JP2002369686A

JP2002369686A - アミノペプチダーゼｂ

Info

Publication number: JP2002369686A
Application number: JP2001133620A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Yokota; 博横田; Yasuko Arai; 康子荒井; Tatsuya Inoue; 竜也井上
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2001-04-27
Filing date: 2001-04-27
Publication date: 2002-12-24

Abstract

(57)【要約】【課題】ヒトのアミノペプチダーゼＢ（ＡＰＢ）を見
出し、その生体における役割を明確化し、その機能また
は生理学的作用を制御することによる新規な診断手段、
医薬用組成物を提供すること。【解決手段】ヒトｃＤＮＡライブラリーからラットＡ
ＰＢ遺伝子とのホモロジー検索を行って選出した遺伝子
の全長を決定し、該遺伝子を大腸菌発現系で発現させて
該遺伝子がコードする蛋白質を得るとともに、該蛋白質
がＡＰＢであることを合成基質を用いて確認し、該蛋白
質、その機能または生理学的作用を制御することによる
新規な疾病診断手段および医薬用組成物を提供した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アミノペプチダーゼＢ
活性をもつペプチドおよびそれをコードする遺伝子に関
し、詳しくはラットのアミノペプチダーゼＢと高い相同
性を示すヒトのアミノペプチダーゼＢに関する。

【０００２】

【従来の技術】アミノペプチダーゼＢ（以下ＡＰＢと略
称することもある）は、ペプチドのＮ末端がアルギニン
（Ａｒｇ）および／またはリジン（Ｌｙｓ）の時に、該
Ａｒｇおよび／またはＬｙｓ残基を特異的に切断するＺ
ｎ^２＋依存性のエキソペプチダーゼであり、主にラット
細胞を用いた研究でその機能解析が進められてきた。ラ
ットのアミノペプチダーゼＢは、炎症やアレルギー反応
等の伝達物質であるロイコトリエンＡ４（Ｌｅｕｋｏｔ
ｒｉｅｎｅＡ４）の加水分解酵素と類似したモチーフ
を有しており、細胞膜内に存在し、細胞外にも分泌され
る蛋白質であることが知られている（ＴｈｅＩｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ＆ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ３
１，７４７−７５０，１９９９）。ＡＰＢが作用する合
成基質としては、Ａｒｇ−Ｌｅｕ−エンケファリン（ｅ
ｎｋｅｐｈａｌｉｎ）、Ａｒｇ−Ｍｅｔ−ｅｎｋｅｐｈ
ａｌｉｎ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ソマトスタチン（ｓｏｍａ
ｔｏｓｔａｔｉｎ）等が知られている。また、ラットＡ
ＰＢは、大脳皮質、副睾丸、心臓、腎臓、大腸、肝臓、
肺、筋肉、膵臓等の多種の臓器でその存在が認められて
いる。このようにラットのＡＰＢについてはその役割が
解明されつつあったが、この酵素のヒト・ホモログ（ｈ
ｏｍｏｌｏｇｕｅ）についての報告はなかった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題のひとつ
は、ヒト・アミノペプチダーゼＢ（ＡＰＢ）を見出し提
供することである。また本発明の別の課題は、ヒトＡＰ
Ｂの生体における役割を明確化し、その機能または生理
学的作用を制御することによる疾病診断手段および医薬
用組成物を提供しようとするものである。

【０００４】

【課題解決のための手段】上記課題を解決すべく本発明
者らは鋭意努力し、ヒトＡＰＢ遺伝子および蛋白質を得
ることに成功した。より具体的には、ＧｅｎＢａｎｋの
ヒトｃＤＮＡライブラリーからラットＡＰＢ遺伝子との
ホモロジー検索を行って選出した遺伝子の全長を決定
し、該遺伝子を大腸菌発現系で発現させて該遺伝子がコ
ードする蛋白質を得た。さらに、得られた蛋白質がＡＰ
Ｂであることを、合成基質を用いた酵素活性の確認およ
びＡＰＢ阻害剤であるピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙ
ｃｉｎ）による酵素活性阻害により初めて確認するとと
もに、該蛋白質の機能または生理学的作用を制御するこ
とによる疾病診断手段および医薬用組成物を提供するこ
とによって本発明を完成した。

【０００５】すなわち本発明は、（１）下記の群より選
ばれるアミノペプチダーゼＢ活性を有するペプチド；配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペ
プチド、前記のペプチドを含有するペプチド、および前記のペプチドと少なくとも約７０％のアミノ酸配
列上の相同性を有するペプチド、（２）下記の群より選ばれるＨ−アルギニン−７−アミ
ド−４−メチルクマリン・２塩酸を分解する活性を有す
るペプチド；配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペ
プチド、前記のペプチドを含有するペプチド、および前記のペプチドと少なくとも約７０％のアミノ酸配
列上の相同性を有するペプチド、（３）前記（１）もしくは（２）のペプチドをコードす
るポリヌクレオチドまたはその相補鎖、（４）アミノペ
プチダーゼＢ活性、および／またはＨ−アルギニン−７
−アミド−４−メチルクマリン・２塩酸を分解する活性
を有するペプチドをコードする、配列表の配列番号２に
記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相
補鎖、（５）前記（３）もしくは（４）のポリヌクレオ
チドまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイゼーションするポリヌクレオチド、（６）前
記（３）から（５）のいずれかのポリヌクレオチドを含
有する組換えベクター、（７）プラスミドｐＤＯＮＲ
２０１／ＡＰＢ＃４、（８）プラスミドｐＤＥＳＴ１
７／ｈＡＰＢ＃１、（９）前記（６）の組換えベクター
または前記（７）もしくは（８）のプラスミドで形質転
換された形質転換体、（１０）前記（９）の形質転換体
を培養する工程を含む、前記（１）または（２）のペプ
チドの製造方法、（１１）前記（１）もしくは（２）の
ペプチドを免疫学的に認識する抗体、（１２）前記（１
１）の抗体であって、アミノペプチダーゼＢ活性を抑制
する抗体、（１３）前記（１）もしくは（２）のペプチ
ドと相互作用してその活性を阻害もしくは促進する化合
物、および／または前記（３）から（５）のいずれかの
ポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害もしく
は促進する化合物のスクリーニング方法であって、前記
（１）もしくは（２）のペプチド、前記（３）から
（５）のいずれかのポリヌクレオチド、前記（６）のベ
クター、前記（７）もしくは（８）のプラスミド、前記
（９）の形質転換体、または前記（１１）もしくは（１
２）の抗体のうちの、少なくともいずれか一つを用いる
ことを特徴とするスクリーニング方法、（１４）前記
（１）もしくは（２）のペプチドと相互作用してその活
性を阻害もしくは促進する化合物、および／または前記
（３）から（５）のいずれかのポリヌクレオチドと相互
作用してその発現を阻害もしくは促進する化合物の同定
方法であって、化合物と該ペプチドまたは該ポリヌクレ
オチドとの相互作用を可能にする条件下で、該ペプチド
または該ポリヌクレオチドと化合物とを接触させ、次い
で、化合物と該ペプチドまたは該ポリヌクレオチドとの
相互作用により生じるシグナルの存在もしくは不存在ま
たは変化を検出することにより、化合物が該ペプチドま
たはポリヌクレオチドと相互作用して、該ペプチドの活
性または該ポリヌクレオチドの発現を阻害または促進す
るかどうかを決定する方法、（１５）前記（１）もしく
は（２）のペプチドと相互作用してその活性を阻害もし
くは促進する化合物、および／または前記（３）から
（５）のいずれかのポリヌクレオチドと相互作用してそ
の発現を阻害もしくは促進する化合物の同定方法であっ
て、前記（９）の形質転換体と化合物とを接触させ、前
記（１）もしくは（２）のペプチドの発現の有無を検出
することのできるシグナルおよび／またはマーカーを使
用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカー
の存在もしくは不存在または変化を検出することによ
り、化合物が前記（１）もしくは（２）のペプチドの発
現を促進または阻害するかどうかを決定する方法、（１
６）前記（１３）から（１５）のいずれかの方法によっ
て得られた化合物、（１７）前記（１）もしくは（２）
のペプチドと相互作用してその活性を阻害もしくは促進
する化合物、または前記（３）から（５）のいずれかの
ポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害もしく
は促進する化合物、（１８）前記（１）もしくは（２）
のペプチド、前記（３）から（５）のいずれかのポリヌ
クレオチド、前記（６）のベクター、前記（７）もしく
は（８）のプラスミド、前記（９）の形質転換体、前記
（１１）もしくは（１２）の抗体、または前記（１６）
もしくは（１７）の化合物のうちの、少なくともいずれ
か一つを含有することを特徴とする医薬組成物、（１
９）前記（１）もしくは（２）のペプチド、前記（３）
から（５）のいずれかのポリヌクレオチド、前記（６）
のベクター、前記（７）もしくは（８）のプラスミド、
前記（９）の形質転換体、前記（１１）もしくは（１
２）の抗体、または前記（１６）もしくは（１７）の化
合物のうちの、少なくともいずれか一つを含有すること
を特徴とする抗炎症剤、（２０）前記（１）もしくは
（２）のペプチドの発現または活性に関連した炎症性疾
患の診断のための測定方法であって、（ａ）該ペプチド
をコードしている核酸および／または（ｂ）試料中の該
ペプチドをマーカーとして分析することを含む測定方
法、（２１）前記（１）もしくは（２）のペプチド、前
記（３）から（５）のいずれかのポリヌクレオチド、ま
たは前記（１１）もしくは（１２）の抗体のうちの、少
なくとも１つを含んでなる、（ａ）該ペプチドをコード
している核酸および／または（ｂ）試料中の該ペプチド
をマーカーとして分析することを含む測定方法に使用す
る試薬キット、からなる。

【０００６】

【発明の実施の形態】（ヒトＡＰＢ）本発明において提
供されるヒトＡＰＢは、ヒトｃＤＮＡライブラリー（Ｇ
ｅｎＢａｎｋ）からラットＡＰＢとのホモロジー検索を
行って選出したもの（ＡＫ０２６６４４；Ｋａｔ１１８
５３）について、その全長ｃＤＮＡを決定して得た遺伝
子がコードするペプチドである。該遺伝子は、ラットの
ＡＰＢと高い相同性を示し、その遺伝子産物はアミノペ
プチダーゼＢ活性を有し、合成基質Ｈ−アルギニン−７
−アミド−４−メチルクマリン・２塩酸（Ｈ−Ａｒｇ−
ＡＭＣ・２ＨＣｌ）を分解できる。また、該遺伝子産物
は６５０残基のアミノ酸からなり、３２２番目のバリン
（Ｖａｌ）から３３１番目のトリプトファン（Ｔｒｐ）
に亜鉛金属プロテアーゼ（ｚｉｎｃｍｅｔａｌｌｏｐ
ｒｏｔｅａｓｅ）モチーフを有していた。これらのこと
から、本発明で取得した遺伝子は新規な亜鉛金属ペプチ
ダーゼをコードしていることが確認された。また、該遺
伝子産物の３２５番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）から３４
８番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）には、ラットＡＰＢと
同様に、ロイコトリエンＡ４加水分解酵素と類似するモ
チーフが存在することが判明した。以下、この遺伝子を
ＡＰＢ遺伝子と呼び、その遺伝子産物をＡＰＢと呼ぶ。

【０００７】前記ＡＰＢ遺伝子の塩基配列は２００１年
３月にＧｅｎＢａｎｋに開示されているもの（アクセッ
ション番号：ＢＣ００１０６４）と同一であり、その推
定アミノ酸配列は２０００年１２月にＮａｔｉｏｎａｌ
ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｍａｍ
ｍａｌｉａｎＧｅｎｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎにより
公知となっている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．
ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．ＡＡＨ０１０６４）。しか
し、それらは単に塩基配列もしくは推定アミノ酸配列を
開示するのみであり、その機能や有用性等に関する開示
や示唆は一切なかった。

【０００８】（ペプチド）本発明は、上記ＡＰＢおよび
その由来物であるペプチドを提供する。ここで、ペプチ
ドとはアミノ酸が２分子以上ペプチド結合で連結した物
質を意味し、蛋白質、ポリペプチド、オリゴペプチド等
を包含する。

【０００９】本発明に係るＡＰＢは、上記ＡＰＢ遺伝子
がコードするペプチドであり、該遺伝子を大腸菌等の細
胞で発現させて得られたペプチドである。該ペプチド
は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる
ペプチドであり得る。また、本発明に係るペプチドは、
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプ
チドを含有するペプチドであってもよい。

【００１０】また、本発明に係るペプチドは配列表の配
列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドと、ア
ミノ酸配列上で約４０％以上、好ましくは約７０％以
上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約
９０％、特に好ましくは約９５％以上の相同性を有し、
かつ少なくともＡＰＢ活性および／または合成基質Ｈ
−Ａｒｇ−ＡＭＣ・２ＨＣｌを分解する活性を有する
ペプチドであってもよい。アミノ酸配列の相同性を決定
する方法は自体公知であり、例えばアミノ酸配列を直接
決定する方法、ｃＤＮＡの塩基配列を決定後これにコー
ドされるアミノ酸配列を推定する方法等を挙げることが
できる。本発明に係るペプチドは、相同性をもつペプチ
ドから、少なくともＡＰＢ活性および／または合成基質
Ｈ−Ａｒｇ−ＡＭＣ・２ＨＣｌを分解する活性を指標
にして選別することができる（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃ
ｅＲｅｓｅａｒｃｈ９，７３−８１，１９９１）。

【００１１】さらに、上記ペプチドを基にして、少なく
ともＡＰＢ活性および／または合成基質Ｈ−Ａｒｇ−
ＡＭＣ・２ＨＣｌを分解する活性を指標とすることに
より、１個以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜
３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは
１〜１０個、特に好ましくは１個ないし数個のアミノ酸
の欠失、置換、付加あるいは挿入といった変異を有する
アミノ酸配列からなるペプチドも提供される。欠失、置
換、付加あるいは挿入の手段は自体公知であり、例え
ば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プラ
イマー伸長法、またはポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣ
Ｒ）等を、単独または適宜組み合わせて、例えばサムブ
ルック等編［モレキュラークローニング，アラボラト
リーマニュアル第２版］コールドスプリングハーバー
ラボラトリー，１９８９、村松正實編［ラボマニュアル
遺伝子工学］丸善株式会社，１９８８、エールリッヒ，
ＨＥ．編［ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応
用］ストックトンプレス，１９８９等の成書に記載の方
法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施する
ことができ、例えばＵｌｍｅｒの技術（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２１９，６６６，１９８３）を利用することができ
る。

【００１２】上記のような変異の導入において、当該ペ
プチドの基本的な性質（物性、活性、または免疫学的活
性等）を変化させないという観点から、例えば、同族ア
ミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ
酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミ
ノ酸、芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想
定される。

【００１３】また、本発明は、配列表の配列番号１に記
載のアミノ酸配列からなるペプチドの部分配列を有する
ペプチドをも包含する。これらは例えば試薬、標準物
質、免疫原等として利用できる。本発明に係るペプチド
は、最小単位として、４〜８個以上のアミノ酸、好まし
くは１０個以上のアミノ酸、より好ましくは１２個以
上、さらに好ましくは１５個以上の連続するアミノ酸か
らなるものであり、好ましくは免疫学的に認識され得る
ペプチド、例えばエピトープペプチドである。

【００１４】本発明に係るペプチドは、試薬、標準物
質、または後述するようにＡＰＢに特異的な抗体を作製
するための抗原として単独またはキャリア（例えば、キ
ーホールリンペットヘモシアニンまたは卵白アルブミン
等）と結合して使用できる。これらのように別種の蛋白
質または物質を結合したペプチドも本発明の範囲に包含
される。

【００１５】本発明においては、配列表の配列番号１に
記載のアミノ酸配列からなるペプチドと同様のＡＰＢ酵
素活性を有するペプチドまたはその最小活性単位（領域
もしくはドメイン）も提供されるが、それら以外にも、
活性の強度または基質特異性を変更したペプチドが提供
される。これらは、例えばＡＰＢ活性様物質もしくはＡ
ＰＢ拮抗物質として、またはＡＰＢ活性を調節する物質
のスクリーニング等において有用である。

【００１６】さらに、本発明に係るペプチドの検出また
は精製を容易にするために、あるいは別の機能を付加す
るために、Ｎ末端側やＣ末端側に別のペプチド、例えば
アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、Ｉｇ
Ｇ等の免疫グロブリンＦｃ断片、またはＦＬＡＧ−ｔａ
ｇ等のペプチドを、直接またはリンカーペプチド等を介
して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付加するこ
とは当業者には容易であり、これらの別の物質を結合し
たペプチド等も本発明の範囲に包含される。

【００１７】（ポリヌクレオチド）本発明は、上記ペプ
チドをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖を
提供する。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドは、
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプ
チドをコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレ
オチドに対する相補鎖であり得る。好ましくは、配列表
の配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチ
ドである。

【００１８】さらに本発明は、上記ポリヌクレオチドま
たはその相補鎖、好ましくは配列表の配列番号２に記載
の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖
の対応する領域にストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズするポリヌクレオチドを提供する。ハイブリダイ
ゼーションの条件は、例えばサムブルック等編［モレキ
ュラークローニング，アラボラトリーマニュアル第
２版］コールドスプリングハーバーラボラトリー，（１
９８９）等に従うことができる。これらのポリヌクレオ
チドは目的のポリヌクレオチド、特に配列表の配列番号
２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはそ
の相補鎖にハイブリダイズするものであれば必ずしも相
補的配列でなくともよい。例えば、配列表の配列番号２
に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその
相補鎖に対する相同性において、少なくとも約４０％、
例えば、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より
好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以
上の相同性を示すポリヌクレオチドでありうる。また本
発明に係るポリヌクレオチドは、指定された塩基配列の
領域に対応する連続する１０個以上のヌクレオチド、好
ましくは１５個以上、より好ましくは２０個以上の配列
からなるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび
その相補鎖を包含する。

【００１９】これらのポリヌクレオチドは、本発明に係
るペプチド等の製造において有用である。さらに、ＡＰ
Ｂをコードする核酸、例えば、その遺伝子もしくはｍＲ
ＮＡの検出のためのプローブもしくはプライマーとし
て、または遺伝子発現を調節するためのアンチセンスオ
リゴヌクレオチド等として有用である。その意味で、本
発明に係るポリヌクレオチドは翻訳領域のみでなく、非
翻訳領域に対応するものも包含する。また、アンチセン
スオリゴヌクレオチドによってＡＰＢの発現を特異的に
阻害するためには、ＡＰＢに固有な領域の塩基配列を用
いることが好ましい。

【００２０】またここで、ＡＰＢまたは同様の活性を有
するペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列
の決定は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して発現蛋
白質の確認を行い、その生理活性、少なくともＡＰＢ活
性および／または合成基質Ｈ−Ａｒｇ−ＡＭＣ・２ＨＣ
ｌを分解する活性を指標にして選別することにより行
うことができる。蛋白質発現系としては、例えば無細胞
蛋白質発現系を利用でき、小麦胚芽、家兎網状赤血球等
由来のリボソーム系の技術を利用できる（Ｎａｔｕｒ
ｅ、１７９、１６０〜１６１、１９５７）。

【００２１】（組換えベクター）上記ポリヌクレオチド
を適当なベクターＤＮＡに組み込むことにより、組換え
ベクターを得ることができる。使用するベクターＤＮＡ
は、天然に存在するものを抽出したもののほか、増殖に
必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているもの
でもよい。ベクターＤＮＡは、宿主の種類により選択さ
れ、発現目的の遺伝子配列と複製そして制御に関する情
報を担持した遺伝子配列、例えばプロモーター、リボソ
ーム結合部位、ターミネーター、シグナル配列、エンハ
ンサー等、とを構成要素とし、これらを自体公知の方法
により組み合わせて作製される。前記ベクターＤＮＡに
本発明に係るポリヌクレオチドを組み込む方法は、自体
公知の方法を適用し得る。例えば、適当な制限酵素を選
択、処理してＤＮＡを特定部位で切断し、次いで同様に
処理したベクターとして用いるＤＮＡと混合し、リガー
ゼによって再結合する方法が用いられる。

【００２２】本発明においては、ベクターＤＮＡとして
プラスミドＤＮＡを用い、後述する実施例中に示すよう
に、上記ＡＰＢ遺伝子を含むプラスミドである、プラス
ミドｐＤＯＮＲ２０１／ＡＰＢ＃４およびプラスミド
ｐＤＥＳＴ１７／ｈＡＰＢ＃１を作製した。

【００２３】（形質転換体）本発明では、上記ポリヌク
レオチドをベクターＤＮＡに組み込んで得られた組換え
ベクターを用いて、大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、
または動物細胞等の自体公知の宿主を利用した遺伝子組
換え技術により、本発明に係るＡＰＢならびにその由来
物からなるペプチドを提供可能である。

【００２４】形質転換は、自体公知の手段が応用され、
例えばレプリコンとして、プラスミド、染色体、または
ウイルス等を利用して宿主の形質転換が行われる。より
好ましい系としては、遺伝子の安定性を考慮するなら
ば、染色体内へのインテグレート法であるが、簡便には
核外遺伝子を利用した自律複製系の利用である。本発明
の具体例においては、宿主として大腸菌を利用し、上記
プラスミドにより形質転換体を得たが、無論これに限定
されるものではない。

【００２５】形質転換体は、自体公知の各々の宿主の培
養条件に最適な条件を選択して培養される。培養は、形
質転換体により発現されるＡＰＢまたはその由来物から
なるペプチドの活性、特に少なくともＡＰＢ活性および
／または合成基質Ｈ−Ａｒｇ−ＡＭＣ・２ＨＣｌを分
解する活性を指標にして行ってもよいが、培地中の形質
転換体量を指標にして継代培養またはバッチ培養を行っ
てもよい。

【００２６】（ＡＰＢおよびその由来物の回収）上記形
質転換体を培養した培地からのＡＰＢまたはその由来物
からなるペプチドの回収は、少なくともＡＰＢ活性およ
び／または合成基質Ｈ−Ａｒｇ−ＡＭＣ・２ＨＣｌを
分解する活性を指標にして、分子篩、イオンカラムクロ
マトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を
組み合わせるか、溶解度差に基づく硫安、アルコール等
の分画手段によっても精製回収できる。好ましくは、回
収しようとするペプチドのアミノ酸配列の情報に基づ
き、これらに対する抗体を作成し、ポリクローナル抗体
またはモノクロ−ナル抗体によって、特異的に吸着回収
する方法を用いる。

【００２７】（抗体）抗体は、本発明に係るＡＰＢまた
はその由来物からなるペプチドを抗原として用いて作製
する。抗原はＡＰＢ自体でもまたはその断片でもよく、
少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、より好
ましくは少なくとも１２個、さらに好ましくは１５個以
上のアミノ酸で構成される。ＡＰＢに特異的な抗体を作
製するためには、該ＡＰＢに固有なアミノ酸配列からな
る領域を用いることが好ましい。このアミノ酸配列は、
必ずしも配列表の配列番号１と相同である必要はなく、
蛋白質の立体構造上の外部への露出部位が好ましく、露
出部位のアミノ酸配列が一次構造上で不連続であって
も、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であれば
よい。抗体は、免疫学的にＡＰＢまたはその由来物から
なるペプチドを結合または認識する限り特に限定されな
い。この結合または認識の有無は、公知の抗原抗体結合
反応によって決定される。

【００２８】抗体を産生するためには、自体公知の抗体
作製法を利用できる。例えば、本発明に係るＡＰＢまた
はその由来物からなるペプチドを、アジュバントの存在
または非存在下で単独または担体に結合して動物に投与
し、体液性応答および／または細胞性応答等の免疫誘導
を行うことにより得られる。担体は、それ自体が宿主に
対して有害作用をおこさなければ特に限定されず、例え
ばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示され
る。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤ
ギ、ウマ等が好適に用いられる。

【００２９】ポリクローナル抗体は、上記免疫手段を施
された動物の血清から自体公知の抗体回収法によって取
得される。好ましい手段として免疫アフィニティクロマ
トグラフィー法により得られる。

【００３０】モノクロ−ナル抗体を生産するためには、
上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞（例え
ば、脾臓またはリンパ節由来のリンパ球）を回収し、自
体公知の永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８株
等のミエローマ株）への形質転換手段を導入することに
よって行われる。例えば、抗体産生細胞と永久増殖性細
胞とを自体公知の方法で融合させてハイブリドーマを作
成してこれをクローン化し、上記ＡＰＢを特異的に認識
する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、該ハイブ
リドーマの培養液から抗体を回収する。

【００３１】かくして得られた、ＡＰＢまたはその由来
物であるペプチドを認識し結合しうるポリクローナル抗
体またはモノクローナル抗体は、本発明に係るペプチド
の精製用抗体、試薬、または標識マーカー等として利用
できる。特にＡＰＢの活性を抑制し得る抗体、例えばＡ
ＰＢの酵素活性を抑制しうる抗体は、本発明からなるＡ
ＰＢの活性を調節するために使用でき、そのためＡＰＢ
が関連する疾患、例えば炎症やアレルギー疾患等、の治
療・予防のために有用である。

【００３２】（スクリーニング）本発明に係るＡＰＢま
たはその由来物からなるペプチド、上記ポリヌクレオチ
ドおよびその相補鎖、上記ポリヌクレオチドを含有する
組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形
質転換体、上記プラスミド、ならびに上記ＡＰＢまたは
その由来物からなるペプチドを免疫学的に認識する抗体
は、単独または複数を組み合わせることによって、上記
ＡＰＢまたはその由来物からなるペプチドに対する活性
阻害剤または活性促進剤のスクリーニングに有効な手段
を提供する。例えば、上記ペプチドの立体構造に基づく
ドラッグデザインによる拮抗剤の選別、蛋白質合成系を
利用した遺伝子レベルでの発現調節剤の選別、抗体を利
用した抗体認識物質の選別等が、自体公知の医薬品スク
リーニングシステムを利用して構築可能である。

【００３３】例えば、本発明に係るＡＰＢまたはその由
来物からなるペプチドとスクリーニングされる化合物と
の間の相互作用を可能にする条件を選択し、該条件下で
これらペプチドと該化合物とを接触させて、その相互作
用により生じるシグナルの存在もしくは不存在または変
化を検出することにより、上記ＡＰＢまたはその由来物
からなるペプチドの活性を促進または阻害する化合物を
同定可能である。具体的には、例えば、上記ＡＰＢとス
クリーニングされる化合物とを接触させ、該ＡＰＢの酵
素活性を定量することにより、該ＡＰＢを阻害もしくは
促進する化合物を同定できる。ＡＰＢの酵素活性は、簡
便には、合成基質Ｈ−Ａｒｇ−ＡＭＣ・２ＨＣｌの
分解を指標として、分解により生じるＡＭＣの蛍光強度
を測定することにより定量できる。上記検出のためのシ
グナルとしては、蛍光に限らず、ＡＰＢの活性または生
理学的作用を検出しうるものであればよい。実際に、Ａ
ＰＢを阻害する化合物としてピューロマイシン（ｐｕｒ
ｏｍｙｃｉｎ）が同定された（実施例５）。

【００３４】また、本発明に係るＡＰＢまたはその由来
物からなるペプチドをコードしているポリヌクレオチド
とスクリーニングされる化合物との間の相互作用を可能
にする条件を選択し、該条件下でこれらポリヌクレオチ
ドと該化合物とを接触させて、その相互作用により生じ
るシグナルの存在もしくは不存在または変化を検出する
ことにより、これらポリヌクレオチドに結合し得る化合
物を同定可能である。得られた化合物から、さらに形質
転換体を用いた下記の方法により、これらポリヌクレオ
チドの発現を阻害し得る化合物を同定可能である。

【００３５】さらにまた、本発明に係る形質転換体を用
いて、スクリーニングされる化合物または上記得られた
化合物とを適当な条件下で接触させ、本発明に係るＡＰ
Ｂの発現の有無または変化を検出することにより、該Ａ
ＰＢの発現を阻害または促進し得る化合物を同定可能で
ある。ＡＰＢの発現の有無または変化を検出するには、
簡便には、発現されるＡＰＢの酵素活性を、例えば合成
基質Ｈ−Ａｒｇ−ＡＭＣ・２ＨＣｌの分解を指標と
して、分解により生じるＡＭＣの蛍光シグナルを測定す
る。また、ＡＰＢの発現の有無または変化を検出するた
めに、検出のためのシグナルもしくはマーカーを使用す
る系を導入し、このシグナルもしくはマーカーの存在も
しくは不存在または変化を検出してもよい。ここでシグ
ナルとは、そのもの自体がその物理的または化学的性質
により直接検出され得るものを指し、マーカーとはその
ものの物理的または生物学的性質を指標として間接的に
検出され得るものを指す。シグナルとしてはルシフェラ
ーゼやグリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）など、マーカーと
しては、レポーター遺伝子、例えばクロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子など、
または検出用のタグ、例えば６×Ｈｉｓタグなど、公知
のものが利用できる。これらのシグナルまたはマーカー
を組み込んだベクターを作成し、該ベクターを形質転換
体に導入すればよい。また、これらのシグナルまたはマ
ーカーの検出方法は、当業者には周知のものである。

【００３６】（化合物）上記手段で得られた化合物は、
本発明に係るＡＰＢまたはその由来物からなるペプチド
に関する活性阻害剤、活性拮抗剤、または活性促進剤の
候補化合物として利用可能である。本発明に係るＡＰＢ
の活性を阻害する化合物として、ピューロマイシン等を
例示することができる。また、遺伝子レベルでの上記Ａ
ＰＢまたはその由来物に対する発現阻害剤または発現促
進剤の候補化合物としても利用可能である。これらの候
補化合物は、上記ＡＰＢの発現や活性の増加、減少また
は欠失等が関連する各種病的症状、例えば炎症やアレル
ギー疾患等、の予防・治療効果が期待できる。

【００３７】（医薬組成物）かくして選別された候補化
合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選
別することによって、医薬組成物として調製可能であ
る。また本発明からなるＡＰＢまたはその由来物からな
るペプチド、本発明に係るポリヌクレオチドおよびその
相補鎖、本発明に係るポリヌクレオチドを含有するベク
ター、本発明に係るプラスミド、ならびにＡＰＢまたは
その由来物からなるペプチドを免疫学的に認識する抗体
は、それ自体が、診断マーカーや試薬等の疾病診断手段
として、あるいはＡＰＢの活性および／または発現を阻
害、拮抗、または促進する機能を利用した治療薬等（阻
害剤、拮抗剤、促進剤等）の医薬手段として使用するこ
とができる。すなわち本発明は、これらを単独または複
数組み合わせて利用することによって、これらのうち少
なくとも１つを含有する医薬組成物を提供する。なお、
製剤化にあたっては、自体公知のペプチド、蛋白質、ポ
リヌクレオチド、抗体等各対象に応じた製剤化手段を導
入すればよい。

【００３８】本発明に係るヒトＡＰＢの発現およびその
活性が過剰な場合、有効量の上記阻害剤を医薬上許容さ
れる担体とともに対象に投与して、当該ＡＰＢの活性を
阻害し、そのことにより異常な症状を改善することがで
きる。さらに、発現ブロック法を用いて内在性の上記Ａ
ＰＢをコードしている遺伝子の発現を阻害してもよい。
細胞内で生成させた、あるいは別個に投与された当該遺
伝子のアンチセンス配列を使用して当該遺伝子の発現を
阻害できる。これらのオリゴヌクレオチドは、上記本発
明に係るポリヌクレオチドを基にして設計し合成でき
る。当該オリゴヌクレオチドはそれ自体投与することが
でき、あるいは関連オリゴマーをインビボで発現させる
こともできる。

【００３９】本発明に係るＡＰＢには、ラットＡＰＢと
同様に、ロイコトリエンＡ４加水分解酵素と類似するモ
チーフが存在しており、特に炎症やアレルキー疾患等に
関与するものと考えられる。従って、上記阻害剤または
拮抗剤は、抗炎症作用を有するものとして有用である。

【００４０】また、本発明に係るＡＰＢの発現およびそ
の活性の減少や欠失等に関連する異常な症状の治療に
は、１つの方法として当該ＡＰＢ自体あるいはＡＰＢを
コードする遺伝子を活性化する治療上有効量の促進剤を
医薬上許容される担体とともに投与し、そのことにより
異常な症状を改善することを特徴とする方法が挙げられ
る。あるいは、遺伝子治療を用いて、対象中の細胞内で
当該ＡＰＢを生成せしめてもよい。上記ポリヌクレオチ
ドを利用した遺伝子治療は、公知の方法が利用できる。
例えば、上記のごとく本発明に係るポリヌクレオチドを
組み入れた複製欠損レトロウイルスベクターを作製して
遺伝子治療に利用すればよい。また、遺伝子治療におい
て、治療に使用する蛋白質を対象中において生成させる
こともできる。例えば、当該蛋白質をコードしているＤ
ＮＡまたはＲＮＡを用いて、例えばレトロウイルスプラ
スミドベクターを用いることによりエクスビボ（ｅｘ
ｖｉｖｏ）において対象由来の細胞を処理し、次い
で、細胞を対象に導入することもできる。

【００４１】（診断のための測定方法および試薬）本発
明に係るＡＰＢおよびその由来物からなるペプチド，こ
れらをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、
ならびに当該ＡＰＢおよびその由来物からなるペプチド
またはポリペプチドを免疫学的に認識する抗体は、それ
自体を単独で、診断マーカーや試薬等として使用可能で
ある。また本発明は、これらのうちの１種またはそれ以
上を充填した、１個またはそれ以上の容器を含んでなる
試薬キットも提供する。なお、製剤化にあたっては、自
体公知のペプチドまたはポリペプチド、蛋白質、ポリヌ
クレオチド、または抗体等それぞれに応じた製剤化手段
を導入すればよい。

【００４２】本発明に係るＡＰＢおよびその由来物から
なるペプチドの発現または活性に関連した疾患の診断手
段は、例えば当該ＡＰＢをコードしている核酸との相互
作用や反応性を利用して、相応する核酸の存在量を決定
すること、および／または当該ＡＰＢについて個体中の
生体内分布を決定すること、および／または当該ＡＰＢ
の存在、個体由来の試料中の存在量を決定することによ
って行われる。詳しくは、本発明に係るヒトＡＰＢを診
断マーカーとして検定するのである。試料中の当該ＡＰ
Ｂの検出またはその存在量の決定に用いることができる
測定法は当業者に周知である。このような測定法には、
ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタン
ブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイ等がある。ま
た、本発明に係るヒトＡＰＢをコードするポリヌクレオ
チドの検出法および定量法としては、例えば増幅、ＰＣ
Ｒ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロッテ
ィングおよびその他のハイブリダイゼーション法を用い
てＲＮＡレベルで測定することができる。

【００４３】測定される試料として、個体由来の細胞、
例えば血液、尿、唾液、髄液、組織生検または剖検材料
等を挙げることができる。また、測定される核酸は、上
記各試料から自体公知の核酸調製法により得られる。核
酸は、ゲノムＤＮＡを検出に直接使用してもよく、ある
いは分析前にＰＣＲもしくはその他の増幅法を用いるこ
とにより酵素的に増幅してもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮ
Ａを同様に用いてもよい。正常遺伝子型との比較におい
て、増幅生成物のサイズ変化により欠失および挿入を検
出することができる。増幅ＤＮＡを標識した上記ＡＰＢ
をコードするＤＮＡにハイブリダイゼーションさせるこ
とにより点突然変異を同定することができる。

【００４４】上記測定により本発明に係るＡＰＢおよび
該ＡＰＢをコードするＤＮＡの変異、減少、増加を検出
することにより、当該ＡＰＢが関連する疾患、例えば、
炎症やアレルギー疾患等の診断が可能となる。

【００４５】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明
するが、本発明は下記の実施例に限定されない。

【００４６】

【実施例１】ヒトＡＰＢの同定ＧｅｎＢａｎｋのヒトｃＤＮＡライブラリーから、バイ
オインフォーマティクス（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ
ｓ）によるラットＡＰＢとのホモロジー検索を行い、該
モチーフを有するｃＤＮＡ（アクセッション番号ＡＫ０
２６６４４；Ｋａｔ１１８５３）を選出した。該ｃＤＮ
ＡはＮ末端側の一部が欠失していると考えられたため、
その全長ｃＤＮＡを決定するために、ゲノムＤＮＡのデ
ータベースを基にＮ末端側の配列を予想し、ＰＣＲに用
いる下記のプライマー（表１）を設計してＲＴ−ＰＣＲ
法により欠失している部分をクローニングした（図
１）。

【００４７】

【表１】

【００４８】（逆転写反応：ｃＤＮＡ化）まず、ヒト脳
由来ｍＲＮＡを鋳型としてＧＩＢＣＯＢＲＬ社のＳＵ
ＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＩキットを使用して逆転写反応
を行った。オリゴ（ｄＴ_１２− _１８）プライマー〔ｏｌ
ｉｇｏ（ｄＴ_{１２−１８}）ｐｒｉｍｅｒ〕（０．５μｇ
／μｌ）１μｌあるいはランダムプライマー（ｒａｎｄ
ｏｍｐｒｉｍｅｒ）（５０ｎｇ／μｌ）１μｌ、ヒト
脳由来ｍＲＮＡ（１μｇ／μｌ）０．２μｌ、Ｈ_２Ｏ
１０．８μｌを混合し、７０℃で１０分間加熱して氷冷
後、５× ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｂｕｆｆｅｒ
４μｌ、０．１ＭＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＩ
２μｌ、１０ｍＭｄＮＴＰＭｉｘ１μｌを添加し
た。続いてＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＩ（２００Ｕ
／μｌ）を１μｌ添加して室温で１０分間、４２℃で５
０分間、７０℃で１５分間反応を行い、ヒト脳由来ｍＲ
ＮＡからｃＤＮＡを調製した。

【００４９】（ＰＣＲ反応）ＰＣＲ反応はベーリンガー
社ＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲ
Ｓｙｓｔｅｍを使用して行った。各プライマーの組み
合わせで、以下に示すＭｉｘ１とＭｉｘ２のそれぞれ２
５μｌを混合し、下記条件でＰＣＲ反応を行った。

【００５０】

【００５１】（Ｍｉｘ２）１０× ＥｘｐａｎｄＨＦｂｕｆｆｅｒ５μｌＥｘｐａｎｄＨＦ（３．５Ｕ／ｍｌ）０．８μｌＨ_２Ｏ１９．２μｌ２５μｌ

【００５２】ＰＣＲ運転条件《Ｐｒ−ＫＡＴ−Ｓ０５とＰｒ−ＫＡＴ−ＡＳ０２の組み合わせ、Ｐｒ−ＫＡＴ −Ｓ０９とＰｒ−ＫＡＴ−ＡＳ１０の組み合わせの時》プレ（ｐｒｅ）９５℃ ３分間１９５℃ ３０秒間２５６℃ ３０秒間３７２℃ １分間（ステップ１−３は１０サイクル）４９５℃ ３０秒間５６２℃ ３０秒間６７２℃ １分間（ステップ４−６は２５サイクル）ポスト（ｐｏｓｔ）７２℃ ３分間

【００５３】《Ｐｒ−ＫＡＴ−Ｓ０３とＰｒ−ＫＡＴ−ＡＳ０４の組み合わせの時》プレ（ｐｒｅ）９４℃ ３分間１９４℃ ３０秒間２５６℃ ３０秒間３７２℃ ２分間（ステップ１−３は３０サイクル）ポスト（ｐｏｓｔ）７２℃ ３分間

【００５４】（サブクローニング）ランダムプライマー
を用いて得られたｃＤＮＡを鋳型とし、Ｐｒ−ＫＡＴ−
Ｓ０５とＰｒ−ＫＡＴ−ＡＳ０２の組み合わせ、または
Ｐｒ−ＫＡＴ−Ｓ０９とＰｒ−ＫＡＴ−ＡＳ１０の組み
合わせを用いて得られたＰＣＲ産物を電気泳動（１％
アガロースゲル）により精製した。その後、得られた各
ＰＣＲ産物をＴａＫａＲａ社のＢＫＬキットを用いて平
滑末端化およびリン酸化処理した。ＰＣＲ反応液２μ
ｌ、１０× ＢｌｕｎｔｉｎｇＫｉｎａｔｉｏｎｂ
ｕｆｆｅｒ２μｌ、ＢｌｕｎｔｉｎｇＫｉｎａｔｉｏ
ｎＥｎｚｙｍｅＭｉｘ１μｌ、Ｈ_２Ｏ１５μｌ
を３７℃で１０分間反応させた後、ｍｉｃｒｏｐｕｒｅ
−ＥＺフィルターカップにアプライし、１５０００ｒｐ
ｍで３０秒間遠心処理した。通過したＰＣＲ産物の一部
をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＫＳ−）ベクター（Ｓｍａ
Ｉ消化後ＢＡＰ処理）とライゲーションし、コンピテン
トセル（ＪＭ１０９）にトランスフォーメーションし
た。オリゴ（ｄＴ_{１２−１８}）プライマーを用いて得ら
れｃＤＮＡを鋳型とし、Ｐｒ−ＫＡＴ−Ｓ０３とＰｒ−
ＫＡＴ−ＡＳ０４の組み合わせを使用して得られたＰＣ
Ｒ産物はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳＫ−）ベクターを
用いて前記同様に処理し、コンピテントセル（ＪＭ１０
９）にトランスフォーメーションした。トランスフォー
メーション後、大腸菌コロニーについてＰＣＲ（パーキ
ンエルマー社Ａｍｐｌｉ−Ｔａｑ使用）によりインサ
ート（ＰＣＲ産物）の有無および方向を確認し、塩基配
列の確認を行った。

【００５５】（ｃＤＮＡライブラリー・スクリーニン
グ）５′側領域のサブクローニングについては、データ
ベース上で予想した領域の一部を除き、前記ヒト脳由来
ｍＲＮＡより行ったＲＴ−ＰＣＲではクローニングでき
なかった。この領域はＧＣリッチであるため増幅されに
くいと考えられた。そこで前記サブクローニングしたク
ローンのうちＫａｔ１１８５３の３′側約６００ｂｐを
プローブとしてヒト脳由来ｃＤＮＡライブラリーよりハ
イブリダイゼーションを行った。

【００５６】（５′側領域のサブクローニング）ヒト脳
由来ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として直接ＰＣＲでク
ローニングを行った。ＣＬＯＮＴＥＣＨ社Ａｄｖａｎ
ｔａｇｅ−ＧＣｃＤＮＡＰＣＲＫｉｔを用い、最
初にＰｒ−λｇｔ１１−Ｓ１とＰｒ−ＫＡＴ−ＡＳ０６
の組み合わせでＰＣＲを行った。続いてそのＰＣＲ反応
液を鋳型としてＰｒ−ＫＡＴ−Ｓ０７とＰｒ−ＫＡＴ−
ＡＳ０６の組み合わせ、またはＰｒ−ＫＡＴ−Ｓ０７
とＰｒ−ＫＡＴ−ＡＳ０８の組み合わせでＰＣＲを行っ
た（図２）。

【００５７】ＰＣＲ産物を電気泳動（１％アガロース
ゲル）により精製した。その後得られたＰＣＲ産物をＴ
ａＫａＲａ社のＢＫＬキットを用い平滑末端化およびリ
ン酸化処理した。ＰＣＲ反応液５μｌ、１０× Ｂｌ
ｕｎｔｉｎｇＫｉｎａｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ２μ
ｌ、ＢｌｕｎｔｉｎｇＫｉｎａｔｉｏｎＥｎｚｙｍ
ｅＭｉｘ１μｌ、Ｈ_２Ｏ１０μｌを混合して３７
℃で１０分間反応させた後、ｍｉｃｒｏｐｕｒｅ−ＥＺ
フィルターカップに添加し、１５０００ｒｐｍで３０秒
間遠心処理した。通過したＰＣＲ産物の一部をｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔ（ＳＫ−）ベクター（ＳｍａＩ消化後Ｂ
ＡＰ処理）とライゲーションし、その後該ベクターをコ
ンピテントセル（ＪＭ１０９）に形質転換（ｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）した。形質転換後の大腸菌コロニ
ーについてＰＣＲ（パーキンエルマー社Ａｍｐｌｉ−
Ｔａｑ使用）によりインサート（ＰＣＲ産物）の有無お
よび方向を確認し、塩基配列の確認を行った。

【００５８】（全長ｃＤＮＡの構築）ヒト脳由来ｃＤＮ
ＡライブラリーよりＰｒ−ＫＡＴ−Ｓ０７とＰｒ−ＫＡ
Ｔ−ＡＳ０８の組み合わせで行ったＰＣＲでサブクロー
ニングしたｐＢＳ／ＡＰＢ（７−８）＃１９と、前記Ｒ
Ｔ−ＰＣＲでサブクローニングした領域（３クローン）
をつなぎ合せて全長ｃＤＮＡ〔ｐＢＳ／ＡＰＢ（７−
４）＃１〕を構築した（図３）。

【００５９】（ヒトＡＰＢの同定）ヒトＡＰＢは６５０
残基のアミノ酸からなり３２２番目のＶａｌから３３１
番目のＴｒｐに亜鉛金属プロテアーゼモチーフを有して
いた。発現に用いたヒトＡＰＢはゲノムＤＮＡのデータ
ベースおよびＧｅｎＢａｎｋの塩基配列と比較すると数
塩基異なっていた。５、６番目のＴＴがＣＧ（Ｖａｌ→
Ａｌａ）、８６６番目のＣがＴ（Ｐｒｏ→Ｌｅｕ）、１
３３７番目のＧがＡ（Ａｒｇ→Ｌｙｓ）、１４２８番目
のＣがＴ（Ｇｌｙ→Ｇｌｙ）となっていたがＰＣＲによ
る変異ではないと考えられた。塩基配列を配列表の配列
番号２に示した。

【００６０】

【実施例２】大腸菌発現ベクターの構築（エントリーベクターの構築）（１）実施例１で得られた全長ｃＤＮＡの大腸菌での発現ベク
ターおよび発現系の構築をＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社Ｇ
ａｔｅｗａｙＳｙｓｔｅｍＫｉｔを用いて行った。
ｐＢＳ／ＡＰＢ（７−４）＃１を鋳型とし、ＣＬＯＮＴ
ＥＣＨ社Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣｃＤＮＡＰＣ
ＲＫｉｔにより、下記に示すプライマー（表２）を用
いて目的遺伝子の蛋白質翻訳領域の増幅を行った。

【００６１】

【表２】

【００６２】次にＰＣＲ産物をＴＥ−ｂｕｆｆｅｒで２
００μｌとし３０％ＰＥＧ８０００／３０ｍＭＭｇＣ
ｌ_２を１００μｌ添加し、室温で遠心処理（１５０００
ｒｐｍで１０分間）した後、ペレットを７０％エタノー
ルで洗浄して乾燥し、ＴＥ−ｂｕｆｆｅｒ１０μｌに
溶解した。その後ＰＣＲ産物１μｌ、エントリーベクタ
ー（ｐＤＯＮＲ２０１：１５０ｎｇ／μｌ）０．５μ
ｌ、ＢＰｃｌｏｎａｓｅｒｅａｃｔｉｏｎｂｕｆ
ｆｅｒ１μｌ、ＴＥ−ｂｕｆｆｅｒ１．５μｌを氷
上で混合（合計４μｌ）し、ＢＰｃｌｏｎａｓｅｅ
ｎｚｙｍｅｍｉｘ１μｌを添加後２５℃で１時間反
応させた。反応後、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ０．５μ
ｌを添加し、３７℃で１０分間インキュベーションして
酵素ミックスを失活させた。この反応液１μｌをコンピ
テントセル（ＪＭ１０９）に形質転換し、サブクローニ
ングした後ｐＤＯＮＲ２０１／ＡＰＢ＃１およびｐＤＯ
ＮＲ２０１／ＡＰＢ＃３を得た。

【００６３】（エントリーベクターの構築）（２）ｐＤＯＮＲ２０１／ＡＰＢ＃１のＡＰＢ翻訳領域のシー
クエンスを行ったところ、１７４８番目のＡがＧに変異
していた。ｐＤＯＮＲ２０１／ＡＰＢ＃３について、ｐ
ＤＯＮＲ２０１／ＡＰＢ＃１で変異が確認された箇所前
後のシークエンスを行ったところ、変異は確認されなか
ったので、ＰｖｕＩ（エントリーベクター内制限酵素部
位）およびＥｃｏＲＶ消化により変異部分を除去したｐ
ＤＯＮＲ２０１／ＡＰＢ＃１に、ｐＤＯＮＲ２０１／Ａ
ＰＢ＃３からＰｖｕＩおよびＥｃｏＲＶ消化により得た
約２ｋｂｐ断片を結合し、新たにｐＤＯＮＲ２０１／Ａ
ＰＢ＃４を構築した（図４）。

【００６４】（発現ベクターの構築）ｐＤＯＮＲ２０１
／ＡＰＢ＃４を用い、６×ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグと
の融合蛋白質として発現するベクターを構築した。ｐＤ
ＯＮＲ２０１／ＡＰＢ＃４（５０ｎｇ／μｌ）１μｌ、
６×Ｈｉｓタグ発現ベクター（ｐＤＥＳＴ１７：１５０
ｎｇ／μｌ）０．５μｌ、ＬＲｃｌｏｎａｓｅｒｅ
ａｃｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ１μｌ、ＴＥ−ｂｕｆｆ
ｅｒ１．５μｌを氷上で混合（合計４μｌ）し、ＬＲ
ｃｌｏｎａｓｅｅｎｚｙｍｅｍｉｘ１μｌを添
加後２５℃で１時間反応させた。反応後ｐｒｏｔｅｉｎ
ａｓｅＫ０．５μｌを添加し、３７℃で１０分間イ
ンキュベーションして酵素ミックスを失活させた。この
反応液１μｌをコンピテントセル（ＢＬ２１−ＳＩ）に
形質転換させ、発現ベクター（ｐＤＥＳＴ１７／ｈＡＰ
Ｂ＃１）を得た（図５）。

【００６５】

【実施例３】（大腸菌発現系の構築）ｐＤＥＳＴ１７／
ｈＡＰＢ＃１についてＮａＣｌによる目的蛋白質の産生
誘導について検討した。大腸菌（ＢＬ２１−ＳＩ）をＬ
Ｂ−Ａｍｐ〔ＮａＣｌ（−）〕１０ｍｌで３７℃にて一
晩培養した。この前培養液を６ｍｌ添加したＬＢ−Ａｍ
ｐ〔ＮａＣｌ（−）〕合計６６ｍｌでＯＤ_６００が１．
０前後となるまで３７℃で２．５時間本培養した。得ら
れた培養液を３１ｍｌずつに分注し、その一方に５Ｍ
ＮａＣｌを１．８６ｍｌ添加（終濃度０．３Ｍ）し、さ
らに３７℃で３時間培養した。またネガティブコントロ
ールとしてＨ_２Ｏを１．８６ｍｌ添加し同様に培養し
た。培養後、各培養液（１０ｍｌまたは１．５ｍｌ）を
遠心処理し集菌した。

【００６６】得られた大腸菌ペレット（培養液１．５ｍ
ｌ分）を２％ＳＤＳ／２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．
４）３００ｍｌにけん濁し、超音波処理後に遠心処理
（１５０００ｒｐｍで１０分間、１０℃）した。遠心処
理上清を２−メルカプトエタノールを含む２× サンプ
ルバッファー（２％ＳＤＳ／５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐ
Ｈ８．０）／３０％グリセロール／０．０１％ブロ
モフェノールブルー）と等量ずつ混合し、煮沸（ｂｏｉ
ｌｉｎｇ）２分間後、５−２０％ポリアクリルアミド
ゲルにてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。

【００６７】その結果、実施例１で得られた全長ｃＤＮ
Ａがコードする蛋白質と６×Ｈｉｓタグとの融合蛋白質
と考えられる約７４ｋＤのバンドが検出された。またコ
ントロール実験として同様に他系統のプロテアーゼであ
るユビキチン特異プロテアーゼ（ＵＳＰ）についても検
討し産生誘導を示した（図６）。

【００６８】

【実施例４】酵素活性の検討：Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃ
ｅＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ
９，７３−８１，１９９１（試料の調整）実施例３と同様の方法で得た大腸菌ペレ
ット（培養液１０ｍｌ分）を５０ｍＭＮａＰＯ_４（ｐＨ
６．５）／１５０ｍＭＮａＣｌ１ｍｌにけん濁
し、超音波処理後に遠心処理（１５０００ｒｐｍで１０
分間、４℃）した。遠心処理後の大腸菌粗抽出液（ｃｒ
ｕｄｅｅｘｔｒａｃｔ）を用い、総蛋白質量の定量を
行った。定量にはＰＩＥＲＣＥ社のＢＣＡａｓｓａｙ
キットを用いた。検量線はウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）（Ｈ_２Ｏ中２ｍｇ／ｍｌ）を用い、１ｍｇ／ｍｌよ
りＨ_２Ｏで倍々希釈（７段階）した標準液より作製し
た。抽出液は原液よりＨ_２Ｏで倍々希釈（８段階）し
た。標準液および希釈した各抽出液を９６穴プレートに
５０μｌ／ウエルずつ分注し、試薬Ａと試薬Ｂを５０：
１の割合で混合し、それを２００μｌ／ウエルずつ分注
し混合、３７℃で３０分間反応させてＯＤ_５５０を測定
した。検量線より各抽出液の総蛋白質量を算出した。
遠心処理上清の一部を２−メルカプトエタノールを含む
２× サンプルバッファー（２％ＳＤＳ／５０ｍＭＴ
ｒｉｓ（ｐＨ８．０）／３０％グリセロール／０．０
１％ブロモフェノールブルー）と等量ずつ混合して２
分間煮沸後、５−２０％ポリアクリルアミドゲルにて泳
動した。その後ウェスタンブロッティングを行い可溶性
画分での目的蛋白質の存在について検討した。ＰＶＤＦ
メンブレンを１００％メタノールで１５秒間、Ｈ_２Ｏ
で２分間振とう前処理し、泳動したゲルからセミドライ
法で１００ｍＡにて１時間転写した。転写後、ＰＶＤＦ
メンブレンを３％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔ（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）／１５０ｍＭＮａＣｌ／
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で室温１時間ブロッキン
グし、抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓｍｏｕ
ｓｅＩｇＧ：０．２ｍｇ／ｍｌ）を３％ＢＳＡ／Ｔ
ＢＳ−Ｔで２０００倍希釈して加え、室温で１時間反応
させた。反応後にＰＶＤＦメンブレンをＴＢＳ−Ｔで１
０分間洗浄することを３回繰り返し、次いで二次抗体
（ＨＲＰ−ａｎｔｉｍｏｕｓｅＩｇＧ）を１０％
スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔで３０００倍希釈して加え、
室温で１時間反応させた。反応後にＰＶＤＦメンブレン
をＴＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄した。その後Ｅｎｈａ
ｎｃｅｄＣｈｅｍｉＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣ
Ｌ）キットおよびＨｙｐｅｒｆｉｌｍを用いてシグナ
ルを検出し、試料とした。コントロール実験として脱ユ
ビキチン活性が認められたＵＳＰ（ｐＤＥＳＴ１７／Ｕ
ＳＰ＃５）についても同様に誘導後３時間のＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥおよびウェスタンブロッティングを行った（図
７）。

【００６９】前記の通り蛋白質補正して調製した大腸菌
粗抽出液（５０ｍＭＮａＰＯ_４（ｐＨ６．５）／１５
０ｍＭＮａＣｌ抽出液）を用い、酵素活性について検
討を行った。各抽出液を総蛋白質量１．５ｍｇ／ｍｌと
なるように５０ｍＭＮａＰＯ_４（ｐＨ６．５）／１５
０ｍＭＮａＣｌで希釈し、これを原液として倍々希釈
（７段階）し、９６穴プレートに１００μｌ／ウエルず
つ分注した。合成基質Ｈ−Ａｒｇ−ＡＭＣ・２ＨＣｌ
（ＢＡＣＨＥＭ社）を７５．４ｍＭとなるよう８０％酢
酸に溶解した後にさらに５０ｍＭＮａＰＯ４（ｐＨ
６．５）／１５０ｍＭＮａＣｌで３００倍希釈（０．
２５ｍＭ）し、１００μｌ／ウエルずつ分注して混合
し、３７℃で３０分間反応させた。反応後、蛍光強度を
励起波長（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）３６０±１０ｎｍ／
放出波長（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）４６０±１０ｎｍにて測
定した。その結果、ＮａＣｌによる誘導を行った大腸菌
粗抽出液は高い酵素活性を示したが、未誘導のものでは
酵素活性がほとんど認められなかった（図８）。

【００７０】

【実施例５】活性阻害の検討：Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃ
ｅＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ
９，７３−８１，１９９１阻害剤（ピューロマイシン）を用い酵素活性について検
討した。各大腸菌抽出液を総蛋白質量０．６ｍｇ／ｍｌ
となるように５０ｍＭＮａＰＯ_４（ｐＨ６．５）／１
５０ｍＭＮａＣｌで希釈し、これを原液として倍々希
釈（７段階）し、９６穴プレートに１００μｌ／ウエル
ずつ分注した。さらに０．８ｍＭピューロマイシンを
含む合成基質Ｈ−Ａｒｇ−ＡＭＣ・２ＨＣｌ（０．２５
ｍＭ）を１００μｌ／ウエルずつ分注して混合し、３７
℃で３０分間反応させた。反応後、蛍光強度を励起波長
３６０±１０ｎｍ／放出波長４６０±１０ｎｍで測定し
た。その結果、総蛋白質濃度が３７．５μｇ／ｍｌの場
合、酵素活性は約８０％阻害された（図９）。以上のこ
とからここで同定したＡＰＢは酵素活性を有しているこ
とが認められた。

【００７１】

【実施例６】（ノーザンブロッティング）本遺伝子につ
いて各臓器での発現パターンについてノーザンブロッテ
ィングを行い検討した。プローブのラベリングにはアマ
シャムファルマシア社ＡｌｋＰｈｏｓＤｉｒｅｃ
ｔ、シグナルの検出には同社ＣＤＰ−Ｓｔａｒを使用
した。ＤＮＡ断片（ｐＢＳ／ＡＰＢ（７−４）＃１→Ｂ
ａｍＨＩ、ＰｓｔＩ消化：目的遺伝子全長約２ｋｂｐ）
をＨ_２Ｏで１０ｎｇ／μｌに希釈し、その１０μｌを熱
変性（９５℃で５分間）させて氷中で急冷した。その
後、反応バッファー１０μｌ、ラベリング・バッファー
２μｌ、クロスリンカー溶液（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅ
ｒｓｏｌｕｔｉｏｎ１：Ｈ_２Ｏ４）１０μｌを添
加して混合し、３７℃で３０分間反応させた。メンブレ
ン（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社Ｈｕｍａｎｍｕｌｔｉｔｉ
ｓｓｕｅｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ）をキット（Ａ
ｌｋＰｈｏｓＤｉｒｅｃｔ）付属のハイブリダイゼー
ション・バッファーで５５℃にて４５分間プレハイブリ
ダイゼーションした。続いて、ラベリングしたプローブ
の全量を、ハイブリダイゼーション・バッファー１３ｍ
ｌに混合し５５℃で一晩ハイブリダイゼーションさせ
た。その後、一次洗浄バッファーにより５５℃での１０
分間の洗浄を２回行い、次に二次洗浄バッファーで室温
にて５分間の洗浄を２回行った。洗浄後、検出試薬５０
０μｌを添加して室温で５分間反応させた後ラップで覆
いＸ線フィルム（Ｘ−ｒａｙｆｉｌｍ）（フジフィル
ム）に一晩露光した。露光後にフィルムを現像した。

【００７２】その結果、心臓、胎盤、肺、肝臓、骨格
筋、腎臓、膵臓で約５ｋｂのバンドが検出された（図１
０）。臓器によってシグナルの強さが異なり骨格筋、腎
臓、膵臓で強く認められた。

【００７３】

【発明の効果】ＧｅｎＢａｎｋのヒトｃＤＮＡライブラ
リーより選出したクローン（ＡＫ０２６６４４；Ｋａｔ
１１８５３）を基に全長ｃＤＮＡを決定して得られた遺
伝子はアミノペプチダーゼＢ活性を有する蛋白質をコー
ドすることが確認できた。この遺伝子はラットＡＰＢと
アミノ酸で８０％以上の相同性を示しており、ノーザン
ブロッティングの結果から各臓器での発現が認められ、
その発現パターンについてもラットＡＰＢと類似してい
た。ラットＡＰＢは、炎症やアレルギー反応の伝達物質
であるロイコトリエンＡ４の加水分解酵素と類似したモ
チーフを有しており、細胞膜内に存在し、細胞外にも分
泌される蛋白質である。本発明に係る遺伝子にもロイコ
トリエンＡ４加水分解酵素と類似したモチーフが３２５
番目のヒスチジンから３４８番目のグルタミン酸からな
る領域に存在していた。したがって、本蛋白質（ＡＰ
Ｂ）は炎症の場で重要な役割を担っていることが示唆さ
れ、本蛋白質の酵素阻害薬が抗炎症薬となる可能性が強
く示唆された。かくして、本発明に係るＡＰＢ、その由
来物であるペプチド、ならびにこれらをコードするポリ
ヌクレオチドは、ＡＰＢに関連する疾病、例えば炎症や
アレルギー疾患等、の予防・治療薬および／または診断
手段として有用である。

【００７４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> DAIICHI PHARMACEUTICAL CO., LTD <120> Aminopeptidase B <130> NP01-1042 <140> <141> <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 650 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Ser Gly Glu His Ser Pro Gly Ser Gly Ala Ala Arg Arg Pro 1 5 10 15 Leu His Ser Ala Gln Ala Val Asp Val Ala Ser Ala Ser Asn Phe Arg 20 25 30 Ala Phe Glu Leu Leu His Leu His Leu Asp Leu Arg Ala Glu Phe Gly 35 40 45 Pro Pro Gly Pro Gly Ala Gly Ser Arg Gly Leu Ser Gly Thr Ala Val 50 55 60 Leu Asp Leu Arg Cys Leu Glu Pro Glu Gly Ala Ala Glu Leu Arg Leu 65 70 75 80 Asp Ser His Pro Cys Leu Glu Val Thr Ala Ala Ala Leu Arg Arg Glu 85 90 95 Arg Pro Gly Ser Glu Glu Pro Pro Ala Glu Pro Val Ser Phe Tyr Thr 100 105 110 Gln Pro Phe Ser His Tyr Gly Gln Ala Leu Cys Val Ser Phe Pro Gln 115 120 125 Pro Cys Arg Ala Ala Glu Arg Leu Gln Val Leu Leu Thr Tyr Arg Val 130 135 140 Gly Glu Gly Pro Gly Val Cys Trp Leu Ala Pro Glu Gln Thr Ala Gly 145 150 155 160 Lys Lys Lys Pro Phe Val Tyr Thr Gln Gly Gln Ala Val Leu Asn Arg 165 170 175 Ala Phe Phe Pro Cys Phe Asp Thr Pro Ala Val Lys Tyr Lys Tyr Ser 180 185 190 Ala Leu Ile Glu Val Pro Asp Gly Phe Thr Ala Val Met Ser Ala Ser 195 200 205 Thr Trp Glu Lys Arg Gly Pro Asn Lys Phe Phe Phe Gln Met Cys Gln 210 215 220 Pro Ile Pro Ser Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Ile Gly Asp Leu Val Ser 225 230 235 240 Ala Glu Val Gly Pro Arg Ser Arg Val Trp Ala Glu Pro Cys Leu Ile 245 250 255 Asp Ala Ala Lys Glu Glu Tyr Asn Gly Val Ile Glu Glu Phe Leu Ala 260 265 270 Thr Gly Glu Lys Leu Phe Gly Pro Tyr Val Trp Gly Arg Tyr Asp Leu 275 280 285 Leu Phe Met Pro Pro Ser Phe Pro Phe Gly Gly Met Glu Asn Pro Cys 290 295 300 Leu Thr Phe Val Thr Pro Cys Leu Leu Ala Gly Asp Arg Ser Leu Ala 305 310 315 320 Asp Val Ile Ile His Glu Ile Ser His Ser Trp Phe Gly Asn Leu Val 325 330 335 Thr Asn Ala Asn Trp Gly Glu Phe Trp Leu Asn Glu Gly Phe Thr Met 340 345 350 Tyr Ala Gln Arg Arg Ile Ser Thr Ile Leu Phe Gly Ala Ala Tyr Thr 355 360 365 Cys Leu Glu Ala Ala Thr Gly Arg Ala Leu Leu Arg Gln His Met Asp 370 375 380 Ile Thr Gly Glu Glu Asn Pro Leu Asn Lys Leu Arg Val Lys Ile Glu 385 390 395 400 Pro Gly Val Asp Pro Asp Asp Thr Tyr Asn Glu Thr Pro Tyr Glu Lys 405 410 415 Gly Phe Cys Phe Val Ser Tyr Leu Ala His Leu Val Gly Asp Gln Asp 420 425 430 Gln Phe Asp Ser Phe Leu Lys Ala Tyr Val His Glu Phe Lys Phe Arg 435 440 445 Ser Ile Leu Ala Asp Asp Phe Leu Asp Phe Tyr Leu Glu Tyr Phe Pro 450 455 460 Glu Leu Lys Lys Lys Arg Val Asp Ile Ile Pro Gly Phe Glu Phe Asp 465 470 475 480 Arg Trp Leu Asn Thr Pro Gly Trp Pro Pro Tyr Leu Pro Asp Leu Ser 485 490 495 Pro Gly Asp Ser Leu Met Lys Pro Ala Glu Glu Leu Ala Gln Leu Trp 500 505 510 Ala Ala Glu Glu Leu Asp Met Lys Ala Ile Glu Ala Val Ala Ile Ser 515 520 525 Pro Trp Lys Thr Tyr Gln Leu Val Tyr Phe Leu Asp Lys Ile Leu Gln 530 535 540 Lys Ser Pro Leu Pro Pro Gly Asn Val Lys Lys Leu Gly Asp Thr Tyr 545 550 555 560 Pro Ser Ile Ser Asn Ala Arg Asn Ala Glu Leu Arg Leu Arg Trp Gly 565 570 575 Gln Ile Val Leu Lys Asn Asp His Gln Glu Asp Phe Trp Lys Val Lys 580 585 590 Glu Phe Leu His Asn Gln Gly Lys Gln Lys Tyr Thr Leu Pro Leu Tyr 595 600 605 His Ala Met Met Gly Gly Ser Glu Val Ala Gln Thr Leu Ala Lys Glu 610 615 620 Thr Phe Ala Ser Thr Ala Ser Gln Leu His Ser Asn Val Val Asn Tyr 625 630 635 640 Val Gln Gln Ile Val Ala Pro Lys Gly Ser 645 650 <210> 2 <211> 1953 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1953) <400> 2 atg gcg agc ggc gag cat tcc ccc ggc agc ggc gcg gcc cgg cgg ccg 48 Met Ala Ser Gly Glu His Ser Pro Gly Ser Gly Ala Ala Arg Arg Pro 1 5 10 15 ctg cac tcc gcg cag gct gtg gac gtg gcc tcg gcc tcc aac ttc cgg 96 Leu His Ser Ala Gln Ala Val Asp Val Ala Ser Ala Ser Asn Phe Arg 20 25 30 gcc ttt gag ctg ctg cac ttg cac ctg gac ctg cgg gct gag ttc ggg 144 Ala Phe Glu Leu Leu His Leu His Leu Asp Leu Arg Ala Glu Phe Gly 35 40 45 cct cca ggg ccc ggc gca ggg agc cgg ggg ctg agc ggc acc gcg gtc 192 Pro Pro Gly Pro Gly Ala Gly Ser Arg Gly Leu Ser Gly Thr Ala Val 50 55 60 ctg gac ctg cgc tgc ctg gag ccc gag ggc gcc gcc gag ctg cgg ctg 240 Leu Asp Leu Arg Cys Leu Glu Pro Glu Gly Ala Ala Glu Leu Arg Leu 65 70 75 80 gac tcg cac ccg tgc ctg gag gtg acg gcg gcg gcg ctg cgg cgg gag 288 Asp Ser His Pro Cys Leu Glu Val Thr Ala Ala Ala Leu Arg Arg Glu 85 90 95 cgg ccc ggc tcg gag gag ccg cct gcg gag ccc gtg agc ttc tac acg 336 Arg Pro Gly Ser Glu Glu Pro Pro Ala Glu Pro Val Ser Phe Tyr Thr 100 105 110 cag ccc ttc tcg cac tat ggc cag gcc ctg tgc gtg tcc ttc ccg cag 384 Gln Pro Phe Ser His Tyr Gly Gln Ala Leu Cys Val Ser Phe Pro Gln 115 120 125 ccc tgc cgc gcc gcc gag cgc ctc cag gtg ctg ctc acc tac cgc gtc 432 Pro Cys Arg Ala Ala Glu Arg Leu Gln Val Leu Leu Thr Tyr Arg Val 130 135 140 ggg gag gga ccc ggg gtt tgc tgg ttg gct ccc gag cag aca gca gga 480 Gly Glu Gly Pro Gly Val Cys Trp Leu Ala Pro Glu Gln Thr Ala Gly 145 150 155 160 aag aag aag ccc ttc gtg tac acc cag ggc cag gct gtc cta aac cgg 528 Lys Lys Lys Pro Phe Val Tyr Thr Gln Gly Gln Ala Val Leu Asn Arg 165 170 175 gcc ttc ttc cct tgc ttc gac acg cct gct gtt aaa tac aag tat tca 576 Ala Phe Phe Pro Cys Phe Asp Thr Pro Ala Val Lys Tyr Lys Tyr Ser 180 185 190 gct ctt att gag gtc cca gat ggc ttc aca gct gtg atg agt gct agc 624 Ala Leu Ile Glu Val Pro Asp Gly Phe Thr Ala Val Met Ser Ala Ser 195 200 205 acc tgg gag aag aga ggt cca aat aag ttc ttc ttc cag atg tgt cag 672 Thr Trp Glu Lys Arg Gly Pro Asn Lys Phe Phe Phe Gln Met Cys Gln 210 215 220 ccc atc ccc tcc tat ctg ata gct ttg gcc atc gga gat ctg gtt tcg 720 Pro Ile Pro Ser Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Ile Gly Asp Leu Val Ser 225 230 235 240 gct gaa gtt gga ccc agg agc cgg gtg tgg gct gag ccc tgc ctg att 768 Ala Glu Val Gly Pro Arg Ser Arg Val Trp Ala Glu Pro Cys Leu Ile 245 250 255 gat gct gcc aag gag gag tac aac ggg gtg ata gaa gaa ttt ttg gca 816 Asp Ala Ala Lys Glu Glu Tyr Asn Gly Val Ile Glu Glu Phe Leu Ala 260 265 270 aca gga gag aag ctt ttt gga cct tat gtt tgg gga agg tat gac ttg 864 Thr Gly Glu Lys Leu Phe Gly Pro Tyr Val Trp Gly Arg Tyr Asp Leu 275 280 285 ctc ttc atg cca ccg tcc ttt cca ttt gga gga atg gag aac cct tgt 912 Leu Phe Met Pro Pro Ser Phe Pro Phe Gly Gly Met Glu Asn Pro Cys 290 295 300 ctg acc ttt gtc acc ccc tgc ctg cta gct ggg gac cgc tcc ttg gca 960 Leu Thr Phe Val Thr Pro Cys Leu Leu Ala Gly Asp Arg Ser Leu Ala 305 310 315 320 gat gtc atc atc cat gag atc tcc cac agt tgg ttt ggg aac ctg gtc 1008 Asp Val Ile Ile His Glu Ile Ser His Ser Trp Phe Gly Asn Leu Val 325 330 335 acc aac gcc aac tgg ggt gaa ttc tgg ctc aat gaa ggt ttc acc atg 1056 Thr Asn Ala Asn Trp Gly Glu Phe Trp Leu Asn Glu Gly Phe Thr Met 340 345 350 tac gcc cag agg agg atc tcc acc atc ctc ttt ggc gct gcg tac acc 1104 Tyr Ala Gln Arg Arg Ile Ser Thr Ile Leu Phe Gly Ala Ala Tyr Thr 355 360 365 tgc ttg gag gct gca acg ggg cgg gct ctg ctg cgt caa cac atg gac 1152 Cys Leu Glu Ala Ala Thr Gly Arg Ala Leu Leu Arg Gln His Met Asp 370 375 380 atc act gga gag gaa aac cca ctc aac aag ctc cgc gtg aag att gaa 1200 Ile Thr Gly Glu Glu Asn Pro Leu Asn Lys Leu Arg Val Lys Ile Glu 385 390 395 400 cca ggc gtt gac ccg gac gac acc tat aat gag acc ccc tac gag aaa 1248 Pro Gly Val Asp Pro Asp Asp Thr Tyr Asn Glu Thr Pro Tyr Glu Lys 405 410 415 ggt ttc tgc ttt gtc tca tac ctg gcc cac ttg gtg ggt gat cag gat 1296 Gly Phe Cys Phe Val Ser Tyr Leu Ala His Leu Val Gly Asp Gln Asp 420 425 430 cag ttt gac agt ttt ctc aag gcc tat gtg cat gaa ttc aaa ttc cga 1344 Gln Phe Asp Ser Phe Leu Lys Ala Tyr Val His Glu Phe Lys Phe Arg 435 440 445 agc atc tta gcc gat gac ttt ctg gac ttc tac ttg gaa tat ttc cct 1392 Ser Ile Leu Ala Asp Asp Phe Leu Asp Phe Tyr Leu Glu Tyr Phe Pro 450 455 460 gag ctt aag aaa aag aga gtg gat atc att cca ggt ttt gag ttt gat 1440 Glu Leu Lys Lys Lys Arg Val Asp Ile Ile Pro Gly Phe Glu Phe Asp 465 470 475 480 cga tgg ctg aat acc ccc ggc tgg ccc ccg tac ctc cct gat ctc tcc 1488 Arg Trp Leu Asn Thr Pro Gly Trp Pro Pro Tyr Leu Pro Asp Leu Ser 485 490 495 cct ggg gac tca ctc atg aag cct gct gaa gag cta gcc caa ctg tgg 1536 Pro Gly Asp Ser Leu Met Lys Pro Ala Glu Glu Leu Ala Gln Leu Trp 500 505 510 gca gcc gag gag ctg gac atg aag gcc att gaa gcc gtg gcc atc tct 1584 Ala Ala Glu Glu Leu Asp Met Lys Ala Ile Glu Ala Val Ala Ile Ser 515 520 525 ccc tgg aag acc tac cag ctg gtc tac ttc ctg gat aag atc ctc cag 1632 Pro Trp Lys Thr Tyr Gln Leu Val Tyr Phe Leu Asp Lys Ile Leu Gln 530 535 540 aaa tcc cct ctc cct cct ggg aat gtg aaa aaa ctt gga gac aca tac 1680 Lys Ser Pro Leu Pro Pro Gly Asn Val Lys Lys Leu Gly Asp Thr Tyr 545 550 555 560 cca agt atc tca aat gcc cgg aat gca gag ctc cgg ctg cga tgg ggc 1728 Pro Ser Ile Ser Asn Ala Arg Asn Ala Glu Leu Arg Leu Arg Trp Gly 565 570 575 caa atc gtc ctt aag aac gac cac cag gaa gat ttc tgg aaa gtg aag 1776 Gln Ile Val Leu Lys Asn Asp His Gln Glu Asp Phe Trp Lys Val Lys 580 585 590 gag ttc ctg cat aac cag ggg aag cag aag tat aca ctt ccg ctg tac 1824 Glu Phe Leu His Asn Gln Gly Lys Gln Lys Tyr Thr Leu Pro Leu Tyr 595 600 605 cac gca atg atg ggt ggc agt gag gtg gcc cag acc ctc gcc aag gag 1872 His Ala Met Met Gly Gly Ser Glu Val Ala Gln Thr Leu Ala Lys Glu 610 615 620 act ttt gca tcc acc gcc tcc cag ctc cac agc aat gtt gtc aac tat 1920 Thr Phe Ala Ser Thr Ala Ser Gln Leu His Ser Asn Val Val Asn Tyr 625 630 635 640 gtc cag cag atc gtg gca ccc aag ggc agt tag 1953 Val Gln Gln Ile Val Ala Pro Lys Gly Ser 645 650

【図面の簡単な説明】

【図１】プライマーの設計に用いた遺伝子構造の模式
図である。

【図２】ｃＤＮＡライブラリーを用いたＰＣＲを示す
図である。

【図３】全長アミノペプチダーゼＢの構築を示す模式
図である。

【図４】プラスミドｐＤＯＮＲ２０１／ＡＰＢ＃４
の構築を示す図である。

【図５】プラスミドｐＤＥＳＴ１７／ｈＡＰＢ＃１
の構築を示す図である。

【図６】発現誘導の検討結果を示す図である。

【図７】ウェスタンブロッティング分析結果を示す図
である。

【図８】酵素活性を示す図である。

【図９】酵素活性に対する阻害剤の影響を示す図であ
る。

【図１０】組織発現の検討結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/19 ４Ｃ０８４Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 ４Ｃ０８５ 1/19 9/48 ４Ｈ０４５ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/37 9/48 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/37 33/50 Ｚ 1/68 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/15 Ｍ 33/50 33/566 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/00 Ａ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者井上竜也東京都江戸川区北葛西１丁目16番13号第一製薬株式会社東京研究開発センター内Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA11 BB50 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA14 CA04 CA09 CA11 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 HA11 4B050 CC01 CC03 DD11 LL01 LL03 4B063 QA01 QA08 QA18 QQ05 QQ13 QQ20 QQ36 QQ42 QQ52 QR08 QR16 QR33 QR55 QR57 QR59 QR62 QR74 QR80 QR82 QS05 QS25 QS26 QS34 QS36 QX02 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 BA01 CA33 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 DC50 NA14 ZB112 4C085 AA13 BB31 CC02 CC04 CC22 DD33 DD63 DD86 4H045 AA11 AA30 BA10 CA40 DA76 EA50 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の群より選ばれるアミノペプチダー
ゼＢ活性を有するペプチド；配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペ
プチド、前記のペプチドを含有するペプチド、および前記のペプチドと少なくとも約７０％のアミノ酸配
列上の相同性を有するペプチド。
【請求項２】下記の群より選ばれるＨ−アルギニン−
７−アミド−４−メチルクマリン・２塩酸を分解する活
性を有するペプチド；配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペ
プチド、前記のペプチドを含有するペプチド、および前記のペプチドと少なくとも約７０％のアミノ酸配
列上の相同性を有するペプチド。
【請求項３】請求項１もしくは２に記載のペプチドを
コードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
【請求項４】アミノペプチダーゼＢ活性、および／ま
たはＨ−アルギニン−７−アミド−４−メチルクマリン
・２塩酸を分解する活性を有するペプチドをコードす
る、配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるポリ
ヌクレオチドまたはその相補鎖。
【請求項５】請求項３もしくは４に記載のポリヌクレ
オチドまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下で
ハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
【請求項６】請求項３から５のいずれか１項に記載の
ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項７】プラスミドｐＤＯＮＲ２０１／ＡＰＢ
＃４。
【請求項８】プラスミドｐＤＥＳＴ１７／ｈＡＰＢ
＃１。
【請求項９】請求項６に記載の組換えベクターまたは
請求項７もしくは８に記載のプラスミドで形質転換され
た形質転換体。
【請求項１０】請求項９に記載の形質転換体を培養す
る工程を含む、請求項１または２に記載のペプチドの製
造方法。
【請求項１１】請求項１もしくは２に記載のペプチド
を免疫学的に認識する抗体。
【請求項１２】請求項１１に記載の抗体であって、ア
ミノペプチダーゼＢ活性を抑制する抗体。
【請求項１３】請求項１もしくは２に記載のペプチド
と相互作用してその活性を阻害もしくは促進する化合
物、および／または請求項３から５のいずれか１項に記
載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害も
しくは促進する化合物のスクリーニング方法であって、
請求項１もしくは２に記載のペプチド、請求項３から５
のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項６に
記載のベクター、請求項７もしくは８に記載のプラスミ
ド、請求項９に記載の形質転換体、または請求項１１も
しくは１２に記載の抗体のうちの、少なくともいずれか
一つを用いることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１４】請求項１もしくは２に記載のペプチド
と相互作用してその活性を阻害もしくは促進する化合
物、および／または請求項３から５のいずれか１項に記
載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害も
しくは促進する化合物の同定方法であって、化合物と該
ペプチドまたは該ポリヌクレオチドとの相互作用を可能
にする条件下で、該ペプチドまたは該ポリヌクレオチド
と化合物とを接触させ、次いで、化合物と該ペプチドま
たは該ポリヌクレオチドとの相互作用により生じるシグ
ナルの存在もしくは不存在または変化を検出することに
より、化合物が該ペプチドまたはポリヌクレオチドと相
互作用して、該ペプチドの活性または該ポリヌクレオチ
ドの発現を阻害または促進するかどうかを決定する方
法。
【請求項１５】請求項１もしくは２に記載のペプチド
と相互作用してその活性を阻害もしくは促進する化合
物、および／または請求項３から５のいずれか１項に記
載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害も
しくは促進する化合物の同定方法であって、請求項９に
記載の形質転換体と化合物とを接触させ、請求項１もし
くは２に記載のペプチドの発現の有無を検出することの
できるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を
用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在もし
くは不存在または変化を検出することにより、化合物が
請求項１もしくは２に記載のペプチドの発現を促進また
は阻害するかどうかを決定する方法。
【請求項１６】請求項１３から１５のいずれか１項に
記載の方法によって得られた化合物。
【請求項１７】請求項１もしくは２に記載のペプチド
と相互作用してその活性を阻害もしくは促進する化合
物、または請求項３から５のいずれか１項に記載のポリ
ヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害もしくは促
進する化合物。
【請求項１８】請求項１もしくは２に記載のペプチ
ド、請求項３から５のいずれか１項に記載のポリヌクレ
オチド、請求項６に記載のベクター、請求項７もしくは
８に記載のプラスミド、請求項９に記載の形質転換体、
請求項１１もしくは１２に記載の抗体、または請求項１
６もしくは１７に記載の化合物のうちの、少なくともい
ずれか一つを含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項１９】請求項１もしくは２に記載のペプチ
ド、請求項３から５のいずれか１項に記載のポリヌクレ
オチド、請求項６に記載のベクター、請求項７もしくは
８に記載のプラスミド、請求項９に記載の形質転換体、
請求項１１もしくは１２に記載の抗体、または請求項１
６もしくは１７に記載の化合物のうちの、少なくともい
ずれか一つを含有することを特徴とする抗炎症剤。
【請求項２０】請求項１もしくは２に記載のペプチド
の発現または活性に関連した炎症性疾患の診断のための
測定方法であって、（ａ）該ペプチドをコードしている
核酸および／または（ｂ）試料中の該ペプチドをマーカ
ーとして分析することを含む測定方法。
【請求項２１】請求項１もしくは２に記載のペプチ
ド、請求項３から５のいずれか１項に記載のポリヌクレ
オチド、または請求項１１もしくは１２に記載の抗体の
うちの、少なくとも１つを含んでなる、（ａ）該ペプチ
ドをコードしている核酸および／または（ｂ）試料中の
該ペプチドをマーカーとして分析することを含む測定方
法に使用する試薬キット。