JP2002504065A

JP2002504065A - 栄養流体中に懸濁されうる被覆された顆粒に含まれ安定化された生物学的に活性の化合物

Info

Publication number: JP2002504065A
Application number: JP50188696A
Authority: JP
Inventors: サンタス・ジャンカルロ
Original assignee: レコルダティ・ソシエテ・アノニム・ケミカル・アンド・ファーマスーティカル・カンパニー
Priority date: 1994-06-14
Filing date: 1995-06-12
Publication date: 2002-02-05
Also published as: AU2537195A; WO1995034292A2; NZ285848A; ITMI941231A0; AU694227B2; ITMI941231A1; DE69505374T2; KR970703754A; MX9606452A; CA2192333A1; IT1270216B; EP0762873A1; ES2122612T3; EP0762873B1; DE69505374D1; WO1995034292A3; US5952021A; CA2192333C; ATE172110T1

Abstract

(57)【要約】本発明は、生物学的活性化合物及び微生物を胃管内及び食物内における不活性化から保護する方法を提供する。前記方法は、前記化合物又は微生物を含有する多数の微小顆粒の調製及び被覆を含む。前記微小顆粒は、一般的に５００μｍより小さく、均質なフィルム化、並びに被覆後の、乳及び乳製品並びに果物ジュース等の通常の食料品における容易な懸濁を可能とする物理特性を有する。

Description

【発明の詳細な説明】栄養流体中に懸濁されうる被覆された顆粒に含まれ安定化された生物学的に活性の化合物発明の分野本発明は、酸に不安定な(acid-labile)、又はプロテアーゼ感受性の生物学的活性化合物及び組成物を含有する食料品等の摂取可能な材料を含む。該化合物及び組成物は、該化合物及び組成物の活性を、被覆されなければ該活性に有害である環境内において、保持する保護被覆により被覆された酵素及び微生物を含む。該被覆された化合物及び組成物はまた、様々な流体及び半流体の摂取可能な材料において、安定な懸濁を形成することができる。発明の背景哺乳動物及びヒトの胃腸管には、一般的に腸内叢と呼ばれる、約４００〜５００の異なった微生物種により形成された、微生物生態系の複合体が生息している。これらの微生物のうちもっとも一般的なものは、ビフィドバクテリウム(Bifid obacterium)、ユーバクテリウム(Eubacterium)及びフソバクテリウム(Fusobacte rium)を含むバクテロイデス属(genus Bacteroides)に属するものである。胃腸管の構造及び機能並びにその代謝活性は、適切な腸内叢の存在に密接に依存している。腸内叢は、正常な生理学的プロセスにおいて非常に重要な役割を果たしており、またいくつかの病理学的条件に関与している。中でも、腸内叢は、病原微生物により引き起こされる胃腸の感染に対する、身体のための保護を提供する。例として、例えば抗生物質の治療学的投与に続いて腸内叢の組成が変化すると、例えば悪心、嘔吐、大腸炎(colitis)及び下痢等様々な腸疾患が起こることがある。これらの条件を改善するために、通常バチルス・スブティリス(Bacillus subt ilis)胞子を含有する経口投与可能な薬剤が、通常懸濁液として処方される。経口投与において、胞子は、胃の酸性の環境（ｐＨ１〜２）で生存し、腸（ｐＨ６〜８）に達し、そこでそれらが複製可能な植物性の形式(vegetative forms)に変換されることが意図される。しかしながら、植物性の細胞を産する胞子の活性化の現象は、特定の栄養学的及び物理化学的条件にさらされることに影響されるものであり、非常に変わりやすく且つ個体の因子に依存する。従って、この現象を制御することは困難である。通常、１用量当たり少なくとも１０億のバチルス・スブティリスの胞子が、ヒト腸内において結果として起こる、投与された生体のうちのわずかな一部の増殖を確実にするため投与される。しかしながらこのアプローチは、予期し得ない量の生きているバチルスが腸内の作用部位に送達されることから、経済的に無駄であり、且つ治療学的に疑問がある。従って、当該技術において、微生物を胃内の環境から遮蔽しながらそれらの生存能を保持し、且つより正確に規定された用量での投与を可能とする方法及び組成物が求められている。治療学的目的で投与される他の微生物は、乳酸菌例えばビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス・ブルガリカス(Lactobacillus bulgaricus)ストレプトコッカス・ラクティス (Streptococcus lactis)、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptocuccus thermophilus)等を含む(Topley and Wilson,：Principles of Bacteriology an d Immunity，E．Arnold，Ed.，London，1966)。米国特許第４，９４６，７９１号明細書には、異なる動物種の腸上皮に粘着する能力のために特に有用なラクトバチルス・アシドフィルスの新しい系が記載されている。腸内叢の構成要素に加え、重要な医学的及び／又は栄養学的作用を有する酵素もまた、胃内の環境及び／又はこのような酵素が組み込まれうる他の媒体の環境により有害に影響される。食品産業によって一般的に用いられる酵素の例はリパーゼ、エステラーゼ、ペクチナーゼ（果物ジュース及びワイン産業で用いられる）、アミラーゼ、グルコアミラーゼ及びラクターゼである。酪農産業においてラクトースをその構成要素であるグルコース及びガラクトースに加水分解するのに使用されるラクターゼは、医学的にも特に重要である。いくつかの個体は牛乳に対し「アレルギー性」であり、この現象は遺伝的背景並びに食習慣と関連している。アジアの国々の４０％及びヨーロッパの１５％の人口において見られる牛乳「アレルギー」の多くは、一般的にラクトース不耐を反映している。この症候群は、通常なら小腸上皮細胞から分泌される酵素であるβ− ガラクトシダーゼ（ラクターゼ）の不足によって引き起こされる。ラクターゼ欠乏症において、ラクトースは消化されずに残り吸収されない。小腸において、高濃度の吸収されないラクトースは空腸において滲透的に水を吸引し、結腸においてガスを産生する大腸菌型叢(coliform flora)の基質として働く。この一連の作用は膨化及び下痢を引き起こす。これらは乳の摂取後数時間から１２時間の間に発生しうる。ラクトース不耐は白人においてまずおよそ１０歳頃から見られ、この現象がより多く見られる他の人種においてはより早期、およそ２〜３歳頃から見られる。さらに、このように影響されやすい個体の食餌から、乳が予防的に除かれると、それでなくても低水準のβ−ガラクトシダーゼ産生がさらに減少し、従って不耐現象が増悪する。広く見られるラクトース不耐現象は、乳のラクトースを修飾する又は乳からラクトースを除く方法の進歩を促進している。もっとも成功した方法のいくつかは、乳ラクトースを完全に加水分解し、ラクトース不耐の個体においても乳を消化可能且つ同化可能とする、固定された(immobilized)酵素カプセルの使用に基づいている。しかしながら、酵素等の生物学的に活性の化合物の投与の欠点は、それらの不安定性及びｐＨ等の環境条件に対する感受性である。例えば、膵臓性リパーゼはｐＨ４未満で完全に変性（し、従って不活性化）し、逆にこの酵素は６を超えるｐＨの時のみ最大に活性である。一般的に、酸環境に感受性の酵素は、例えばヨーグルトや果物ジュース等の酸性ｐＨを有する食物に添加された場合無効であろうことが予測される。さらに、栄養的な投与が意図される製品に対する天然の障壁は、胃管である。そこでは極端に酸性のｐＨと内因性の消化酵素の両方が生物学的食品添加剤を不活性化しうる。活性材料の損失を最小化するための１つのアプローチは、活性化合物を腸溶被覆(enteric coating)で包むことである。例えば、ＥＰ第５８３，７２６号では腸溶的に被覆しうるパンクレアチンのマイクロペレットが教示されており、またＪＰ第０４４１１，４３４号（ＣＡ１１６：２４１９９６）では、腸溶性物質で被覆されたラクトバチルス・アシドフィルスを含む錠剤が教示される。これらの教示の主な欠点は、製剤（ペレット、錠剤）の粒子の寸法に関する。この寸法では、液体又は半液体の食物に懸濁させるのには不適切なものとなってしまう。米国特許第５，２９６，２３６号明細書（’２３６特許）には、薬剤成分を含む微小顆粒からなり、活性成分の制御放出を可能とするフィルム材料の複数の層で被覆された、液体に懸濁する治療システムが記載されている。しかしながら、 ’２３６特許に記載されている方法及び組成物は、独立の(self-contained)制御放出薬剤液体剤形のために設計されている。それらは、それらの使用部位に持続する放出様式で送達される必要があるのではなく有害な環境から長期間保護される必要がある食品添加剤のためのものではない。さらに、この方法及び組成物は、大きすぎて制御放出を保証する微小顆粒からは拡散することができない微生物には、応用することができない。従って本発明の目的は、有益な酸不安定性の又はプロテアーゼ感受性の生物学的化合物及び微生物を、食料品等、特に流体及び半流体の食物等の摂取可能な材料に添加することを可能とし、一方（ａ）前記生物学的活性に対して有害な環境において（剤形内、使用部位、又はそれらの両方において）化合物又は生体の生物学的活性を（特定の食料品とされる限りにおいて）維持し、且つ（ｂ）摂取可能な材料特に食料品において、食料品の消費者に対する規定された量の添加剤の投与を可能とする安定な添加剤の懸濁をつくる、方法及び組成物を提供することにある。本発明者は、（例えば’２３６特許に記載された）薬剤の投与剤形の製造のために開発された顆粒化及び被覆技術が、微生物又は他の生物学的に活性の化合物で補われた食料品の調製に特に有用であることをここに見いだした。特に、本発明により調製された生物学的に活性の材料を含有した被覆された微小顆粒は、十分に寸法が小さいものであり、流体又は半流体の食物中に均一に懸濁させることができる。発明の要約微生物、ペプチド、ポリペプチド、酵素又はビタミン等の酸に不安定な又はプロテアーゼ感受性の生物学的活性な材料に有害な環境を与える食料品等の摂取可能な材料は：ａ）生物学的材料を、少なくとも１つの賦形剤と混合して微小顆粒を形成する工程であって、被覆に先立っての微小顆粒は均一な被覆の付着に適した５０〜４００μｍの範囲の寸法、回転楕円体の形状、及び実質的に平滑な表面を有する工程；ｂ）微小顆粒を、酸性環境において溶解に対し抵抗性の少なくとも１つの被覆で被覆する工程であって、被覆後の前記微小顆粒は５０〜５００μＭの範囲の寸法を有する工程；及びｃ）複数の、（ｂ）で作られた被覆された微小顆粒を摂取可能な材料に加える工程を含む方法により生物学的活性な材料で補うことができることが、ここに見いだされた。腸溶被覆は食料品又は他の摂取可能な材料の環境から、及び／又は胃の酸環境から微小顆粒の内容物を保護する。従って、食料品の摂取に続いて、被覆された微小顆粒内の生物学的活性材料は、小腸に達した後まで活性を維持し、ｐＨの増加の為に、被覆は溶解し生物学的活性材料を放出する。本発明によれば、腸溶被覆された微小顆粒は、乳、乳製品、果物及び野菜のジュース、プディング、ソース、ゼリー等を含む様々な液体及び半液体／半固体の食料品に添加することができる。微小顆粒に含まれる生物学的材料は、微生物、ペプチド、ポリペプチド、酵素、ビタミン又はこれらの複合物を含むことができる。前記被覆が存在しない場合のそれらの生物学的活性は食料品環境及び／又は胃管の環境により有害に影響される。好ましい実施態様において、ラクトバチルス・アシドフィルスを含む微小顆粒の芯がセルロースアセトフタレートを含む腸溶フィルムで被覆されたものが、ヨーグルトに、約１〜１０％（ｗ／ｗ）の量で添加され、均一で安定な懸濁を形成する。他の好ましい実施態様において、微小顆粒の芯は、β−ガラクトシダーゼを含み、腸溶被覆はポリアクリル酸エステルを含み、被覆された微小顆粒は、牛乳に約１〜１０％（ｗ／ｗ）の量で添加され、ヒトの消費に供される。適切なポリアクリル酸エステルは、ユードラジット(Eudragit、商標）Ｓ又はＬ、あるいは酸性条件（ｐＨ＜６）で不溶であり高いｐＨ値で可溶な他のポリマーを含むがこれらに限定されない。ユードラジットＳ（商標）は、メタクリル酸及びメタクリル酸メチルを基礎とするアニオン共重合体である。それは中性から弱アルカリの環境においてアルカリと塩を形成することにより可溶となり、従って腸液で徐々に溶解する腸溶フィルム被覆を与える。ユードラジットＬ（商標）は十二指腸内及び上部腸管内でより迅速に溶解する腸溶被覆に適したもう１つのメタクリル酸共重合体である。他の特徴において、本発明は上記の腸溶被覆微小顆粒により補われた食料品を含む栄養組成物を提供する。発明の詳細な説明全てのここで引用された特許、特許出願及び文献は、参照によりそれらの全体が本願に組み込まれる。矛盾が生じた場合、定義を含む本願の記載が制御する。本発明は、生物学的活性材料、特に酸に不安定な又はプロテアーゼ感受性の生物学的活性化合物又は微生物を、補助摂取材料として用いることができる方法を提供する。摂取可能な材料は、液体、半液体又は固体とすることができ、また、伝統的な食料品又は食品添加剤を含むことができるがこれらに限定されない。ここで用いられる通り、「半液体」の摂取可能な材料とは、液体と固体との中間の粘度を有するものである。「腸溶」は、胃の酸環境及び胃環境の消化酵素（例えばプロテアーゼ）に対して抵抗性であることを意味する。従って、本発明での使用により、酵素等の不安定な化合物又はバクテリア及びイースト等の傷つきやすい微生物が、それらが懸濁されている食物の不活化効果及び／又は上部胃管の有害な環境から保護される。ここで用いられる通り、生物学的活性材料の「生物学的活性」は、生存能（微生物の場合）及び酵素、補因子、ホルモン、栄養補助剤等としての代謝活性（化合物の場合）を含む。ここで用いられる通り、「生存能」は、胞子又は植物性細胞の微生物の、複製し、複製能力のある子孫を形成する能力を意味する。詳細には、本発明は、５０〜５００μｍ、好ましくは９０〜３００μｍの範囲の寸法を有する被覆された微小顆粒を提供する。被覆された微小顆粒は、異なる食料品に添加されうるよう、且つ流体又は半流体／半固体食品中で長期間例えば１か月以上にわたり安定な懸濁を維持するよう設計される。微小顆粒組成物は：ａ）賦形剤を有するかあるいは有さない、少なくとも１つの生物学的に活性の化合物又は保存条件あるいは使用環境に感受性の（例えば酸に不安定な又はプロテアーゼ感受性の）微生物の混合物であって、実質的に球状で、約５０〜４００μｍ（被覆前）の範囲の寸法を有し、且つ続いての被覆の再現性及び均一な分配を確実にする他の物理学的特性（後述）を有する微小顆粒を形成するよう処理された混合物；及びｂ）１つ以上の、続いての被覆であって、直接微小顆粒に適用され、その少なくとも１つは腸溶特性を有する被覆を含む。好ましくは、被覆後の微小顆粒は５０〜５００μｍの寸法範囲を有する。被覆は、単独の腸溶層を含むことができる。また、製剤の用途によって必要な場合は連続的な適用のために、異なる組成の１つ以上のフィルムを付加することが可能である。腸溶被覆の前及び／又は後に、親水性又は疎水性の特性を有する被覆を微小顆粒に次々に適用することができる。本発明においての使用に適する生物学的活性化合物は、ペプチド、ポリペプチド（好ましくは酵素）、及びビタミンを含むがこれらに限定されない。特に有用な酵素は、ラクターゼ（β−ガラクトシダーゼ）、リパーゼ、エステラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ及びグルコアミラーゼを含むがこれらに限定されない。本発明の組成物に組み込むことができる微生物は、ビフィドバクテリア（特にビフィドバクテリウム・ロングム、ユーバクテリア、及びフソバクテリア）を含むバクテロイデス、バチルス・スブティリス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ブルガリカス、ストレプトコッカス・ラクティス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、Ｅ．ｃｏｌｉ並びに例えばTopley and Wilson's“P rinciples of bacteriology and immunity"，5th edition，Edward Arnold（pub lisheds）1td.，Londonに記載される全ての生体を含むがこれらに限定されない。微生物は天然に分離された又は実験室で育てられた系を用いることができ、それらの野生型のものと比べて特異な生物学的特性を発現するよう、組替え遺伝子を含むことができ、また他の方法で修飾されていてもよい。組替え体又は他の修飾された微生物を得る組替えＤＮＡ操作は、例えばMolecular Cloning，A Labor atory Manual(2nd Ed.，Sambook，et al.，Cold Spring Harbor)又はCurrent Pr otocols in Molecular Biology(Eds．Aufubel，et al.，Greene Publ．Assoc.， Wiley-Interscience，NY，NY，1992)等に開示される、当該分野においてよく知られた方法を用いて反復的に行われる。本発明において、食料品の補助として有用な組替え微生物の例は、ビタミン特に酸に不安定なビタミン、特定の抗微生物物質、消化酵素等を分泌するようプログラムされたものを含む。例えば、米国特許第５，１５１，３５４号明細書には、デンプン分解酵素を産生する微生物の設計が記載されている。本発明において、微小顆粒の芯における使用のための賦形剤は、リン酸カルシウム二塩基酸；糖例えばラクトース、微小結晶セルロース；デンプン；タルク等を含む、湿式混合において一般的に使用されるものを含むがこれらに限定されない。これらの化合物の重量百分率は１０〜８０％、好ましくは５０〜８０％の範囲である。微小顆粒の芯剤は、必要に応じてゼラチン、アラビアゴム、トラガカントゴム、ポリビニルピロリドン、セルロース誘導体等の１つ以上の結合剤を含んでもよい。これらの化合物の重量百分率は５〜１５％、好ましくは１０％の範囲である。本発明において、微小顆粒の芯剤は：ａ）１つ以上の生物学的に活性の化合物及び１つ以上の造粒賦形剤を含有する粉末の、高剪断混合造粒器内での混合；ｂ）所定の流速においての（好ましくは製品が混合及び摩砕の複合作用に供されながら、造粒流体のより均一な分散を確実にするような噴霧による）造粒流体のスプレーによる前記混合物の湿潤；ｃ）混合−摩砕の複合作用による前記混合物の混練；ｄ）残留湿度１〜１０％、好ましくは５〜８％までの、制御された温度での乾燥；及びｅ）所望の寸法を有する顆粒を選択するための最終分篩を含む。造粒のための混合流体は、水、又は微小顆粒内において生物学的に活性の化合物又は微生物と適合しうる限りにおいて、水と混合しうる他のどのような溶媒でもよい。適切な溶媒の例はポリエチレングリコール及びグリセリンを含むがこれらに限定されない。米国特許出願連続番号第０８／１８８，１９３号（’１９３出願、既に許可されている）では、微小顆粒の形成に用いられる処理パラメータ、例えば乾燥混合物に対する混合流体の量；スプレー速度、混練時間、スプレー圧、混合器速度、及び摩砕速度の効果的な範囲が記載されている。有用で好ましい範囲は、以下の表１に要約される。 ’１９３出願にはまた、被覆のための微小顆粒の適合性の決定のための要件、例えば粒子寸法の分布、空気混入密度(aerated density)、充填密度(packed den sity)、見かけ密度、カー指数(Carr index、圧縮性百分率)、及び安息角が記載されている。これらの値の有用で好ましい範囲は、以下の表２に要約される。さらに、電子顕微鏡法及び双眼実体顕微鏡法による形状及び表面の観察も考慮される。被覆前の微小顆粒は回転楕円体で、実質的に荒れの無い平滑な表面であることが好ましい。本発明において、適切に分篩され適切な寸法及び表面特性を有する顆粒は、続いて腸溶被覆で被覆される。腸溶被覆は、定義すれば、ヨーグルト（ｐＨ〜４）等一般的な食物又は胃液（ｐＨ＝１−２）等の酸性の環境においての溶解に比較的抵抗性のものである。生物学的活性化合物含有微小顆粒のための効果的な腸溶被覆は、それが添加される食料品の意図された保管寿命又は使用間隔の間化合物の活性の約７０％から約１００％を保存する。さらに、効果的な腸溶被覆は、添加された食料品が摂取された後、化合物の活性の約７０％から約１００％を保存する。同様に、微生物含有微小顆粒の効果的な腸溶被覆は、それが添加される食料品の意図された保管寿命又は微小顆粒に含有された微生物の約７０％から約１００％の生存能を保存し、且つ摂取された後、微生物の生存能の約７０％から約１００％を保存する。本発明により調製された、それぞれの補われた食料品は、その中に含有される生物学的に活性の材料の安定性について、それぞれの生物学的に活性の材料を定量するのに適した、当該分野においてよく知られた方法を用いて評価することができることが理解される。例えば、食料品添加剤が微生物である場合、微生物の生存能は、補給後の異なる時間において以下の実施例８に示されるコロニー法を用いて評価される。材料が酵素又は他の蛋白の場合、安定性は、酵素検定法、免疫検定法又はそれらの組み合わせを用いて評価される。また、材料がビタミン又は他の化合物の場合、化合物の化学的及び／又は光学的特性に基づいて適切な検出方法が選択される。食料品中に残っている生物学的活性材料の百分率を補給後の時間の関数として比較することによって、不活性化速度を計算することができる。この値は、反対に、予想される食料品の使用間隔の間の、活性材料の所定の及び再現性のある水準を提供するために、食料品に加えなければならない生物学的活性材料の量の計算を可能とする。微小顆粒に腸溶特性を与えることができる、腸溶被覆における使用のための物質は、セルロースアセトフタレート（ＣＡＰ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ポリアクリル酸エステル（例えば、ユードラジット−Ｌ及びＳ）、及びこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。腸溶被覆層は、可塑化剤をも含有することができる；これらは、ジエチルフタレート、ジブチルセバケート、トリアセチン、トリアルキルシトレート、植物油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、及びこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。好ましい可塑化剤は、ジエチルフタレート及びポリエチレングリコールを含む。好ましい実施態様において、溶液は例えばＣＡＰ、ユードラジット−Ｌ、又はＨＰＭＣＰを、４〜１０％（ｗ／ｗ）の割合で含んで調製される。最適には、可塑化剤例えばジエチルフタレートは、１〜１０％（ｗ／ｗ）の割合で加えられる。これらの物質は、水、又は例えばアセトン、イソプロピルアルコール、クロロホルム又はこれらの混合物等の有機溶媒を含む溶媒系に溶解する。溶解した被覆材料は続いて微小顆粒に適用される。フィルム化工程は、好ましくは、流体床装置において、良く知られたウースター法(Wurster process)にて行われる。ウースター法では、液体に維持されたフィルム化材料が微小顆粒に適用される。空気懸濁被覆(a ir suspension coating)技術の詳細は、D．Jones，Drug Development and Indus trial Pharmacy 20:3175-3206(1994)に見ることができる。適用本発明の方法及び組成物は、栄養的又は医学的な利益を提供する生物学的活性化合物又は微生物で補われた食料品を提供するのに使用することができる。本発明の腸溶組成物で補うことのできる食料品は、乳及び乳製品を含むがこれらに限定されない。乳は、全乳又は低脂肪乳を用いることができ、通常利用可能などのような種、例えば牛、羊、又は山羊から得られたものでもよい。本発明において補うことのできる乳製品の例は、チーズ、クリーム、アイスクリーム、ヨーグルト、フローズンヨーグルト等、及び冷凍デザート等の他の乳又は乳含有製品等を含むがこれらに限定されない。ラクトバチルスで補うことが好ましい食物は、牛乳で作られたヨーグルトであり、一方ラクターゼで補うことが好ましい液体は牛の全乳又は低脂肪乳である。どちらの適用においても、被覆された微小顆粒は、好ましくは、乳に約１から約１０％（ｗ／ｗ）の量で添加される。液体及び半液体／半固体の食物を含む他の食料品も、本発明の実施に使用することができることが理解される。これらは果物ジュース（柑橘類のジュースを含む）、果物を基礎としたソース及びゼリー、プディング等を含むがこれらに限定されない。以下に提供される方法、表及び実施例においては、本発明の範囲を限定することなしに、本発明の好ましい実施態様をより十分に説明し、その利点と適用性を示すことが意図される。実施例１ β−ガラクトシダーゼを含む微小顆粒の調製 β−ガラクトシダーゼ(Fluka Chemika-Biochemika，Buchs，Switzerland)１００ｇ、リン酸カルシウム１，３４０ｇ及びポリビニルピロリドン１５０ｇを含有する混合物を、フィールダー(Fielder)Ｐ１０混練器で５分間混合し、満足な均質度を確実に得た。次に２バールの圧力で霧化した水２００ｍｌを１０ｍｌ／分の速度で撹拌された混合物に加えた。顆粒をさらに１０分間混合し、球形の微小顆粒の形成を促進した。次に生成物を静止床で約２時間３５ ℃に制御された温度で、製剤に残った水分が４〜５重量％に減少するまで乾燥した。次に微小顆粒を０．６ｍｍのふるいを通して分篩し、９０〜３００μｍの粒子径を有し、且つ表面の荒れや不均一の無い回転楕円体形状を有する顆粒を得た。９０μｍ未満又は３００μｍを超える寸法を有する顆粒部分は分離し、摩砕し、次の製造サイクルに再使用した。実施例２ラクトバチルス・アシドフィルス含有微小顆粒の調製Ａ）ラクトバチルス・アシドフィルス６０１(Wiesby GmbH & CoKG)の凍結乾燥粉末２，１００ｇ、ポリビニルピロリドン５００ｇ、及びラクトース１，５００ｇを含有する混合物を、５分間混合し、満足な均質度を確実に得た。次に２バールの圧力で霧化した水５００ｍｌを窒素雰囲気下で３５ｍｌ／分の速度で撹拌した混合物に加えた。このように得られた顆粒をさらに１５分間混合し、球形の微小顆粒の形成を促進した。微小顆粒の生成物を真空下静止床で１時間周囲温度で、残渣水分が一定となるまで、即ちそれ以上の重量減少がなくなるまで乾燥した。乾燥後、顆粒は０．６ｍｍのふるいを通して分篩し、９０〜３００μｍの粒子寸法分布を有し、且つ表面の不均一の無い回転楕円体形状を有する顆粒を得た。前記粒子寸法範囲外の部分は再度摩砕し、次の製造サイクルに再利用した。Ｂ）ラクトバチルス・アシドフィルス６０１(Wiesby GmbH & CoKG)の凍結乾燥粉末３７５ｇ、ポリビニルピロリドン３７５ｇ、及びラクトース３，０００ｇを含有する混合物を、５分間混合した。次に２バールの圧力で霧化した水２５０〜２８０ｍｌを窒素雰囲気下で２５ｍｌ／分の速度で撹拌した混合物に加えた。このように得られた顆粒をさらに１０分間混合し、球形の微小顆粒の形成を促進した。微小顆粒の生成物を真空下静止床で１時間３０℃のオーブンで乾燥した。乾燥後、顆粒を、９０〜３００μｍの粒子寸法分布を得るよう分篩した。実施例３ビフィドバクテリウム・ロングム含有微小顆粒の調製４５０メッシュのラクトース１，２００部、ポリビニルピロリドン３００部、及び凍結乾燥したビフィドバクテリウム・ロングム(DIFCO-Milan)１００部を合わせてターブラ(Turbula)装置で１０分間混合した。次に得られた混合物を高速混合／造粒器に移し、１バールの圧力で霧化した水２００ｍｌを２０ｇ／分の速度で加えた。このように得られた顆粒をさらに１０分間１７５ｒｐｍの速度で混練し、球形の微小顆粒の形成を促進した。次いで微小顆粒を２時間恒温オーブン中３５℃で乾燥した。乾燥後、顆粒を分篩し、１００〜３００μｍの範囲の粒子寸法部分を分離した。実施例４セルロースアセトフタレート（ＣＡＰ）での微小顆粒の被覆表３（下記）は、生物学的に活性の化合物を含有する被覆微小顆粒のために使用できる、セルロースアセトフタレートを含有する７種の異なる製剤の組成を示す。製剤Ａは、実施例１記載の微小顆粒の被覆に好ましい。これらの溶液を調製するには、アセトン、イソプロピルアルコール、及びセルロースアセトフタレートを３リットルのフラスコ中で混合し、４０℃に加熱する。次にジエチルフタレートを加える。完全に溶解した後、溶液を冷却し、実施例１に記載の通り調製された微小顆粒に適用する。実施例５ユードラジットＬ（商標）含有被覆の形成以下の表４は、微生物を含有する被覆微小顆粒のために使用できる、ポリアクリル酸エステル（ユードラジットＬ（商標）、イソプロパノール中１２．５％溶液、Rohm Pharma GMBH，Darmstadt，Germany）を含有する４つの異なった製剤（ＧからＪ）の組成を示す。製剤Ｈは、実施例２記載の通り調製された微小顆粒の被覆に好ましい。実施例６ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）含有被覆の製剤以下の重量百分率組成（ｗ／ｗ）を有するフィルムが調製された：ＨＰＭＣＰ８％エタノール４６％ジクロロメタン４６％ミバセット(Myvacet) ０．６％（ＨＰＭＣＰはShin Ester Chemical Co.より；部分水素化モノグリセリドアセチレートから作られた可塑化剤であるミバセットはEastmanより。）顆粒当たり５〜７０％（ｗ／ｗ）の範囲の乾燥フィルムが適用された場合、この被覆は、膵臓性酵素を含有する微小顆粒の被覆に特に有効である。即ち、前記酵素は胃内の酸性環境で安定を維持し、さらに、それらは微小顆粒が添加された食物と同時に幽門へ放出される。実施例７フィルム化溶液の適用実施例１、２及び３記載の通り調製された微小顆粒製剤２ｋｇを、７"のウースター挿入物(Wurster insert)を備えたグラット(Glatt)の装置にかけ、流動床フィルム化を行った。３０〜３５℃の温度の空気を、４０〜４５ｍ³／時間の速度で装置に吹き込んだ。ＣＡＰ含有混合物（実施例４参照）については２，２００ｍｌの溶液を用い、ユードラジットＬ含有混合物（実施例５参照）については１，１００ｍｌの溶液を用い、またＨＰＭＣＰ含有混合物（実施例６参照）のためには９００ｍｌを使用した。溶液は、２バールの圧力で８〜１０ｇ／分の速度でスプレーした。実施例８ラクトバチルス・アシドフィルスの胃液耐久性試験第２２版米国薬局方１５８０頁に記載された６容器装置を用い、０．１ＮＨＣl ７５０ｍｌ中で３７℃、６０ｒｐｍにて操作し、胃液耐久性試験を行った。試料は第１の時間及び第２の時間の経過後に取られた。実施例１Ａ）記載の通りに調製され実施例４（製剤ａ）及び実施例７記載の通りに被覆された微小顆粒を使用した。細菌計数は、以下のプレート法に従って行なった。プレートは以下の通りに調製された培地を用いて調製した：トリプトン２０．０ｇ；イースト抽出物５．０ｇ；セロビオース２０．０ｇ；塩化ナトリウム４．０ｇ；酢酸ナトリウム三水和物１．５ｇ；トゥイーン(Tween) ８００．５ｇ；エスクリン１．０ｇ；クエン酸鉄(III)アンモニウム０．５ｇ；（赤いクロロフェノール０．２ｇを絶対(absolute)エタノール数ｍｌに懸濁し、蒸留水を加え１００ｍｌとして得られた）０．２％赤色クロロフェノール溶液６．５ｍｌ；及び寒天−寒天１５．０ｇを蒸留水１０００ｍｌ中撹拌して溶解し、８０ｍｌのびんに充填し、オートクレーブ中１２１℃で１５分間滅菌した。注いだ後、ｐＨは６．６であり、色調は明るい赤みのあるライラック色であった。細胞計数は、ペトリ皿（直径９ｃｍ）当たり約１０ｍｌを用いて嫌気ジャー中ＣＯ２雰囲気下４０℃にて４８時間インキュベートする注入プレート法(pour-plat e method)を適用することにより決定された。全ての試験された試料において、溶液に溶出された細菌部分は１０％を超えず、従って米国薬局方の胃内耐久性の第１の要件を満たすものであった。さらに、処理の終わりに、微小顆粒１，０００ｍｇ当たりの生菌数は、腸溶被覆微小顆粒の２×１０⁸に比較して、（腸溶でない）対照の微小顆粒においては１００未満であった。それぞれの微小顆粒に含有されていた細胞の最初の量は：グラム当たり４．４１０⁹個細胞であった。胃内耐久性試験に用いられた酸条件は極めて極端であるので、この試験において示された腸溶被覆ラクトバチルス含有微小顆粒の溶解に対する耐久性は、微小顆粒はより厳しくない酸条件、例えばヨーグルト等における条件において、損なわれずに保たれることを示す。実施例９微小顆粒懸濁の試験様々な栄養流体中の微小顆粒の懸濁性を試験するために、以下の実験を行った。（実施例２Ｂ記載の通り調製され）平均寸法１００〜３００μｍを有し、実施例４（製剤Ａ）に記載の通りに被覆された微小顆粒、及び参照製剤として被覆されてない５００〜８００μｍ及び２，０００μｍの寸法のラクトースマイクロスフェアを、以下の手順を用いて異なる密度の食物担体に懸濁させた。顆粒５００ｍｇ及び担体１０ｍｌを目盛付き遠心管に移し、１５秒間水平撹拌器上で撹拌した。次いで顆粒の沈降百分率を、予め定められた時間において、単独の試料を光に対して観察することにより決定した。以下の市販の食物が担体として使用された：Ａ）１：５に希釈したダノン(DANONE)ヨーグルト；Ｂ）ズエグ(ZUEGG)オレンジジュース；Ｃ）部分的にスキムされたバルニーブ(VALNEVE)ＵＨＴ乳。結果を表５に示す。５秒後、１００〜３００μｍ微小顆粒組成物では３つのどの担体でも沈降の兆候が見られなかった。対照的に、殆ど全ての参照組成物は略完全に沈降した。これは、本発明の組成物の、液体及び半液体食物中で十分に安定な懸濁を形成する強い傾向を示す。実施例１０腸溶被覆ラクトバチルス・アシドフィルス微小顆粒ヨーグルトの調製実施例２Ａ）の通りに調製され実施例５の通りに腸溶被覆で被覆されたラクトバチルス・アシドフィルス微小顆粒を、以下に述べる手順に従って調製されたヨーグルトに添加した。脂肪含有割合１〜５％の牛乳を約８２℃に加熱し、この条件に３０分間維持した。均質化した後、乳を４３〜４６℃に冷却し、ラクトバチルス・ブルガリカス及びストレプトコッカス・サーモフィルスを含有する２％（ｖ／ｖ）の培養物を接種した。次に乳を４３℃で３時間インキュベートし、４．４℃又はそれ未満の温度に冷却した。冷却した製造物は、測定可能な酸性度１〜１．２％及びｐＨ４．３〜４．４を示した。次に腸溶被覆ラクトバチルス・アシドフィルス微小顆粒（１０ｇ）を、ヨーグルト塊（１，０００ｇ）に添加し、均質な１％の分散が得られるまで撹拌した。４℃で保存された得られた製造物は、１月を超える安定性を示した。この安定性は、実施例８に記載された方法に従った細菌計数により試験された。実施例１１腸溶被覆β−ガラクトシダーゼ微小顆粒を含有する乳の調製実施例４記載の通りセルロースアセトフタレートで被覆された、実施例１記載の通り調製されたβ−ガラクトシダーゼ７５０ｍｇ含有微小顆粒は、５０ｍｇ等量のβ−ガラクトシダーゼを含有する。比活性が３０，０００ＮＬＵ／ｇであるとすると、この量の酵素（１，５００ＮＬＵに相当）は１リットルの乳に含有されるラクトースの切断に十分である。この量の被覆微小顆粒は、１リットルの乳と１０〜１５秒間混合され、均質な懸濁を形成する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ２３Ｌ 1/05 Ａ２３Ｌ 1/30 Ｚ 1/30 1/39 1/39 Ａ６１Ｋ 9/50 2/62 Ｂ０１Ｊ 2/00 ＢＡ６１Ｋ 9/50 2/10 ＺＢ０１Ｊ 2/00 Ａ２３Ｌ 2/00 Ｌ 2/10 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．摂取可能な材料に添加される生物学的活性材料を保護するための方法であって、前記摂取可能な材料は、前記生物学的活性材料の活性又は生存能に対して有害な環境を含み、前記方法は：ａ）前記生物学的活性材料を、少なくとも１つの賦形剤と混合して微小顆粒を形成する工程であって、以下の工程（ｂ）における被覆に先立っての前記微小顆粒は被覆に適した５０〜４００μｍの範囲の寸法、回転楕円体の形状、及び実質的に平滑な表面を有する工程；ｂ）前記微小顆粒を、酸性環境において溶解に対し抵抗性の少なくとも１つの被覆で被覆する工程であって、被覆後の前記微小顆粒は５０〜５００μｍの範囲内の寸法を有する工程；及びｃ）複数の、工程（ｂ）で作られた前記被覆された微小顆粒を摂取可能な材料に加える工程を含む方法。２．前記摂取可能な材料が食料品である請求項１記載の方法。３．前記食料品が乳、果物ジュース、野菜ジュースからなる群より選択される液体を含む請求項２記載の方法。４．前記食料品がクリーム、アイスクリーム、ヨーグルト、プディング、ゼリー及びソースからなる群より選択される半固体を含む請求項２記載の方法。５．前記生物学的活性材料が、前記摂取可能な材料の使用間隔を通してその生物学的活性の少なくとも７０％を保持し、且つその摂取後その生物学的活性の少なくとも７０％を保持する請求項１記載の方法。６．前記生物学的活性材料が、酸に不安定な材料、プロテアーゼ感受性材料又はこれらの組み合わせからなる群より選択される請求項１記載の方法。７．前記生物学的活性材料が微生物、ペプチド、ポリペプチド、酵素、ビタミン及びこれらの組み合わせからなる群より選択される請求項６記載の方法。８．前記微生物が、ビフィドバクテリウム・ロングム、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ブルガリカス、ストレプトコッカス・ラクティス、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びＥ．ｃｏｌｉからなる群より選択される請求項７記載の方法。９．前記微生物がラクトバチルス・アシドフィルスである請求項８記載の方法。１０．前記微生物が組替え遺伝子を含む請求項８記載の方法。１１．前記ポリペプチドが、ラクターゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、ペクチナーゼからなる群より選択される酵素である請求項７記載の方法。１２．前記ラクターゼがβ−ガラクトシダーゼである請求項１１記載の方法。１３．前記賦形剤がリン酸カルシウム二塩基酸、糖、微小結晶セルロース、デンプン、タルク及びラクトース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、セルロース誘導体、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される請求項１記載の方法。１４．前記被覆がセルロースアセトフタレート、ポリアクリル酸エステル、ヒドロキシプロピルセルロースフタレート、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される材料を含む請求項１記載の方法。１５．前記被覆が、ジエチルフタレート、ジブチルセバケート、トリアセチン、トリアルキルシトレート、植物油、ポリエチレングリコールプロピレングリコール、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される可塑化剤をさらに含む請求項１４記載の方法。１６．前記混合工程が高速混練／造粒器において行われ、且つ前記被覆工程が流動床装置において行われるウースター法を含む請求項１記載の方法。１７．酸抵抗性の形式のラクトバチルス・アシドフィルスにより補われたヨーグルトの製造方法であって：ａ）前記ラクトバチルスをラクトース及びポリビニルピロリドンと混合して微小顆粒を形成し、ここで以下の工程（ｂ）における被覆に先立っての前記微小顆粒は被覆に適した５０〜４００μｍの範囲の寸法、回転楕円体の形状、及び実質的に平滑な表面を有し；ｂ）前記微小顆粒を、ポリアクリル酸エステル及びジエチルフタレートの混合物で被覆して酸性環境において溶解に対し抵抗性の被覆を形成し、被覆後の前記微小顆粒は５０〜５００μｍの範囲内の寸法を有し；ｃ）前記被覆された微小顆粒をヨーグルトに加えることを含む方法。１８．酸抵抗性の形式のβ−ガラクトシダーゼで補われた牛乳の製造方法であって、ａ）β−ガラクトシダーゼをリン酸カルシウム及びポリビニルピロリドンと混合して微小顆粒を形成し、ここで以下の工程（ｂ）における被覆に先立っての前記微小顆粒は被覆に適した５０〜４００μｍの範囲の寸法、回転楕円体の形状、及び実質的に平滑な表面を有し；ｂ）前記微小顆粒を、セルロースアセトフタレート及びジエチルフタレートの混合物で被覆して酸性環境において溶解に対し抵抗性の被覆を形成し、被覆後の前記微小顆粒は５０〜５００μｍの範囲内の寸法を有し；ｃ）前記被覆された微小顆粒を乳に加えることを含む方法。１９．哺乳類の乳及び腸溶被覆ラクターゼ含有微小顆粒を含む栄養組成物。２０．前記乳が牛乳、羊乳、及び山羊乳からなる群より選択される請求項１９記載の組成物。２１．前記乳が牛乳であり、前記腸溶被覆ラクターゼ含有微小顆粒が約１％から約１０％ｗ／ｗの量で存在する請求項１９記載の組成物。２２．前記被覆微小顆粒が：ａ）前記ラクターゼを少なくとも１つの賦形剤と混合して微小顆粒を形成する工程であって、以下の工程（ｂ）における被覆に先立っての前記微小顆粒は被覆に適した５０〜４００μｍの範囲の寸法、回転楕円体の形状、及び実質的に平滑な表面を有する工程；及びｂ）前記微小顆粒を、酸性環境において溶解に対し抵抗性の少なくとも１つの被覆で被覆する工程であって、被覆後の前記微小顆粒は５０〜５００μｍの範囲内の寸法を有する工程により製造される請求項１９記載の組成物。２３．前記被覆がセルロースアセトフタレート、ポリアクリル酸エステル、ヒドロキシプロピルセルロースフタレート、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される材料を含む請求項１９記載の組成物。２４．ラクトバチルス・アシドフィルス含有腸溶被覆微小顆粒で補われたヨーグルトを含む栄養組成物。２５．前記ヨーグルトが牛、羊及び山羊の乳からなる群より選択される乳を含む請求項２４記載の組成物。２６．前記乳が牛乳であり、前記微小顆粒が約１％から約１０％ｗ／ｗの量で存在する請求項２５記載の組成物。２７．前記被覆微小顆粒が：ａ）前記ラクトバチルスを少なくとも１つの賦形剤と混合して微小顆粒を形成する工程であって、以下の工程（ｂ）における被覆に先立っての前記微小顆粒は被覆に適した５００μｍ未満の範囲の寸法、回転楕円体の形状、及び実質的に平滑な表面を有する工程；及びｂ）前記微小顆粒を、酸性環境において溶解に対し抵抗性の少なくとも１つの被覆で被覆する工程により製造される請求項２４記載の組成物。２８．前記腸溶被覆が、セルロースアセトフタレート、ヒドロキシプロピルセルロースフタレート、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される材料を含む請求項２７記載の組成物。２９．微生物、ペプチド、ポリペプチド、酵素、ビタミン、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される構成員を含む組成物の生物学的活性を、前記組成物が前記生物学的活性に対し有害なｐＨ及び／又は酵素的条件にさらされる際に保存する方法であって、前記方法は、前記有害なｐＨ及び／又は酵素的条件に対し抵抗性の少なくとも１つの被覆で前記組成物を含む微小顆粒を被覆することを含み、前記微小顆粒は（ａ）前記組成物を含む粉末及び１つ以上の顆粒化賦形剤を混合して顆粒化混合物を形成する工程；（ｂ）前記混合物を湿潤させる工程；（ｃ）前記混合物を高速造粒器において混練する工程；（ｄ）前記混合物を所定の温度で乾燥させる工程；及び（ｅ）乾燥された混合物を分篩して所定の寸法を有する顆粒を選択する工程を含む方法により製造される方法。