JP2002500033A

JP2002500033A - 遺伝物質のトランスフェクションのための方法および物品

Info

Publication number: JP2002500033A
Application number: JP2000527344A
Authority: JP
Inventors: トマリア，ドナルド・エイ; バログ，ラジヨス
Original assignee: Dow Chemical Co
Current assignee: Dow Chemical Co
Priority date: 1998-01-07
Filing date: 1999-01-06
Publication date: 2002-01-08
Also published as: ATE365584T1; WO1999034908A1; US20020013283A1; EP1051244B1; CA2317666A1; EP1051244A4; DE69936377D1; EP1051244A1; US6475994B2

Abstract

(57)【要約】遺伝子トランスフェクション粒子は、ポリマー、樹枝状ポリマーと結合した支持体粒子および樹枝状ポリマーと結合した遺伝物質を含む。この遺伝子トランスフェクション粒子は高い効率を有し、しかも細胞傷害は減らしながら大量の遺伝物質を細胞に送達することができる。遺伝子トランスフェクション法には支持体粒子を用いて、または用いずにポリマーおよび遺伝物質の結合体を用いて細胞を衝撃することを包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、遺伝物質を植物および動物細胞の内部に送達するために有用な物質
の組成物および方法、より詳細には遺伝子トランスフェクションのための遺伝子
トランスフェクション粒子および粒子衝撃法に関する。

【０００２】発明の背景遺伝子銃法としても知られている粒子衝撃(particle bombardment)法は、遺伝
物質を、種々の遺伝的な、新生物性の、および感染性の疾患の処置および制御に
おいて植物および動物細胞中に導入するための、ならびにトランスジェニック種
を作出するための潜在的に効果的な方法を提供する。遺伝物質を植物および動物
細胞に導入する粒子衝撃法は、遺伝物質で被覆した微視的な粒子を加速して、細
胞壁を通過して細胞内部に遺伝物質を送達することを包含する。粒子を加速する
ために使用する起動力は、高電圧放電、ヘリウム加圧放電（helium pressure di
scharge)またはその他の手段により発生させることができる。微視的な発射体の
トランスフェクション粒子は、一般に約１〜15マイクロメーターの直径を有する
金粒子、およびそれらに付いた遺伝物質を含んで成る。金粒子はそれらが化学的
に不活性であり、細胞中で細胞傷害性効果をもたず、しかも細胞中への大きな運
動量および貫通を可能にする高い密度を有するので好適である。スペルミジン(N
-3-アミノプロピル-1-4-ブタンジアミン)のような結合試薬が、遺伝物質を金粒子に付着させるために使用されてきた。

【０００３】既知の粒子衝撃法の欠点は、許容できない高レベルの細胞傷害を生じることな
く所望の治療効果を達成するために、それらが十分な量の遺伝物質を提供できな
い点にある。Ning-Sun Yongらは、遺伝子治療：直接的な遺伝子輸送の方法および応用（Gene Therapeutics:Methods and Applications of Direct Gene Transf
er)で、15〜20マイクロメーターのサイズの細胞を含むコンフルエントな単層細胞培養物について、細胞あたり約２個の粒子を送達する0.9マイクロメーター粒子の１平方センチメートルあたり0.1の粒子衝撃密度で、粒子衝撃後に90％の単層細胞および75％の懸濁細胞が生存し、そして健康であったが、ほとんどの組織
サンプルについてはより高い粒子衝撃密度で過度の細胞および組織傷害を引き起
こしたことを報告した。金粒子に遺伝物質を付着するために使用した線状ポリア
ミンの比較的低い結合能、および過度の細胞傷害なしに耐え得る比較的低レベル
の粒子衝撃のために、既知のトランスフェクション粒子は過度の細胞傷害を回避
しながら所望の治療または他の効果を達成するために十分な量の遺伝物質を送達
することができないかもしれない。

【０００４】したがって細胞傷害を最小にすると同時に、粒子衝撃法を使用して細胞中によ
り高い量の遺伝物質を送達することができるトランスフェクション粒子の必要性
が存在する。

【０００５】発明の要約本発明は、細胞傷害を最小にすると同時に、より高い量の遺伝物質を細胞に送
達することができる高度に効率的なトランスフェクション粒子および衝撃法を提
供する。本発明の遺伝子トランスフェクション粒子は、ポリマー、ポリマーと結
合した（conjugated）支持体粒子およびポリマーに結合した遺伝物質を含む複合
材料を含んで成る。

【０００６】本発明の衝撃法は、支持体粒子を用いて、または用いずに、ポリマーおよび遺
伝物質結合体を含む遺伝子トランスフェクション粒子を形成し、そして遺伝子ト
ランスフェクション粒子を細胞へ貫通させ、そして入れるために十分な運動力で
遺伝子トランスフェクション粒子を細胞に向けて加速する工程を包含する。

【０００７】本発明の利点は、本発明が遺伝子トランスフェクション粒子の密度を、通さな
ければならない細胞膜の強さに依存して必要とされるように調整できる方法を提
供する点にある。

【０００８】好適な態様の説明本発明の好適な態様の遺伝子トランスフェクション粒子は、好ましくはポリマ
ーに結合している遺伝物質、および１以上の原子、１以上のイオン錯体、クラス
ターまたは粒子状態の金属、あるいはポリマーに結合している他の支持体を含む
。担持される遺伝物質が細胞内部に送達できるように、粒子が細胞に向けて加速
される時、金属成分は遺伝子トランスフェクション粒子に細胞壁および／または
膜を貫通するために必要な運動量を達成するために必要となる密度を提供する。
細胞環境内で化学的に不活性でなければならない遺伝子トランスフェクション粒
子を調製するのに使用する金属は、本質的に細胞中で細胞傷害作用が無いか、ま
たは少なくとも大変低く、そして樹枝状ポリマーに結合することができる。金属
はより大きな運動量を可能とし、したがって細胞壁および／または膜への十分な
貫通を可能とするために、好ましくは比較的高い密度を有する。金は遺伝子治療
に使用するための許容性が確立されているので、現在のところ、好適である。し
かし他の金属もある一定の応用に使用することができる。粒子衝撃遺伝子治療法
に使用するために適する金属の例は、金、タングステン、銀、銅、マグネシウム
、カルシウムおよびそれらの組み合わせを含む。

【０００９】金属成分は、個々の原子、イオンもしくは錯体の状態で、または原子のクラス
ターもしくは顕微鏡的サイズの粒子状で樹枝状ポリマーに結合され得る。金属粒
子に加えて、適当な支持体にはシリカ粒子、アルミナ粒子およびルイス酸の表面
官能性を有する他の適当な支持体を含む。またいかなる金属もしくは他の支持材
料も結合せずに遺伝物質に結合した樹枝状ポリマーも、粒子衝撃法における遺伝
子トランスフェクション粒子として有効に使用しうることが決定された。

【００１０】樹枝状ポリマーを金属原子または金属原子を含有する物体、および遺伝物質と
接触させることにより調製される遺伝子トランスフェクション粒子は、約１nm〜
約15nmの直径もしくは最大寸法を有することができる。樹枝状クラスターまたは
凝集物から成る粒子は、約２nmから最大少なくとも数マイクロメーターの最大寸
法を有することができる。しかし本発明の遺伝子トランスフェクション粒子は、
好ましくは約１nm〜1000nm、そしてより好ましくは約１nm〜約100nmの粒子サイズを有する。

【００１１】本発明の遺伝子トランスフェクション粒子の調製に使用することができる遺伝
物質は、インターロイキン、インターフェロンのような生物学的反応モディファ
イヤー、およびウイルスおよびウイルス断片および他の遺伝物質を含む。本明細
書で使用する用語「遺伝物質」とは、ヌクレオチドを基本とした物質を称し、限
定するわけではないがウイルス、ウイルス断片、デオキシリボ核酸（DNA）、プラスミド、リボ核酸（RNA）、メッセンジャーRNA（mRNA)、トランスファーRNA（
tRNA）、リボソームRNA（rRNA）、触媒的RNA（cRNA）、核内低分子RNA（snRNA）
、エキソン、イントロン、コドンおよびアンチ−センスオリゴヌクレオチドを含
む。遺伝物質、特にウイルスおよびウイルス断片は、付随的に同じタンパク質を
含んでもよい。

【００１２】ポリマーは好ましくは樹枝状であるが、線状および他の非樹枝状ポリマーも適
当であり得る。好適な態様の遺伝子トランスフェクション粒子の調製に使用する
樹枝状ポリマーは、金属を樹枝状ポリマーに結合または複合化できる官能基を内
部および／または外部に含む一般に任意の樹枝状ポリマーを含む。金属粒子を被
覆するために使用する樹枝状ポリマーは、支持体粒子の表面に対する親和性(すなわち表面に粘着しうる)を有する表面官能基を有し、好適な樹枝状ポリマーは、例えばPAMAM、POPAMおよびPEI樹枝状ポリマーのようなアミン官能基を有するものである。支持体粒子と樹枝状ポリマーを、樹枝状ポリマー粒子が支持体粒子
の表面へ付着することを引き起こすのに十分な条件下で接触させる。その後に樹
枝状ポリマー−支持体粒子結合体を遺伝物質と接触させて、既知の遺伝子トラン
スフェクション粒子と比較して細胞へより大量の遺伝物質を送達することができ
る高度に効率的な遺伝子トランスフェクション粒子を形成させる。この結果は既
知の遺伝子トランスフェクション粒子よりも実質的に小さい粒子を用いても達成
でき、改善された治療効果および細胞傷害の減少をもたらす。

【００１３】使用できる樹枝状ポリマーは、デンドリマー、規則性デンドロン（regular de
ndron)、調整超分岐ポリマー（controlled hyperbranched polymer）、デンドリ
グラフト（dendrigraft)およびランダム超分岐ポリマー（random hyperbranched
polymer）を初めとする一般に既知の樹状構造物を含む。樹枝状ポリマーは多数
の反応基を有する密に分岐した構造をもつポリマーである。樹枝状ポリマーはす
べてが１以上の分岐点を含む反復単位の幾つかの層または世代を含む。デンドリ
マーおよび超分岐ポリマーを含め樹枝状ポリマーは、少なくとも２つの反応基を
有するモノマー単位の縮合反応により調製される。使用できるデンドリマーは、
単一原子または原子の群であることができる共通のコアから広がる複数の樹枝か
ら成る。各樹枝は一般に末端表面基、２以上の分岐官能基を有する内部分岐結節
点、および隣接する分岐結節点を共有結合する二価の連結点を含む。

【００１４】デンドロンおよびデンドリマーは、収束的（convergent）または分岐的（dive
rgent）合成により調製することができる。

【００１５】デンドロンおよびデンドリマーの分岐的合成には、放射状外側の分子方向に連
続して幾何級数的に進行する段階的な枝上への枝の付加により、層状に分岐した
セルの順序だった配列を生成することを通して起こる分子の成長工程を包含する
。各樹枝状高分子には、コアのセル、１以上の内部セルの層および表面セルの外
層を含み、ここで各セルは１つの分岐結節点を含む。セルは化学構造および分岐
官能性が同じ、または異なることができる。表面分岐セルは、化学的反応性また
は受動（passive）官能基のいずれかを含むことができる。化学的に反応性の表面の基を樹枝状の成長のさらなる延長に、または樹枝状分子表面の修飾に使用す
ることができる。化学的に受動性の基は、疎水性対親水性末端の比率を調整し、
かつ／または特定の溶媒に対する樹枝状ポリマーの溶解性を改善するためのよう
に、樹枝状表面を物理的に修飾するために使用することができる。

【００１６】デンドリマーおよびデンドロンの収束的合成には、デンドロンまたはデンドリ
マー表面となるものから始まり、そして収束点またはコアに向かう分子方向に放
射状に進行する成長工程を包含する。樹枝状ポリマーは、理想的または非理想的
、すなわち不完全または欠損的であってよい。不完全は、不完全な化学反応また
は不可避な競合的な副反応のいずれかの普通の結果である。実際に、真の樹枝状
ポリマーは一般に非理想的であり、すなわちある一定量の構造的不完全性を含む
。

【００１７】使用することができる超分枝ポリマーは、デンドロンおよびデンドリマーのよ
り完全に近い規則的構造と比べると、高レベルの非理想的な不規則分岐を含む種
類の樹枝状ポリマーを表す。具体的には超分枝ポリマーは比較的多数の不規則な
分岐領域を含み、ここでは各反復単位が分岐結節点を含まない。デンドリマー、
デンドロン、規則性超分岐ポリマー、調整超分岐ポリマーおよびデンドリグラフ
トは周知である。デンドリマーおよびデンドロンの例、およびそれらの合成法は
、米国特許第4,507,466号;同第4,558,120号;同第4,568,737号;4,587,329号;4,63
1,337号;同第4,694,064号;同第4,713,975号;同4,737,550号;同第4,871,779号および同第4,857,599号明細書に説明されている。超分岐ポリマーの例およびその合成法は、例えば米国特許第5,418,301号明細書に説明されている。

【００１８】本発明の実施に有用な樹枝状ポリマーまたは高分子は、比較的高い分岐度（こ
れは分子あたりの分岐基の数平均分画、すなわち末端基、分岐基および直線状基
の総数に対する分岐基に加えた末端基の比率）が特徴である。理想的なデンドロ
ンおよびデンドリマーについては、分岐度は１である。線状ポリマーについては
、分岐度は０である。超分岐ポリマーは、線状ポリマーと理想的なデンドリマー
との中間の分岐度を有し、少なくとも約0.5以上の分岐度が好ましい。分岐度は以下のように表わされる：

【００１９】

【数１】

【００２０】式中、Ｎ_xは構造中のｘ型単位の数である。末端（ｔ型）および分岐（ｂ型）単位の両方が、完全に分岐した構造に寄与するが、直線状（ｌ型）単位は、分岐
因子を下げる；したがって０＜ｆ_br ＜１式中、ｆ_br＝０は線状ポリマーの場合を表し、そしてｆ_br＝１は完全に分岐し
た高分子の場合を表す。

【００２１】本発明に使用するために適する樹枝状ポリマーは、カスケード分子（cascade
moecules）、アルボロール（arborol)、樹枝状グラフト化分子（arborescent gr
afted molecule)等と普通呼ばれている高分子も含む。また適当な樹枝状ポリマーは架橋化樹枝状ポリマー、すなわち表面官能基を通して、または表面官能基を
一緒に連結する連結分子のいずれかを通して一緒に連結された樹枝状高分子、お
よび物理的力により一緒に保持される樹枝状ポリマー凝集物を含む。また重合性
のコアから成長した球の形状の樹枝状ポリマーおよび棒状の樹枝状ポリマーも含
む。

【００２２】本発明の実施に使用する樹枝状ポリマーは、世代的に単分散または世代的に多
分散であることができる。単分散溶液中の樹枝状ポリマーは、実質的にすべて同
じ世代であり、したがって均一なサイズおよび形である。多分散溶液中の樹枝状
ポリマーは、異なる世代のポリマーの分散を含んで成る。本発明の実施に使用す
ることができる樹枝状ポリマー分子は、種々の内部および外部組成または官能性
の混合物を含む。

【００２３】本発明の実施に有用な樹枝状ポリマーは、対称的な分岐セルを有するもの（等
しい長さのアーム、例えばPAMAMデンドリマー）、および非対称的に分岐したセル（等しくない長さのアーム、例えばリシン−分岐デンドリマー）を有するもの
、分岐デンドリマー、カスケード分子、アルボロール等を含む。

【００２４】また用語「樹枝状ポリマー」は、いわゆる「超櫛型分岐」ポリマー（“hyper
comb-branched"polymer）も含む。これらは、（１）重合中、分岐およびグラフト化に対して保護されるか、または非−反応性であるいずれかの第１組のモノマ
ーの重合を開始することにより、第１組の線状ポリマー分岐を形成し、各々の分
岐は重合の完成時に反応性末端単位を有し、この反応性末端単位は互いに反応す
ることができず；（２）分岐の上の反応性末端基と反応することができる複数の
反応部位を有するコア分子またはコアポリマーに分枝をグラフト化し；（３）各
分枝上の複数のモノマー単位を脱保護または活性化のいずれかを行い；（４）第
２組のモノマーを用いて、工程（１）を繰り返すことにより、第２組の線状ポリ
マー分枝を別に形成し；（５）第２組の分枝を第１組の分枝に、第２組の分枝の
反応性末端基を第１組の分枝上の反応性部位と反応させ、そして次に上記の工程
（３）、（４）および（５）を繰り返して、１組以上の分枝を続いて加えるにと
により、調製される非−架橋化ポリ−分岐化ポリマーを含んで成る。そのような
超櫛型分岐ポリマーは、欧州特許出願公開第0473088A2号明細書に開示されている。そのような超櫛型分岐ポリマーの代表的な式は：

【００２５】

【化１】

【００２６】式中、Ｃはコア分子であり；各Ｒは、遊離基開始剤、カチオン性開始剤、アニ
オン性開始剤、配位重合開始剤および基転移開始剤から成る群から選択される開
始剤の残りの部分であり；ＡおよびＢは、少なくとも｛(A)-(B)}線状ポリマー鎖
の重合中、および｛(A)-(B)}コア分枝の｛(A)-(B)}分枝の前のグラフト化中に、
それらから分岐するために、またはそれらにグラフト化するために必要な条件に
耐えることができる重合性モノマーまたはコモノマーであり；各Ｇはグラフト化
成分であり、そして

【００２７】

【化２】

【００２８】の意味は、Ｇが(A)単位または(B)単位のいずれかに付くことができることを示し
；ｎは示した世代の櫛型分枝の重合度であり；ｙは示した世代の分枝中のＢ単位
の画分であり、そして.01〜１の値を有し；上付きの０、１およびｉは櫛型分枝の世代レベルを意味し、ｉは「２」から始まり、そしてポリマー中で反復する分
枝組の世代の数続き；そして少なくともｎ⁰およびｎ'は＞２である。

【００２９】専門用語を明瞭にする目的で、稠密なスターデンドリマーは、反復する末端分
岐により合成されるが、超櫛型デンドリマーは反復する櫛型分岐により合成され
る。稠密なスターデンドリマーでは、次の世代の分枝が前の世代の末端部分に付
き、これにより前の末端部分の官能性に対して分岐の程度を限定し、これは典型
的には２または３となるだろう。対照的に超櫛型分岐デンドリマーに従い、前世
代のオリゴマー分枝上にオリゴマーを分岐することにより、世代から世代へと劇
的に分岐度を増すことができ、そしてまさに世代から世代への分岐度を変動させ
ることができる。

【００３０】本発明の遺伝子トランスフェクション粒子の調製に使用するために特に良く適
する樹枝状ポリマーは、外部および／または内部の第１級または第２級アミン基
、アミド基またはそれらの組み合わせを含む種々の樹枝状ポリマーを含む。例と
してはポリアミドアミン（PAMAM)樹枝状ポリマー、ポリプロピルアミン（POPAM ）樹枝状ポリマーおよびポリエチレンイミン（PEI）樹枝状ポリマーを含む。アミドおよび／またはアミン基を有する樹枝状ポリマーは、金属および遺伝物質の
両方に大変高い親和性および結合能を有する。

【００３１】本発明の好適な観点によれば、好ましくは金属の支持体粒子が最初に樹枝状ポ
リマーに結合されて金属／デンドリマー複合体を形成し、これを実質的に遺伝物
質と接触させて遺伝子トランスフェクション粒子を形成する。本明細書で使用す
る結合とは、樹枝状ポリマーと支持体との間の任意の様々な相互作用を称し、こ
こで支持体は支持体の密度が、粒子衝撃中に遺伝子トランスフェクション粒子に
十分な運動量を与えて、細胞貫通そして細胞内部への遺伝物質の導入を達成する
ために利用できるように、樹枝状ポリマーと結合させるか、またはそうではなく
樹枝状ポリマーに関して局在させる(localized)。このように本明細書で使用する結合とは、錯化、水素結合、双極子−双極子相互作用、ロンドンの分散力、フ
ァンデルワールス相互作用のような化学的結合、ならびに樹枝状ポリマーの内部
内に支持体を物理的に閉じ込めること、または拡散を制御した保持を含む。

【００３２】樹枝状ポリマーに結合される金属は、樹枝状ポリマー分子の内部内または外部
上の官能性反応部位に結合する個々の金属原子または金属原子を含有する部分で
あるか、あるいは樹枝状ポリマー分子の内部内に物理的に閉じ込められた、また
は保持された状態であることができる。樹枝状ポリマーに結合される金属は、樹
枝状ポリマー（１つまたは複数）が結合する金属原子のクラスターまたは金属粒
子の状態でもよい。

【００３３】金属が、金属原子または金属を含有する部分の状態で樹枝状ポリマー分子に結
合し、樹枝状ポリマー分子内に閉じ込められ、またはその中に保持された金属−
樹枝状ポリマー結合体または組成物は、金属原子を含有する物体（金属原子、金
属イオンまたは金属を含有する錯体もしくは分子）を樹枝状ポリマーに関して局
在させることにより調製することができる。本明細書で使用する局在とは、樹枝
状ポリマーと金属原子を含有する物体とを、金属原子を含有する物体を樹枝状ポ
リマー分子の内部または外部(またはその両方)の反応性部位と化学的に結合する
ようにさせるか、かつ／または樹枝状ポリマー分子の内部内に配置させるために
適当な時間、適当な条件下で接触させることを包含する。物理的拘束は、樹枝状
ポリマーの内部内に比較的一過性の反応体（１つまたは複数）の混入から、樹枝
状ポリマーの内部内または外部に比較的永久的な反応体（１つまたは複数）の閉
じ込みまでの範囲であることができる。反応体（１つまたは複数）と樹枝状ポリ
マーの内部または外部との結合には、イオン結合、供与体受容体相互作用（配位
結合）、水素結合、ファンデルワールス相互作用およびロンドンの分散力を含む
。金属原子を含有する物体は、金属原子を含有する物体と金属原子を含有する物
体が接近できる内部を有する樹枝状ポリマーとを、金属原子を含有する物体が樹
枝状ポリマー分子の内部内に配置され、そしてその後に、金属原子を含有する物
体を反応させて、樹枝状ポリマー分子の内部内に物理的に閉じ込められた化合物
またはイオンを形成し、かつ／またはデンドリマーがもはや金属原子を含有する
物体に浸透できないように樹枝状ポリマー分子の表面を修飾することを可能とす
るために十分な時間、適当な条件下で接触させることにより物理的に閉じ込める
ことができるようになる。例えば金属イオンは一般に、第４世代から第６世代の
PAMAMデンドリマーにより規定される内部に入り、そして／または続いてデンドリマー表面に浸透することができる錯化剤と反応して、物理的サイズおよび／ま
たは形状のためにデンドリマーの内部から出ることができない錯体を形成するこ
とができる。金属原子を含有する物体を、表面の基を修飾することにより樹枝状
ポリマーの内部内に閉じ込める方法は、例えば欧州特許出願公開第95 201373.8 号明細書（公開番号0,684,044,A2)に開示されている。

【００３４】金属が樹枝状ポリマー上および／または内に個々の原子または単一金属原子を
含有する部分の状態で分布している金属−樹枝状ポリマー結合体を、遺伝物質と
接触させて遺伝子トランスフェクション粒子を形成することができる。すべての
遺伝物質は容易かつ強固に、樹枝状ポリマー上の種々の表面の官能性反応部位、
特にアミンおよびアミド官能基と反応する酸性の官能基を含む。樹枝状ポリマー
上の大変高い官能基の表面密度から（例えば第５世代のPAMAMデンドリマーは、1
28個のアミン結合部位を有する）、比較的高い量の遺伝物質を樹枝状ポリマーに
結合して、既知の遺伝子トランスフェクション粒子よりもより粒子塊およびサイ
ズに対して一層高レベルの遺伝物質を有する遺伝子トランスフェクション粒子を
形成することができる。その結果、効果的量の遺伝物質をより少量の粒子を使用
して、しかもより小さい粒子を使用して細胞の内部に送達することができる。こ
のような各因子は、粒子衝撃中により低レべルの細胞傷害に寄与することができ
、したがって粒子衝撃後の高レべルの細胞および組織生存に貢献することができ
る。

【００３５】上記の金属−樹枝状ポリマー結合体は互いに、またはいかなる金属も含まない
樹枝状ポリマーと組み合わせ、または結合し、単一の樹枝状ポリマー分子より大
きな直径または最大寸法を有する樹枝状ポリマークラスターまたは凝集物を形成
してもよい。樹枝状ポリマーのクラスターまたは凝集物への結合は、少なくとも
２つの異なる樹枝状ポリマー分子を金属原子に配位結合することにより、あるい
は二価、三価もしくは多価架橋剤の使用により達成することができ、これは直鎖
もしくは分岐ポリマーまたは他の高分子でよく、他の樹枝状ポリマーの表面官能
基と直接結合する表面官能基を有する樹枝状ポリマーを含む。異なる種類の表面
官能基を有する２種以上の異なる樹枝状ポリマーを使用して、異なる種類の表面
官能基を互いに直接反応させることにより金属−樹枝状ポリマークラスターを形
成する時、異なる種類のデンドリマーを最初に互いに反応させてクラスターまた
は凝集物を形成し、そしてその後に金属原子を含有する物体と接触させるか、あ
るいは１以上の異なる種類の樹枝状ポリマーを金属原子を含有する物体と接触さ
せて、１またはそれ以上の金属−樹枝状ポリマー結合物（１つまたは複数）を形
成し、これを続いて他の樹枝状ポリマー（１つまたは複数）および／または樹枝
状ポリマー結合物（１つまたは複数）と反応させて、金属を含有する樹枝状ポリ
マークラスターまたは凝集物を形成してもよい。

【００３６】遺伝物質は、樹枝状ポリマー（１つまたは複数）が金属原子を含有する物体（
１つまたは複数）もしくはそれらの組み合わせと接触する前、最中または後に樹
枝状ポリマー（１つまたは複数）と接触させることができる。

【００３７】金属および遺伝物質の付加は、例えば互いに接触する材料の量を慎重に調整す
ることにより、種類、サイズ、世代および表面官能性に関して樹枝状ポリマー（
１つまたは複数）を選択することにより、成分が接触する条件を調整する等によ
り所望するように調整することができる。

【００３８】樹枝状ポリマー（１つまたは複数）、架橋剤、もしあれば、金属を含有する物
質（１つまたは複数）の種類および量を適当に選択することにより、金属および
遺伝物質の付加レベル、成分を合わせる様式および条件、種々の粒子サイズ、粒
子密度および治療的活性を、処理する細胞の種類および処置する疾患の種類に関
連する具体的要件に合うようにすることができる。

【００３９】本発明の別の観点に従い、遺伝子トランスフェクション粒子は樹枝状ポリマー
分子を金属粒子の表面に被覆することにより調製できる。金ゾル状態で提供され
る適当な金粒子は、様々な供給元から市販されている。

【００４０】本発明に従い好適な金属粒子は、１マイクロメーター未満、そしてより好まし
くは約１nm〜約100nmの直径または最大寸法を有する。

【００４１】本発明に付随する改善された効率および細胞傷害の減少に関連する多大な利点
に加えて、本発明の粒子は遺伝物質のヌクレアーゼ分解に対するよりよい保護を
提供することが見いだされており、したがって治療的効果の期間を延長すること
ができる。

【００４２】本発明の方法には、遺伝子トランスフェクション粒子を細胞に通し、そして入
れるために十分な力で植物または動物細胞に向けて本明細書で開示した遺伝子ト
ランスフェクション粒子を加速することを包含する。この方法は表皮細胞のよう
な通常は暴露されている細胞にインビボで、種々の内部器官の組織または細胞の
ような外科的方法により暴露される細胞にインビボで、粒子衝撃後に宿主植物ま
たは動物に移植される組織または細胞外植片にエクスビボで、あるいは遺伝子増
幅法のようにインビトロで、またはある種の遺伝子産物の大量生産に際して行う
ことができる。本発明の遺伝子トランスフェクション粒子を使用する粒子衝撃は
、高電圧放電装置、加圧装置、および十分に開発された、またはこれから開発さ
れるであろう他の適当な手段を含め、当該技術分野および技術文献で現在周知の
種々の遺伝子銃を使用して達成することができる。加圧装置に使用するガスは本
質的に支持体、遺伝物質およびポリマーに不活性であるべきである。適当な不活
性ガスは例えばヘリウムおよびアルゴンである。

【００４３】

【実施例】

以下の非限定的な説明的実施例を参照にすることにより、さらに理解が容易に
なるだろう。実施例１デンドリマー−金結合体は、500μlの1.0mM G4.T PAMAMデンドリマー溶液を50
0μlの10.15mM HAuCl₄溶液、10μlの35％ヒドラジン溶液（水中）および２ml(20
00μl)の水と室温で混合することにより調製した。(「G4.T」とは第４世代PAMAM
デンドリマーを表し、ここでアミン末端はトリス−ヒドロキシメチル脂肪族表面
基と反応することにより修飾されている。）デンドリマー−金結合体の形成は、
紫外線分光分析法で確認した。実施例２実施例１のデンドリマー−金結合体を、任意に種々の遺伝物質と接触させて高
度に効率的な遺伝子トランスフェクション粒子を形成することができる。

【００４４】当業者には、前記の請求項に定める本発明の精神および範囲から逸脱すること
なく、本明細書に記載したような好適な態様に様々な変更を施すことができるこ
とが明らかであろう。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリマー、樹枝状ポリマーと結合した支持体、および樹枝状
ポリマーと結合した遺伝物質を含む複合材料を含んで成る遺伝子トランスフェク
ション粒子。
【請求項２】支持体粒子が金、タングステン、銀、銅、マグネシウム、カ
ルシウムまたはそれらの組み合わせから選択される金属である請求項１に記載の
粒子。
【請求項３】支持体粒子が金である、請求項１に記載の粒子。
【請求項４】ポリマーが、アミン官能基を有する樹枝状ポリマーである、
請求項１に記載の粒子。
【請求項５】樹枝状ポリマーがPAMAM、POPAMまたはPEIである、請求項４に記載の粒子。
【請求項６】樹枝状ポリマーがPAMAMである、請求項４に記載の粒子。
【請求項７】約１nm〜約1000nmの最大寸法を有する、請求項１に記載の粒
子。
【請求項８】遺伝物質がDNA、DNA断片またはオリゴヌクレオチドである、
請求項１に記載の粒子。
【請求項９】ポリマーが、アミン官能基を有する樹枝状ポリマーである、
請求項３に記載の粒子。
【請求項１０】樹枝状ポリマーがPAMAMである、請求項３に記載の粒子。
【請求項１１】約１nm〜約1000nmの最大寸法を有する、請求項１０に記載
の粒子。
【請求項１２】ポリマーが樹枝状であり、そして樹枝状ポリマーに結合し
た金属が単一金属原子（１つまたは複数）またはイオン、あるいは単一金属原子
を含有する化合物の状態である、請求項１に記載の粒子。
【請求項１３】金属が金、タングステン、銀、銅、マグネシウム、カルシ
ウムまたはそれらの組み合わせである請求項１２に記載の粒子。
【請求項１４】金属が金である、請求項１２に記載の粒子。
【請求項１５】樹枝状ポリマーがポリアミンである、請求項１２に記載の
粒子。
【請求項１６】樹枝状ポリマーがPAMAM、POPAMまたはPEIである、請求項１２に記載の粒子。
【請求項１７】樹枝状ポリマーがPAMAMである、請求項１２に記載の粒子。
【請求項１８】約１nm〜約1000nmの最大寸法を有する、請求項１２に記載
の粒子。
【請求項１９】樹枝状ポリマーがポリアミンである、請求項１４に記載の
粒子。
【請求項２０】樹枝状ポリマーがPAMAMである、請求項１４に記載の粒子。
【請求項２１】約１nm〜約100nmの最大寸法を有する、請求項２０に記載の粒子。
【請求項２２】金属核粒子、金属核粒子の表面に付着した樹枝状ポリマー
分子、および樹枝状ポリマーに付着した遺伝物質を含んで成る遺伝子トランスフ
ェクション粒子。
【請求項２３】遺伝物質の植物または動物細胞への送達方法であって；ポリマーを支持体に結合してポリマー−支持体結合体を形成し；遺伝物質をポリマー−支持体結合体に結合して遺伝子トランスフェクション粒子
を形成し；そして遺伝子トランスフェクション粒子を植物および動物細胞に向けて十分な運動力で
加速して遺伝子トランスフェクション粒子を細胞へ貫通させそして入れる、ことを含んで成る上記方法。
【請求項２４】ポリマーが樹枝状であり、そしてさらに樹枝状ポリマーを
支持体粒子に結合することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】遺伝子トランスフェクション粒子が高電圧放電により加速
される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】遺伝子トランスフェクション粒子が加圧放電により加速さ
れる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】遺伝子トランスフェクション粒子がインビボで細胞に加速
される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】遺伝子トランスフェクション粒子が細胞の外植片中に加速
され、そしてさらに遺伝子トランスフェクション粒子を含有する細胞を宿主植物
または動物に移植する工程を含んで成る、請求項２３に記載の方法。