相対 比についてアッセイする手段を提供することも、本発明の目的である。 発明の概要 リポ蛋白質と選択的かつ差別的に結合する抗体が記載される。アテローム性動 脈硬化の診断および治療のための、抗コレステロール抗体の使用方法が記載され る。本発明の一態様においては、アテローム性動脈硬化病変から採取された試料 をリポ蛋白質分子の量および相対比についてアッセイするために、抗コレステロ ール抗体が使用される。本発明の別の態様においては、ＶＬＤＬ、ＩＤＬおよび ＬＤＬの分子とリポソームとの融合を促進する融合原(fusiogen)として、体内か らのコレステロールのクリアランスを促進するために、抗コレステロール抗体が 使用される。 図面の簡単な説明 図１は、７１モル％コレステロールリポソームを用いたコレステロールに対す る抗体の誘導を示すグラフである。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、７１モル％コレステ ロールを含有するリポソームを２回（２週間の間隔をおいて）接種された。二回 目の接種後１週間してマウスから採血され、血清はＰＶＤＦ−ＥＬＩＳＡを利用 して抗コレステロール結合活性について評価された。縦軸の吸光度値は、３重測 定の平均値および標準偏差である。縦軸は血清希釈率の逆数を示している。バッ クグランド吸光度は０．２００であった。（四角）：免疫血清、（菱形）：免疫 前血清。 図２は、リポソームコレステロールのエピトープ密度による、コレステロール に対する抗体の誘導への影響を示す棒グラフである。ＢＡＬＢ／ｃマウスは様々 な量のコレステロールを含有するリポソームを２回（２週間の間隔をおいて）接 種された。追加免疫後１週間して血清が採取され、抗コレステロール活性が、後 記するようにＰＶＤＦ−ＥＬＩＳＡ法で評価された。抗体価（縦軸）は３重測定 の平均である。免疫前の力価は８００未満であった。横軸はリポソームコレステ ロールのモル％を表す。 図３は、免疫血清中の抗リン脂質抗体および抗リピドＡ抗体の測定量を示す棒 グラフである。ＰＶＤＦ−ＥＬＩＳＡのウェルは、コレステロール（５μｇ）、 ＤＭＰＣ（７．５μｇ）またはＤＭＰＧ（７．５μｇ）でコーティングされた（ 横軸）。ポリスチレン−ＥＬＩＳＡのウェルはリピドＡ（０．５μｇ）でコーテ ィングされた。免疫血清（図１と同様にして得られた）は、後記するように個々 のリポソーム成分への結合活性が評価された。力価は３重測定により計算した（ 横軸）。免疫前の力価は８００未満であった。 図４は、コレステロールに対する抗コレステロールモノクローナル抗体２Ｃ５ −６の結合を示すグラフである。アフィニティークロマトグラフィーで精製した マウスＩｇＭ抗コレステロールモノクローナル抗体２Ｃ５−６の結合は、ＰＶＤ Ｆ−ＥＬＩＳＡ法で評価された。吸光度値＋／−標準偏差は３重測定の平均であ る。（四角）：抗コレステロールＩｇＭ、（丸）：非特異的マウスＩｇＭである 。４０５ｎｍにおける吸光度が縦軸に示され、モノクローナル抗体量ｎｇ／ｍｌ が横軸に示されている。 図５は、様々な量のリポ蛋白質でコーティングされたＥＬＩＳＡのウェル中で の、ヒトの未処理(intact)のＶＬＤＬ／ＩＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬへの抗コレ ステロール抗体の結合を示す３つのグラフである。示されるように、ポリスチレ ン−ＥＬＩＳＡプレートのウェルをコーティングするために、様々な量のＨＤＬ ＬＤＬおよびＶＬＤＬ／ＩＤＬが使用された。未結合のリポ蛋白質を除去した後 、免疫血清の希釈液は結合活性について評価された。吸光度値は３重測定の平均 である。免疫前血清の吸光度値は０．２５０以下であった。横軸には血清希釈率 の逆数がプロットされている。縦軸は４０５ｎｍにおける吸光度である。 図６は、対応する量の非エステル化コレステロールでコーティングされたＥＬ ＩＳＡのウェル中での、ヒトの未処理のＶＬＤＬ／ＩＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬ への抗コレステロール抗体の結合を示すグラフである。ポリスチレン−ＥＬＩＳ Ａプレートは、０．０５μｇのＶＬＤＬ／ＩＤＬ、０．１５μｇのＬＤＬ、また は２２０μｇのＨＤＬ（蛋白質を基準）のいずれかを含む溶液５０μｌでコーテ ィングされた。未結合のリポ蛋白質を除去した後、モノクローナル抗体２Ｃ５− ６の結合が評価された。ＥＬＩＳＡを実施した後、ウェルに吸着された総コレス テロールおよび非エステル化コレステロールの量を個々のリポ蛋白質に対して測 定した。得られた値が図に示されている。横軸は血清希釈率の逆数がプロットさ れており、縦軸は４０５ｎｍでの吸光度がプロットされている。 図７ＡおよびＢは、ヒトリポ蛋白質からの総脂質抽出液に対する抗コレステロ ール抗体の結合を示すグラフである。図７Ａは、ＶＬＤＬ／ＩＤＬ、ＬＤＬまた はＨＤＬのいずれかから抽出された総脂質をＥＬＩＳＡプレートウェルのＰＶＤ Ｆ膜に結合させた場合を示すグラフである（１０μｇ総コレステロール／ウェル ）。図７Ｂは、未処理の対応するリポ蛋白質量（１０μｇ総コレステロール／ウ ェル）をＰＶＤＦ−ＥＬＩＳＡプレートのウェルをコーティングするために使用 した場合を示すグラフである。脂質抽出物（Ａ）および未処理リポ蛋白質（Ｂ） の両方が、示された希釈率の免疫血清および免疫前血清と共にインキュベートさ れ、さらに「方法」の部分で述べるようにして処理された。吸光度値は３重測定 の結果を平均＋／−標準偏差で表した。横軸は４０５ｎｍでの吸光度がプロット され、縦軸は希釈率の逆数がプロットされている。 図８は、ヒトリポ蛋白質からのＴＬＣ分離脂質抽出物の抗コレステロールイム ノブロットの写真である。ＶＬＤＬ／ＩＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬ（１０μｇ総 コレステロール）の総脂質抽出物は、ＴＬＣにより分離され、脂質はその後ＰＶ ＤＦ膜へ移された。膜は抗コレステロール免疫反応性血清でプローブされ、後記 のようにペルオキシダーゼと抗ＩｇＭ抗体の結合体で染色された。図８Ａ：塩化 鉄（III）スプレーによって移動後に染色されたＴＬＣプレート。図８Ｂ：イム ノブロット（鏡像）。Ｃ：コレステロール、ＣＥ：コレステロールエステル、Ｔ Ｇ：トリグリセリド、ＰＬ：リン脂質。 図９Ａ、ＢおよびＣは、コレステロール、コレステロールリッチリポソームお よびＶＬＤＬ／ＩＤＬへの抗コレステロール抗体の結合に対する温度の影響を表 す３つのグラフである。コレステロール（パネルＡ）、７１モル％コレステロー ルリポソーム（パネルＢ）およびＶＬＤＬ／ＩＤＬ（パネルＣ）はＰＶＤＦ−Ｅ ＬＩＳＡプレート（１０μｇ／ウェルの遊離コレステロール）へ吸着された。免 疫血清の結合は４℃（四角）または３７℃（菱形）で評価された。免疫前血清も また、４℃（丸）および３７℃（三角）で評価された。吸光度値は３重測定の結 果を平均＋／−標準偏差で表した。横軸は４０５ｎｍでの吸光度値がプロットさ れ、縦軸は希釈率の逆数がプロットされている。 図１０Ａ、ＢおよびＣは、懸濁液のリポ蛋白質に対する抗コレステロール反応 性血清の影響を表す３つのグラフである。ＶＬＤＬ／ＩＤＬ（図１０Ａ）、ＬＤ Ｌ（図１０Ｂ）およびＨＤＬ（図１０Ｃ）（１０μｇ総コレステロール）は、抗 コレステロールＩｇＭモノクローナル抗体２Ｃ５−６または無関係の対照ＩｇＭ 抗体（５μｇ蛋白質）と４℃で３０分間混合された。一部はフローサイトメトリ ーにより凝集を分析した。曲線が右へシフトするのは、サイズが増大しているこ とを示す。 図１１ＡおよびＢは、抗コレステロール抗体とインキュベートした後のリポ蛋 白質およびリポソームの顕微鏡写真である。ヒトＶＬＤＬ／ＩＤＬ、ＬＤＬおよ びＨＤＬ（図１１Ａ）またはコレステロールリッチ（７１モル％）ＳＵＶ（図１ １Ｂ）は、モノクローナル抗コレステロールＩｇＭ抗体（２Ｃ５−６；５μｇ蛋 白質）と混合して４℃でインキュベートし、３０分後およびその後の時点に顕微 鏡で検査した。得られた構造は、３０から６０分後には観測可能であったが、映 像を最適化するために一晩インキュベートした後、写真を撮影した。ＨＤＬとは 異なり、ＶＬＤＬ／ＩＤＬおよびＬＤＬと抗体のインキュベーションにより、直 径が５μｍまでの球状水滴状構造が現れた（図１１Ａ）。同様に、小型の単ラメ ラ小胞（直径＜０．１μｍ）とインキュベートしたところ、大きな小胞構造（直 径が３０μｍまで）が形成された（図１１Ｂ）。抗体のない状態では、リポソー ムは光学顕微鏡レベルでは見ることが出来なかった（図１１Ｂ）。倍率：２００ 倍。 図１２は、コレステロールが吸着するポリビニルニトロセルロース複合体を用 いた、７１％コレステロールおよび２μｇのモノホスホリルリピドＡを含むリポ ソームを接種したＢＡＬＢ／ｃマウスの血清中のコレステロールに対する抗体の 検出を示すグラフである。横軸はコレステロール（μｇ／ウェル）が、縦軸は４ ０５ｎｍにおける吸光度がプロットされている（四角：免疫、丸：免疫前）。各 ポイントは３重測定の平均＋／−標準偏差である。 図１３は、ポリビニルニトロセルロース上に固定化したコレステロールを含む ウェルへ加えられた様々な希釈率の免疫血清を用いたコレステロールの検出を表 すグラフである。横軸はコレステロール量（μｇ／ウェル）が、縦軸は４０５ｎ ｍでの吸光度がプロットされている。 発明の詳細な説明 コレステロールおよび異なるクラスのリポ蛋白質へ選択的かつ差別的に結合す る新規な抗体が本発明により提供される。アテローム性動脈硬化の診断および治 療のための、抗コレステロール抗体の使用法が記載される。 生物学的試料中のＶＬＤＬ、ＩＤＬおよびＬＤＬの定量法は、 （ａ）生物学的試料を抗コレステロール抗体と接触させる段階、 （ｂ）抗原−抗体の複合体の形成を測定する段階、および、 （ｃ）試料のＶＬＤＬ、ＩＤＬおよびＬＤＬの量を決定するという段階、 を含む。 生物学的試料は、血液、血清、組織などのいかなる適した生物学的供給源に由 来してもよいが、この方法の一態様においては、生物学的試料がアテローム性動 脈硬化病変に由来することが望ましい。 また、抗体は、番号ＡＴＣＣ８９９５でＡＴＣＣに保存されているハイブリド ーマ細胞系により産生されることが望ましい。 本発明の一態様においては、アテローム性動脈硬化病変から採取した試料をＶ ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬの分子の量および相対比についてアッセイ するために、ＡＴＣＣ８９９５由来の抗コレステロール抗体が使用される。本発 明の別の態様においては、高コレステロール抗体はＶＬＤＬ、ＬＤＬの分子およ びリポソームの融合を促進する融合原として、体内からのコレステロールのクリ アランスを促進するために使用される。 本発明の抗体は、インビボ免疫検出のために、ユーロピウムもしくはガドリニ ウムのような常磁性イオン、または安定なフリーラジカルで標識することが出来 る。その上、本発明の抗体はコンピュータ断層撮影で使用される¹¹¹Ｉｎで標識 できる。さらに、放射性同位体、発色試薬、発光試薬のようなインビトロ検査で 有用な標識物質を、本発明の抗体に結合してもよく、あるいは会合させてもよい 。 本発明の標識抗体は、非侵襲性造影技術によりコレステロールの存在およびリ ポ蛋白質の位置を調べるために、患者へ投与されてもよい。コレステロール量お よび様々なリポ蛋白質の相対比を測定するために、本発明の標識抗体はインビト ロアッセイシステムで生物学的試料と接触させてもよい。 本発明の抗体の結合特異性に関連して本明細書で使用される、「コレステロー ル」という用語は、抗体に結合されるコレステロールの構造上の類似物質を含む ことが理解されよう。本発明は、次に示す非限定的実施例を参照することにより さらに理解される。引用された文献は全て参照により本明細書に含める。 実施例１：コレステロールリッチリポソームを接種した後のマウスのおける抗コ レステロール抗体誘導 材料と方法 試薬 １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、 １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＭＰＣ ）、およびコレステロール（５−コレステン−３β−オール）は、Avanti Polar Lipids，Inc(Alabster，AL)から入手した。コレステリルβ−エポキサイド（コ レスタン−５β，６β−エポキシ−３β−オール）、７−デヒドロコレステロー ル（５，７−コレスタジエン−３β−オール）、エピコレステロール（５−コレ ステン−３α−オール）、７−ケトコレステロール（５−コレステン−３β−オ ール−７−オン）、４β−ヒドロキシコレステロール（５−コレステン−３β， ４β−ジオール）、７β−ヒドロキシコレステロール（５−コレステン−３β， ７ β−ジオール）、およびラノステロール（８，２４（５α）コレスタジエン−４ ，４，１４α−トリメチル−３β−オール）は、Steraloids，Inc（Wilton，NH ）から入手した。コレステン（５−コレステン）、コレステノン（４−コレステ ン−３−オン）、コレステリルα−エポキサイド（コレスタン−５α，６α−エ ポキシ−３β−オール）、コレステリルヘミスクシネート（５−コレステン−３ β−オールヘミスクシネート）、コレステリルミリステート（５−コレステン− ３β−オールミリステート）、コレステリルオレイト（５−コレステン−３β− オールオレイト）、コレステリルサルフェイト（５−コレステン−３β−オール サルフェイト、ナトリウム塩）、コプロスタン（５β−コレスタン）、ジヒドロ コレステロール（５α−コレスタン−３β−オール）、エルゴステロール（５， ７，２２−コレスタトリエン−２４β−メチル−３β−オール）、７α−ヒドロ キシコレステロール（５−コレステン−３β，７α−ジオール）、２５−ヒドロ キシコレステロール（５−コレステン−３β，２５−ジオール）は、Sigma Chem ical Company(St．Louis，MO)から購入した。主に、サルモネラ・ミネソタ由来 のモノホスホリルリピドＡすなわちＲ５９５リポポリサッカライドは、List Bio logical Laboratories Inc.(Campbell，CA)により調製された。ほとんどの脂質 保存液は、クロロホルムで調製したが、ステロイドの中にはエタノール中に保存 されたものあった。全液とも−２０℃で保存された。 コレステロールリポソーム コレステロールに対する抗体の誘導に使用されたコレステロールリッチ多重ラ メラ小胞（ＭＬＶ；７１モル％コレステロール）は、モル比９：１：２５のＤＭ ＰＣ、ＤＭＰＧおよびコレステロールで構成され、補助剤のモノホスホリルリピ ドＡを２５μｇ／モルリン脂質の濃度で含有していた。抗体の結合の試験のため 、場合により、コレステロールが低濃度である、またはリピドＡを全く含まない リポソームも調製した。脂質はクロロホルム中の保存液から、発熱物質を含まな い丸底フラスコへ一部移し、溶媒は回転式エバポレーションで除去した。脂質は さらに高真空下で２時間乾燥した。乾燥フィルムは滅菌した脱イオン水を加えて 水和させ、５０ｍＭ総リン脂質とし、脂質全てが再懸濁されるまでボルテックス し た。続いて、材料は室温で２時間インキュベートし、時々ボルテックスした。リ ポソーム調製液の一部は、ワクチンバイアルで凍結乾燥し、使用に先立ちＰＢＳ で再生して１０ｍＭ総リン脂質濃度とした。 抗コレステロール抗体により誘導されるリポソームの凝集をフローサイトメト リーや光学顕微鏡で調べるために、リピドＡを含まないように調製されたＭＬＶ を超音波処理し、小さな単ラメラ小胞（ＳＵＶ）を得た。１〜２ｍｌのＭＬＶ懸 濁液（ＰＢＳで希釈して５ｍＭリン脂質とする）は、キャップ付きガラス培養チ ューブへ移した。次に、脂質は３０℃で水浴型ソニケータ（Laboratory Supplie s，Inc.，Hicksville，NY）を使って窒素雰囲気で乳光が出るまで超音波処理を 行った（１５分間のボルテックスを間欠的に４回行った）。ＳＷは調製日に使用 した。 コレステロールに対する免疫化 コレステロールに対する抗体の誘導のために、５匹の雄の同系繁殖マウスから なる複数の群（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＯｕＪ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５ ７ＢＬ／ＬＤＬｒ-/-、ＣＨ３．ＭＲＬＦａｓ^lpr、ＤＢＡ／２Ｊ、ＣＢＡ／Ｃａ Ｊ、ＣＢＡ／ＣａＨＮ−ｘｉｄ／Ｊ、Ａ／Ｊ、ＢＸＳＢ／ＭｐＪＹａａ、ＮＺＢ ／Ｂ１ＮＪ、ＨＲＳ／Ｊ、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪおよびＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ−ｎｕ 系統、Jackson Lab,Bar Harbor,MP）を、１００μｌのコレステロールリッチＭ ＬＶ（２．５μｍｏｌのコレステロール）の腹腔内投与により免疫化した。１〜 ２週間後、マウスは追加免疫され、免疫血清を採取するためにその２週間後に尾 静脈から採血した。免疫前血清は１回目のワクチン接種の直前に採取した。 コレステロールに対するモノクローナル抗体およびその他の抗体 コレステロールと反応するモノクローナルＩｇＭ抗体を分泌するハイブリドー マ細胞系２Ｃ５−６（ＡＴＣＣ８９９５）（Swartz,G.M.,et al.,1988,Proc.Nat l.Acad.Sci.USA 85:1902.）は、Walter Reed Army Institute of ResearchのC.R .Alving博士から寄与された。以前に報告されたように、Ｂａｌｂ／ｃマウスか ら採取した腹水は遠心し、上清を加熱不活化した後、−７０℃で保存した。Ｉｇ Ｍはマンナン結合蛋白質カラム（Pierce，Rockford，IL）を用いたアフィニティ クロマトグラフィーにより精製された。ホスファチジルイノシトールリン酸に特 異的 なモノクローナルＩｇＭ抗体を含む腹水もまた、C．R．Alving博士から寄与され た（Alving,B.M.,C.R.Alving,et al.,1987,Clin.Exp.Immunol.:69,403.）。アイ ソタイプ対照すなわち非特異的マウスＩｇＭは、Southem Biotechnology Associ ates,Inc.,Birmingham,ALから購入した。 リポ蛋白質からの脂質抽出、薄層クロマトグラフィーおよび免疫検出のためのＰ ＶＤＦ膜への移動 総脂質は、Folchらの方法（Folch et al.,1957,J.Biol.Chem.226:497)に従っ て、ヒトリポ蛋白質ＶＬＤＬ／ＩＤＬ（１．００６〜１．０１９ｇ／ｃｃ）、Ｌ ＤＬ（１．０１９〜１．０６３ｇ／ｃｃ）およびＨＤＬ（１．０６３〜１．２１ ｇ／ｃｃ）（Organon Teknika Corp.-CAPPEL Res.Product,Durham,NC）から抽出 した。抽出でクロロホルム相に得られた脂質を乾燥し、純粋なクロロホルムで再 懸濁し、−２０℃で保存した。 リポ蛋白質抽出液および純粋な脂質標準物は、Aniagolu,S.J.Green et al.,19 95,J.Immunol Methods 182:85の方法に従ってＴＬＣシリカゲルプレート上で分 離、検出された。ＴＬＣプレートでのコレステロールの免疫検出のため、分離さ れた脂質は疎水性ポリビニリデンフルオライド膜（ＰＶＤＦ）へ移し、抗体と共 にインキュベートし、既報の方法により染色された（Aniagolu，J．et al.，199 5，J．Immunol Methods 182:85.）。 コレステロール、リポ蛋白質、リポソームおよびリピドＡのＥＬＩＳＡ測定 血清または腹水の抗コレステロール活性量を測定するために、既報のように（ Aniagolu,J.et al.,1995,J.Immunol Methods 182:85）ＰＶＤＦ−ＥＬＩＳＡを 用いた。手短に言うと、５０μｌエタノール中の５〜１０μｇのコレステロール は、ＰＶＤＦ膜（Immobilon-P;Millipore Corp.,Bedford,MA）を含むマイクロタ イタープレートへ直接添加された。乾燥後ウェルは、ＰＢＳに溶かした１０％の 加熱不活化ＦＣＳ（Biofluids,Inc.,Rockville,MD）からなるＦＣＳブロッキン グ緩衝液で１時間処理した。血清試料はブロッキング緩衝液で順次希釈され、ニ 重測定のウェルへ１００μｌが加えられた。１時間緩やかに攪拌してインキュベ ートした後、ウェルはブロッキング緩衝液で４回洗浄し、続いて抗マウスＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ 鎖;BioRad,Richmond,CA）またはＩｇＭ（Kirkegaard & Perry,Gaithersburg,MD ）と結合したペルオキシダーゼの１／１５００希釈液と共に１時間インキュベー トした。さらに膜は、ＰＢＳで４回洗浄し、１００μｌの２，２’−アジノ−ジ ［３−エチルベンズ−チアゾリン−６−スルフォン酸］溶液（ABTSペルオキシダ ーゼ基質システム、Kirkegaad & Perry,Gaithersburg,MD）とインキュベートさ れ、適切な色に変化するまで１０〜１５分間観察した。反応液（８５μｌ）は、 透明プラスチックのマイクロタイタープレートへ移され、Bio-Radマイクロプレ ートリーダーを使って４０５ｎｍでの吸光度が測定された。示したように、場合 によってはＰＶＤＦ−ＥＬＩＳＡは抗リン脂質活性および抗ステロイド活性の測 定にも利用された。 リポ蛋白質およびリポソームのＥＬＩＳＡ用に、ポリスチレンイムロン−２プ レート(Dynatech Labs,Inc.,Chantilly,VA)のウェルは、蛋白質もしくは脂質の 示した量を含む、ＰＢＳを溶媒とするＶＬＤＬ／ＩＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬまたは リポソームの希釈液の５０〜１００μｌで１時間コーティングした。比較のため に、場合によってはＰＶＤＦプレートも、リポ蛋白質またはリポソームいずれか との結合を評価するために使用された。コーティング後ウェルは洗浄し、さらに コレステロールＥＬＩＳＡ用に処理された。リポ蛋白質ＥＬＩＳＡ実験において 、残存する発色団を除去するために、吸収を測定した後ウェルが十分に洗浄され た。次に、１００ｍｌイソプロパノールで３回洗浄して、各ウェルからコレステ ロールを抽出した。１２ウェルの結合抽出液は、プールされてスピードバック(S peed Vac)濃縮器で乾燥され、総コレステロールは、５０μｌのイソプロパノー ルで再懸濁された後、アッセイされた。遊離コレステロール量はＥＬＩＳＡで使 用されたリポ蛋白質保存溶液のそれぞれで測定された遊離コレステロールと総コ レステロールの比から計算された。 リピドＡ−ＥＬＩＳＡは、Freudenburg,et al.,1988,Infection 7:322.に記載 されたように、ポリスチレンイムロン(Immulon)−２プレートを用いて実施され た。このウェルは５０μｌエタノール中０．５μｇリピドＡでコーティングされ 、乾燥後このプレートはさらにコレステロール−ＥＬＩＳＡについて記載したよ うに して処理された。 この実施例では、抗体価は、バックグラウンドレベルを標準偏差の２倍以上超 えるような吸光度を有する溶液の最も高い血清希釈率の逆数と定義される。バッ クグランドは抗血清または精製した第一（モノクローナル）抗体をブロッキング 緩衝液で置換えて測定する。 フローサイトメトリーおよび顕微鏡写真 示した量の蛋白質または脂質を含むリポ蛋白質またはリポソームの希釈液（１ ０μｌ）は、精製した１ｍｇ／ｍｌ抗コレステロールモノクローナル抗体ＩｇＭ 溶液１０μｌと混合され、３００μｌの生理食塩水（滅菌済み、組織培養用、Si gma Chem.Co.,St.Louis,MO）で希釈され、ポリプロピレンチューブに入れ４℃で ３０分間インキュベートされた。対照として、リポ蛋白質は対照物質である非特 異的ＩｇＭの１０μｇともインキュベートされた。続いて、試料は、ＦＡＣＳｏ ｒｔ(Becton-Dickinson,San Jose,CA)フローサイトメトリーにより分析された。 バックグランドノイズを排除するために、２回蒸留水が被覆液(sheath fluid) として使用された。シグナルの直線性をチェックするために、また粒子サイズの 標準として、１、２および６．８μｍのビーズが使用された。加えて、無添加の 生理食塩水、リポ蛋白質、リポソーム、およびモノクローナル抗体のシグナルは 、試薬シグナルのバックグランド対照を確立するために測定された。１０，００ ０の事象(event)から得たＦＳＣおよびＳＳＣの増幅シグナル対数値が測定され 、リストモード獲得データは、後にＬＹＳＹＳ IIおよびＣＥＬＬＱｕｅｓｔプ ログラム(Becton-Dickinson)で解析された。 インキュベーション液の一部は、９６穴ポリスチレンプレートへも移され、リ ポ蛋白質凝集物を沈殿させ、Hoffmanのコントラスト光学系を取り付けたオリン パスCK-2倒立顕微鏡およびコダックフィルム（ＡＳＡ４００）を使用して可視構 造の写真を撮影した。 その他の方法 保存液およびリポソームの水中懸濁液のリン脂質濃度は、Bartlettの方法に従 ってリンを測定することにより決定した(Bartlett,G.B.,1959,J.Biol.Chem.234, 466.)。リポ蛋白質および脂質抽出液（５０μｌのイソプロパノールで再懸濁さ せた）の総コレステロール、および、遊離すなわち非エステル化コレステロール は、Wako Chemicals USA,Inc.(Richmond,VA)からキットとして購入された試薬で 酵素比色法にて決定された。 結果 コレステロールに対する抗体応答の誘導 以前に示されたように(Swartz,G.M.,et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 :1902.;Freudenberg,M.A.,et al.,1988,Infection 7:322.)、リピドＡを含む７ １モル％コレステロールリポソームのBalb/cByJマウスにおける腹腔内接種は、 純粋なコレステロールに対する体液性応答を誘導する。免疫前血清と比較すると 、接種されたマウスの血清では抗コレステロール活性が１００倍増加していた（ 図１）。免疫性抗コレステロール抗体価は通常５０，０００を超えるが、免疫前 の力価は８００未満であった。免疫前の力価は抗コレステロール活性を表さず非 特異的抗体吸着による。このような抗原は界面活性剤溶液への溶解性が高いため 、ステロール−ＥＬＩＳＡで非特異的結合を減少させる界面活性剤を使用するこ とは出来ない。 リポソーム膜のコレステロール比重は免疫応答の程度にかなりの影響を与えた 。５６モル％以上のコレステロールを含むリポソームは最適活性を刺激した（図 ２）。リポソーム中のリピドＡの存在は、抗コレステロール応答誘導に重要であ ることがわかった。リピドＡがない場合、７１モル％コレステロールリポソーム で得られた力価は免疫前の値と差がなかった（図示しない）。ＩｇＭ抗コレステ ロール抗体だけが、コレステロールリッチリポソームを接種されたマウスの血清 に検出された。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥは検出されなかった。 ヌードマウス（BALB/cByJ-nu）などこの他の様々な同系繁殖マウス系（C3H/He J、C3H/HeOuJ、C57BLt6J、C57BL/LDLr-/-、C3H.MRL-FaslPr(4)、DBA/2J、CBA/Ca J、CBA/CaHN-xid/J、A/J、BXSB/MpJYaa、NZB/B1NJ,HRS/J）も、７１モル％コレ ステロールリポソームへの応答が見られた。雄および雌の両方が、 同様に反応した（データは示さない）。血清に関連する抗コレステロール活性は 、C3H/HeJマウスの接種後に検出されなかった。この結果は、この系統のリピド Ａに対する低い応答性と一致していた。しかし、リポソームに被包された大腸菌 熱不安定性エンテロトキシン（Clements,J.D.,et al.,1988,Vaccine 6,269.）の ような他のアジュバントの代わりにリポソームリピドＡを用いることで、これら の動物血清の抗コレステロール量がかなり高くなった（データは示さない）。 抗コレステロール応答に加え、弱い抗ＤＭＰＣ活性も観察されたが、７１モル ％リポソームコレステロール製剤の接種を受けたマウスの血清に、抗ＤＭＰＧ活 性は観察されなかった（図３）。コレステロールについては、抗ＤＭＰＣ抗体は ＩｇＭアイソタイプのものである。加えて、この免疫血清はアジュバントリピド Ａに対する抗体を多量に含み、これが、ＩｇＧおよびＩｇＭアイソタイプの両方 であることがわかった（図３）。リン脂質小胞へ取り込まれたリピドＡがリポソ ームの脂質およびリピドＡ自身の両方に対する抗体を誘導可能であるという観察 は、これまでの研究と一致する（Dancey,G.F.,et al.,1977,Immunol.119,1868;S chuster,B.G.,et al.,1979,J.Immunol,122:900）。 抗コレステロール抗体の特異性 初めに、コレステロールに対する抗コレステロールモノクローナル抗体の活性 を、ＰＶＤＦ−ＥＬＩＳＡを利用して調べた。このＩｇＭ抗体（２Ｃ５−６）は ７１モル％コレステロールリポソームに対して既に産生された(Swartz,G.M.et a l.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:1902)。図４に示す結果から、精製した１ ｍｇ/ｍｌのＩｇＭモノクローナル保存液について約１００，０００という抗コ レステロール価を算出した。抗コレステロールモノクローナルＩｇＭがリポソー ムのリン脂質ＤＭＰＣおよびＤＭＰＧまたはリピドＡのいずれとも交差反応を示 さなかったことは注目に値する（図示しない）。 続く一連の実験で、様々なステロイドやそれらの誘導体に対するポリクローナ ル抗血清およびモノクローナル抗体の両方の結合を、ＰＶＤＦ−ＥＬＩＳＡにお いてコレステロールの代わりに示したステロイドを用いて評価した。 表１：ステロイドおよびその誘導体の、抗コレステロール抗体との免疫反応性表１（続き）ａ エタノール（ｔ＜２％クロロホルム）中に希釈された、示した脂質の相当量 （１０μｇ／ウェル）を、ＰＶＤＦ−ＥＬＩＳＡ上で乾燥した。次いで、ポリク ローナルおよびモノクローナル抗コレステロール抗体の両方との結合を、「実験 方法」に記載したように評価した。ｂ 免疫反応性物質：力価の範囲は３，００ ０〜１００，０００。非免疫反応性物質：力価≦１０００。抗原にコレステロー ルを使用すると、この実験で使用されたポリクローナル抗血清およびモノクロー ナル抗体溶液の力価は、それぞれ約５０，０００および１００，０００であった 。 表１に示すように、抗体の特異性は、３β−ヒドロキシル基（すなわちエルゴ ステロール）を含む非エステル化コレステロールおよび同様の構造をしたステロ ールに対して存在した。それに反し、３β−ヒドロキシル基がエピマー化（すな わちエピコレステロール）、水素による置換（すなわちコレステン）、ケト基へ の酸化（すなわちコレステノン）、またはエステル化（すなわちコレステリルサ ルフェイトまたはコレステリルオレイト）により変えられると、抗コレステロー ル結合活性は著しく減少した。β環の構造変化（飽和度、すなわちジヒドロコレ ステロールもしくは７−デヒドロコレステロール、または酸化度すなわちコレス テリルエポキサイドまたはケトコレステロール）は、抗コレステロール抗体の親 和性に影響しないようであった。Ａ環の４位での別のベータヒドロキシル基の導 入（４β−ヒドロキシコレステロール）もまた、ステロールへの抗体結合の効率 を変えなかった。一方で、ラノステロールは、Ａ環の４位に２つのメチル基を有 するが、抗体との有意な相互作用はなかった。総合すると、これらの結果は、そ のようなステロイドにポリクローナルおよびモノクローナル抗体が有意に結合す るためには、３β−ヒドロキシル基が必要とされることを示唆している。官能基 の性質や数により、Ａ環への付加は抗体結合を妨げるかもしれないが、β環の構 造はその相互作用にはそれほど重要でないようである。 ＥＬＩＳＡで検出された抗コレステロール抗体のヒトリポ蛋白質との相互作用 これまでの研究は、食事により誘発されるアテローム性動脈硬化におけるコレ ステロールに対する抗体の可能な役割を示唆したため（Bailey,J.M.,et al.,196 4,Nature:201,407;Bailey,J.M.,et al.,1967,in The Reticuloendothelial Syst em and Atherosclerosis.N.R.Di Luzio,et al.,eds,Plenum Press,New York,pp. 433.）、次に、抗コレステロール抗体がヒトリポ蛋白質ＶＬＤＬ／ＩＤＬ、ＬＤ ＬおよびＨＤＬと相互作用するかについて検証した。最初のアプローチとして、 ＥＬＩＳＡプレートに吸着されたリポ蛋白質への抗コレステロール血清の結合が 測定された。ポリスチレンプレートのウェルは、各リポ蛋白質の様々な希釈液で コーティングした（３〜１００μｇ蛋白質／ウェル）。非結合リポ蛋白質を除去 した後、リポ蛋白質のそれぞれに対するコレステロール抗血清の結合が評価され た。図５は、ウェルをコーティングするために使用された全ての蛋白質濃度で、 抗コレステロール抗体が、優先的にそして予期せずにＶＬＤＬ／ＩＤＬおよびＬ ＤＬと結合するが、ＨＤＬとは結合しなかったことを示している。モノクローナ ル抗コレステロール抗体のこれらリポ蛋白質への結合で、同様の結果が得られた （図示しない）。 ポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体（ｍＡｂ）はいずれもＨＤＬ と結合しなかったため、ＨＤＬが他のリポ蛋白質と同濃度でＥＬＩＳＡプレート ウェルに存在するかどうかを決定する試験をした。ＥＬＩＳＡ実施後のウェルに 吸着されたコレステロールの量を測定した。同量の遊離コレステロールがウェル に安定して吸着されるよう、ウェルは各リポ蛋白質の希釈液でコーティングされ た。 この可能性を除外するために、我々は、ＥＬＩＳＡ実施後のウェルに吸着され たコレステロール量を測定した。次の実験で、ウェルは、同量の遊離コレステロ ールが安定してウェルに吸着されるような各リポ蛋白質の希釈液でコーティング した。図６は、ウェルに結合した遊離ＨＤＬコレステロールがわずかに過剰なだ けで、抗コレステロールモノクローナル抗体のＶＬＤＬ／ＩＤＬおよびＬＤＬへ の結合における抗体価は、２０，０００を超えたが、ＨＤＬとの相互作用は無視 できるほどしか観察されなかったことを示している（力価＜８００）。抗コレス テロール免疫血清がこのような条件下で試験されたときに、同様の結果が得られ た（図示しない）。 ＶＬＤＬ／ＩＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬからの総脂質抽出液（総コレステロー ルが等量に調整された）は、ＰＶＤＦ−ＥＬＩＳＡで免疫血清と同等に強く反応 したため、未処理のＨＤＬへ抗コレステロール抗体が結合しなかったことは、抗 体とＨＤＬコレステロール自体が相互作用できないことによるものではなかった （図７Ａ）。一方で、ＰＶＤＦ−ＥＬＩＳＡプレートを未処理のリポ蛋白質調製 液の対応する量（総コレステロール量を基準に）とインキュベートしたとき、抗 コレステロール血清は、ＶＬＤＬ／ＩＤＬおよびＬＤＬと再び独占的に相互作用 した（図７Ｂ）。抗コレステロール免疫反応性血清がリポ蛋白質抽出液の非エス テル化コレステロールを認識したことを検証するために、脂質は薄層クロマトグ ラフィーで分離し、ＰＶＤＦ膜へ移して、抗コレステロール血清を用いてプロー ブした。図８に示すように、各リポ蛋白質抽出液の非エステル化コレステロール のバンドは、強い免疫陽性として反応したが、リン脂質バンドは染色が弱く、コ レステロールエステルやトリグリセリドは全く反応しなかった。後者の観察は、 抗コレステロール抗血清がいくつかの抗リン脂質（すなわちＤＭＰＣ）活性を含 むが（図３）、リポ蛋白質の疎水性コアの主要な成分すなわちコレステロールエ ステル（表Ｉ）やトリアシルグリセロール（図示しない）とは反応しなかったこ とを示したＰＶＤＦ−ＥＬＩＳＡ試験の結果と一致する。結論として、ヒトＶＬ ＤＬ／ＩＤＬおよびＬＤＬは、マウス抗コレステロール抗体と相互作用したが、 ＨＤＬと有意には結合しないことがＥＬＩＳＡを使って示すことができた。これ は驚くべき結果であり、かつ予期しない結果でもあった。 抗コレステロール抗体と、リポソームコレステロール、リポ蛋白質会合コレステ ロールおよび純粋コレステロールとの相互作用における温度の影響 膜の物性は温度などの環境因子に依存する。例えば、各脂質分子の回転運動お よび側方運動は、温度の上昇により高まる。これまでの部分で示した抗コレステ ロール抗体の結合試験は、全て室温で実施したため、次に低温（４℃）および生 理的温度（３７℃）の、純粋なコレステロールならびにリポソーム膜および理歩 タンパク質中のコレステロールへの抗体の結合における影響を調べた（図９）。 一次抗体の結合段階およびそれに続く洗浄が４℃および３７℃で行われた以外は 、全ての抗原製剤についてＰＶＤＦプレートを使用してＥＬＩＳＡ測定を室温で 実施した。抗コレステロール抗体のコレステロール自体への結合は、４℃と３７ ℃とで同様であることがわかった（図９Ａ）。しかし、ウェルのコーティングに ７１モル％コレステロールリポソーム（リピドＡを含まない）またはＶＬＤＬ／ ＩＤＬのいずれかを用いると、温度を４℃から３７℃へ上昇させたときに、結合 がそれぞれ約５０％および８０％減少した（図９Ｂおよび９Ｃ）。同様でさらに 急激な抗体結合の減少が、３７℃でのＬＤＬで認められた（図示しない）。免疫 前血清の結合はこれらの実験では温度により有意に影響されないことがわかった （図９）。これらの観察は、純粋なコレステロールとは異なり、３７℃での膜結 合コレステロールの運動増加により、抗体と抗原の相互作用の際、安定な付着が 減少することを示唆している。 抗コレステロール抗体と懸濁液中のリポ蛋白質およびリポソームとの相互作用 リポ蛋白質と抗コレステロール抗体との相互作用も、フローサイトメトリーお よび光学顕微鏡技術の両方を利用して、懸濁液で調べた。フローサイトメトリー による分析では、４℃での抗コレステロールモノクローナル抗体のヒトＶＬＤＬ との相互作用で、メディウムサイズの粒子が増加した（図１０Ａ）。同様の結果 がＬＤＬでも得られた（図１０Ｂ）。一方で、抗体はＨＤＬのサイズ分布を変え なかった（図１０Ｃ）。対照すなわち非特異的ＩｇＭは、試験されたリポ蛋白質 の分布プロフィールには影響しなかった。抗コレステロール抗体のＶＬＤＬおよ びＬＤＬへの結合により、おそらく、サイズ分布の変化により示されたように、 リポ蛋白質が凝集したものと考えられる。 顕微鏡で調べると、大型（直径５μｍ以下）で球形の水滴様構造が、抗コレス テロールモノクローナルＩｇＭ抗体とインキュベートしたＶＬＤＬ／ＩＤＬおよ びＬＤＬ懸濁液に認められた（図１１Ａ）。対照ＩｇＭすなわち無関係の抗ホス ファチジルイノシトールリン酸モノクローナル抗体は、影響を示さなかった（デ ータは示さない）。ＨＤＬおよび抗コレステロール抗体を含む懸濁液に、可視構 造は検出されなかった（図１１Ａ）。得られた構造の平滑な外観は、これら粒子 が各ＶＬＤＬまたはＬＤＬ粒子の単なる凝集物ではなく、かなりの数のリポ蛋白 質粒子（それぞれのリポ蛋白質が０．０１〜０．０７５μｍの直径を有する(Bra dley,W.A.,et al.,1988,in Biology of Cholesterol,P.L.Yeagle,ed.,CRC Press ,Boca Raton,FL,pp.95.)）の間の融合または融合様過程によるものであることを 示唆している。４℃でのインキュベーションで得られた構造が、室温または３７ ℃へ移すと安定しなくなったことは興味深い。室温では、平滑な構造が緩やかに サイズを減少させ、最終的には完全に溶解した。この反応は、続く４℃への冷却 により、可逆的ではないことがわかった。 より複雑でないシステムで、コレステロールを含む膜と抗コレステロール抗体 との相互作用を研究するために、７１モル％コレステロールリポソームを、サイ ズを減少するため超音波処理した（直径が０．１μｍ未満）。得られた小さな単 ラメラ小胞（ＳＵＶ）は、超音波未処理の多重ラメラ小胞と同様に（図示しない ）抗コレステロール抗体と結合する（図９Ｂ）。ＳＵＶが４℃で抗コレステロー ルＩｇＭとインキュベートされ、フローサイトメトリーで分析されたとき、小胞 のサイズが増大し、大部分が１μｍを超える大きさであることがわかった（図示 しない）。ほとんどが恐らくＳＵＶの抗体誘導性融合の産物であろうが、顕微鏡 下では様々なサイズの大きな小胞構造（直径２μｍから３０μｍ）が容易に判別 できる（図１１Ｂ）。ＶＬＤＬおよびＬＤＬで得られた構造とは異なり、ＳＵＶ 産物は高温でも分解されなかったが、加温によりさらに大きく複雑な構造へ融合 される（図示しない）。大きな小胞構造は、室温または３７℃においてもＳＵＶ から形成された。対照ＩｇＭの存在下でＳＵＶをインキュベートしたときは、フ ローサイトメトリーでの評価でも、顕微鏡による可視構造の外観でもサイズの増 加は検出されなかった。抗コレステロールモノクローナル抗体とリポ蛋白質およ びリポソームとの相互作用について記載したのと同様の現象が、抗コレステロー ル 抗血清を用いたときに観察された（図示しない）。ここで得られた結果は、抗コ レステロール抗体と、コレステロール含有脂質単層または二重層との相互作用が 、条件によっては膜の不安定化およびそれに続くこのような融合をもたらすかも しれないことを示している。考察 抗コレステロール抗体が、（１）ステロールの３β−ヒドロキシル基を認識し 、（２）低比重リポ蛋白質すなわちＶＬＤＬ／ＩＤＬおよびＬＤＬとは結合する がＨＤＬとは結合せず、（３）これらのリポ蛋白質への結合において融合様反応 を誘導することを観察した。ＩｇＭサブタイプの抗コレステロール抗体のみが、 リピドＡ含有のコレステロールリッチリポソームで追加免役したマウスの血清に 検出された。これに反し、ヒトに見られるコレステロールに対する自然産生抗体 はＩｇＭおよびＩｇＧサブタイプ両方であることが報告された。Swartz,G.M.,et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:1902;Alving,C.R.,et al.,1989,Bichem. Soc.Trans.17:637。リポソームコレステロール製剤もヌード胸腺欠損マウスで抗 コレステロール抗体を誘導したという観察は、胸腺に依存しない反応を特徴付け ている（Pantelouris,E.M.,1968,Nature 217,370.）。 その上、CBA/CaHN-xidマウスも応答したという事実は、ＣＤｄ５+Ｂリンパ球 が抗コレステロール抗体の誘導には重要ではないことを示唆している（Hayakawa ,K.,et al.,1986,Eur.J.Immunol.16，450）。これらの結果は、抗コレステロー ル抗体の特異性が、ステロイド核の３位にある遊離β水酸基を含むステロイドに 対するものであることを示している。この特異性は、セムリキ森林熱ウイルスお よび細菌の細胞溶解素の両方がコレステロール含有膜と結合するために必要なも のと同様である(Kielian,M.C.,et al.,1984,J.Virol.52:281.;Alouf,J.E.,1980, Phamlacol.Ther.11,611.)。 マウスで最適な抗コレステロール抗体量を得るには、リピドＡの存在下でリポ ソームに５０モル％を超えるコレステロールが必要であった。逆に、コレステロ ールに対する免疫血清およびモノクローナル抗体は、コレステロールリッチリポ ソームまたは純粋なコレステロールに対してのみ結合することがわかった。例え ば、モノクローナル抗体のリポソームへの結合が、グルコースの補体誘導性放出 により評価されると、５０モル％コレステロールでは有意な放出が起きたが、４ ３モル％では不十分であった。最適な放出は５０モル％をはるかに超えるコレス テロールを含有するリポソームで誘導された(Swartz,G.M.,et al.,1988,Proc.Na tl.Acad.Sci.USA 85:1902.)。捕獲抗原(capture antigen)として様々な量のコレ ステロールと共にリポソームを使用して、モノクローナル抗体結合をＥＬＩＳＡ で測定したときに同様の結果が得られた（結果は示さない）。ＤＭＰＣおよびＤ ＭＰＧからなるコレステロール含有リン脂質二重層に対する抗体の最適結合につ いて、コレステロールのリン脂質に対するモル比が少なくとも１となるはずであ ることをこれらの観察は示唆している。そのような比では、遊離コレステロール のクラスターが膜に存在する(Collins,J.J.,et al.,1982,J.Lipid Res.23,291) 。 ＥＬＩＳＡプレートに付着した純粋なコレステロールへの抗コレステロール抗 体の結合は、温度を４℃から３７℃へ上昇させると、影響されなくなるようであ った。一方で、３７℃での結合は、抗原がリポソーム二重膜またはリポ蛋白質単 層に存在したときには、減少した。膜にコレステロールクラスターを当然に含む (Collins,J.J.,et al.,1982,J.Lipid Res.23,291)７１モル％コレステロールリ ポソームで観察された減少は、これは３７℃での脂質分子の運動量増加によるも のかもしれない。 結局、３７℃での抗体−リポ蛋白質結合は、ＥＬＩＳＡプレートからの抗体リ ポ蛋白質断片の遊離を引き起こすものかもしれない。そのため、３７℃でのＥＬ ＩＳＡでは、抗コレステロール抗体と固定化リポ蛋白質との実際の相互作用を過 小評価している可能性がある。 懸濁液中の、リポソームおよび低比重リポ蛋白質の両方と抗コレステロール抗 体との相互作用は、膜の不安定化をもたらした。リポソームは直径がかなり増大 した小胞に融合したようであるが、リポ蛋白質は恐らく融合様過程により大きな 球状構造へ変形したのであろう。 コレステロールエステルの血清アルブミン結合体または異種ＬＤＬで免疫化し たウサギは、食事で誘発されるアテローム性大動脈硬化の発生を減少させること が報告されている(Sachs,H.,1925,Biochem.Z.159:491;Bailey,J.M.,et al.,1967 ,in The Reticuloendothelial System and Atherosclerosis.N.R.Di Luzio、et al.,eds.,Plenum Press,New York,p.433)。結合したコレステロールエステルへ の抗体は、コレステロール−エステル−アルブミン複合体を接種された後検出可 能となった(Bailey,J.M.,1967,Rev.Atheroscl.9:204)。 実施例２：摂氏３７度でのマウスモノクローナルおよびポリクローナルＩｇＭ抗 体の、血清由来ＬＤＬではなく進行したヒトのアテロームから分離した脂質粒子 に対する結合 方法 組織および血清試料 ヒト動脈組織は、死亡２４時間以内の患者の死体解剖から、または動脈瘤修復 による外科試料から得た後、直ちに凍結した（−７０℃）。肉眼的に正常な組織 を得るために、小児科症例の腹部大動脈試料、および疾病のないないし極小さい 疾病を有する患者からの胸部または動脈弓材料が利用された。試料は３群、すな わち、肉眼的に正常または病変のないもの、最小のプラークまたは脂肪線条が存 在するもの、重症または潰瘍化した病変に分けた。表２は抗コレステロールＩｇ Ｍ抗体を評価した組織の由来をまとめている。 表２ 非エステル化コレステロールに対する抗体について評価される ヒト動脈組織における臨床概要＊胸部大動脈由来の組織；その他は全て大動脈弓由来の組織 ＃動脈の異なる２つの領域由来である以外は、同じ患者から採取した組織 ＠４７、６１、６４、６８、７０、７４および７５歳の男性７人から採取した組 織 ＆ＭＶＡ−交通事故、ＡＲＦ−急性腎疾患、ＧＳＷ−銃創、ＡＭＬ−急性骨髄性 白血病 アテロームからの免疫グロブリン抽出 動脈は湿組織グラムあたり約２〜５ｍｌのＰＢＳでホモジナイズした。これら の材料の免疫アッセイは、抽出物の蛋白質濃度で正規化した。 動脈リポソームの分離および精製 従った方法は、Chao,et al.,1990,A.J.Path.,136:169である。簡単に説明する と、 外膜のない切除大動脈組織は、PBSで洗浄し、水気を拭き取って乾燥し、重量を 測定した。その後、０．１％ＥＤＴＡ、０．０５％グルタチオンおよび０．０２ ％ＮａＮ₃を添加した低温の標準生理食塩水を、組織の湿重量グラムあたり約６ ｍｌとなるよう加えて細かく刻んだ。１５００×ｇでの遠心分離を二回行った後 、上清を０．４５μのフイルターに通し、容器撹拌濃縮器(stirred cell concen trator)を使い分子量１０，０００のカットオフで濃縮した。０．１％ＥＤＴＡ 、０．０５％グルタチオンおよび０．０２％ＮａＮ₃を含む１．５ＭＮａＣｌ(ｐ Ｈ７．４)に対して一晩透析したのち、抽出液は、記載されたように１．６×５ ０ｃｍカラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィー(Bio-gel A-50m,Richmond CA )に供試した。次に、コレステロールを含むボイドボリューム画分をプールし、 密度勾配遠心分離法に付した。勾配は、底から上部へ向け、ＮａＣｌ溶液の１． １００ｇ／ｍｌが３ｍｌ、ボイドボリューム画分（１．０６１ｇ／ｍｌに密度を 調整した）が３ｍｌ、１．０１９ｇ／ｍｌが３ｍｌ、１．００６ｇ／ｍｌが２． ５ｍｌ使われて構成され、１７０，０００ｇ、４℃で２２時間遠心分離した。様 々な比重のリポソームを含む分画は、視覚的に位置を特定でき、上部から吸引し て回収した。画分はＰＢＳおよび０．０２％ＮａＮ₃に対して透析した。 コレステロールおよびリポソームへの抗コレステロールＩｇＭ結合活性のＥＬＩ ＳＡ これらの抗原に特異的な抗体を定量するために、ＰＤＶＦマイクロタイタープ レート(Immobilon P Millipore)に、１ｍｇ／ｍｌのコレステロールまたはコレ ステロールオレイトのエタノール溶液のいずれかを１０μｌスポットし、風乾し た。リポソームでコーティングした場合は、プレートはウェルごとに２５０μｌ のＰＢＳで４回洗浄した。次に、プレートは加熱不活化した１０％牛胎児血清で ブロッキングされ、さらに記載されたように一次および二次抗体と共にインキュ ベートした（Aniagola J.,et al.,1995,J.Immunol.Methods 182:85)。全例での 特異的な吸光度は、試験材料の吸光度から非抗原またはコレステロールオレイト 陰性対照の値を差し引いて計算した。 ＩｇＭ量の測定 ＰＤＶＦプレートは抗−総ヒトイムノグロブリンでコーティングした。非特異 的結合をブロッキングした後、大動脈ホモジナイズの希釈系列の滴定曲線を、二 次抗体として、アフィニティーにより精製したＩｇＭ（ｍ）特異的抗血清(Kirke gard and Perry)を用いて作成した。曲線の結果は、ＩｇＭを定量するための既 知の市販標準液と比較した。大動脈ホモジネートの抗コレステロールＩｇＭ濃度 は、コレステロールコーティングウェルへ結合したＩｇＭ濃度から陰性対照ウェ ルに結合したＩｇＭ濃度を差し引いて計算した。この計算では、上に記載された ものと同じ標準曲線が、コレステロール特異的および非特異的ＩｇＧの両方を定 量するために使用された。プレート間の差をコントロールするために、可能な限 りこれらの検査は同じマイクロタイタートレイで実施した。 マウス抗体 マウス抗コレステロール抗血清およびマウス抗コレステロールモノクローナル 抗体（２Ｃ５−６）の産生は、Swartz,G.M.,et al.,1988.PNAS,85:1902に記載さ れている。 ＬＤＬの分離 血漿は健康で絶食した被験動物から得た。ＬＤＬは、Patsch,J.R.,et al.,198 6,in Methods in Enzymology,Vol.129,J.Albers,et al.,eds.,Academic Press,N ew York,NY,p.37.に記載された逐次超遠心分離法により分離された。 蛋白質およびコレステロールの測定 ほとんどの免疫アッセイで、総コレステロールの測定および総蛋白質の測定は 、ベーリンガーマンハイム試薬を使ってヒタチ７１７臨床試験器(Hitachi 717Cl inical laboratory)で行った。この臨床システムは両方のアッセイに約２０μｌ の試料を必要とし、抽出液ごとに他の免疫アッセイを実施することも可能である 。 結果 コレステロールに対する自己抗体が関節形成のアテローム発生大動脈由来の血 管壁に封鎖されているかどうかを決定するために、組織から抗体を抽出し、抗コ レステロールＩｇＭ結合活性を測定した。１８のヒト血管全てについて抗コレス テロール抗体の存在を検討した（表２）。疾病の重症度は無病変、脂肪線条、潰 瘍化病変のいずれかに等級付けした。抗コレステロールＩｇＭおよび総ＩｇＭの 測定値は、疾病の重症度に応じて増加した。しかし、疾病の重症度が増加するほ ど総ＩｇＭに対する特異的抗コレステロールＩｇＭが増加し、潰瘍化病変の特異 的コレステロールＩｇＭは無病変の４倍で、総Ｉｇに対する特異的抗コレステロ ールＩｇＭ量の比は、潰瘍化病変と無病変でそれぞれ０．２２対０．０６％であ った（ｐ＝０．０３）。脂肪線条と無病変群との間に有意な差は認められなかっ た（ｐ＝０．２２）が、脂肪線条および潰瘍化病変群を無病変群と比較したとき 、著しい差が認められた（ｐ＜０．００１）。 病変由来の脂質粒子が免疫反応性であるかどうかを評価するために、粒子を分 離し、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方と特異的抗コレステ ロール抗体との結合活性を評価した。結合活性を評価するために、進行性ヒト病 変で見いだされる低比重（Ｄ＜１．０１）および高比重（Ｄ＞１．０２）の両方 の細胞外脂質粒子を分離しＥＬＩＳＡプレートへ吸着させた。両粒子の比重につ いては、報告されたリン脂質に対する非エステル化コレステロールのモル比が２ ．５：１である(Chao F.F.,et al.,1990,A.J.Path.,136:169)。この比は、再構 成された７１モル％コレステロールリポソームに対するマウス抗コレステロール 抗体の最適結合を支持すると以前に報告された範囲に当てはまる(Swartz,G.M.,1 988,PNAS.85:1902)。アジュバントＭＰＬＡを含む７１モル％コレステロールリ ポソームで免疫化されたマウスの血清は、ヒト病変から分離したエステル化およ び非エステル化コレステロール脂質粒子と３７℃で反応するが、同被験者からの ＬＤＬとでは活性が有意に低いことがわかった。免疫前血清は同じ条件では反応 しなかった。マウスモノクローナル抗コレステロール抗体は、３７℃で病変由来 の脂質粒子の両方と選択的に結合するが、同条件でのＬＤＬとの反応は観察され なかった。まとめると、これらのデータは、ヒト大動脈由来の脂質粒子が、非エ ステル化コレステロールを認識する特異的Ｉｇと独特の免疫反応性を有すること を示唆している。 考察 本明細書に報告された結果は、コレステロールおよび関連するステロールに対 して特異性があるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が、進行性アテ ロームから抽出されたコレステロールリッチリポソームと結合可能であるが、血 清由来のＬＤＬとは結合しないことを示している。これは、Ｉｇと大動脈リポソ ーム調製液に見いだされた高濃度の非エステル化コレステロールとの間にある独 特の相互作用の存在について免疫学的証拠を与えており(Hui,S.W.,1988,in TheB iology of Cholesterol ,P.L.Yeager,Ed.CRC Press.Boca Raton,Fl.p.213)、この 構造に対する生物学的応答がアテローム発生に寄与することを示しているかもし れない。これまでの研究は、健常なヒト血清に存在する抗コレステロールＩｇ様 結合活性、および高濃度コレステロールリポソームの補体依存性溶解を開始する ヒト血清の能力という両方の存在を検出してきた(Alving C.R.,et al.,1977,J.I mmunol.118:342.)。本明細書に示したデータは、抗コレステロールＩｇＭがアテ ローム性動脈硬化疾患に関連するが、血漿コレステロール濃度には関連しないこ とを示唆している。 実施例３：ポリビニルニトロセルロースおよび抗ステロール抗体を用いた抗ステ ロール抗体を検出するためのＥＬＩＳＡ ＥＬＩＳＡプレートは、ステロール溶解に必要な有機溶媒（すなわちクロロホ ルム／エタノール）に耐性のあるポリビニルニトロセルロース複合材料を使用す る。Aniagolu,J.,et al.,1995,J.Immunol.Methods,182:85。ステロール抗原の最 初のコーティングは、クロロホルム／エタノール溶液の存在下で行う。ニトロセ ルロース複合物質の疎水性により、コレステロールとエルゴステロールは堅く結 合しており、ステロールを沈殿させることなく水溶性緩衝液で有機溶媒を置換で きる。一旦、生理学的緩衝液の中にはいると、この処理は従来の蛋白質を基剤と するＥＬＩＳＡと同様になる。この方法を利用して、我々は、以下の図１２に示 すように７１％コレステロールおよび２μｇのモノホスホリルリピドＡを含むリ ポソームとインキュベートしたＢＡＬＢ／ｃマウス血清のコレステロールに対す る 抗体を検出した。各ポイントは３重測定の平均±標準偏差である。 他のアッセイと比較すると、この方法は最も感度が高い。図１３に示すように 、≦６００ｎｇの固定化コレステロールが、コレステロールに対する抗血清の検 出のためにポリビニルニトロセルロースにおいて必要とされる。この実験では、 免疫血清の希釈液を、横軸に示されたような様々な濃度のコレステロールを含む ウェルへ添加した（図１３参照）。実験結果はさらに、エルゴステロールがポリ ビニルニトロセルロースと堅く複合体を形成し、モノホスホリルリピドＡを含む リポソーム−エルゴステロールを接種されたマウスの抗血清とは反応性があるが 、未処置のマウス血清はエルゴステロールとは反応性がないことを示す。 提案されたＥＬＩＳＡはポリビニルニトロセルロースに固定化されたステロー ルを用いており、放射性リガンドを必要としない、結合のためにリガンドが化学 的に修飾されるまたはクロスリンクされる必要がない、リガンドの不溶性が問題 とならない、感度および再現性が放射線免疫アッセイと等しい、定量および定性 の測定ができる、放射線免疫アッセイや他の従来の方法に比べ速く安価である、 直接的で、あらゆる疎水性ステロールまたはステロイド用に改変できる、生物学 的汚染性がない、という理由で、従来の放射性免疫アッセイおよびバイオアッセ イよりも優れている。 上記方法および装置の改変が本発明により予測され、添付される請求の範囲に 含まれると意図される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成９年７月３日（１９９７．７．３） 【補正内容】 ・・・免疫前の力価は８００未満であった。 図４は、コレステロールに対する抗コレステロールモノクローナル抗体２Ｃ５ −６の結合を示すグラフである。アフィニティークロマトグラフィーで精製した マウスＩｇＭ抗コレステロールモノクローナル抗体２Ｃ５−６の結合は、ＰＶＤ Ｆ−ＥＬＩＳＡ法で評価された。吸光度値＋／−標準偏差は３重測定の平均であ る。（四角）：抗コレステロールＩｇＭ、（丸）：非特異的マウスＩｇＭである 。４０５ｎｍにおける吸光度が縦軸に示され、モノクローナル抗体量ｎｇ／ｍｌ が横軸に示されている。 図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃは、様々な量のリポ蛋白質でコーティングされたＥＬ ＩＳＡのウェル中での、ヒトの未処理(intact)のＶＬＤＬ／ＩＤＬ、ＬＤＬおよ びＨＤＬへの抗コレステロール抗体の結合を示す３つのグラフである。示される ように、ポリスチレン−ＥＬＩＳＡプレートのウェルをコーティングするために 、様々な量のＨＤＬ、ＬＤＬおよびＶＬＤＬ／ＩＤＬが使用された。未結合のリ ポ蛋白質を除去した後、免疫血清の希釈液は結合活性について評価された。吸光 度値は３重測定の平均である。免疫前血清の吸光度値は０．２５０以下であった 。横軸には血清希釈率の逆数がプロットされている。縦軸は４０５ｎｍにおける 吸光度である。 図６は、対応する量の非エステル化コレステロールでコーティングされたＥＬ ＩＳＡのウェル中での、ヒトの未処理のＶＬＤＬ／ＩＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬ への抗コレステロール抗体の結合を示すグラフである。ポリスチレン−ＥＬＩＳ Ａプレートは、０．０５μｇのＶＬＤＬ／ＩＤＬ、０．１５μｇのＬＤＬ、また は２２０μｇのＨＤＬ（蛋白質を基準）のいずれかを含む溶液５０μｌでコーテ ィングされた。未結合のリポ蛋白質を除去した後、モノクローナル抗体２Ｃ５− ６の結合が評価された。ＥＬＩＳＡを実施した後、ウェルに吸着された総コレス テロールおよび非エステル化コレステロールの量を個々のリポ蛋白質に対して測 定した。得られた値が図に示されている。横軸は血清希釈率の逆数がプロットさ れており、縦軸は４０５ｎｍでの吸光度がプロットされている。 図７Ａおよび７Ｂは、ヒトリポ蛋白質からの総脂質抽出液に対する抗コレステ ロール抗体の結合を示すグラフである。図７Ａは、ＶＬＤＬ／ＩＤＬ、ＬＤＬま たはＨＤＬのいずれかから抽出された総脂質をＥＬＩＳＡプレートウェルのＰＶ ＤＦ膜に結合させた場合を示すグラフである（１０μｇ総コレステロール／ウェ ル）。図７Ｂは、未処理の対応するリポ蛋白質量（１０μｇ総コレステロール／ ウェル）をＰＶＤＦ−ＥＬＩＳＡプレートのウェルをコーティングするために使 用した場合を示すグラフである。脂質抽出物（Ａ）および未処理リポ蛋白質（Ｂ ）の両方が、示された希釈率の免疫血清および免疫前血清と共にインキュベート され、さらに「方法」の部分で述べるようにして処理された。吸光度値は３重測 定の結果を平均＋／−標準偏差で表した。横軸は４０５ｎｍでの吸光度がプロッ トされ、縦軸は希釈率の逆数がプロットされている。 図８Ａおよび８Ｂは、ヒトリポ蛋白質からのＴＬＣ分離脂質抽出物の抗コレス テロールイムノブロットの写真である。ＶＬＤＬ／ＩＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬ （１０μｇ総コレステロール）の総脂質抽出物は、ＴＬＣにより分離され、脂質 はその後ＰＶＤＦ膜へ移された。膜は抗コレステロール免疫反応性血清でプロー ブされ、後記のようにペルオキシダーゼと抗ＩｇＭ抗体の結合体で染色された。 図８Ａ：塩化鉄（III）スプレーによって移動後に染色されたＴＬＣプレート。 図８Ｂ：イムノブロット（鏡像）。Ｃ：コレステロール、ＣＥ：コレステロール エステル、ＴＧ：トリグリセリド、ＰＬ：リン脂質。 図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃは、コレステロール、コレステロールリッチリポソー ムおよびＶＬＤＬ／ＩＤＬへの抗コレステロール抗体の結合に対する温度の影響 を表す３つのグラフである。コレステロール（図９Ａ）、７１モル％コレステロ ールリポソーム（図９Ｂ）およびＶＬＤＬ／ＩＤＬ（図９Ｃ）はＰＶＤＦ−ＥＬ ＩＳＡプレート（１０μｇ／ウェルの遊離コレステロール）へ吸着された。免疫 血清の結合は４℃（四角）または３７℃（菱形）で評価された。免疫前血清もま た、４℃（丸）および３７℃（三角）で評価された。吸光度値は３重測定の結果 を平均＋／−標準偏差で表した。横軸は４０５ｎｍでの吸光度値がプロットされ 、縦軸は希釈率の逆数がプロットされている。 図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃは、懸濁液のリポ蛋白質に対する抗コレステロ ール反応性血清の影響を表す３つのグラフである。ＶＬＤＬ／ＩＤＬ（図１０Ａ ）、ＬＤＬ（図１０Ｂ）およびＨＤＬ（図１０Ｃ）（１０μｇ総コレステロール ）は、抗コレステロールＩｇＭモノクローナル抗体２Ｃ５−６または無関係の対 照ＩｇＭ抗体（５μｇ蛋白質）と４℃で３０分間混合された。一部はフローサイ トメトリーにより凝集を分析した。曲線が右へシフトするのは、サイズが増大し ていることを示す。 図１１Ａ〜１１Ｅは、抗コレステロール抗体とインキュベートした後のリポ蛋 白質およびリポソームの顕微鏡写真である。ヒトＶＬＤＬ／ＩＤＬ（図１１Ａ） 、ＬＤＬ（図１１Ｂ）およびＨＤＬ（図１１Ｃ）またはコレステロールリッチ（ ７１モル％）ＳＵＶ（図１１Ｄおよび１１Ｅ）は、モノクローナル抗コレステロ ールＩｇＭ抗体（２Ｃ５−６；５μｇ蛋白質）と混合して４℃でインキュベート し、３０分後およびその後の時点に顕微鏡で検査した。得られた構造は、３０か ら６０分後には観測可能であったが、映像を最適化するために一晩インキュベー トした後、写真を撮影した。ＨＤＬ（図１１Ｃ）とは異なり、ＶＬＤＬ／ＩＤＬ （図１１Ａ）およびＬＤＬ（図１１Ｂ）と抗体のインキュベーションにより、直 径が５μｍまでの球状水滴状構造が現れた。同様に、小型の単ラメラ小胞（直径 ＜０．１μｍ）とインキュベートしたところ、大きな小胞構造（直径が３０μｍ まで）が形成された（図１１Ｄ）。抗体のない状態では、リポソームは光学顕微 鏡レベルでは見ることが出来なかった（図１１Ｅ）。倍率：２００倍。 図１２は、コレステロールが吸着するポリビニルニトロセルロース複合体を用 いた、７１％コレステロールおよび２μｇのモノホスホリルリピドＡを含むリポ ソームを接種したＢＡＬＢ／ｃマウスの血清中のコレステロールに対する抗体の 検出を示すグラフである。横軸はコレステロール（μｇ／ウェル）が、縦軸は４ ０５ｎｍにおける吸光度がプロットされている（四角：免疫、丸：免疫前）。各 ポイントは３重測定の平均＋／−標準偏差である。 図１３は、ポリビニルニトロセルロース上に固定化したコレステロールを含む ウェルへ加えられた様々な希釈率の免疫血清を用いたコレステロールの検出を表 すグラフである。横軸はコレステロール量（μｇ／ウェル）が、縦軸は４０５ｎ ｍでの吸光度がプロットされている。 発明の詳細な説明 コレステロールおよび異なるクラスのリポ蛋白質へ選択的かつ差別的に結合す る新規な抗体が本発明により提供される。アテローム性動脈硬化の診断および治 療のための、抗コレステロール抗体の使用法が記載される。 生物学的試料中のＶＬＤＬ、ＩＤＬおよびＬＤＬの定量法は、・・・

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 アニアゴル，ジャシンタ アメリカ合衆国，20723 メリーランド, ローレル，ナンバー 31，スピネッカー ロード 7804番地 (72)発明者 ネイシー，キャロル，エー. アメリカ合衆国，20817 メリーランド, ベセスダ，ウェスト ハウェル ロード 8531番地 (72)発明者 グリーン，シャウン，ジェイ. アメリカ合衆国，22182 ヴァージニア, ヴィエンナ，ガンバ コート 9416番地

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． （ａ）抗コレステロール抗体と生物学的試料を接触させる段階、 （ｂ）抗原−抗体複合体の形成を測定する段階、および、 （ｃ）ＶＬＤＬ、ＩＤＬおよびＬＤＬの量を決定する段階 を含む、生物学的試料のＶＬＤＬ、ＩＤＬおよびＬＤＬの量の測定方法。 ２． 前記生物学的試料がアテローム性動脈硬化病変に由来する、請求の範囲第 １項に記載の方法。 ３． 前記抗体が、番号ＡＴＣＣ８９９５でＡＴＣＣに保存されているハイブリ ドーマにより産生される、請求の範囲第１項に記載の方法。 ４． 試料の総ＨＤＬ量に対するＶＬＤＬ、ＩＤＬおよびＬＤＬの量を比較し、 ＨＤＬに対するＶＬＤＬ、ＩＤＬおよびＬＤＬの比を決定することをさらに含む 、請求の範囲第１項に記載の方法。