JP2002355095A - 生体成分の測定方法およびそれに用いる試薬キット - Google Patents
生体成分の測定方法およびそれに用いる試薬キットInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 生体成分、特にホルミアルデヒド、または反
応中間体としてホルムアルデヒドを生成する、ホモシス
テイン、クレアチン、クレアチニン等の生体成分の、よ
り簡便且つ高感度な測定手段の提供。 【解決手段】 サイクリング反応によるホルムアルデヒ
ドの定量を可能にする新規グルタチオン依存性ホルムア
ルデヒド脱水素酵素、それを用いたホルムアルデヒドお
よび反応中間体としてホルムアルデヒドを生成する生体
成分の測定方法、及び当該方法に使用するための試薬キ
ット。チオール化合物に対して安定な新規ジメチルグリ
シンオキシダーゼ、ベタイン−ホモシステインメチル転
移酵素および該ジメチルグリシンオキシダーゼを用いた
ホモシステインの測定方法、及び当該方法に使用するた
めの試薬キット。
応中間体としてホルムアルデヒドを生成する、ホモシス
テイン、クレアチン、クレアチニン等の生体成分の、よ
り簡便且つ高感度な測定手段の提供。 【解決手段】 サイクリング反応によるホルムアルデヒ
ドの定量を可能にする新規グルタチオン依存性ホルムア
ルデヒド脱水素酵素、それを用いたホルムアルデヒドお
よび反応中間体としてホルムアルデヒドを生成する生体
成分の測定方法、及び当該方法に使用するための試薬キ
ット。チオール化合物に対して安定な新規ジメチルグリ
シンオキシダーゼ、ベタイン−ホモシステインメチル転
移酵素および該ジメチルグリシンオキシダーゼを用いた
ホモシステインの測定方法、及び当該方法に使用するた
めの試薬キット。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、グルタチオン依存
性ホルムアルデヒド脱水素酵素を用いた、ホルムアルデ
ヒドまたは反応中間体としてホルムアルデヒドを生成す
る化合物の、簡便で且つ高感度な測定方法、およびその
ための試薬キットに関する。さらに本発明は、中間生成
物としてホルムアルデヒドを経由する、クレアチニン、
クレアチンおよびホモシステイン等の生体成分を測定す
る方法、およびそのための試薬キットに関する。本発明
はまた、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素およ
びジメチルグリシンオキシダーゼを用いたホモシステイ
ンの測定方法およびそのための試薬キットに関する。さ
らに本発明は、上記の測定方法および試薬キットに好適
に用いられる新規酵素に関する。
性ホルムアルデヒド脱水素酵素を用いた、ホルムアルデ
ヒドまたは反応中間体としてホルムアルデヒドを生成す
る化合物の、簡便で且つ高感度な測定方法、およびその
ための試薬キットに関する。さらに本発明は、中間生成
物としてホルムアルデヒドを経由する、クレアチニン、
クレアチンおよびホモシステイン等の生体成分を測定す
る方法、およびそのための試薬キットに関する。本発明
はまた、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素およ
びジメチルグリシンオキシダーゼを用いたホモシステイ
ンの測定方法およびそのための試薬キットに関する。さ
らに本発明は、上記の測定方法および試薬キットに好適
に用いられる新規酵素に関する。
【０００２】
【従来の技術】ホルムアルデヒドは、蛋白質、膜、ＤＮ
Ａ等と反応性に富む細胞毒であり、吸引、内服すること
で種々の障害を引き起こすことが知られている。近年、
大気中、工業廃液、食品等に含有されるホルムアルデヒ
ドが問題視されており、これを簡便かつ正確に測定する
方法が要求されている。
Ａ等と反応性に富む細胞毒であり、吸引、内服すること
で種々の障害を引き起こすことが知られている。近年、
大気中、工業廃液、食品等に含有されるホルムアルデヒ
ドが問題視されており、これを簡便かつ正確に測定する
方法が要求されている。
【０００３】ホルムアルデヒドの測定法として、Ｈａｎ
ｚ試薬、ＣＴＡ試薬（J. Biol. Chem., 231, 813 (195
8)）、Ｐｕｒｐａｌｄ試薬（Anal. Biochem., 234(1),
50 (1996)）などを用いて比色分析する方法、フェニル
ヒドラジン、フェリシアン化カリウム、クロロホルム、
メタノールを組み合わせた試薬を用いる分析法が知られ
ている。しかし、これらの方法は、操作が煩雑で測定に
長時間を要する、或いは有害試薬を使用するなどの問題
点があった。この問題を解決する手段として、グルタチ
オン非依存性のホルムアルデヒド脱水素酵素（EC 2.1.
1.46）を用いる酵素法が開示されている（特開平５−４
２０００号公報、特開２０００−２２５０００号公
報）。これらの酵素法は、酵素反応によりホルムアルデ
ヒドから蟻酸を生成する際に、同時に生成される還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、若
しくは該補酵素のさらなる反応により生成される発色色
素を分析するものであるが、測定感度は還元型ＮＡＤや
色素の分子吸光係数に依存するため、微量のホルムアル
デヒドの測定には必ずしも十分とは言えない。
ｚ試薬、ＣＴＡ試薬（J. Biol. Chem., 231, 813 (195
8)）、Ｐｕｒｐａｌｄ試薬（Anal. Biochem., 234(1),
50 (1996)）などを用いて比色分析する方法、フェニル
ヒドラジン、フェリシアン化カリウム、クロロホルム、
メタノールを組み合わせた試薬を用いる分析法が知られ
ている。しかし、これらの方法は、操作が煩雑で測定に
長時間を要する、或いは有害試薬を使用するなどの問題
点があった。この問題を解決する手段として、グルタチ
オン非依存性のホルムアルデヒド脱水素酵素（EC 2.1.
1.46）を用いる酵素法が開示されている（特開平５−４
２０００号公報、特開２０００−２２５０００号公
報）。これらの酵素法は、酵素反応によりホルムアルデ
ヒドから蟻酸を生成する際に、同時に生成される還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、若
しくは該補酵素のさらなる反応により生成される発色色
素を分析するものであるが、測定感度は還元型ＮＡＤや
色素の分子吸光係数に依存するため、微量のホルムアル
デヒドの測定には必ずしも十分とは言えない。
【０００４】一方、微量物質の酵素による高感度定量法
として、測定対象とする基質や、基質に作用する酵素の
補酵素をサイクリング反応により増幅、定量する方法が
知られている（検査と技術、vol.27、No8、1999年7
月）。サイクリング法の１つとして、脱水素酵素と２種
類の補酵素（チオＮＡＤ類とＮＡＤＨ類、またはＮＡＤ
類とチオＮＡＤＨ類）を用いて、可逆反応を利用した酵
素サイクリング法による測定法が報告されている（特公
平６−６１２７８号公報、特公平６−７３４７７号公
報、特公平６−７３４７８号公報、特公平６−７３４７
９号公報、特許第３０２３７００号公報、特許第３０３
４９６９号公報、特許第３０３４９７９号公報、特許第
３０３４９８４号公報、特許第３０３４９８６号公報、
特許第３０３４９８７号公報、特許第３０３４９８８号
公報、特開平８−１０３２９８号公報）。
として、測定対象とする基質や、基質に作用する酵素の
補酵素をサイクリング反応により増幅、定量する方法が
知られている（検査と技術、vol.27、No8、1999年7
月）。サイクリング法の１つとして、脱水素酵素と２種
類の補酵素（チオＮＡＤ類とＮＡＤＨ類、またはＮＡＤ
類とチオＮＡＤＨ類）を用いて、可逆反応を利用した酵
素サイクリング法による測定法が報告されている（特公
平６−６１２７８号公報、特公平６−７３４７７号公
報、特公平６−７３４７８号公報、特公平６−７３４７
９号公報、特許第３０２３７００号公報、特許第３０３
４９６９号公報、特許第３０３４９７９号公報、特許第
３０３４９８４号公報、特許第３０３４９８６号公報、
特許第３０３４９８７号公報、特許第３０３４９８８号
公報、特開平８−１０３２９８号公報）。
【０００５】特開平４−３４１１９８号公報には、アル
コールデヒドロゲナーゼおよびチオＮＡＤ類とＮＡＤＨ
類、またはＮＡＤ類とチオＮＡＤＨ類を用いるアルコー
ル類またはアルデヒド類の高感度定量法が開示されてい
る。ここで用いられるアルコールデヒドロゲナーゼの代
表的な酵素として、下記の反応を触媒する酵素（EC 1.
1.1.1）が挙げられている。
コールデヒドロゲナーゼおよびチオＮＡＤ類とＮＡＤＨ
類、またはＮＡＤ類とチオＮＡＤＨ類を用いるアルコー
ル類またはアルデヒド類の高感度定量法が開示されてい
る。ここで用いられるアルコールデヒドロゲナーゼの代
表的な酵素として、下記の反応を触媒する酵素（EC 1.
1.1.1）が挙げられている。
【０００６】
【数１】
【０００７】しかしながら、D. SchomburgおよびD. Ste
phan編, 「酵素ハンドブック９（Enzyme Handbook
9）」（Springer-Verlag）には、本酵素は、基質として
メタノールを酸化するのみならず、その生成物であるホ
ルムアルデヒドをも酸化することが記載されている。ホ
ルムアルデヒドは水溶液中では水和して存在し、アルコ
ールの状態で存在するので、アルコールデヒドロデナー
ゼの被酸化基質となり、一部は酢酸まで酸化されて反応
系の外に放出されてしまう。したがって、この酵素を用
いてのホルムアルデヒドの高感度測定は成り立たない。
phan編, 「酵素ハンドブック９（Enzyme Handbook
9）」（Springer-Verlag）には、本酵素は、基質として
メタノールを酸化するのみならず、その生成物であるホ
ルムアルデヒドをも酸化することが記載されている。ホ
ルムアルデヒドは水溶液中では水和して存在し、アルコ
ールの状態で存在するので、アルコールデヒドロデナー
ゼの被酸化基質となり、一部は酢酸まで酸化されて反応
系の外に放出されてしまう。したがって、この酵素を用
いてのホルムアルデヒドの高感度測定は成り立たない。
【０００８】また、グルタチオン非依存性のホルムアル
デヒド脱水素酵素等のアルデヒド脱水素酵素は非可逆的
にホルムアルデヒドを酸化するので、同様にサイクリン
グ反応による高感度測定には適用できない。
デヒド脱水素酵素等のアルデヒド脱水素酵素は非可逆的
にホルムアルデヒドを酸化するので、同様にサイクリン
グ反応による高感度測定には適用できない。
【０００９】一方、分析科学の分野において、ホルムア
ルデヒドを中間生成物として経由して測定できる化合物
があることが知られている。中でも有用なものとして、
臨床検査におけるクレアチニン、クレアチンおよびホモ
システイン等の測定が挙げられる。
ルデヒドを中間生成物として経由して測定できる化合物
があることが知られている。中でも有用なものとして、
臨床検査におけるクレアチニン、クレアチンおよびホモ
システイン等の測定が挙げられる。
【００１０】クレアチニンは臨床検査において腎機能の
主要な診断マーカーである。また、クレアチンの測定
は、筋ジストロフィー症、甲状腺機能亢進症などの病態
解析に用いられる。これらの測定法としてはＪａｆｆｅ
法が主流であるが、特異性に関する問題点の指摘があっ
た。最近は、基質特異性の高いクレアチニンアミドハイ
ドロラ−ゼ、クレアチンアミジノハイドロラーゼ、サル
コシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼを用いた酵素法
も増加しているが、生体内に存在する還元物質の影響を
受ける可能性の指摘があった。また、酵素法においてペ
ルオキシダーゼの代わりにグルタチオン非依存性ホルム
アルデヒド脱水素酵素を用いて、サルコシンオキシダー
ゼ反応により生成するホルムアルデヒドを上記方法にて
分析する方法も報告されているが（Clin. Clim. Acta,
122, 181 (1982), Ann. Clin. Biochem., 29, 523 (199
2)）、上述のように、微量の測定には必ずしも十分では
なかった。
主要な診断マーカーである。また、クレアチンの測定
は、筋ジストロフィー症、甲状腺機能亢進症などの病態
解析に用いられる。これらの測定法としてはＪａｆｆｅ
法が主流であるが、特異性に関する問題点の指摘があっ
た。最近は、基質特異性の高いクレアチニンアミドハイ
ドロラ−ゼ、クレアチンアミジノハイドロラーゼ、サル
コシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼを用いた酵素法
も増加しているが、生体内に存在する還元物質の影響を
受ける可能性の指摘があった。また、酵素法においてペ
ルオキシダーゼの代わりにグルタチオン非依存性ホルム
アルデヒド脱水素酵素を用いて、サルコシンオキシダー
ゼ反応により生成するホルムアルデヒドを上記方法にて
分析する方法も報告されているが（Clin. Clim. Acta,
122, 181 (1982), Ann. Clin. Biochem., 29, 523 (199
2)）、上述のように、微量の測定には必ずしも十分では
なかった。
【００１１】ホモシステインは、生体内では必須アミノ
酸であるメチオニンが代謝を受けて生成されるＳＨ基を
有するアミノ酸であるが、シスタチオニンβ−シンター
ゼによってさらに代謝されるため、通常は低濃度で生体
内に存在する。血中ホモシステイン濃度の上昇をもたら
すこれら代謝酵素の遺伝疾患であるホモシスチン尿症が
動脈硬化症と関連のあることが知られており、近年で
は、正常値より若干高いレベルのホモシステイン濃度に
おいても脳梗塞、心筋梗塞、深部静脈血栓症（いわゆる
エコノミークラス症候群）と関連付けられることが明ら
かにされたことから、現在では、血中ホモシステイン濃
度がこれら疾患の独立した危険因子として注目されてい
る。
酸であるメチオニンが代謝を受けて生成されるＳＨ基を
有するアミノ酸であるが、シスタチオニンβ−シンター
ゼによってさらに代謝されるため、通常は低濃度で生体
内に存在する。血中ホモシステイン濃度の上昇をもたら
すこれら代謝酵素の遺伝疾患であるホモシスチン尿症が
動脈硬化症と関連のあることが知られており、近年で
は、正常値より若干高いレベルのホモシステイン濃度に
おいても脳梗塞、心筋梗塞、深部静脈血栓症（いわゆる
エコノミークラス症候群）と関連付けられることが明ら
かにされたことから、現在では、血中ホモシステイン濃
度がこれら疾患の独立した危険因子として注目されてい
る。
【００１２】ホモシステインの測定法は、これまでＨＰ
ＬＣを用いた方法が標準法として用いられており（Cli
n. Chem., 39, 1590 (1993)）、種々の改良法も報告さ
れているが、ＨＰＬＣを用いる方法では、精巧な分析装
置を必要とする上、多量の検体を扱うには不適であると
いう欠点がある。ＨＰＬＣによる分離を要しない方法と
しては、ホモシステインをアデノシン、フルオレセイン
標識Ｓ−アデノシルホモシステイン存在下でＳ−アデノ
シルホモシステイン加水分解酵素と反応させ、反応系に
存在するＳ−アデノシルホモシステインを、抗Ｓ−アデ
ノシルホモシステイン抗体を用いて蛍光偏向イムノアッ
セイにより計測することで、ホモシステインを測定する
方法（特表平８−５０６４７８号公報）などが知られて
いる。また最近、酵素法として、ホモシステインをホモ
システインデスルフラーゼで反応させ、生成するアンモ
ニア、α−ケト酸または硫化水素を測定する方法（特表
２０００−５０２２６２号公報）、ホモシステインに対
して分解作用を有するＬ−メチオニンγ−リアーゼやｏ
−アセチルホモセリン−リアーゼを用いて、チオール化
合物の存在下で生成する硫化水素またはチオール化合物
置換ホモシステインを測定する方法（特開２０００−１
６６５９７号公報）、ホモシステインのγ位メルカプト
基と置換可能な求核試薬の存在下、γ−置換−α−アミ
ノ酪酸合成酵素によりホモシステインから生成する、γ
−置換−α−アミノ酪酸または硫化水素を定量する方法
（特開２０００−２２８９９８号公報）なども報告され
ている。
ＬＣを用いた方法が標準法として用いられており（Cli
n. Chem., 39, 1590 (1993)）、種々の改良法も報告さ
れているが、ＨＰＬＣを用いる方法では、精巧な分析装
置を必要とする上、多量の検体を扱うには不適であると
いう欠点がある。ＨＰＬＣによる分離を要しない方法と
しては、ホモシステインをアデノシン、フルオレセイン
標識Ｓ−アデノシルホモシステイン存在下でＳ−アデノ
シルホモシステイン加水分解酵素と反応させ、反応系に
存在するＳ−アデノシルホモシステインを、抗Ｓ−アデ
ノシルホモシステイン抗体を用いて蛍光偏向イムノアッ
セイにより計測することで、ホモシステインを測定する
方法（特表平８−５０６４７８号公報）などが知られて
いる。また最近、酵素法として、ホモシステインをホモ
システインデスルフラーゼで反応させ、生成するアンモ
ニア、α−ケト酸または硫化水素を測定する方法（特表
２０００−５０２２６２号公報）、ホモシステインに対
して分解作用を有するＬ−メチオニンγ−リアーゼやｏ
−アセチルホモセリン−リアーゼを用いて、チオール化
合物の存在下で生成する硫化水素またはチオール化合物
置換ホモシステインを測定する方法（特開２０００−１
６６５９７号公報）、ホモシステインのγ位メルカプト
基と置換可能な求核試薬の存在下、γ−置換−α−アミ
ノ酪酸合成酵素によりホモシステインから生成する、γ
−置換−α−アミノ酪酸または硫化水素を定量する方法
（特開２０００−２２８９９８号公報）なども報告され
ている。
【００１３】しかし、イムノアッセイ法でも、一般の生
化学検査に比べて時間、費用を要することが知られてお
り、短時間に多数の検体を安価に分析するのには好適と
はいえない。また、従来の酵素反応を用いた分析法で
は、一般に血中ホモシステイン量が正常値で１０μＭ程
度若しくはそれ以下と微量であるため測定感度が不足し
ていたり、あるいは使用する酵素の基質特異性により、
検体中のホモシステイン以外の物質に作用するなどの点
で、正確なホモシステイン量の測定には十分であるとは
言えない。
化学検査に比べて時間、費用を要することが知られてお
り、短時間に多数の検体を安価に分析するのには好適と
はいえない。また、従来の酵素反応を用いた分析法で
は、一般に血中ホモシステイン量が正常値で１０μＭ程
度若しくはそれ以下と微量であるため測定感度が不足し
ていたり、あるいは使用する酵素の基質特異性により、
検体中のホモシステイン以外の物質に作用するなどの点
で、正確なホモシステイン量の測定には十分であるとは
言えない。
【００１４】服部と川村（特開２００１−１７１９８）
は、ホモシステインと他の物質とを基質とする転移酵素
を、当該他の基質とともにホモシステインを含む試料に
作用させて、生成する化合物を測定することにより、ホ
モシステインをより高感度且つ高精度に測定できること
を開示している。特に、転移酵素としてベタイン−ホモ
システインメチル転移酵素、および他の基質としてベタ
インを使用し、生成するジメチルグリシンを、ジメチル
グリシンオキシダーゼを用いて更にサルコシン、ホルム
アルデヒドおよび過酸化水素にまで分解し、これらの化
合物のいずれかを測定することにより、ホモシステイン
を特に高感度且つ高精度に測定できることが記載されて
いる。しかしながら、生体試料において、ホモシステイ
ンの多くは、ジスルフィド結合により蛋白質やチオール
基を有する他のアミノ酸と結合した状態で存在するた
め、総ホモシステインの測定は還元条件下で行う必要が
あるが、還元条件下で十分に安定なジメチルグリシンオ
キシダーゼはこれまでに報告されておらず、したがっ
て、かかる条件下では試薬性能の低下を引き起こす可能
性があった。
は、ホモシステインと他の物質とを基質とする転移酵素
を、当該他の基質とともにホモシステインを含む試料に
作用させて、生成する化合物を測定することにより、ホ
モシステインをより高感度且つ高精度に測定できること
を開示している。特に、転移酵素としてベタイン−ホモ
システインメチル転移酵素、および他の基質としてベタ
インを使用し、生成するジメチルグリシンを、ジメチル
グリシンオキシダーゼを用いて更にサルコシン、ホルム
アルデヒドおよび過酸化水素にまで分解し、これらの化
合物のいずれかを測定することにより、ホモシステイン
を特に高感度且つ高精度に測定できることが記載されて
いる。しかしながら、生体試料において、ホモシステイ
ンの多くは、ジスルフィド結合により蛋白質やチオール
基を有する他のアミノ酸と結合した状態で存在するた
め、総ホモシステインの測定は還元条件下で行う必要が
あるが、還元条件下で十分に安定なジメチルグリシンオ
キシダーゼはこれまでに報告されておらず、したがっ
て、かかる条件下では試薬性能の低下を引き起こす可能
性があった。
【００１５】一方、酵素サイクリング法を利用したホモ
システイン測定法として、シスタチオニンβ−シンター
ゼとシスタチオニンβ−リアーゼにより生成するピルビ
ン酸、アンモニアを測定する方法（ＵＳ６１７４６９
６）、ホモシステインデスルフラーゼと２−ケト酪酸脱
水素酵素を用いて、生成されるＮＡＤ類または消費され
るチオＮＡＤ類を分析する方法（特開２００１−１６１
３９９，特開２００１−１４９０９２）などが知られて
いるが、生体内でのホモシステイン量を考慮すると更に
高感度で測定できる方法が望ましい。
システイン測定法として、シスタチオニンβ−シンター
ゼとシスタチオニンβ−リアーゼにより生成するピルビ
ン酸、アンモニアを測定する方法（ＵＳ６１７４６９
６）、ホモシステインデスルフラーゼと２−ケト酪酸脱
水素酵素を用いて、生成されるＮＡＤ類または消費され
るチオＮＡＤ類を分析する方法（特開２００１−１６１
３９９，特開２００１−１４９０９２）などが知られて
いるが、生体内でのホモシステイン量を考慮すると更に
高感度で測定できる方法が望ましい。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の第１
の目的は、ホルムアルデヒド、または測定系における反
応中間体としてホルムアルデヒドが生成する、ホモシス
テイン、クレアチニン、クレアチン等の化合物の、高感
度且つ簡便な測定手段を提供することである。また、本
発明の第２の目的は、ＨＰＬＣやイムノアッセイを用い
ずに、高感度且つ簡便にホモシステインを測定する手段
を提供することである。
の目的は、ホルムアルデヒド、または測定系における反
応中間体としてホルムアルデヒドが生成する、ホモシス
テイン、クレアチニン、クレアチン等の化合物の、高感
度且つ簡便な測定手段を提供することである。また、本
発明の第２の目的は、ＨＰＬＣやイムノアッセイを用い
ずに、高感度且つ簡便にホモシステインを測定する手段
を提供することである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の第
１の課題を解決すべく、酵素サイクリング法を用いたホ
ルムアルデヒドの高感度測定法の確立を目標とした。そ
こでまず、当該方法に使用し得る酵素として、ホルムア
ルデヒドに可逆的に作用するグルタチオン依存性ホルム
アルデヒド脱水素酵素（EC 1.2.1.1）に着目して、鋭意
研究を重ねた結果、２種類の異なる酸化還元物質を補酵
素として利用することができ、且つ両者に対する反応性
のバランスがサイクリング反応の進行を可能ならしめる
ものである、新規なグルタチオン依存性ホルムアルデヒ
ド脱水素酵素をスクリーニングすることに成功した。さ
らに、この酵素を、グルタチオン、酸化型の補酵素およ
び還元型の他の補酵素とともに試料に作用させ、該酵素
反応によるいずれかの補酵素量の変化を測定することに
より、ホルムアルデヒド、並びに反応中間体としてホル
ムアルデヒドを生成するホモシステインやクレアチニ
ン、クレアチン等を、高感度且つ簡便に測定できること
を確認した。
１の課題を解決すべく、酵素サイクリング法を用いたホ
ルムアルデヒドの高感度測定法の確立を目標とした。そ
こでまず、当該方法に使用し得る酵素として、ホルムア
ルデヒドに可逆的に作用するグルタチオン依存性ホルム
アルデヒド脱水素酵素（EC 1.2.1.1）に着目して、鋭意
研究を重ねた結果、２種類の異なる酸化還元物質を補酵
素として利用することができ、且つ両者に対する反応性
のバランスがサイクリング反応の進行を可能ならしめる
ものである、新規なグルタチオン依存性ホルムアルデヒ
ド脱水素酵素をスクリーニングすることに成功した。さ
らに、この酵素を、グルタチオン、酸化型の補酵素およ
び還元型の他の補酵素とともに試料に作用させ、該酵素
反応によるいずれかの補酵素量の変化を測定することに
より、ホルムアルデヒド、並びに反応中間体としてホル
ムアルデヒドを生成するホモシステインやクレアチニ
ン、クレアチン等を、高感度且つ簡便に測定できること
を確認した。
【００１８】一方で、本発明者らは、上記の第２の課題
を解決する手段として、ベタイン−ホモシステインメチ
ル転移酵素とジメチルグリシンオキシダーゼを用いる測
定系に着目し、当該測定系における使用に適した特性を
有するジメチルグリシンオキシダーゼを鋭意探索した結
果、チオール化合物に対して耐性であり、且つ従来の酵
素に比べてジメチルグリシンに対するＫm値の小さい、
新規なジメチルグリシンオキシダーゼを単離精製するこ
とに成功した。さらに、本酵素を上記測定系に適用した
ところ、ホモシステインをさらに高感度且つ高精度に測
定できることを確認して、本発明を完成するに至った。
を解決する手段として、ベタイン−ホモシステインメチ
ル転移酵素とジメチルグリシンオキシダーゼを用いる測
定系に着目し、当該測定系における使用に適した特性を
有するジメチルグリシンオキシダーゼを鋭意探索した結
果、チオール化合物に対して耐性であり、且つ従来の酵
素に比べてジメチルグリシンに対するＫm値の小さい、
新規なジメチルグリシンオキシダーゼを単離精製するこ
とに成功した。さらに、本酵素を上記測定系に適用した
ところ、ホモシステインをさらに高感度且つ高精度に測
定できることを確認して、本発明を完成するに至った。
【００１９】即ち、本発明は以下のような構成からな
る。 （１）ＮＡＤに対する反応性に対してのチオＮＡＤに対
する反応性の比が３０％以上、好ましくは６０％以上で
あるグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素、
グルタチオンおよび酸化型補酵素を試料に接触させ、該
酵素反応より生成した化合物を分析することを特徴とす
るホルムアルデヒドの測定方法。 （２）グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素
が、さらに以下の理化学的性質を有するものである、上
記（１）のホルムアルデヒドの測定方法。 (a) 作用：ＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、チオ
ＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる１つの酸化型補酵素
および還元型グルタチオンの存在下にホルムアルデヒド
に作用して、Ｓ−ホルミルグルタチオンおよび還元型補
酵素を生成する。 (b) 至適ｐＨ：約７．５〜約８．５ (c) ｐＨ安定性：約６．０〜約９．０ (d) 熱安定性：約４０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間処
理） （３）グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素
が、微生物、好ましくはメタノール資化性酵母、より好
ましくはハンゼヌラ（Hansenula）属に属する酵母、就
中ハンゼヌラ・ノンファーメンタンス（Hansenula nonf
ermentans）ＩＦＯ１４７３株由来である、上記（１）
または（２）のホルムアルデヒドの測定方法。 （４）ＮＡＤに対する反応性に対してのチオＮＡＤに対
する反応性の比が３０％以上であるグルタチオン依存性
ホルムアルデヒド脱水素酵素、グルタチオン、チオＮＡ
Ｄ類およびチオＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる１つ
の化合物、並びに還元型ＮＡＤ類および還元型ＮＡＤＰ
類からなる群より選ばれる1つの化合物を試料に接触さ
せて、サイクリング反応を行わせしめ、該反応により変
化した化合物の量を分析することを特徴とする、ホルム
アルデヒドの測定方法。 （５）ＮＡＤに対する反応性に対してのチオＮＡＤに対
する反応性の比が３０％以上であるグルタチオン依存性
ホルムアルデヒド脱水素酵素、グルタチオン、還元型チ
オＮＡＤ類および還元型チオＮＡＤＰ類からなる群より
選ばれる1つの化合物、並びにＮＡＤ類およびＮＡＤＰ
類からなる群より選ばれる1つの化合物を試料に接触さ
せて、サイクリング反応を行わせしめ、該反応により変
化した化合物の量を分析することを特徴とする、ホルム
アルデヒドの測定方法。 （６）生成した還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオ
ＮＡＤ類化合物の量を分析することを特徴とする、上記
（４）のホルムアルデヒドの測定方法。 （７）ホルムアルデヒドの最低検出感度が１μｍｏｌ／
Ｌ以下である、上記（４）〜（６）のいずれかのホルム
アルデヒドの測定方法。 （８）反応中間体としてホルムアルデヒト゛を生成する生
体成分の測定方法において、生成したホルムアルデヒド
を上記（１）〜（７）のいずれかの方法により分析する
ことを特徴とする、該生体成分の測定方法。 （９）ベタイン、ベタイン−ホモシステインメチル転移
酵素、ジメチルグリシンオキシダーゼおよび必要に応じ
てサルコシンオキシダーゼを試料に接触させ、該酵素反
応により生成したホルムアルデヒドを、上記（１）〜
（７）のいずれかの方法により測定することを特徴とす
る、ホモシステインの測定方法。 （１０）クレアチンアミジノハイドロラーゼ、サルコシ
ンオキシダーゼ、および必要に応じてクレアチニンアミ
ドハイドロラーゼを作用させ、該酵素反応により生成し
たホルムアルデヒドを上記（１）〜（７）のいずれか方
法により測定することを特徴とする、クレアチンまたは
クレアチニンの測定方法。 （１１）ベタイン、ベタイン−ホモシステインメチル転
移酵素、チオール化合物に対し安定なジメチルグリシン
オキシダーゼおよび必要に応じてサルコシンオキシダー
ゼを試料に接触させ、該酵素反応により生成した過酸化
水素を、ペルオキシダーゼ存在下、酸化系発色試薬およ
び必要に応じてカップラーと反応させ、生成する色素を
測定することを特徴とする、ホモシステインの測定方
法。 （１２）ベタイン、ベタイン−ホモシステインメチル転
移酵素、チオール化合物に対し安定なジメチルグリシン
オキシダーゼおよび必要に応じてサルコシンオキシダー
ゼを試料に接触させ、該酵素反応により生成したホルム
アルデヒドを、ホルムアルデヒド脱水素酵素および酸化
型補酵素と反応させ、生成する還元型補酵素を測定する
ことを特徴とする、ホモシステインの測定方法。 （１３）ベタイン、ベタイン−ホモシステインメチル転
移酵素、チオール化合物に対し安定なジメチルグリシン
オキシダーゼおよび必要に応じてサルコシンオキシダー
ゼを試料に接触させ、該酵素反応により生成したホルム
アルデヒドを、グルタチオン、グルタチオン依存性ホル
ムアルデヒド脱水素酵素および酸化型補酵素と反応さ
せ、生成する還元型補酵素を測定することを特徴とす
る、ホモシステインの測定方法。 （１４）チオール化合物が、ジチオスレイトール、ジチ
オエリスリトール、２−メルカプトエタノール、２−メ
ルカプトエタンスルホン酸、２−メルカプトエチルアミ
ン、システイン、ホモシステイン、Ｎ−アセチルシステ
イン、チオグリセロール、チオグリコール酸、還元型グ
ルタチオンまたはこれらの塩から選択される少なくとも
１種、好ましくはジチオスレイトールであり、より好ま
しくは、ジチオスレイトール非存在下に対し、０．０５
ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール存在下で、少なくとも
５０％酵素活性が保持されるジメチルグリシンオキシダ
ーゼを用いることを特徴とする、上記（１１）〜（１
３）のいずれかのホモシステインの測定方法。 （１５）ジメチルグリシンオキシダーゼが、さらに以下
の理化学的性質を有する酵素である、上記（１１）〜
（１４）のいずれかのホモシステインの測定方法。 (a) 作用：酸素の存在下にジメチルグリシンに作用し
て，サルコシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を
生成する。 (b) ジメチルグリシンに対するＫm値：１５ｍＭ以下 （１６）ジメチルグリシンオキシダーゼが、微生物、好
ましくはアルスロバクター属（Arthrobacter）またはス
トレプトマイセス属（Streptomyces）に属する微生物、
より好ましくはアルスロバクター・ニコチアナエ（Arth
robacter nicotianae）ＩＦＯ１４２３４株またはスト
レプトマイセス・ミュータビリス（Streptomyces mutab
ilis）ＩＦＯ１２８００株由来である、上記（１１）〜
（１５）のいずれかのホモシステインの測定方法。 （１７）ホモシステインの最低検出感度が１μｍｏｌ／
Ｌ以下である、上記（１３）〜（１６）のいずれかのホ
モシステインの測定方法。 （１８）以下の理化学的性質を有するグルタチオン依存
性ホルムアルデヒド脱水素酵素。 (a) 作用：ＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、チオ
ＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる１つの補酵素、還元
型グルタチオンの存在下にホルムアルデヒドに作用し
て、Ｓ−ホルミルグルタチオン、還元型補酵素を生成す
る。 (b) ＮＡＤに対する反応性に対してのチオＮＡＤに対す
る反応性の比が３０％以上である。 (c) 至適ｐＨ：約７．５〜約８．５ (d) ｐＨ安定性：約６．０〜約９．０ (e) 熱安定性：約４０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間処
理） （１９）微生物、好ましくはメタノール資化性酵母、よ
り好ましくはハンゼヌラ属に属する酵母、就中ハンゼヌ
ラ・ノンファーメンタンスＩＦＯ１４７３株由来であ
る、上記（１８）のグルタチオン依存性ホルムアルデヒ
ド脱水素酵素。 （２０）以下の理化学的性質を有するジメチルグリシン
オキシダーゼ。 (a) 作用：酸素の存在下にジメチルグリシンに作用し
て，サルコシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を
生成する。 (b) ジチオスレイトール非存在下に対し、０．０５ｍｍ
ｏｌ／Ｌジチオスレイトール存在下で、少なくとも５０
％酵素活性が保持される。 (c) ジメチルグリシンに対するＫm値：１５ｍＭ以下 （２１）微生物、好ましくはアルスロバクター属または
ストレプトマイセス属に属する微生物、より好ましくは
アルスロバクター・ニコチアナエＩＦＯ１４２３４株ま
たはストレプトマイセス・ミュータビリスＩＦＯ１２８
００株由来である、上記（２０）のジメチルグリシンオ
キシダーゼ。 （２２）緩衝液、グルタチオン、ＮＡＤに対する反応性
に対してのチオＮＡＤに対する反応性の比が３０％以上
であるグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵
素、および該酵素反応により生成する化合物を分析する
ための試薬を少なくとも含有してなることを特徴とする
ホルムアルデヒド測定用試薬キット。 （２３）緩衝液、グルタチオン、ＮＡＤに対する反応性
に対してのチオＮＡＤに対する反応性の比が３０％以上
であるグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵
素、チオＮＡＤ類およびチオＮＡＤＰ類からなる群より
選ばれる1つの化合物、並びに還元型ＮＡＤ類および還
元型ＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる1つの化合物を
少なくとも含有してなることを特徴とするホルムアルデ
ヒド測定用試薬キット。 （２４）緩衝液、グルタチオン、ＮＡＤに対する反応性
に対してのチオＮＡＤに対する反応性の比が３０％以上
であるグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵
素、還元型チオＮＡＤ類および還元型チオＮＡＤＰ類か
らなる群より選ばれる1つの化合物、並びにＮＡＤ類お
よびＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる1つの化合物を
少なくとも含有してなることを特徴とするホルムアルデ
ヒド測定用試薬キット。 （２５）グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵
素が、上記（１８）または（１９）の酵素である、上記
（２２）〜（２４）のいずれかのホルムアルデヒド測定
用試薬キット。 （２６）上記（２２）〜（２５）のいずれかに記載の試
薬に加えて、ベタイン、ベタイン−ホモシステインメチ
ル転移酵素、ジメチルグリシンオキシダーゼおよび必要
に応じてサルコシンオキシダーゼを更に含有してなるこ
とを特徴とする、ホモシステイン測定用試薬キット。 （２７）上記（２２）〜（２５）のいずれかに記載の試
薬に加えて、クレアチンアミジノハイドロラーゼ、サル
コシンオキシダーゼおよび必要に応じてクレアチニンア
ミドハイドロラーゼを更に含有してなることを特徴とす
る、クレアチニンまたはクレアチン測定用試薬キット。 （２８）緩衝液、ベタイン、ベタイン−ホモシステイン
メチル転移酵素、チオール化合物に対し安定なジメチル
グリシンオキシダーゼおよび必要に応じてサルコシンオ
キシダーゼ、並びに該酵素反応により生成した過酸化水
素を測定するための試薬を含有してなることを特徴とす
る、ホモシステイン測定用試薬キット。 （２９）過酸化水素を測定するための試薬として、ペル
オキシダーゼ、酸化系発色試薬および必要に応じてカッ
プラーを含有することを特徴とする、上記（２８）のホ
モシステイン測定用試薬キット。 （３０）緩衝液、ベタイン、ベタイン−ホモシステイン
メチル転移酵素、チオール化合物に対し安定なジメチル
グリシンオキシダーゼおよび必要に応じてサルコシンオ
キシダーゼ、並びに該酵素反応により生成したホルムア
ルデヒドを測定するための試薬を含有してなることを特
徴とする、ホモシステイン測定用試薬キット。 （３１）ホルムアルデヒドを測定するための試薬とし
て、ホルムアルデヒド脱水素酵素および酸化型補酵素を
含有することを特徴とする、上記（３０）のホモシステ
イン測定用試薬キット。 （３２）ホルムアルデヒドを測定するための試薬とし
て、グルタチオン、グルタチオン依存性ホルムアルデヒ
ド脱水素酵素および酸化型補酵素を含有することを特徴
とする、上記（３０）のホモシステイン測定用試薬キッ
ト。 （３３）ジメチルグリシンオキシダーゼが、上記（２
０）または（２１）のいずれかの酵素である、上記（２
８）〜（３２）のいずれかのホモシステイン測定用試薬
キット。
る。 （１）ＮＡＤに対する反応性に対してのチオＮＡＤに対
する反応性の比が３０％以上、好ましくは６０％以上で
あるグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素、
グルタチオンおよび酸化型補酵素を試料に接触させ、該
酵素反応より生成した化合物を分析することを特徴とす
るホルムアルデヒドの測定方法。 （２）グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素
が、さらに以下の理化学的性質を有するものである、上
記（１）のホルムアルデヒドの測定方法。 (a) 作用：ＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、チオ
ＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる１つの酸化型補酵素
および還元型グルタチオンの存在下にホルムアルデヒド
に作用して、Ｓ−ホルミルグルタチオンおよび還元型補
酵素を生成する。 (b) 至適ｐＨ：約７．５〜約８．５ (c) ｐＨ安定性：約６．０〜約９．０ (d) 熱安定性：約４０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間処
理） （３）グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素
が、微生物、好ましくはメタノール資化性酵母、より好
ましくはハンゼヌラ（Hansenula）属に属する酵母、就
中ハンゼヌラ・ノンファーメンタンス（Hansenula nonf
ermentans）ＩＦＯ１４７３株由来である、上記（１）
または（２）のホルムアルデヒドの測定方法。 （４）ＮＡＤに対する反応性に対してのチオＮＡＤに対
する反応性の比が３０％以上であるグルタチオン依存性
ホルムアルデヒド脱水素酵素、グルタチオン、チオＮＡ
Ｄ類およびチオＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる１つ
の化合物、並びに還元型ＮＡＤ類および還元型ＮＡＤＰ
類からなる群より選ばれる1つの化合物を試料に接触さ
せて、サイクリング反応を行わせしめ、該反応により変
化した化合物の量を分析することを特徴とする、ホルム
アルデヒドの測定方法。 （５）ＮＡＤに対する反応性に対してのチオＮＡＤに対
する反応性の比が３０％以上であるグルタチオン依存性
ホルムアルデヒド脱水素酵素、グルタチオン、還元型チ
オＮＡＤ類および還元型チオＮＡＤＰ類からなる群より
選ばれる1つの化合物、並びにＮＡＤ類およびＮＡＤＰ
類からなる群より選ばれる1つの化合物を試料に接触さ
せて、サイクリング反応を行わせしめ、該反応により変
化した化合物の量を分析することを特徴とする、ホルム
アルデヒドの測定方法。 （６）生成した還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオ
ＮＡＤ類化合物の量を分析することを特徴とする、上記
（４）のホルムアルデヒドの測定方法。 （７）ホルムアルデヒドの最低検出感度が１μｍｏｌ／
Ｌ以下である、上記（４）〜（６）のいずれかのホルム
アルデヒドの測定方法。 （８）反応中間体としてホルムアルデヒト゛を生成する生
体成分の測定方法において、生成したホルムアルデヒド
を上記（１）〜（７）のいずれかの方法により分析する
ことを特徴とする、該生体成分の測定方法。 （９）ベタイン、ベタイン−ホモシステインメチル転移
酵素、ジメチルグリシンオキシダーゼおよび必要に応じ
てサルコシンオキシダーゼを試料に接触させ、該酵素反
応により生成したホルムアルデヒドを、上記（１）〜
（７）のいずれかの方法により測定することを特徴とす
る、ホモシステインの測定方法。 （１０）クレアチンアミジノハイドロラーゼ、サルコシ
ンオキシダーゼ、および必要に応じてクレアチニンアミ
ドハイドロラーゼを作用させ、該酵素反応により生成し
たホルムアルデヒドを上記（１）〜（７）のいずれか方
法により測定することを特徴とする、クレアチンまたは
クレアチニンの測定方法。 （１１）ベタイン、ベタイン−ホモシステインメチル転
移酵素、チオール化合物に対し安定なジメチルグリシン
オキシダーゼおよび必要に応じてサルコシンオキシダー
ゼを試料に接触させ、該酵素反応により生成した過酸化
水素を、ペルオキシダーゼ存在下、酸化系発色試薬およ
び必要に応じてカップラーと反応させ、生成する色素を
測定することを特徴とする、ホモシステインの測定方
法。 （１２）ベタイン、ベタイン−ホモシステインメチル転
移酵素、チオール化合物に対し安定なジメチルグリシン
オキシダーゼおよび必要に応じてサルコシンオキシダー
ゼを試料に接触させ、該酵素反応により生成したホルム
アルデヒドを、ホルムアルデヒド脱水素酵素および酸化
型補酵素と反応させ、生成する還元型補酵素を測定する
ことを特徴とする、ホモシステインの測定方法。 （１３）ベタイン、ベタイン−ホモシステインメチル転
移酵素、チオール化合物に対し安定なジメチルグリシン
オキシダーゼおよび必要に応じてサルコシンオキシダー
ゼを試料に接触させ、該酵素反応により生成したホルム
アルデヒドを、グルタチオン、グルタチオン依存性ホル
ムアルデヒド脱水素酵素および酸化型補酵素と反応さ
せ、生成する還元型補酵素を測定することを特徴とす
る、ホモシステインの測定方法。 （１４）チオール化合物が、ジチオスレイトール、ジチ
オエリスリトール、２−メルカプトエタノール、２−メ
ルカプトエタンスルホン酸、２−メルカプトエチルアミ
ン、システイン、ホモシステイン、Ｎ−アセチルシステ
イン、チオグリセロール、チオグリコール酸、還元型グ
ルタチオンまたはこれらの塩から選択される少なくとも
１種、好ましくはジチオスレイトールであり、より好ま
しくは、ジチオスレイトール非存在下に対し、０．０５
ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール存在下で、少なくとも
５０％酵素活性が保持されるジメチルグリシンオキシダ
ーゼを用いることを特徴とする、上記（１１）〜（１
３）のいずれかのホモシステインの測定方法。 （１５）ジメチルグリシンオキシダーゼが、さらに以下
の理化学的性質を有する酵素である、上記（１１）〜
（１４）のいずれかのホモシステインの測定方法。 (a) 作用：酸素の存在下にジメチルグリシンに作用し
て，サルコシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を
生成する。 (b) ジメチルグリシンに対するＫm値：１５ｍＭ以下 （１６）ジメチルグリシンオキシダーゼが、微生物、好
ましくはアルスロバクター属（Arthrobacter）またはス
トレプトマイセス属（Streptomyces）に属する微生物、
より好ましくはアルスロバクター・ニコチアナエ（Arth
robacter nicotianae）ＩＦＯ１４２３４株またはスト
レプトマイセス・ミュータビリス（Streptomyces mutab
ilis）ＩＦＯ１２８００株由来である、上記（１１）〜
（１５）のいずれかのホモシステインの測定方法。 （１７）ホモシステインの最低検出感度が１μｍｏｌ／
Ｌ以下である、上記（１３）〜（１６）のいずれかのホ
モシステインの測定方法。 （１８）以下の理化学的性質を有するグルタチオン依存
性ホルムアルデヒド脱水素酵素。 (a) 作用：ＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、チオ
ＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる１つの補酵素、還元
型グルタチオンの存在下にホルムアルデヒドに作用し
て、Ｓ−ホルミルグルタチオン、還元型補酵素を生成す
る。 (b) ＮＡＤに対する反応性に対してのチオＮＡＤに対す
る反応性の比が３０％以上である。 (c) 至適ｐＨ：約７．５〜約８．５ (d) ｐＨ安定性：約６．０〜約９．０ (e) 熱安定性：約４０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間処
理） （１９）微生物、好ましくはメタノール資化性酵母、よ
り好ましくはハンゼヌラ属に属する酵母、就中ハンゼヌ
ラ・ノンファーメンタンスＩＦＯ１４７３株由来であ
る、上記（１８）のグルタチオン依存性ホルムアルデヒ
ド脱水素酵素。 （２０）以下の理化学的性質を有するジメチルグリシン
オキシダーゼ。 (a) 作用：酸素の存在下にジメチルグリシンに作用し
て，サルコシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を
生成する。 (b) ジチオスレイトール非存在下に対し、０．０５ｍｍ
ｏｌ／Ｌジチオスレイトール存在下で、少なくとも５０
％酵素活性が保持される。 (c) ジメチルグリシンに対するＫm値：１５ｍＭ以下 （２１）微生物、好ましくはアルスロバクター属または
ストレプトマイセス属に属する微生物、より好ましくは
アルスロバクター・ニコチアナエＩＦＯ１４２３４株ま
たはストレプトマイセス・ミュータビリスＩＦＯ１２８
００株由来である、上記（２０）のジメチルグリシンオ
キシダーゼ。 （２２）緩衝液、グルタチオン、ＮＡＤに対する反応性
に対してのチオＮＡＤに対する反応性の比が３０％以上
であるグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵
素、および該酵素反応により生成する化合物を分析する
ための試薬を少なくとも含有してなることを特徴とする
ホルムアルデヒド測定用試薬キット。 （２３）緩衝液、グルタチオン、ＮＡＤに対する反応性
に対してのチオＮＡＤに対する反応性の比が３０％以上
であるグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵
素、チオＮＡＤ類およびチオＮＡＤＰ類からなる群より
選ばれる1つの化合物、並びに還元型ＮＡＤ類および還
元型ＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる1つの化合物を
少なくとも含有してなることを特徴とするホルムアルデ
ヒド測定用試薬キット。 （２４）緩衝液、グルタチオン、ＮＡＤに対する反応性
に対してのチオＮＡＤに対する反応性の比が３０％以上
であるグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵
素、還元型チオＮＡＤ類および還元型チオＮＡＤＰ類か
らなる群より選ばれる1つの化合物、並びにＮＡＤ類お
よびＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる1つの化合物を
少なくとも含有してなることを特徴とするホルムアルデ
ヒド測定用試薬キット。 （２５）グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵
素が、上記（１８）または（１９）の酵素である、上記
（２２）〜（２４）のいずれかのホルムアルデヒド測定
用試薬キット。 （２６）上記（２２）〜（２５）のいずれかに記載の試
薬に加えて、ベタイン、ベタイン−ホモシステインメチ
ル転移酵素、ジメチルグリシンオキシダーゼおよび必要
に応じてサルコシンオキシダーゼを更に含有してなるこ
とを特徴とする、ホモシステイン測定用試薬キット。 （２７）上記（２２）〜（２５）のいずれかに記載の試
薬に加えて、クレアチンアミジノハイドロラーゼ、サル
コシンオキシダーゼおよび必要に応じてクレアチニンア
ミドハイドロラーゼを更に含有してなることを特徴とす
る、クレアチニンまたはクレアチン測定用試薬キット。 （２８）緩衝液、ベタイン、ベタイン−ホモシステイン
メチル転移酵素、チオール化合物に対し安定なジメチル
グリシンオキシダーゼおよび必要に応じてサルコシンオ
キシダーゼ、並びに該酵素反応により生成した過酸化水
素を測定するための試薬を含有してなることを特徴とす
る、ホモシステイン測定用試薬キット。 （２９）過酸化水素を測定するための試薬として、ペル
オキシダーゼ、酸化系発色試薬および必要に応じてカッ
プラーを含有することを特徴とする、上記（２８）のホ
モシステイン測定用試薬キット。 （３０）緩衝液、ベタイン、ベタイン−ホモシステイン
メチル転移酵素、チオール化合物に対し安定なジメチル
グリシンオキシダーゼおよび必要に応じてサルコシンオ
キシダーゼ、並びに該酵素反応により生成したホルムア
ルデヒドを測定するための試薬を含有してなることを特
徴とする、ホモシステイン測定用試薬キット。 （３１）ホルムアルデヒドを測定するための試薬とし
て、ホルムアルデヒド脱水素酵素および酸化型補酵素を
含有することを特徴とする、上記（３０）のホモシステ
イン測定用試薬キット。 （３２）ホルムアルデヒドを測定するための試薬とし
て、グルタチオン、グルタチオン依存性ホルムアルデヒ
ド脱水素酵素および酸化型補酵素を含有することを特徴
とする、上記（３０）のホモシステイン測定用試薬キッ
ト。 （３３）ジメチルグリシンオキシダーゼが、上記（２
０）または（２１）のいずれかの酵素である、上記（２
８）〜（３２）のいずれかのホモシステイン測定用試薬
キット。
【００２０】
【発明の実施の形態】本発明のホルムアルデヒドの測定
方法は、チオＮＡＤ類もしくはチオＮＡＤＰ類、および
ＮＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類の２種類の補酵素を利用で
き、且つＮＡＤに対する反応性に対するチオＮＡＤに対
する反応性の比が従来公知のものに比べて高い新規グル
タチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素を、グルタ
チオンおよび上記いずれかの酸化型補酵素とともに試料
に作用させ、生成もしくは消費されるいずれかの化合物
の量を測定することを特徴とする。
方法は、チオＮＡＤ類もしくはチオＮＡＤＰ類、および
ＮＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類の２種類の補酵素を利用で
き、且つＮＡＤに対する反応性に対するチオＮＡＤに対
する反応性の比が従来公知のものに比べて高い新規グル
タチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素を、グルタ
チオンおよび上記いずれかの酸化型補酵素とともに試料
に作用させ、生成もしくは消費されるいずれかの化合物
の量を測定することを特徴とする。
【００２１】本発明において使用されるグルタチオン依
存性ホルムアルデヒド脱水素酵素（EC 1.2.1.1）は、正
確には、酸化型補酵素の存在下、グルタチオンとホルム
アルデヒドより非酵素的に生成するＳ−ヒドロキシメチ
ルグルタチオンを基質として、Ｓ−ホルミルグルタチオ
ンと還元型補酵素の生成を可逆的に触媒する酵素であ
る。
存性ホルムアルデヒド脱水素酵素（EC 1.2.1.1）は、正
確には、酸化型補酵素の存在下、グルタチオンとホルム
アルデヒドより非酵素的に生成するＳ−ヒドロキシメチ
ルグルタチオンを基質として、Ｓ−ホルミルグルタチオ
ンと還元型補酵素の生成を可逆的に触媒する酵素であ
る。
【００２２】本発明におけるグルタチオン依存性ホルム
アルデヒド脱水素酵素は、補酵素として、チオＮＡＤ類
もしくはチオＮＡＤＰ類、およびＮＡＤ類もしくはＮＡ
ＤＰ類を利用することができる。ＮＡＤ類としては、例
えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、アセチ
ルピリジンアデニンジヌクレオチド、アセチルピリジン
アデニンヒポキサンチンジヌクレオチド、ニコチンアミ
ドヒポキサンチンジヌクレオチドなどが、ＮＡＤＰ類と
しては、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドリン酸、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチドリ
ン酸、アセチルピリジンアデニンヒポキサンチンジヌク
レオチドリン酸、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌク
レオチドリン酸などが例示される。また、チオＮＡＤ類
としては、例えば、チオニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレ
オチドなどが、チオＮＡＤＰ類としては、例えば、チオ
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、チオニ
コチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドリン酸など
が具体例として挙げられる。
アルデヒド脱水素酵素は、補酵素として、チオＮＡＤ類
もしくはチオＮＡＤＰ類、およびＮＡＤ類もしくはＮＡ
ＤＰ類を利用することができる。ＮＡＤ類としては、例
えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、アセチ
ルピリジンアデニンジヌクレオチド、アセチルピリジン
アデニンヒポキサンチンジヌクレオチド、ニコチンアミ
ドヒポキサンチンジヌクレオチドなどが、ＮＡＤＰ類と
しては、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドリン酸、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチドリ
ン酸、アセチルピリジンアデニンヒポキサンチンジヌク
レオチドリン酸、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌク
レオチドリン酸などが例示される。また、チオＮＡＤ類
としては、例えば、チオニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレ
オチドなどが、チオＮＡＤＰ類としては、例えば、チオ
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、チオニ
コチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドリン酸など
が具体例として挙げられる。
【００２３】好ましい実施態様においては、本発明のホ
ルムアルデヒドの測定方法は、グルタチオン、グルタチ
オン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素、チオＮＡＤ類
およびチオＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる１つの化
合物、並びに還元型ＮＡＤ類および還元型ＮＡＤＰ類か
らなる群より選ばれる1つの化合物を試料に作用させ
て、サイクリング反応を行わせしめ、該反応より変化し
た化合物の量を分析することを特徴とする。
ルムアルデヒドの測定方法は、グルタチオン、グルタチ
オン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素、チオＮＡＤ類
およびチオＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる１つの化
合物、並びに還元型ＮＡＤ類および還元型ＮＡＤＰ類か
らなる群より選ばれる1つの化合物を試料に作用させ
て、サイクリング反応を行わせしめ、該反応より変化し
た化合物の量を分析することを特徴とする。
【００２４】別の好ましい実施態様においては、本発明
のホルムアルデヒドの測定方法は、グルタチオン、グル
タチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素、還元型チ
オＮＡＤ類および還元型チオＮＡＤＰ類からなる群より
選ばれる1つの化合物、並びにＮＡＤ類およびＮＡＤＰ
類からなる群より選ばれる1つの化合物を試料に作用さ
せて、サイクリング反応を行わせしめ、該反応より変化
した化合物の量を分析することを特徴とする。
のホルムアルデヒドの測定方法は、グルタチオン、グル
タチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素、還元型チ
オＮＡＤ類および還元型チオＮＡＤＰ類からなる群より
選ばれる1つの化合物、並びにＮＡＤ類およびＮＡＤＰ
類からなる群より選ばれる1つの化合物を試料に作用さ
せて、サイクリング反応を行わせしめ、該反応より変化
した化合物の量を分析することを特徴とする。
【００２５】該サイクリング反応では、酸化型補酵素か
ら還元型補酵素、若しくは還元型補酵素から酸化型補酵
素の生成が反応時間に比例して、基質の量に対して増幅
して生成されることから、補酵素がＮＡＤ類、ＮＡＤＰ
類の場合は３４０ｎｍ付近の吸光度を、チオＮＡＤ類、
チオＮＡＤＰ類の場合は４００ｎｍ付近の吸光度を測定
することで、ホルムアルデヒドを高感度に定量すること
ができる。該サイクリング反応に用いるグルタチオン依
存性ホルムアルデヒド脱水素酵素としては、ホルムアル
デヒドを分解してサイクリング反応系外に放出するよう
な夾雑酵素（例えば、Ｓ−ホルミルグルタチオンハイド
ロラーゼ等）を含まないか、測定値に影響を与えない程
度に含量が低いことが望ましい。またＮＡＤ（Ｐ）分解
酵素についても全く含まないか、測定値に影響を与えな
い程度に含量が低いことが望ましい。
ら還元型補酵素、若しくは還元型補酵素から酸化型補酵
素の生成が反応時間に比例して、基質の量に対して増幅
して生成されることから、補酵素がＮＡＤ類、ＮＡＤＰ
類の場合は３４０ｎｍ付近の吸光度を、チオＮＡＤ類、
チオＮＡＤＰ類の場合は４００ｎｍ付近の吸光度を測定
することで、ホルムアルデヒドを高感度に定量すること
ができる。該サイクリング反応に用いるグルタチオン依
存性ホルムアルデヒド脱水素酵素としては、ホルムアル
デヒドを分解してサイクリング反応系外に放出するよう
な夾雑酵素（例えば、Ｓ−ホルミルグルタチオンハイド
ロラーゼ等）を含まないか、測定値に影響を与えない程
度に含量が低いことが望ましい。またＮＡＤ（Ｐ）分解
酵素についても全く含まないか、測定値に影響を与えな
い程度に含量が低いことが望ましい。
【００２６】該サイクリング反応を効率的に行わせしめ
るためには、本発明で使用するグルタチオン依存性ホル
ムアルデヒド脱水素酵素は、チオＮＡＤ類もしくはチオ
ＮＡＤＰ類に対して十分な反応性を有する必要がある。
具体的には、ＮＡＤに対する反応性に対してのチオＮＡ
Ｄに対する反応性の比が３０％以上であり、好ましくは
６０％以上である。さらに、酸化型補酵素としてチオＮ
ＡＤ（Ｐ）類を用いる場合、逆反応において、グルタチ
オン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素は、正反応によ
り生成する還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類に対する反応性に
対して、添加される還元型ＮＡＤ（Ｐ）類に対する反応
性が十分に高いものである。一方、酸化型補酵素として
ＮＡＤ（Ｐ）類を用いる場合、逆反応において、グルタ
チオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素は、正反応に
より生成する還元型ＮＡＤ（Ｐ）類に対する反応性に対
して、添加される還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類に対する反
応性が十分に高いものである。グルタチオン依存性ホル
ムアルデヒド脱水素酵素は高等動物から微生物まで広く
存在することが知られており、チオＮＡＤに対して比較
的高い作用性を有する該酵素としてはヒト肝臓由来のも
のが報告されているが（Biochem. J., 177, 869-878 (1
979)）、高等動物のグルタチオン依存性ホルムアルデヒ
ド脱水素酵素は、通常、微生物由来の酵素と比べて比活
性が低く、また、該酵素を用いてサイクリング反応を行
うことができたという報告は未だなされていない。
るためには、本発明で使用するグルタチオン依存性ホル
ムアルデヒド脱水素酵素は、チオＮＡＤ類もしくはチオ
ＮＡＤＰ類に対して十分な反応性を有する必要がある。
具体的には、ＮＡＤに対する反応性に対してのチオＮＡ
Ｄに対する反応性の比が３０％以上であり、好ましくは
６０％以上である。さらに、酸化型補酵素としてチオＮ
ＡＤ（Ｐ）類を用いる場合、逆反応において、グルタチ
オン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素は、正反応によ
り生成する還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類に対する反応性に
対して、添加される還元型ＮＡＤ（Ｐ）類に対する反応
性が十分に高いものである。一方、酸化型補酵素として
ＮＡＤ（Ｐ）類を用いる場合、逆反応において、グルタ
チオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素は、正反応に
より生成する還元型ＮＡＤ（Ｐ）類に対する反応性に対
して、添加される還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類に対する反
応性が十分に高いものである。グルタチオン依存性ホル
ムアルデヒド脱水素酵素は高等動物から微生物まで広く
存在することが知られており、チオＮＡＤに対して比較
的高い作用性を有する該酵素としてはヒト肝臓由来のも
のが報告されているが（Biochem. J., 177, 869-878 (1
979)）、高等動物のグルタチオン依存性ホルムアルデヒ
ド脱水素酵素は、通常、微生物由来の酵素と比べて比活
性が低く、また、該酵素を用いてサイクリング反応を行
うことができたという報告は未だなされていない。
【００２７】従って、本発明は、上記のいずれかの条件
を具備し、サイクリング反応を触媒することができる、
新規グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素を
提供する。好ましくは、当該酵素は、さらに下記の理化
学的性質を有する。 (a) 作用：ＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、チオ
ＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる１つの補酵素、還元
型グルタチオンの存在下にホルムアルデヒドに作用し
て、Ｓ−ホルミルグルタチオン、還元型補酵素を生成す
る。 (b) 至適ｐＨ：約７．５〜約８．５ (c) ｐＨ安定性：約６．０〜約９．０ (d) 熱安定性：約４０℃以下 ここで「ｐＨ安定性」とは、２５℃で２４時間処理した
後の残存活性が８０％以上のｐＨ範囲をいい、「熱安定
性」とは、ｐＨ７．５で３０分間処理した後の残存活性
が９０％以上の温度範囲をいう。
を具備し、サイクリング反応を触媒することができる、
新規グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素を
提供する。好ましくは、当該酵素は、さらに下記の理化
学的性質を有する。 (a) 作用：ＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、チオ
ＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる１つの補酵素、還元
型グルタチオンの存在下にホルムアルデヒドに作用し
て、Ｓ−ホルミルグルタチオン、還元型補酵素を生成す
る。 (b) 至適ｐＨ：約７．５〜約８．５ (c) ｐＨ安定性：約６．０〜約９．０ (d) 熱安定性：約４０℃以下 ここで「ｐＨ安定性」とは、２５℃で２４時間処理した
後の残存活性が８０％以上のｐＨ範囲をいい、「熱安定
性」とは、ｐＨ７．５で３０分間処理した後の残存活性
が９０％以上の温度範囲をいう。
【００２８】本発明のグルタチオン依存性ホルムアルデ
ヒド脱水素酵素は、サイクリング反応を触媒するのに必
要な上記の条件を具備する限り、その由来は特に制限さ
れないが、好ましくは微生物由来であり、より好ましく
はメタノール資化性酵母由来、いっそう好ましくはハン
ゼヌラ属に属する酵母由来、就中ハンゼヌラ・ノンファ
ーメンタンスＩＦＯ１４７３株由来のものが挙げられ
る。ＩＦＯ１４７３株は、財団法人発酵研究所（〒５３
２−８６８６ 大阪市淀川区十三本町２−１７−８５）
より入手可能である。
ヒド脱水素酵素は、サイクリング反応を触媒するのに必
要な上記の条件を具備する限り、その由来は特に制限さ
れないが、好ましくは微生物由来であり、より好ましく
はメタノール資化性酵母由来、いっそう好ましくはハン
ゼヌラ属に属する酵母由来、就中ハンゼヌラ・ノンファ
ーメンタンスＩＦＯ１４７３株由来のものが挙げられ
る。ＩＦＯ１４７３株は、財団法人発酵研究所（〒５３
２−８６８６ 大阪市淀川区十三本町２−１７−８５）
より入手可能である。
【００２９】また、本発明のグルタチオン依存性ホルム
アルデヒド脱水素酵素は、ランダムにもしくは部位特異
的に変異を誘発することにより、サイクリング反応を触
媒するのに必要な、２種類の補酵素に対する反応性のバ
ランスを保持する範囲で、比活性や安定性を向上させる
などの酵素特性の改良をもたらすように遺伝的に改変さ
れたものであってもよい。
アルデヒド脱水素酵素は、ランダムにもしくは部位特異
的に変異を誘発することにより、サイクリング反応を触
媒するのに必要な、２種類の補酵素に対する反応性のバ
ランスを保持する範囲で、比活性や安定性を向上させる
などの酵素特性の改良をもたらすように遺伝的に改変さ
れたものであってもよい。
【００３０】本発明のグルタチオン依存性ホルムアルデ
ヒド脱水素酵素は、該酵素を産生する細胞または組織の
培養物を原料として単離精製する方法、あるいは当該酵
素蛋白質をコードする遺伝子を常法によって単離し、遺
伝子組換え技術を用いて適当な宿主中で発現させる方法
によって取得することができる。前者の好ましい一実施
態様として、以下の方法が例示される。
ヒド脱水素酵素は、該酵素を産生する細胞または組織の
培養物を原料として単離精製する方法、あるいは当該酵
素蛋白質をコードする遺伝子を常法によって単離し、遺
伝子組換え技術を用いて適当な宿主中で発現させる方法
によって取得することができる。前者の好ましい一実施
態様として、以下の方法が例示される。
【００３１】まず、上記のいずれかのグルタチオン依存
性ホルムアルデヒド脱水素酵素生産菌（例えば、ハンゼ
ヌラ・ノンファーメンタンスＩＦＯ１４７３株など）を
栄養培地中で培養する。使用する栄養培地としては、使
用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必
要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地、天
然培地のいずれも使用できる。炭素源としては、例えば
リンゴ酸、コハク酸等が使用される。窒素源としては、
例えばペプトン類、肉エキス、酵母エキス等の窒素含有
天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウム等
の無機窒素含有化合物が使用される。無機物としては、
リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム
等が使用される。
性ホルムアルデヒド脱水素酵素生産菌（例えば、ハンゼ
ヌラ・ノンファーメンタンスＩＦＯ１４７３株など）を
栄養培地中で培養する。使用する栄養培地としては、使
用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必
要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地、天
然培地のいずれも使用できる。炭素源としては、例えば
リンゴ酸、コハク酸等が使用される。窒素源としては、
例えばペプトン類、肉エキス、酵母エキス等の窒素含有
天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウム等
の無機窒素含有化合物が使用される。無機物としては、
リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム
等が使用される。
【００３２】培養は通常、振盪培養あるいは通気撹拌培
養により行う。培養温度は約２０〜約４０℃、好ましく
は約２５〜約３７℃である。培養ｐＨは約５〜約９、好
ましくは約６〜約８の範囲に制御するのがよい。しかし
ながら、使用する菌株が生育し得る限り、これら以外の
条件下でも実施することができる。培養期間は、通常約
１〜約７日であり、グルタチオン依存性ホルムアルデヒ
ド脱水素酵素は通常、菌体内に生産蓄積される。
養により行う。培養温度は約２０〜約４０℃、好ましく
は約２５〜約３７℃である。培養ｐＨは約５〜約９、好
ましくは約６〜約８の範囲に制御するのがよい。しかし
ながら、使用する菌株が生育し得る限り、これら以外の
条件下でも実施することができる。培養期間は、通常約
１〜約７日であり、グルタチオン依存性ホルムアルデヒ
ド脱水素酵素は通常、菌体内に生産蓄積される。
【００３３】本発明のグルタチオン依存性ホルムアルデ
ヒド脱水素酵素の精製は、一般に使用される精製法を用
いて行うことができる。例えば、菌体を回収後、超音波
破砕、ガラスビーズを用いる機械的な破砕、フレンチプ
レス、界面活性化剤による溶解などにより、菌体内画分
を抽出することができる。得られた抽出液を、硫安やぼ
う硝などによる塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシ
ウムなどによる金属凝集法、プロタミンやポリエチレン
イミンなどを用いた凝集法、さらにはＤＥＡＥ（ジエチ
ルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カルボキシメ
チル）−セファロースなどによるイオン交換クロマト法
などに付すことにより、グルタチオン依存性ホルムアル
デヒド脱水素酵素を精製することができる。
ヒド脱水素酵素の精製は、一般に使用される精製法を用
いて行うことができる。例えば、菌体を回収後、超音波
破砕、ガラスビーズを用いる機械的な破砕、フレンチプ
レス、界面活性化剤による溶解などにより、菌体内画分
を抽出することができる。得られた抽出液を、硫安やぼ
う硝などによる塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシ
ウムなどによる金属凝集法、プロタミンやポリエチレン
イミンなどを用いた凝集法、さらにはＤＥＡＥ（ジエチ
ルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カルボキシメ
チル）−セファロースなどによるイオン交換クロマト法
などに付すことにより、グルタチオン依存性ホルムアル
デヒド脱水素酵素を精製することができる。
【００３４】本発明のグルタチオン依存性ホルムアルデ
ヒド脱水素酵素によるサイクリング反応を用いたホルム
アルデヒドの測定方法について、酸化型補酵素としてチ
オＮＡＤ（Ｐ）類化合物を用いる場合を例にとってさら
に詳述する。還元型グルタチオン、グルタチオン依存性
ホルムアルデヒド脱水素酵素、酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）
類化合物および還元型ＮＡＤ（Ｐ）類化合物を試料に接
触させると、試料中に含まれるホルムアルデヒド、還元
型グルタチオンおよび酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）類化合物
から、Ｓ−ホルミルグルタチオンと還元型チオＮＡＤ
（Ｐ）類化合物が生成する。次いで、グルタチオン依存
性ホルムアルデヒド脱水素酵素は、過剰に存在する還元
型ＮＡＤ（Ｐ）類化合物を補酵素として利用し、生成さ
れたＳ−ホルミルグルタチオンを再びホルムアルデヒド
とグルタチオンに戻す。以下、酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）
類化合物を補酵素とする正反応と、還元型ＮＡＤ（Ｐ）
類を補酵素とする逆反応とが繰り返され、結果として１
分子のホルムアルデヒドに対して多数分子の還元型チオ
ＮＡＤ（Ｐ）類化合物が生成される。一方で、還元型Ｎ
ＡＤ（Ｐ）類化合物は反応サイクルの進行に伴って消費
される。したがって、還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類化合物
量の増加または還元型ＮＡＤ（Ｐ）類化合物量の減少
を、上記のように吸光度を指標にしてモニタリングする
ことにより、低濃度のホルムアルデヒドも感度よく検出
することができる。
ヒド脱水素酵素によるサイクリング反応を用いたホルム
アルデヒドの測定方法について、酸化型補酵素としてチ
オＮＡＤ（Ｐ）類化合物を用いる場合を例にとってさら
に詳述する。還元型グルタチオン、グルタチオン依存性
ホルムアルデヒド脱水素酵素、酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）
類化合物および還元型ＮＡＤ（Ｐ）類化合物を試料に接
触させると、試料中に含まれるホルムアルデヒド、還元
型グルタチオンおよび酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）類化合物
から、Ｓ−ホルミルグルタチオンと還元型チオＮＡＤ
（Ｐ）類化合物が生成する。次いで、グルタチオン依存
性ホルムアルデヒド脱水素酵素は、過剰に存在する還元
型ＮＡＤ（Ｐ）類化合物を補酵素として利用し、生成さ
れたＳ−ホルミルグルタチオンを再びホルムアルデヒド
とグルタチオンに戻す。以下、酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）
類化合物を補酵素とする正反応と、還元型ＮＡＤ（Ｐ）
類を補酵素とする逆反応とが繰り返され、結果として１
分子のホルムアルデヒドに対して多数分子の還元型チオ
ＮＡＤ（Ｐ）類化合物が生成される。一方で、還元型Ｎ
ＡＤ（Ｐ）類化合物は反応サイクルの進行に伴って消費
される。したがって、還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類化合物
量の増加または還元型ＮＡＤ（Ｐ）類化合物量の減少
を、上記のように吸光度を指標にしてモニタリングする
ことにより、低濃度のホルムアルデヒドも感度よく検出
することができる。
【００３５】また、上記測定系において、ＮＡＤ（Ｐ）
類を補酵素として利用し得るがチオＮＡＤ（Ｐ）類を補
酵素として実質的に利用できない他の酵素と、当該酵素
の基質をさらに添加することにより、酸化型ＮＡＤ
（Ｐ）類化合物を還元型に再生することができる。この
場合、ホルムアルデヒドの測定は、還元型チオＮＡＤ
（Ｐ）類化合物の増加を指標にして行われる。このよう
な測定系に使用される他の酵素およびその基質の組み合
わせとしては、ＮＡＤ類を利用し得るものとして、例え
ば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.37）（例え
ば、ブタやウシの心筋由来）とＬ−リンゴ酸、グリセロ
ール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.8）（例
えば、ウサギ筋肉由来）とＬ−グリセロール−３−リン
酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（EC
1.1.1.12）（例えば、ウサギ骨格筋もしくは肝、酵母ま
たは大腸菌由来）とＤ−グリセロアルデヒドリン酸およ
びリン酸、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
（EC 1.1.1.49）（例えば、リューコノストック（Leuco
nostoc）属細菌由来）とグルコース−６−リン酸、グル
コースデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.47）（例えば、バ
チルス属細菌、シュードモナス属細菌由来）とβ−Ｄ−
グルコース、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.4.
1.3）（例えば、ウシ肝由来）とＬ−グルタミン酸等
が、ＮＡＤＰ類を利用し得るものとして、例えば、グリ
オキシル酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.17）（例え
ば、シュードモナス・オキサラティカス（Pseudomonas
oxalaticus）由来）とＣｏＡおよびグリオキシル酸、ホ
スホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.44）（例
えば、ラット肝、ビール酵母または大腸菌由来）と６−
ホスホ−Ｄ−グルコン酸、グリセロアルデヒドリン酸デ
ヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.13）（例えば、植物葉緑体
由来）とＤ−グリセロアルデヒド−３−リン酸およびリ
ン酸、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（EC
1.1.1.49）（例えば、酵母またはリューコノストック属
細菌由来）とグルコース−６−リン酸、グルコースデヒ
ドロゲナーゼ（EC 1.1.1.47）（例えば、バチルス属細
菌、シュードモナス属細菌由来）とβ−Ｄ−グルコー
ス、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.4.1.3）（例
えば、ウシ肝由来）とＬ−グルタミン酸等が挙げられ
る。
類を補酵素として利用し得るがチオＮＡＤ（Ｐ）類を補
酵素として実質的に利用できない他の酵素と、当該酵素
の基質をさらに添加することにより、酸化型ＮＡＤ
（Ｐ）類化合物を還元型に再生することができる。この
場合、ホルムアルデヒドの測定は、還元型チオＮＡＤ
（Ｐ）類化合物の増加を指標にして行われる。このよう
な測定系に使用される他の酵素およびその基質の組み合
わせとしては、ＮＡＤ類を利用し得るものとして、例え
ば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.37）（例え
ば、ブタやウシの心筋由来）とＬ−リンゴ酸、グリセロ
ール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.8）（例
えば、ウサギ筋肉由来）とＬ−グリセロール−３−リン
酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（EC
1.1.1.12）（例えば、ウサギ骨格筋もしくは肝、酵母ま
たは大腸菌由来）とＤ−グリセロアルデヒドリン酸およ
びリン酸、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
（EC 1.1.1.49）（例えば、リューコノストック（Leuco
nostoc）属細菌由来）とグルコース−６−リン酸、グル
コースデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.47）（例えば、バ
チルス属細菌、シュードモナス属細菌由来）とβ−Ｄ−
グルコース、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.4.
1.3）（例えば、ウシ肝由来）とＬ−グルタミン酸等
が、ＮＡＤＰ類を利用し得るものとして、例えば、グリ
オキシル酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.17）（例え
ば、シュードモナス・オキサラティカス（Pseudomonas
oxalaticus）由来）とＣｏＡおよびグリオキシル酸、ホ
スホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.44）（例
えば、ラット肝、ビール酵母または大腸菌由来）と６−
ホスホ−Ｄ−グルコン酸、グリセロアルデヒドリン酸デ
ヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.13）（例えば、植物葉緑体
由来）とＤ−グリセロアルデヒド−３−リン酸およびリ
ン酸、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（EC
1.1.1.49）（例えば、酵母またはリューコノストック属
細菌由来）とグルコース−６−リン酸、グルコースデヒ
ドロゲナーゼ（EC 1.1.1.47）（例えば、バチルス属細
菌、シュードモナス属細菌由来）とβ−Ｄ−グルコー
ス、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.4.1.3）（例
えば、ウシ肝由来）とＬ−グルタミン酸等が挙げられ
る。
【００３６】本発明のグルタチオン依存性ホルムアルデ
ヒド脱水素酵素を用いたサイクリング法によれば、試料
中の濃度が１μｍｏｌ／Ｌ以下の微量のホルムアルデヒ
ドの検出が可能となる。
ヒド脱水素酵素を用いたサイクリング法によれば、試料
中の濃度が１μｍｏｌ／Ｌ以下の微量のホルムアルデヒ
ドの検出が可能となる。
【００３７】しかしながら、本発明のグルタチオン依存
性ホルムアルデヒド脱水素酵素を用いたホルムアルデヒ
ドの測定は、サイクリング反応を介さずに、以下のよう
にして行うこともできる。即ち、グルタチオン、グルタ
チオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素およびチオＮ
ＡＤ類、チオＮＡＤＰ類、ＮＡＤ類およびＮＡＤＰ類か
らなる群より選ばれる１つの酸化型補酵素を試料に接触
させ、生成されるＳ−ホルミルグルタチオンを、紫外部
における吸光度を指標として測定することにより、ホル
ムアルデヒドを測定することができる。あるいは、さら
にＳ−ホルミルグルタチオンハイドロラーゼ（EC 3.1.
1.12）を作用させて生成するギ酸を、さらにギ酸脱水素
酵素（EC1.2.1.2；EC 1.2.1.43）を用いて二酸化炭素に
分解し、生成する還元型補酵素を測定することによって
も、ホルムアルデヒドの測定が可能である。
性ホルムアルデヒド脱水素酵素を用いたホルムアルデヒ
ドの測定は、サイクリング反応を介さずに、以下のよう
にして行うこともできる。即ち、グルタチオン、グルタ
チオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素およびチオＮ
ＡＤ類、チオＮＡＤＰ類、ＮＡＤ類およびＮＡＤＰ類か
らなる群より選ばれる１つの酸化型補酵素を試料に接触
させ、生成されるＳ−ホルミルグルタチオンを、紫外部
における吸光度を指標として測定することにより、ホル
ムアルデヒドを測定することができる。あるいは、さら
にＳ−ホルミルグルタチオンハイドロラーゼ（EC 3.1.
1.12）を作用させて生成するギ酸を、さらにギ酸脱水素
酵素（EC1.2.1.2；EC 1.2.1.43）を用いて二酸化炭素に
分解し、生成する還元型補酵素を測定することによって
も、ホルムアルデヒドの測定が可能である。
【００３８】Ｓ−ホルミルグルタチオンハイドロラーゼ
は、動物臓器やメタノール資化性酵母、細菌などに存在
することが知られており、これら給源より採取して使用
することができる。また、ギ酸脱水素酵素は、植物種
子、メタノール資化性酵母、細菌などに存在する酵素
で、これら給源より採取して使用することができる。あ
るいは、市販の酵素（例えば、シグマ製FORMATE DEHYDR
OGENASE等）を使用してもよい。
は、動物臓器やメタノール資化性酵母、細菌などに存在
することが知られており、これら給源より採取して使用
することができる。また、ギ酸脱水素酵素は、植物種
子、メタノール資化性酵母、細菌などに存在する酵素
で、これら給源より採取して使用することができる。あ
るいは、市販の酵素（例えば、シグマ製FORMATE DEHYDR
OGENASE等）を使用してもよい。
【００３９】上記の一連の酵素反応により生成される還
元型補酵素（ＮＡＤＨ類またはＮＡＤＰＨ類）は、紫外
部での吸光度、或いは蛍光を測定することにより分析す
ることができる。また、ジアホラーゼやメチルフェナジ
ウムメチルスルフェートのような電子伝達体の存在下で
テトラゾリウム塩を還元する際に生成するホルマザン色
素を測定することによっても、還元型補酵素を測定する
ことができる。
元型補酵素（ＮＡＤＨ類またはＮＡＤＰＨ類）は、紫外
部での吸光度、或いは蛍光を測定することにより分析す
ることができる。また、ジアホラーゼやメチルフェナジ
ウムメチルスルフェートのような電子伝達体の存在下で
テトラゾリウム塩を還元する際に生成するホルマザン色
素を測定することによっても、還元型補酵素を測定する
ことができる。
【００４０】本発明のホルムアルデヒドの測定方法は、
多段階測定の反応中間体としてホルムアルデヒドを生成
する種々の生体成分の測定方法において、その最終工程
として好ましく使用され得る。
多段階測定の反応中間体としてホルムアルデヒドを生成
する種々の生体成分の測定方法において、その最終工程
として好ましく使用され得る。
【００４１】例えば、クレアチニンまたはクレアチンの
測定は、クレアチンアミジノハイドロラーゼおよびサル
コシンオキシダーゼ（クレアチニンの場合はさらにクレ
アチニンアミドハイドロラーゼ）を試料に作用させて、
クレアチニンまたはクレアチンをグリシン、ホルムアル
デヒドおよび過酸化水素に分解し、生成する過酸化水素
を発色基質等を用いて測定することにより行われてい
る。そこで、過酸化水素の定量用試薬の代わりに、本発
明のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素を
用いてホルムアルデヒドを測定することにより、クレア
チニンまたはクレアチンを高感度で測定することができ
る。
測定は、クレアチンアミジノハイドロラーゼおよびサル
コシンオキシダーゼ（クレアチニンの場合はさらにクレ
アチニンアミドハイドロラーゼ）を試料に作用させて、
クレアチニンまたはクレアチンをグリシン、ホルムアル
デヒドおよび過酸化水素に分解し、生成する過酸化水素
を発色基質等を用いて測定することにより行われてい
る。そこで、過酸化水素の定量用試薬の代わりに、本発
明のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素を
用いてホルムアルデヒドを測定することにより、クレア
チニンまたはクレアチンを高感度で測定することができ
る。
【００４２】従って、本発明は、クレアチンアミジノハ
イドロラーゼ、サルコシンオキシダーゼおよび必要に応
じてクレアチニンアミドハイドロラーゼを試料に接触さ
せてホルムアルデヒドを生成させ、さらに、本発明のグ
ルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素、グルタ
チオン、およびチオＮＡＤ類、チオＮＡＤＰ類、ＮＡＤ
類およびＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる１つの酸化
型補酵素、および必要に応じてさらに該酸化型補酵素と
は異なる種類の還元型補酵素を接触させて、生成もしく
は消費される化合物量を分析することによる、クレアチ
ニンまたはクレアチンの測定方法を提供する。
イドロラーゼ、サルコシンオキシダーゼおよび必要に応
じてクレアチニンアミドハイドロラーゼを試料に接触さ
せてホルムアルデヒドを生成させ、さらに、本発明のグ
ルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素、グルタ
チオン、およびチオＮＡＤ類、チオＮＡＤＰ類、ＮＡＤ
類およびＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる１つの酸化
型補酵素、および必要に応じてさらに該酸化型補酵素と
は異なる種類の還元型補酵素を接触させて、生成もしく
は消費される化合物量を分析することによる、クレアチ
ニンまたはクレアチンの測定方法を提供する。
【００４３】使用するクレアチンアミジノハイドロラー
ゼ、サルコシンオキシダーゼおよびクレアチニンアミド
ハイドロラーゼは特に限定されるものではなく、これら
の酵素を生産する微生物などから公知の手法を用いて採
取できる他、各種市販の酵素を用いることもできる。例
えば、クレアチンアミジノハイドロラーゼとしては、バ
チルス属、コリネバクテリウム属、ミクロコッカス属、
アクチノバチルス属、アルカリゲネス属（Alcaligene
s）に属する細菌等由来のものが、クレアチニンアミド
ハイドロラーゼとしては、シュードモナス属、アルカリ
ゲネス属、フラボバクテリウム属、コリネバクテリウム
属、ミクロコッカス属、ペニシリウム属に属する細菌等
由来のものが、サルコシンオキシダーゼとしては、各種
動物や、アルスロバクター属、ペニシリウム属、バチル
ス属に属する微生物等由来のものが挙げられる。
ゼ、サルコシンオキシダーゼおよびクレアチニンアミド
ハイドロラーゼは特に限定されるものではなく、これら
の酵素を生産する微生物などから公知の手法を用いて採
取できる他、各種市販の酵素を用いることもできる。例
えば、クレアチンアミジノハイドロラーゼとしては、バ
チルス属、コリネバクテリウム属、ミクロコッカス属、
アクチノバチルス属、アルカリゲネス属（Alcaligene
s）に属する細菌等由来のものが、クレアチニンアミド
ハイドロラーゼとしては、シュードモナス属、アルカリ
ゲネス属、フラボバクテリウム属、コリネバクテリウム
属、ミクロコッカス属、ペニシリウム属に属する細菌等
由来のものが、サルコシンオキシダーゼとしては、各種
動物や、アルスロバクター属、ペニシリウム属、バチル
ス属に属する微生物等由来のものが挙げられる。
【００４４】また、ホモシステインの測定は、ベタイ
ン、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素およびジ
メチルグリシンオキシダーゼを試料に作用させて、ホモ
システインをサルコシン、過酸化水素およびホルムアル
デヒドに分解し、生成する過酸化水素を発色基質等を用
いて測定することにより行うことができる。そこで、上
記と同様に、過酸化水素の定量用試薬の代わりに、本発
明のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素を
用いてホルムアルデヒドを測定することにより、ホモシ
ステインを測定することができる。
ン、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素およびジ
メチルグリシンオキシダーゼを試料に作用させて、ホモ
システインをサルコシン、過酸化水素およびホルムアル
デヒドに分解し、生成する過酸化水素を発色基質等を用
いて測定することにより行うことができる。そこで、上
記と同様に、過酸化水素の定量用試薬の代わりに、本発
明のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素を
用いてホルムアルデヒドを測定することにより、ホモシ
ステインを測定することができる。
【００４５】本発明において使用されるベタイン−ホモ
システインメチル転移酵素（EC 2.1.1.5）は、ベタイン
をもう一方の基質としてホモシステインに作用し、ジメ
チルグリシンとメチオニンを生成する酵素であり、例え
ば、哺乳動物やシュードモナス属、アスペルギルス属な
どの微生物から採取することが可能である。本酵素のも
う一方の基質であるベタインは、塩酸塩の形で安価に市
販されている。
システインメチル転移酵素（EC 2.1.1.5）は、ベタイン
をもう一方の基質としてホモシステインに作用し、ジメ
チルグリシンとメチオニンを生成する酵素であり、例え
ば、哺乳動物やシュードモナス属、アスペルギルス属な
どの微生物から採取することが可能である。本酵素のも
う一方の基質であるベタインは、塩酸塩の形で安価に市
販されている。
【００４６】ジメチルグリシンオキシダーゼ（EC 1.5.
3.10）は、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素に
より生成したジメチルグリシンに作用して、サルコシ
ン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素に分解する酵素
であり、例えばシリンドロカーポン（Cylindrocarpon）
属、アクロモバクター（Achromobacter）属、アルスロ
バクター属などの微生物から採取することができる。
3.10）は、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素に
より生成したジメチルグリシンに作用して、サルコシ
ン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素に分解する酵素
であり、例えばシリンドロカーポン（Cylindrocarpon）
属、アクロモバクター（Achromobacter）属、アルスロ
バクター属などの微生物から採取することができる。
【００４７】また、ジメチルグリシンオキシダーゼによ
り生成されるサルコシンにサルコシンオキシダーゼを作
用させれば、２倍量のホルムアルデヒドが生成するので
検出感度をさらに増加させることができる。サルコシン
オキシダーゼとしては、クレアチニンまたはクレアチン
の測定方法について上記した通りのものを、同様に使用
することができる。
り生成されるサルコシンにサルコシンオキシダーゼを作
用させれば、２倍量のホルムアルデヒドが生成するので
検出感度をさらに増加させることができる。サルコシン
オキシダーゼとしては、クレアチニンまたはクレアチン
の測定方法について上記した通りのものを、同様に使用
することができる。
【００４８】反応中間体としてホルムアルデヒドを生成
する他の測定対象として、例えば、メタノール、尿酸な
どが例示される（Clin. Chem., 33/12, 2204-2208 (198
7),Clin. Biochem., 27/2, 93-97 (1994)）。即ち、メ
タノールは、アルコールオキシダーゼ（EC 1.1.3.13）
によりホルムアルデヒドと過酸化水素を生成する。ま
た、尿酸は、ウリカーゼ（EC 1.7.3.3）の反応により生
成される過酸化水素を、メタノールの存在下でカタラー
ゼ（EC 1.11.1.6）と作用させることでホルムアルデヒ
ドを生成するので、これを上記測定方法により分析する
ことができる。
する他の測定対象として、例えば、メタノール、尿酸な
どが例示される（Clin. Chem., 33/12, 2204-2208 (198
7),Clin. Biochem., 27/2, 93-97 (1994)）。即ち、メ
タノールは、アルコールオキシダーゼ（EC 1.1.3.13）
によりホルムアルデヒドと過酸化水素を生成する。ま
た、尿酸は、ウリカーゼ（EC 1.7.3.3）の反応により生
成される過酸化水素を、メタノールの存在下でカタラー
ゼ（EC 1.11.1.6）と作用させることでホルムアルデヒ
ドを生成するので、これを上記測定方法により分析する
ことができる。
【００４９】本発明はまた、上記のホルムアルデヒドの
測定方法に使用するための試薬キットを提供する。本発
明におけるホルムアルデヒド測定用試薬キットは、緩衝
液、グルタチオン、上述の本発明のグルタチオン依存性
ホルムアルデヒド脱水素酵素および該酵素反応により生
成する化合物を分析するための試薬を少なくとも含有し
てなる。当該試薬キットは、ＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、チ
オＮＡＤ類およびチオＮＡＤＰ類からなる群より選ばれ
る１つの酸化型補酵素をさらに含有することが好まし
い。
測定方法に使用するための試薬キットを提供する。本発
明におけるホルムアルデヒド測定用試薬キットは、緩衝
液、グルタチオン、上述の本発明のグルタチオン依存性
ホルムアルデヒド脱水素酵素および該酵素反応により生
成する化合物を分析するための試薬を少なくとも含有し
てなる。当該試薬キットは、ＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、チ
オＮＡＤ類およびチオＮＡＤＰ類からなる群より選ばれ
る１つの酸化型補酵素をさらに含有することが好まし
い。
【００５０】グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水
素酵素の反応により生成する化合物を分析するための試
薬としては、Ｓ−ホルミルグルタチオンを分析するため
の試薬として、Ｓ−ホルミルグルタチオンハイドロラー
ゼ、ギ酸脱水素酵素および生成する還元型補酵素を分析
するための試薬が挙げられる。Ｓ−ホルミルグルタチオ
ンハイドロラーゼ、ギ酸脱水素酵素および生成する還元
型補酵素を分析するための試薬は、それぞれ上述のもの
が好ましく使用され得る。なお、Ｓ−ホルミルグルタチ
オンは、反応液の紫外部での吸光度を分析することによ
り直接測定することができるので、この場合は上記の試
薬に代えて、吸光度測定に必要な試薬もしくは器具類を
含むこともできる。
素酵素の反応により生成する化合物を分析するための試
薬としては、Ｓ−ホルミルグルタチオンを分析するため
の試薬として、Ｓ−ホルミルグルタチオンハイドロラー
ゼ、ギ酸脱水素酵素および生成する還元型補酵素を分析
するための試薬が挙げられる。Ｓ−ホルミルグルタチオ
ンハイドロラーゼ、ギ酸脱水素酵素および生成する還元
型補酵素を分析するための試薬は、それぞれ上述のもの
が好ましく使用され得る。なお、Ｓ−ホルミルグルタチ
オンは、反応液の紫外部での吸光度を分析することによ
り直接測定することができるので、この場合は上記の試
薬に代えて、吸光度測定に必要な試薬もしくは器具類を
含むこともできる。
【００５１】本発明の試薬キットにおいて使用される緩
衝液としては、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ
酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。トリス塩
酸緩衝液、リン酸緩衝液は濃度、温度によりｐＨの変動
を受けやすいが、安価という利点がある。一方、ＧＯＯ
Ｄ緩衝液は具体的にはＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤ
Ａ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥ
Ｓ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＰＯ
ＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳなどが例示さ
れ、臨床診断薬用として多用されている。これら緩衝液
の種類、濃度およびｐＨは、各試薬成分の保存および酵
素反応など目的に応じて一種もしくは複数が選択される
が、いずれの緩衝液を用いるに際しても、酵素反応時の
ｐＨとしては５．０〜１０．０の範囲で使用されること
が好ましい。
衝液としては、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ
酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。トリス塩
酸緩衝液、リン酸緩衝液は濃度、温度によりｐＨの変動
を受けやすいが、安価という利点がある。一方、ＧＯＯ
Ｄ緩衝液は具体的にはＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤ
Ａ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥ
Ｓ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＰＯ
ＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳなどが例示さ
れ、臨床診断薬用として多用されている。これら緩衝液
の種類、濃度およびｐＨは、各試薬成分の保存および酵
素反応など目的に応じて一種もしくは複数が選択される
が、いずれの緩衝液を用いるに際しても、酵素反応時の
ｐＨとしては５．０〜１０．０の範囲で使用されること
が好ましい。
【００５２】また、本発明の試薬キットを構成する試薬
には、金属塩、蛋白質、アミノ酸、糖、有機酸などを安
定化剤として使用することができる。金属塩としてはナ
トリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄、
銅、亜鉛、マンガンなどの塩が挙げられる。蛋白質とし
ては酵素反応に影響を与えないものが望ましいが、例え
ば牛血清アルブミン、卵アルブミン、ゼラチンなどが挙
げられる。アミノ酸としては、グリシン、リジン、グル
タミン酸、グリシルグリシン、ポリリジンなどを挙げる
ことができる。糖としては、単糖、二糖、オリゴ糖、多
糖およびこれらの誘導体を用いることができる。具体的
には、グルコース、フラクトース、ガラクトース、マン
ノース、キシロース、ラクトース、シュークロース、マ
ルトース、トレハロース、マルトトリオース、マルトテ
トラオース、マルトシルシクロデキストリン、α−シク
ロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロ
デキストリン、デキストリン、アミロース、グリコーゲ
ン、デンプン、イヌリン、グルコサミン、イノシトー
ル、マンニトール、ソルビトール、リビトール、デオキ
シグルコースなどが挙げられる。有機酸としては、α−
ケトグルタル酸、リンゴ酸、フマル酸、グルコン酸、コ
ール酸、デオキシコール酸などが例示される。その他、
ホウ酸、ホウ砂、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸
アンモニウム、グリセロール、フィコールなども使用可
能である。
には、金属塩、蛋白質、アミノ酸、糖、有機酸などを安
定化剤として使用することができる。金属塩としてはナ
トリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄、
銅、亜鉛、マンガンなどの塩が挙げられる。蛋白質とし
ては酵素反応に影響を与えないものが望ましいが、例え
ば牛血清アルブミン、卵アルブミン、ゼラチンなどが挙
げられる。アミノ酸としては、グリシン、リジン、グル
タミン酸、グリシルグリシン、ポリリジンなどを挙げる
ことができる。糖としては、単糖、二糖、オリゴ糖、多
糖およびこれらの誘導体を用いることができる。具体的
には、グルコース、フラクトース、ガラクトース、マン
ノース、キシロース、ラクトース、シュークロース、マ
ルトース、トレハロース、マルトトリオース、マルトテ
トラオース、マルトシルシクロデキストリン、α−シク
ロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロ
デキストリン、デキストリン、アミロース、グリコーゲ
ン、デンプン、イヌリン、グルコサミン、イノシトー
ル、マンニトール、ソルビトール、リビトール、デオキ
シグルコースなどが挙げられる。有機酸としては、α−
ケトグルタル酸、リンゴ酸、フマル酸、グルコン酸、コ
ール酸、デオキシコール酸などが例示される。その他、
ホウ酸、ホウ砂、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸
アンモニウム、グリセロール、フィコールなども使用可
能である。
【００５３】更に、本発明の試薬キットを構成する試薬
には、試薬性能に悪影響を及ぼさない範囲で防腐剤や界
面活性剤を添加してもよい。防腐剤としてはアジ化ナト
リウム、キレート剤、各種抗生物質、防菌剤、防黴剤な
どが挙げられる。具体的にはアジ化ナトリウムの他、Ｅ
ＤＴＡ及びその塩（金属キレートを含む）、ＣｙＤＴ
Ａ、ＧＨＥＧ、ＤＰＴＡ−ＯＨ、ＤＴＰＡ、ＥＤＤＡ、
ＥＤＤＰ、ＥＤＤＰＯ、ＥＤＴＡ−ＯＨ、ＥＤＴＰＯ、
ＥＧＴＡ、ＨＢＥＤ、ＨＤＴＡ、ＨＩＤＡ、ＩＤＡ、Me
thyl-ＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＮＴＰ、ＮＴＰＯ、ＴＴＨＡ
（これらは同仁より市販）等のキレート剤、ＢＮＤ、Ｃ
ＡＡ、ＨＰＯ、ＩＺＵ、ＭＩＴ（ロッシュより市販）、
ProClin150、ProClin300（ローム＆ハースより市販）、
ベンザルコニウムクロリド、KathonCG、ｐ−ヒドロキシ
メチルベンゾエート等の防菌（黴）剤、アンフォテリシ
ンＢ、アンピシリン、ブラスティシジンＳ、クロラムフ
ェニコール、ジヒドロストレプトマイシン、クリンダマ
イシン、シクロヘキシミド、フィリピン、Ｇ４１８、ゲ
ンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リン
コマイシン、ネオマイシン、ロモフンジン、ポリオキシ
ン、ペニシリン、スルファメチゾール、テトラサイクリ
ン等の抗生物質が使用可能である。界面活性剤として
は、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰
イオン性界面活性剤、両性界面活性剤が挙げられる。具
体的には、アデカトール７２０Ｎ、Ｂ−７９５、Ｂ−７
９７、ＬＯ−７、ＮＰ−６９０、ＮＰ−６９５、ＮＰ−
７２０、ＰＣ−８、ＳＯ−１２０、ＳＯ−１４５、ブリ
ジェ３５、９８、７００、エマルゲン１０９Ｐ、４３
０、４６０、７０７、７０９、８１０、９１１、９３
５、９５０、Ａ−６０，Ｂ６６、ｎ−ドデシルマルトシ
ド、ゲナポールＸ−０８０，ＭＥＧＡ−７、８、９、１
０、ニッコールＢＬ−９ＥＸ、ＢＬ−２０ＴＸ、ＨＣＤ
−１００、ＭＧＯ、ＭＹＯ−６、ＭＹＬ−１０、ＮＰ−
１８ＴＸ、ＯＰ−１０、ＴＬ−１０、ＴＭＧＯ５、ＳＬ
−１０、オクチル α―グルコシド、オクチル β―グ
ルコシド、オクチルチオグルコシド、オクチルチオガラ
クトシド、ペンタエチレングリコールドデシルエーテ
ル、ポリエチレンエーテルＷ−１、プルロニックＦ−６
８、Ｌ−７１、Ｐ−１０３、ノニデットＰ４０、レオド
ール４６０、ＴＷＬ−１０３、ＴＷＬ−１０６、サポニ
ン、サルコシネートＰＮ、スパン２０、８５、ＳＭ１０
８０、スクロースモノラウレート、テトロニック７０
４、テシット、トリトンＸ−１００、Ｘ−１１４、Ｘ−
３０５、ツイーン２０、４０、８０等の非イオン性界面
活性剤、ビス（ヒドロキシエチル）−（ステアロイルア
ミノメチルカルボニルオキシ）エチルアミンクロリド、
メチル硫酸ベンジルラウリルメチルスルフォニウム、２
−[（４−ｔ−オクチルフェノキシ）エトキシ]エチルモ
ルフォリンクロリド、ラウリルピリジニウムクロリド、
ラウリル（トリ−ｐ−トリル）ホスホニウムクロリド、
ラウリルフェニルシクロテトラメチレンホフホニウムブ
ロミド、セチルピリジウムクロリド、セチルトリメチル
アンモニウムクロリド、（ポリオキシエチレン）ラウリ
ルアミン、などの陽イオン性界面活性剤、コール酸ナト
リウム、デオキシコール酸、Ｎ−ラウロイルサルコシ
ン、タウロコール酸などの陰イオン性界面活性剤、ＣＨ
ＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、Ｎ，Ｎ−ビス（オクチルアミノ
エチル）グリシン、Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−（ステ
アリルオキシメチル）ピリジウムベタイン、Ｎ−パルミ
チルスルホタウリン、ラウリルジメチルアミンオキシ
ド、Ｎ−（ラウリルチオエトキシ）メチル−Ｎ，Ｎ−ジ
メチルベタインなどの両性界面活性剤が使用できる。
には、試薬性能に悪影響を及ぼさない範囲で防腐剤や界
面活性剤を添加してもよい。防腐剤としてはアジ化ナト
リウム、キレート剤、各種抗生物質、防菌剤、防黴剤な
どが挙げられる。具体的にはアジ化ナトリウムの他、Ｅ
ＤＴＡ及びその塩（金属キレートを含む）、ＣｙＤＴ
Ａ、ＧＨＥＧ、ＤＰＴＡ−ＯＨ、ＤＴＰＡ、ＥＤＤＡ、
ＥＤＤＰ、ＥＤＤＰＯ、ＥＤＴＡ−ＯＨ、ＥＤＴＰＯ、
ＥＧＴＡ、ＨＢＥＤ、ＨＤＴＡ、ＨＩＤＡ、ＩＤＡ、Me
thyl-ＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＮＴＰ、ＮＴＰＯ、ＴＴＨＡ
（これらは同仁より市販）等のキレート剤、ＢＮＤ、Ｃ
ＡＡ、ＨＰＯ、ＩＺＵ、ＭＩＴ（ロッシュより市販）、
ProClin150、ProClin300（ローム＆ハースより市販）、
ベンザルコニウムクロリド、KathonCG、ｐ−ヒドロキシ
メチルベンゾエート等の防菌（黴）剤、アンフォテリシ
ンＢ、アンピシリン、ブラスティシジンＳ、クロラムフ
ェニコール、ジヒドロストレプトマイシン、クリンダマ
イシン、シクロヘキシミド、フィリピン、Ｇ４１８、ゲ
ンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リン
コマイシン、ネオマイシン、ロモフンジン、ポリオキシ
ン、ペニシリン、スルファメチゾール、テトラサイクリ
ン等の抗生物質が使用可能である。界面活性剤として
は、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰
イオン性界面活性剤、両性界面活性剤が挙げられる。具
体的には、アデカトール７２０Ｎ、Ｂ−７９５、Ｂ−７
９７、ＬＯ−７、ＮＰ−６９０、ＮＰ−６９５、ＮＰ−
７２０、ＰＣ−８、ＳＯ−１２０、ＳＯ−１４５、ブリ
ジェ３５、９８、７００、エマルゲン１０９Ｐ、４３
０、４６０、７０７、７０９、８１０、９１１、９３
５、９５０、Ａ−６０，Ｂ６６、ｎ−ドデシルマルトシ
ド、ゲナポールＸ−０８０，ＭＥＧＡ−７、８、９、１
０、ニッコールＢＬ−９ＥＸ、ＢＬ−２０ＴＸ、ＨＣＤ
−１００、ＭＧＯ、ＭＹＯ−６、ＭＹＬ−１０、ＮＰ−
１８ＴＸ、ＯＰ−１０、ＴＬ−１０、ＴＭＧＯ５、ＳＬ
−１０、オクチル α―グルコシド、オクチル β―グ
ルコシド、オクチルチオグルコシド、オクチルチオガラ
クトシド、ペンタエチレングリコールドデシルエーテ
ル、ポリエチレンエーテルＷ−１、プルロニックＦ−６
８、Ｌ−７１、Ｐ−１０３、ノニデットＰ４０、レオド
ール４６０、ＴＷＬ−１０３、ＴＷＬ−１０６、サポニ
ン、サルコシネートＰＮ、スパン２０、８５、ＳＭ１０
８０、スクロースモノラウレート、テトロニック７０
４、テシット、トリトンＸ−１００、Ｘ−１１４、Ｘ−
３０５、ツイーン２０、４０、８０等の非イオン性界面
活性剤、ビス（ヒドロキシエチル）−（ステアロイルア
ミノメチルカルボニルオキシ）エチルアミンクロリド、
メチル硫酸ベンジルラウリルメチルスルフォニウム、２
−[（４−ｔ−オクチルフェノキシ）エトキシ]エチルモ
ルフォリンクロリド、ラウリルピリジニウムクロリド、
ラウリル（トリ−ｐ−トリル）ホスホニウムクロリド、
ラウリルフェニルシクロテトラメチレンホフホニウムブ
ロミド、セチルピリジウムクロリド、セチルトリメチル
アンモニウムクロリド、（ポリオキシエチレン）ラウリ
ルアミン、などの陽イオン性界面活性剤、コール酸ナト
リウム、デオキシコール酸、Ｎ−ラウロイルサルコシ
ン、タウロコール酸などの陰イオン性界面活性剤、ＣＨ
ＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、Ｎ，Ｎ−ビス（オクチルアミノ
エチル）グリシン、Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−（ステ
アリルオキシメチル）ピリジウムベタイン、Ｎ−パルミ
チルスルホタウリン、ラウリルジメチルアミンオキシ
ド、Ｎ−（ラウリルチオエトキシ）メチル−Ｎ，Ｎ−ジ
メチルベタインなどの両性界面活性剤が使用できる。
【００５４】本発明の別のホルムアルデヒド測定用試薬
キットは、グルタチオンおよび本発明のグルタチオン依
存性ホルムアルデヒド脱水素酵素に加えて、チオＮＡＤ
類およびチオＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる1つの
化合物、並びに還元型ＮＡＤ類および還元型ＮＡＤＰ類
からなる群より選ばれる1つの化合物をさらに含有して
なるか、あるいは、還元型チオＮＡＤ類および還元型チ
オＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる1つの化合物、並
びにＮＡＤ類およびＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる
1つの化合物をさらに含有してなる。
キットは、グルタチオンおよび本発明のグルタチオン依
存性ホルムアルデヒド脱水素酵素に加えて、チオＮＡＤ
類およびチオＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる1つの
化合物、並びに還元型ＮＡＤ類および還元型ＮＡＤＰ類
からなる群より選ばれる1つの化合物をさらに含有して
なるか、あるいは、還元型チオＮＡＤ類および還元型チ
オＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる1つの化合物、並
びにＮＡＤ類およびＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる
1つの化合物をさらに含有してなる。
【００５５】これらの試薬キットによれば、上記のサイ
クリング反応によるホルムアルデヒドの高感度測定を簡
便に実施することが可能である。ＮＡＤ類、ＮＡＤＰ
類、チオＮＡＤ類、チオＮＡＤＰ類としては、それぞれ
上述のようなものを用いることができる。また、当該試
薬キットには、サイクリング反応により生成する酸化型
補酵素を還元型に再生する、上述のような酵素およびそ
の基質をさらに含有させることもできる。
クリング反応によるホルムアルデヒドの高感度測定を簡
便に実施することが可能である。ＮＡＤ類、ＮＡＤＰ
類、チオＮＡＤ類、チオＮＡＤＰ類としては、それぞれ
上述のようなものを用いることができる。また、当該試
薬キットには、サイクリング反応により生成する酸化型
補酵素を還元型に再生する、上述のような酵素およびそ
の基質をさらに含有させることもできる。
【００５６】本発明のホルムアルデヒド測定用試薬キッ
トは、上記の各試薬成分を、それぞれ単独で保存するこ
ともできるし、あるいは２以上の成分を同一の試薬中に
保存することもできる。したがって、本発明の試薬キッ
トは、上記の全ての試薬成分を含有してなる単一の試薬
組成物であってもよい。しかしながら、互いに干渉を与
える成分が存在するか、または単一の保存条件で安定性
の確保が難しい成分が存在する場合には、構成成分を分
割して保存することが好ましい。
トは、上記の各試薬成分を、それぞれ単独で保存するこ
ともできるし、あるいは２以上の成分を同一の試薬中に
保存することもできる。したがって、本発明の試薬キッ
トは、上記の全ての試薬成分を含有してなる単一の試薬
組成物であってもよい。しかしながら、互いに干渉を与
える成分が存在するか、または単一の保存条件で安定性
の確保が難しい成分が存在する場合には、構成成分を分
割して保存することが好ましい。
【００５７】本発明は、上記のホルムアルデヒド測定用
の試薬成分に加えて、更にクレアチンアミジノハイドロ
ラーゼ、サルコシンオキシダーゼおよび必要に応じてク
レアチニンアミドハイドロラーゼを含有してなる、クレ
アチニンまたはクレアチン測定用試薬キットを提供す
る。これらの酵素としては、上述したようなものを適宜
利用可能である。
の試薬成分に加えて、更にクレアチンアミジノハイドロ
ラーゼ、サルコシンオキシダーゼおよび必要に応じてク
レアチニンアミドハイドロラーゼを含有してなる、クレ
アチニンまたはクレアチン測定用試薬キットを提供す
る。これらの酵素としては、上述したようなものを適宜
利用可能である。
【００５８】また、別の本発明は、上記のホルムアルデ
ヒド測定用の試薬成分に加えて、更にベタイン、ベタイ
ン−ホモシステインメチル転移酵素、ジメチルグリシン
オキシダーゼを少なくとも含有してなる、ホモシステイ
ン測定用試薬キットを提供する。これらの酵素および基
質としては、それぞれ上述したようなものを好ましく使
用することができる。
ヒド測定用の試薬成分に加えて、更にベタイン、ベタイ
ン−ホモシステインメチル転移酵素、ジメチルグリシン
オキシダーゼを少なくとも含有してなる、ホモシステイ
ン測定用試薬キットを提供する。これらの酵素および基
質としては、それぞれ上述したようなものを好ましく使
用することができる。
【００５９】しかしながら、測定に供される試料が生体
試料、特に血漿や尿の場合、含有されるホモシステイン
は、大部分がアルブミンのような循環蛋白質と結合した
状態、あるいはシステインや他のホモシステイン分子の
ような遊離アミノ酸とのジスルフィド結合体の状態で存
在する。従って、総ホモシステインを測定する際には、
予め試料を還元剤や酵素反応により処理し、遊離ホモシ
ステインを生成させることが必要となる。
試料、特に血漿や尿の場合、含有されるホモシステイン
は、大部分がアルブミンのような循環蛋白質と結合した
状態、あるいはシステインや他のホモシステイン分子の
ような遊離アミノ酸とのジスルフィド結合体の状態で存
在する。従って、総ホモシステインを測定する際には、
予め試料を還元剤や酵素反応により処理し、遊離ホモシ
ステインを生成させることが必要となる。
【００６０】この場合に用いられる還元剤としては、例
えばチオール類、水素化ホウ素類、アマルガム、ホスフ
ィンやホスホチオエートなどを例示することができる。
具体的には、チオール類としてはジチオスレイトール、
ジチオエリスリトール、２−メルカプトエタノール、２
−メルカプトメチルアミン、システイン、シスタミン、
システインチオグリコレート、チオグリコール酸、還元
型グルタチオンなど、水素化ホウ素類としては水素化ホ
ウ素ナトリウムなど、アマルガムとしてはナトリウムア
マルガムなどが挙げられる。
えばチオール類、水素化ホウ素類、アマルガム、ホスフ
ィンやホスホチオエートなどを例示することができる。
具体的には、チオール類としてはジチオスレイトール、
ジチオエリスリトール、２−メルカプトエタノール、２
−メルカプトメチルアミン、システイン、シスタミン、
システインチオグリコレート、チオグリコール酸、還元
型グルタチオンなど、水素化ホウ素類としては水素化ホ
ウ素ナトリウムなど、アマルガムとしてはナトリウムア
マルガムなどが挙げられる。
【００６１】しかしながら、本発明において使用される
酵素が該チオール化合物により活性阻害を受けた場合、
試薬性能の低下を引き起こす可能性が考えられるが、チ
オール化合物に影響を受けないジメチルグリシンオキシ
ダーゼはこれまでに報告されておらず、本発明によって
初めて単離精製されたものである。
酵素が該チオール化合物により活性阻害を受けた場合、
試薬性能の低下を引き起こす可能性が考えられるが、チ
オール化合物に影響を受けないジメチルグリシンオキシ
ダーゼはこれまでに報告されておらず、本発明によって
初めて単離精製されたものである。
【００６２】従って、本発明は、チオール化合物に対し
て安定な新規ジメチルグリシンオキシダーゼを提供す
る。このようなチオール化合物としては、ジチオスレイ
トール、ジチオエリスリトール、２−メルカプトエタノ
ール、２−メルカプトエタンスルホン酸、２−メルカプ
トエチルアミン、システイン、ホモシステイン、Ｎ−ア
セチルシステイン、チオグリセロール、チオグリコール
酸、還元型グルタチオンまたはこれらの塩から選択され
る少なくとも一種が挙げられる。
て安定な新規ジメチルグリシンオキシダーゼを提供す
る。このようなチオール化合物としては、ジチオスレイ
トール、ジチオエリスリトール、２−メルカプトエタノ
ール、２−メルカプトエタンスルホン酸、２−メルカプ
トエチルアミン、システイン、ホモシステイン、Ｎ−ア
セチルシステイン、チオグリセロール、チオグリコール
酸、還元型グルタチオンまたはこれらの塩から選択され
る少なくとも一種が挙げられる。
【００６３】ここで「チオール化合物に対して安定」と
は、試料中の総ホモシステインをすべて遊離型に還元す
るのに必要な量のチオール化合物の存在下において、ホ
モシステインの正確な測定に影響を与えない程度に酵素
活性が保持され得ることをいう。好ましくは、本発明の
ジメチルグリシンオキシダーゼは、ジチオスレイトール
非存在下に対し、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイト
ール存在下で、少なくとも５０％酵素活性が保持される
ものである。
は、試料中の総ホモシステインをすべて遊離型に還元す
るのに必要な量のチオール化合物の存在下において、ホ
モシステインの正確な測定に影響を与えない程度に酵素
活性が保持され得ることをいう。好ましくは、本発明の
ジメチルグリシンオキシダーゼは、ジチオスレイトール
非存在下に対し、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイト
ール存在下で、少なくとも５０％酵素活性が保持される
ものである。
【００６４】より好ましくは、本発明のジメチルグリシ
ンオキシダーゼは、さらに下記の理化学的性質を有する
酵素である。 (a) 作用：酸素の存在下にジメチルグリシンに作用し
て，サルコシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を
生成する。 (b) ジメチルグリシンに対するＫｍ値：１５ｍＭ以下
ンオキシダーゼは、さらに下記の理化学的性質を有する
酵素である。 (a) 作用：酸素の存在下にジメチルグリシンに作用し
て，サルコシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を
生成する。 (b) ジメチルグリシンに対するＫｍ値：１５ｍＭ以下
【００６５】本発明のジメチルグリシンオキシダーゼ
は、上記のチオール化合物に対する安定性を有する限り
その由来は特に制限されないが、好ましくはアルスロバ
クター属またはストレプトマイセス属等の微生物由来で
あり、特に好ましくは、アルスロバクター・ニコチアナ
エＩＦＯ１４２３４株またはストレプトマイセス・ミュ
ータビリスＩＦＯ１２８００株由来のものが挙げられ
る。ＩＦＯ１４２３４株およびＩＦＯ１２８００株は、
いずれも財団法人発酵研究所（〒５３２−８６８６日本
国大阪市淀川区十三本町２−１７−８５）より入手可能
である。
は、上記のチオール化合物に対する安定性を有する限り
その由来は特に制限されないが、好ましくはアルスロバ
クター属またはストレプトマイセス属等の微生物由来で
あり、特に好ましくは、アルスロバクター・ニコチアナ
エＩＦＯ１４２３４株またはストレプトマイセス・ミュ
ータビリスＩＦＯ１２８００株由来のものが挙げられ
る。ＩＦＯ１４２３４株およびＩＦＯ１２８００株は、
いずれも財団法人発酵研究所（〒５３２−８６８６日本
国大阪市淀川区十三本町２−１７−８５）より入手可能
である。
【００６６】また、本発明のジメチルグリシンオキシダ
ーゼは、ランダムにもしくは部位特異的に変異を誘発す
ることにより、上記のチオール化合物に対する耐性を保
持する範囲で、比活性や安定性を向上させるなどの酵素
特性の改良をもたらすように遺伝的に改変されたもので
あってもよい。
ーゼは、ランダムにもしくは部位特異的に変異を誘発す
ることにより、上記のチオール化合物に対する耐性を保
持する範囲で、比活性や安定性を向上させるなどの酵素
特性の改良をもたらすように遺伝的に改変されたもので
あってもよい。
【００６７】本発明のジメチルグリシンオキシダーゼ
は、該酵素を産生する細胞または組織の培養物を原料と
して単離精製する方法、あるいは当該酵素蛋白質をコー
ドする遺伝子を常法によって単離し、遺伝子組換え技術
を用いて適当な宿主中で発現させる方法によって取得す
ることができる。前者の好ましい一実施態様として、以
下の方法が例示される。
は、該酵素を産生する細胞または組織の培養物を原料と
して単離精製する方法、あるいは当該酵素蛋白質をコー
ドする遺伝子を常法によって単離し、遺伝子組換え技術
を用いて適当な宿主中で発現させる方法によって取得す
ることができる。前者の好ましい一実施態様として、以
下の方法が例示される。
【００６８】まず、上記のいずれかのジメチルグリシン
オキシダーゼ生産菌、例えば、アルスロバクター・ニコ
チアナエＩＦＯ１４２３４株またはストレプトマイセス
・ミュータビリスＩＦＯ１２８００株などを栄養培地中
で培養する。使用する栄養培地としては、使用菌株が資
化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素
を適量含有するものであれば、合成培地、天然培地のい
ずれも使用できる。炭素源としては、例えばリンゴ酸、
コハク酸等が使用される。窒素源としては、例えばペプ
トン類、肉エキス、酵母エキス等の窒素含有天然物や、
塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の無機窒素
含有化合物が使用される。無機物としては、リン酸カリ
ウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等が使用さ
れる。
オキシダーゼ生産菌、例えば、アルスロバクター・ニコ
チアナエＩＦＯ１４２３４株またはストレプトマイセス
・ミュータビリスＩＦＯ１２８００株などを栄養培地中
で培養する。使用する栄養培地としては、使用菌株が資
化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素
を適量含有するものであれば、合成培地、天然培地のい
ずれも使用できる。炭素源としては、例えばリンゴ酸、
コハク酸等が使用される。窒素源としては、例えばペプ
トン類、肉エキス、酵母エキス等の窒素含有天然物や、
塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の無機窒素
含有化合物が使用される。無機物としては、リン酸カリ
ウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等が使用さ
れる。
【００６９】培養は通常、振盪培養あるいは通気撹拌培
養により行う。培養温度は約２０〜約４０℃、好ましく
は約２５〜約３７℃である。培養ｐＨは約５〜約９、好
ましくは約６〜約８の範囲に制御するのが良い。しかし
ながら、使用する菌株が生育し得る限り、これら以外の
条件下で実施することもできる。培養期間は通常、約１
〜約７日であり、ジメチルグリシンオキシダーゼは通
常、菌体内に生産蓄積される。
養により行う。培養温度は約２０〜約４０℃、好ましく
は約２５〜約３７℃である。培養ｐＨは約５〜約９、好
ましくは約６〜約８の範囲に制御するのが良い。しかし
ながら、使用する菌株が生育し得る限り、これら以外の
条件下で実施することもできる。培養期間は通常、約１
〜約７日であり、ジメチルグリシンオキシダーゼは通
常、菌体内に生産蓄積される。
【００７０】本発明のジメチルグリシンオキシダーゼの
精製は、一般に使用される精製法を用いて行うことがで
きる。例えば、菌体を回収後、超音波破砕、ガラスビー
ズを用いる機械的な破砕、フレンチプレス、界面活性化
剤による溶解などにより、菌体内画分を抽出することが
できる。得られた抽出液を、硫安やぼう硝などによる塩
析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムなどによる金
属凝集法、プロタミンやポリエチレンイミンなどを用い
た凝集法、さらにはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）
−セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロ
ースなどによるイオン交換クロマト法などに付すことに
より、ジメチルグリシンオキシダーゼを精製することが
できる。
精製は、一般に使用される精製法を用いて行うことがで
きる。例えば、菌体を回収後、超音波破砕、ガラスビー
ズを用いる機械的な破砕、フレンチプレス、界面活性化
剤による溶解などにより、菌体内画分を抽出することが
できる。得られた抽出液を、硫安やぼう硝などによる塩
析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムなどによる金
属凝集法、プロタミンやポリエチレンイミンなどを用い
た凝集法、さらにはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）
−セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロ
ースなどによるイオン交換クロマト法などに付すことに
より、ジメチルグリシンオキシダーゼを精製することが
できる。
【００７１】本発明はまた、上記の本発明のジメチルグ
リシンオキシダーゼを用いたホモシステインの測定方法
を提供する。当該方法は、ベタイン、ベタイン−ホモシ
ステインメチル転移酵素および本発明のジメチルグリシ
ンオキシダーゼを試料に作用させて、試料中に含まれる
ホモシステインをサルコシン、過酸化水素およびホルム
アルデヒドに分解し、これらの生成物のいずれかを分析
することを特徴とする。
リシンオキシダーゼを用いたホモシステインの測定方法
を提供する。当該方法は、ベタイン、ベタイン−ホモシ
ステインメチル転移酵素および本発明のジメチルグリシ
ンオキシダーゼを試料に作用させて、試料中に含まれる
ホモシステインをサルコシン、過酸化水素およびホルム
アルデヒドに分解し、これらの生成物のいずれかを分析
することを特徴とする。
【００７２】ベタインおよびベタイン−ホモシステイン
メチル転移酵素は、それぞれ上述のものが好ましく使用
され得る。
メチル転移酵素は、それぞれ上述のものが好ましく使用
され得る。
【００７３】ジメチルグリシンオキシダーゼは、下式に
示すように、酸素の存在下にジメチルグリシンをサルコ
シン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素に分解する。
示すように、酸素の存在下にジメチルグリシンをサルコ
シン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素に分解する。
【００７４】
【数２】
【００７５】したがって、反応中の酸素消費量を計測す
るか、あるいは過酸化水素センサーを用いて、または直
接もしくはペルオキシダーゼ存在下に酸化還元指示薬を
用いて、過酸化水素の生成量を計測することにより、ジ
メチルグリシンを測定することができる。あるいは、生
成したホルムアルデヒドを、Ｈａｎｚ試薬、ホルムアル
デヒド脱水素酵素、ホルムアルデヒドオキシダーゼ等を
用いて、紫外部もしくは可視部の吸光度、あるいは蛍光
を計測することにより間接的に測定することができる。
例えば、ホルムアルデヒド脱水素酵素によりＮＡＤより
生成する還元型ＮＡＤ（ＮＡＤＨ）は、ジアホラーゼや
メチルフェナジウムメチルスルフェートのような電子伝
達体の存在下で、テトラゾリウム塩を還元してホルマザ
ン色素を生じるので、これを測定することによりホモシ
ステインを定量することができる。
るか、あるいは過酸化水素センサーを用いて、または直
接もしくはペルオキシダーゼ存在下に酸化還元指示薬を
用いて、過酸化水素の生成量を計測することにより、ジ
メチルグリシンを測定することができる。あるいは、生
成したホルムアルデヒドを、Ｈａｎｚ試薬、ホルムアル
デヒド脱水素酵素、ホルムアルデヒドオキシダーゼ等を
用いて、紫外部もしくは可視部の吸光度、あるいは蛍光
を計測することにより間接的に測定することができる。
例えば、ホルムアルデヒド脱水素酵素によりＮＡＤより
生成する還元型ＮＡＤ（ＮＡＤＨ）は、ジアホラーゼや
メチルフェナジウムメチルスルフェートのような電子伝
達体の存在下で、テトラゾリウム塩を還元してホルマザ
ン色素を生じるので、これを測定することによりホモシ
ステインを定量することができる。
【００７６】更に、サルコシンオキシダーゼ（EC 1.5.
3.1）を追加して加えると、サルコシンはグリシン、ホ
ルムアルデヒドおよび過酸化水素に分解されるので、ホ
ルムアルデヒドまたは過酸化水素を感度的に倍加して測
定することができる。また、更にホルムアルデヒドオキ
シダーゼを作用させてホルムアルデヒドを過酸化水素に
分解することにより、感度をさらに向上させることがで
きる。
3.1）を追加して加えると、サルコシンはグリシン、ホ
ルムアルデヒドおよび過酸化水素に分解されるので、ホ
ルムアルデヒドまたは過酸化水素を感度的に倍加して測
定することができる。また、更にホルムアルデヒドオキ
シダーゼを作用させてホルムアルデヒドを過酸化水素に
分解することにより、感度をさらに向上させることがで
きる。
【００７７】サルコシンオキシダーゼは、上述のよう
に、各種動物や、アルスロバクター属、ペニシリウム
属、バチルス属等の微生物などから採取することが可能
である。また、市販の酵素を使用することもできる。
に、各種動物や、アルスロバクター属、ペニシリウム
属、バチルス属等の微生物などから採取することが可能
である。また、市販の酵素を使用することもできる。
【００７８】また、上記酵素は、それぞれの酵素蛋白質
をコードする遺伝子を生産菌から単離し、遺伝子工学的
技術により発現させた酵素であってもよい。更に、例え
ば酵素蛋白質の比活性や安定性を向上させるなど、酵素
特性の改良をもたらすように遺伝子を改変したものも含
まれる。
をコードする遺伝子を生産菌から単離し、遺伝子工学的
技術により発現させた酵素であってもよい。更に、例え
ば酵素蛋白質の比活性や安定性を向上させるなど、酵素
特性の改良をもたらすように遺伝子を改変したものも含
まれる。
【００７９】ジメチルグリシンオキシダーゼにより（場
合によっては、さらにサルコシンオキシダーゼおよびホ
ルムアルデヒドオキシダーゼにより）生成する過酸化水
素は、紫外部の吸光度を直接測定するか、カタラーゼと
酸化チタン試薬（Agric. Biol. Chem., 38, 1213 (197
4)）により比色定量分析を行うか、あるいは過マンガン
酸カリウムを用いて滴定定量するなどにより分析するこ
とが可能であるが、高感度測定のためには、ペルオキシ
ダーゼ存在下、酸化系発色試薬及び、必要に応じて４−
アミノアンチピリンや３−メチル−２−ベンゾチアゾリ
ノンなどのカップラーと反応させ、生成する色素を測定
することにより定量することが好ましい。使用する発色
試薬は特に制限されるものではなく、各種の市販されて
いるものなどを使用することができるが、具体例として
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン、Ｎ
−エチル−Ｎ−スルホプロピル−アニリン、Ｎ−メチル
−Ｎ−スルホプロピル−アニリン、Ｎ−ブチル−Ｎ−ス
ルホプロピル−アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロ
ピル−３,５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピ
ル−３,５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−ス
ルホプロピル−３,５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル
−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−
Ｎ−スルホプロピル−ｏ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ
−スルホプロピル−ｐ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシ
ジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキ
シ−３−スルホプロピル）−３,５−ジメトキシアニリ
ン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−
３,５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−
ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３,５−ジメチル
シアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−
スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−スルホプロピ
ルアニリン、ｐ−クロロフェノール、ｐ−ブロモフェノ
ール、２,４−ジクロロフェノール、ｐ−ヒドロキシ安
息香酸、３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジン、
Ｎ−（３−スルホプロピル）３,３’,５,５’−テトラ
メチルベンジジン、Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’,Ｎ”,Ｎ”−ヘキ
サ（３−スルホプロピル）−４，４’，４”−トリアミ
ノトリフェニルメタンなどが挙げられる。また、過酸化
水素は直接、またはカタラーゼ共存下で酸素の消費をセ
ンサーを用いてモニタリングすることでも測定すること
ができる。
合によっては、さらにサルコシンオキシダーゼおよびホ
ルムアルデヒドオキシダーゼにより）生成する過酸化水
素は、紫外部の吸光度を直接測定するか、カタラーゼと
酸化チタン試薬（Agric. Biol. Chem., 38, 1213 (197
4)）により比色定量分析を行うか、あるいは過マンガン
酸カリウムを用いて滴定定量するなどにより分析するこ
とが可能であるが、高感度測定のためには、ペルオキシ
ダーゼ存在下、酸化系発色試薬及び、必要に応じて４−
アミノアンチピリンや３−メチル−２−ベンゾチアゾリ
ノンなどのカップラーと反応させ、生成する色素を測定
することにより定量することが好ましい。使用する発色
試薬は特に制限されるものではなく、各種の市販されて
いるものなどを使用することができるが、具体例として
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン、Ｎ
−エチル−Ｎ−スルホプロピル−アニリン、Ｎ−メチル
−Ｎ−スルホプロピル−アニリン、Ｎ−ブチル−Ｎ−ス
ルホプロピル−アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロ
ピル−３,５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピ
ル−３,５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−ス
ルホプロピル−３,５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル
−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−
Ｎ−スルホプロピル−ｏ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ
−スルホプロピル−ｐ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシ
ジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキ
シ−３−スルホプロピル）−３,５−ジメトキシアニリ
ン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−
３,５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−
ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３,５−ジメチル
シアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−
スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−スルホプロピ
ルアニリン、ｐ−クロロフェノール、ｐ−ブロモフェノ
ール、２,４−ジクロロフェノール、ｐ−ヒドロキシ安
息香酸、３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジン、
Ｎ−（３−スルホプロピル）３,３’,５,５’−テトラ
メチルベンジジン、Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’,Ｎ”,Ｎ”−ヘキ
サ（３−スルホプロピル）−４，４’，４”−トリアミ
ノトリフェニルメタンなどが挙げられる。また、過酸化
水素は直接、またはカタラーゼ共存下で酸素の消費をセ
ンサーを用いてモニタリングすることでも測定すること
ができる。
【００８０】ジメチルグリシンオキシダーゼにより生成
するサルコシンは、サルコシンオキシダーゼを作用させ
ることにより生成するホルムアルデヒドまたは過酸化水
素を上述方法により分析できる他、電子伝達体、発色色
素の存在下でサルコシン脱水素酵素を作用させ、生成す
る色素を測定することでも分析することが可能である。
電子伝達体としては、ジアホラーゼやメチルフェナジウ
ムメチルスルフェート、メチレンブルー、フェリシアン
化カリウムなどが例示される。また、色素としてはテト
ラゾリウム塩、インドフェノールなどが挙げられる。ま
た、サルコシン脱水素酵素は哺乳動物やシュードモナス
属微生物などから直接、もしくは該酵素の遺伝子を遺伝
子工学的手法で作製した組換え体より採取可能である。
するサルコシンは、サルコシンオキシダーゼを作用させ
ることにより生成するホルムアルデヒドまたは過酸化水
素を上述方法により分析できる他、電子伝達体、発色色
素の存在下でサルコシン脱水素酵素を作用させ、生成す
る色素を測定することでも分析することが可能である。
電子伝達体としては、ジアホラーゼやメチルフェナジウ
ムメチルスルフェート、メチレンブルー、フェリシアン
化カリウムなどが例示される。また、色素としてはテト
ラゾリウム塩、インドフェノールなどが挙げられる。ま
た、サルコシン脱水素酵素は哺乳動物やシュードモナス
属微生物などから直接、もしくは該酵素の遺伝子を遺伝
子工学的手法で作製した組換え体より採取可能である。
【００８１】ジメチルグリシンオキシダーゼにより（場
合によっては、さらにサルコシンオキシダーゼにより）
生成するホルムアルデヒドは、好ましくは、グルタチオ
ン、グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素お
よび酸化型補酵素、および必要に応じて当該酸化型酵素
とは異なる種類の還元型補酵素を試料に作用させて、生
成もしくは消費され化合物を分析することにより測定す
ることができる。
合によっては、さらにサルコシンオキシダーゼにより）
生成するホルムアルデヒドは、好ましくは、グルタチオ
ン、グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素お
よび酸化型補酵素、および必要に応じて当該酸化型酵素
とは異なる種類の還元型補酵素を試料に作用させて、生
成もしくは消費され化合物を分析することにより測定す
ることができる。
【００８２】グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水
素酵素としては、本発明において新たに取得された上述
の酵素を用いることが最も好ましいが、哺乳動物、高等
植物、メタノール資化性酵母、細菌などに由来する従来
公知の酵素も同様に使用することができる。例えば、市
販品である、キャンジダ（Candida）属酵母由来の酵素
などを使用することができる。具体的には、シグマ製FO
RMALDEHYDE DEHYDROGENASE (Glutathione dependent)等
が挙げられる。
素酵素としては、本発明において新たに取得された上述
の酵素を用いることが最も好ましいが、哺乳動物、高等
植物、メタノール資化性酵母、細菌などに由来する従来
公知の酵素も同様に使用することができる。例えば、市
販品である、キャンジダ（Candida）属酵母由来の酵素
などを使用することができる。具体的には、シグマ製FO
RMALDEHYDE DEHYDROGENASE (Glutathione dependent)等
が挙げられる。
【００８３】該酵素は酵素蛋白質をコードする遺伝子を
生産菌から単離し、遺伝子工学的技術により発現させた
ものであっても良く、更には、例えば酵素比活性や安定
性を向上させるなど、酵素特性を改変した変異体や化学
修飾酵素も含まれる。
生産菌から単離し、遺伝子工学的技術により発現させた
ものであっても良く、更には、例えば酵素比活性や安定
性を向上させるなど、酵素特性を改変した変異体や化学
修飾酵素も含まれる。
【００８４】補酵素としては、ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド類（ＮＡＤ類）、ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドリン酸類（ＮＡＤＰ類）、チオニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド類（チオＮＡＤ類）ま
たはチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
類（チオＮＡＤＰ類）が挙げられ、ＮＡＤ類またはＮＡ
ＤＰ類は、グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素
酵素が補酵素として利用できるものを適宜使用すれば良
いが、公知のものではＮＡＤ類として、ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド、アセチルピリジンアデニンジ
ヌクレオチド、アセチルピリジンアデニンヒポキサンチ
ンジヌクレオチド、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌ
クレオチドなどが、ＮＡＤＰ類としてはニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドリン酸、アセチルピリジンアデ
ニンジヌクレオチドリン酸、アセチルピリジンアデニン
ヒポキサンチンジヌクレオチドリン酸、ニコチンアミド
ヒポキサンチンジヌクレオチドリン酸などが例示され
る。また、チオＮＡＤ類またはチオＮＡＤＰ類において
も、グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素が
補酵素として利用可能なものを適宜使用可能であるが、
公知のものとして、チオニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレ
オチド、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチ
ドリン酸などが具体例として挙げられる。
ジヌクレオチド類（ＮＡＤ類）、ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドリン酸類（ＮＡＤＰ類）、チオニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド類（チオＮＡＤ類）ま
たはチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
類（チオＮＡＤＰ類）が挙げられ、ＮＡＤ類またはＮＡ
ＤＰ類は、グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素
酵素が補酵素として利用できるものを適宜使用すれば良
いが、公知のものではＮＡＤ類として、ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド、アセチルピリジンアデニンジ
ヌクレオチド、アセチルピリジンアデニンヒポキサンチ
ンジヌクレオチド、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌ
クレオチドなどが、ＮＡＤＰ類としてはニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドリン酸、アセチルピリジンアデ
ニンジヌクレオチドリン酸、アセチルピリジンアデニン
ヒポキサンチンジヌクレオチドリン酸、ニコチンアミド
ヒポキサンチンジヌクレオチドリン酸などが例示され
る。また、チオＮＡＤ類またはチオＮＡＤＰ類において
も、グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素が
補酵素として利用可能なものを適宜使用可能であるが、
公知のものとして、チオニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレ
オチド、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチ
ドリン酸などが具体例として挙げられる。
【００８５】従来公知のグルタチオン依存性ホルムアル
デヒド脱水素酵素を用いた場合のホルムアルデヒドの測
定方法としては、本発明の新規グルタチオン依存性ホル
ムアルデヒド脱水素酵素について上述したもののうち、
サイクリング反応を介した測定法を除くいかなる手段も
同様に用いることができる。
デヒド脱水素酵素を用いた場合のホルムアルデヒドの測
定方法としては、本発明の新規グルタチオン依存性ホル
ムアルデヒド脱水素酵素について上述したもののうち、
サイクリング反応を介した測定法を除くいかなる手段も
同様に用いることができる。
【００８６】ベタイン−ホモシステインメチル転移酵
素、本発明のジメチルグリシンオキシダーゼおよびグル
タチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素を用いた本
発明の測定方法によれば、試料中の濃度が１μｍｏｌ／
Ｌ以下の微量のホモシステインの検出が可能となる。
素、本発明のジメチルグリシンオキシダーゼおよびグル
タチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素を用いた本
発明の測定方法によれば、試料中の濃度が１μｍｏｌ／
Ｌ以下の微量のホモシステインの検出が可能となる。
【００８７】本発明はまた、上記のホモシステインの測
定方法に使用するための試薬キットを提供する。本発明
のホモシステイン測定用試薬キットは、緩衝液、ベタイ
ン、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素、チオー
ル化合物に対して安定な本発明のジメチルグリシンオキ
シダーゼ、およびこれらの酵素反応により生成するホル
ムアルデヒド、サルコシンまたは過酸化水素の少なくと
も１種を分析するための試薬を含有してなる。さらにサ
ルコシンオキシダーゼを含んでいてもよい。ベタイン−
ホモシステインメチル転移酵素、サルコシンオキシダー
ゼに関しては、上述したようなものが好ましいが、特に
限定はされない。ここで酵素反応により生成するホルム
アルデヒド、サルコシン、または過酸化水素を分析する
ための試薬とは、具体的には上述したような原理に基づ
くものが挙げられる。即ち、ホルムアルデヒドを分析す
るための試薬としては、ホルムアルデヒド脱水素酵素、
ホルムアルデヒドオキシダーゼ、Ｈａｎｚ試薬、ＣＴＡ
試薬（J. Biol. Chem., 231, 813 (1958)）、Ｐｕｒｐ
ａｌｄ試薬（Anal. Biochem., 234(1), 50 (1996)）や
フェニルヒドラジン、フェリアン化カリウム、クロロホ
ルム、メタノールを組み合わせた試薬などがある。過酸
化水素を分析するための試薬としては、ペルオキシダー
ゼ、酸化系発色試薬及び、必要に応じて４−アミノアン
チピリンや３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンなどの
カップラー、カタラーゼ、酸化チタン試薬、過マンガン
酸カリウムなどがある。また、サルコシンを分析するた
めの試薬としては、サルコシンオキシダーゼおよび該酵
素反応により生成するホルムアルデヒド、過酸化水素を
分析するための上記試薬、サルコシン脱水素酵素、電子
伝達体、発色色素などがある。
定方法に使用するための試薬キットを提供する。本発明
のホモシステイン測定用試薬キットは、緩衝液、ベタイ
ン、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素、チオー
ル化合物に対して安定な本発明のジメチルグリシンオキ
シダーゼ、およびこれらの酵素反応により生成するホル
ムアルデヒド、サルコシンまたは過酸化水素の少なくと
も１種を分析するための試薬を含有してなる。さらにサ
ルコシンオキシダーゼを含んでいてもよい。ベタイン−
ホモシステインメチル転移酵素、サルコシンオキシダー
ゼに関しては、上述したようなものが好ましいが、特に
限定はされない。ここで酵素反応により生成するホルム
アルデヒド、サルコシン、または過酸化水素を分析する
ための試薬とは、具体的には上述したような原理に基づ
くものが挙げられる。即ち、ホルムアルデヒドを分析す
るための試薬としては、ホルムアルデヒド脱水素酵素、
ホルムアルデヒドオキシダーゼ、Ｈａｎｚ試薬、ＣＴＡ
試薬（J. Biol. Chem., 231, 813 (1958)）、Ｐｕｒｐ
ａｌｄ試薬（Anal. Biochem., 234(1), 50 (1996)）や
フェニルヒドラジン、フェリアン化カリウム、クロロホ
ルム、メタノールを組み合わせた試薬などがある。過酸
化水素を分析するための試薬としては、ペルオキシダー
ゼ、酸化系発色試薬及び、必要に応じて４−アミノアン
チピリンや３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンなどの
カップラー、カタラーゼ、酸化チタン試薬、過マンガン
酸カリウムなどがある。また、サルコシンを分析するた
めの試薬としては、サルコシンオキシダーゼおよび該酵
素反応により生成するホルムアルデヒド、過酸化水素を
分析するための上記試薬、サルコシン脱水素酵素、電子
伝達体、発色色素などがある。
【００８８】特に好ましい態様においては、本発明のホ
モシステイン測定用試薬キットは、緩衝液、ベタイン、
ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素、チオール化
合物に対して安定な本発明のジメチルグリシンオキシダ
ーゼ、グルタチオン、グルタチオン依存性ホルムアルデ
ヒド脱水素酵素および該グルタチオン依存性ホルムアル
デヒド脱水素酵素が利用し得る酸化型補酵素を含有して
なる。必要に応じてサルコシンオキシダーゼをさらに含
むことができる。ベタイン、ベタイン−ホモシステイン
メチル転移酵素、グルタチオン依存性ホルムアルデヒド
脱水素酵素および酸化型補酵素としては、上述のものが
好ましく使用できる。また、グルタチオン依存性ホルム
アルデヒド脱水素酵素として、本発明において新たに得
られた酵素を使用し、サイクリング反応を介してホルム
アルデヒドを測定する場合には、該試薬キットは、上記
酸化型補酵素とは異なる種類の還元型補酵素をさらに含
むことが好ましい。
モシステイン測定用試薬キットは、緩衝液、ベタイン、
ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素、チオール化
合物に対して安定な本発明のジメチルグリシンオキシダ
ーゼ、グルタチオン、グルタチオン依存性ホルムアルデ
ヒド脱水素酵素および該グルタチオン依存性ホルムアル
デヒド脱水素酵素が利用し得る酸化型補酵素を含有して
なる。必要に応じてサルコシンオキシダーゼをさらに含
むことができる。ベタイン、ベタイン−ホモシステイン
メチル転移酵素、グルタチオン依存性ホルムアルデヒド
脱水素酵素および酸化型補酵素としては、上述のものが
好ましく使用できる。また、グルタチオン依存性ホルム
アルデヒド脱水素酵素として、本発明において新たに得
られた酵素を使用し、サイクリング反応を介してホルム
アルデヒドを測定する場合には、該試薬キットは、上記
酸化型補酵素とは異なる種類の還元型補酵素をさらに含
むことが好ましい。
【００８９】緩衝液としては、トリス塩酸緩衝液、リン
酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液など、上記の
ホルムアルデヒド測定用試薬キット中に含まれる緩衝液
として例示されたものが同様に使用可能である。緩衝液
の種類、濃度およびｐＨは、各試薬成分の保存および酵
素反応など目的に応じて一種もしくは複数が選択される
が、いずれの緩衝液を用いるに際しても、酵素反応時の
ｐＨとしては５．０〜１０．０の範囲で使用されること
が好ましい。
酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液など、上記の
ホルムアルデヒド測定用試薬キット中に含まれる緩衝液
として例示されたものが同様に使用可能である。緩衝液
の種類、濃度およびｐＨは、各試薬成分の保存および酵
素反応など目的に応じて一種もしくは複数が選択される
が、いずれの緩衝液を用いるに際しても、酵素反応時の
ｐＨとしては５．０〜１０．０の範囲で使用されること
が好ましい。
【００９０】また、本発明のホモシステイン測定用試薬
キットを構成する試薬には、上記のホルムアルデヒド測
定用試薬キットを構成する試薬の安定化剤として例示さ
れた、各種の金属塩、蛋白質、アミノ酸、糖、有機酸な
どを同様に含有させることができる。さらに、試薬性能
に悪影響を及ぼさない範囲で上述のような防腐剤や界面
活性剤を添加してもよい。
キットを構成する試薬には、上記のホルムアルデヒド測
定用試薬キットを構成する試薬の安定化剤として例示さ
れた、各種の金属塩、蛋白質、アミノ酸、糖、有機酸な
どを同様に含有させることができる。さらに、試薬性能
に悪影響を及ぼさない範囲で上述のような防腐剤や界面
活性剤を添加してもよい。
【００９１】本発明のホモシステイン測定用試薬キット
は、上記の各試薬成分を、それぞれ単独で保存すること
もできるし、あるいは２以上の成分を同一の試薬中に保
存することもできる。したがって、本発明の試薬キット
は、上記の全ての試薬成分を含有してなる単一の試薬組
成物であってもよい。しかしながら、互いに干渉を与え
る成分が存在するか、または単一の保存条件で安定性の
確保が難しい成分が存在する場合には、構成成分を分割
して保存することが好ましい。
は、上記の各試薬成分を、それぞれ単独で保存すること
もできるし、あるいは２以上の成分を同一の試薬中に保
存することもできる。したがって、本発明の試薬キット
は、上記の全ての試薬成分を含有してなる単一の試薬組
成物であってもよい。しかしながら、互いに干渉を与え
る成分が存在するか、または単一の保存条件で安定性の
確保が難しい成分が存在する場合には、構成成分を分割
して保存することが好ましい。
【００９２】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００９３】実施例１ グルタチオン依存性ホルムアル
デヒド脱水素酵素の取得 本発明のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵
素の活性測定は以下の試薬及び測定条件にて行った。 〈試薬〉 試薬Ａ １００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
５） 試薬Ｂ １０ｍＭ 酸化型ＮＡＤ水溶液 試薬Ｃ ２０ｍＭ ホルムアルデヒド水溶液 試薬Ｄ ２０ｍＭ グルタチオン水溶液 〈測定条件〉試薬Ａ、試薬Ｂ、試薬Ｃおよび試薬Ｄを各
２．１ｍｌ、０．３ｍｌ、０．３ｍｌ、０．３ｍｌの割
合で混合し、試薬混液を作成する。この試薬混液３ｍｌ
を３７℃で約５分間予備加温した後、０．１ｍｌの酵素
溶液を加えて混和し、３７℃で４分間反応させる。この
時、３４０ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化を測
定する。盲検は酵素溶液の代わりに蒸留水を試薬混液に
加えて、以下同様に吸光度変化を測定する。上記条件に
て１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成する酵素
量を１単位（Ｕ）とする。
デヒド脱水素酵素の取得 本発明のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵
素の活性測定は以下の試薬及び測定条件にて行った。 〈試薬〉 試薬Ａ １００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
５） 試薬Ｂ １０ｍＭ 酸化型ＮＡＤ水溶液 試薬Ｃ ２０ｍＭ ホルムアルデヒド水溶液 試薬Ｄ ２０ｍＭ グルタチオン水溶液 〈測定条件〉試薬Ａ、試薬Ｂ、試薬Ｃおよび試薬Ｄを各
２．１ｍｌ、０．３ｍｌ、０．３ｍｌ、０．３ｍｌの割
合で混合し、試薬混液を作成する。この試薬混液３ｍｌ
を３７℃で約５分間予備加温した後、０．１ｍｌの酵素
溶液を加えて混和し、３７℃で４分間反応させる。この
時、３４０ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化を測
定する。盲検は酵素溶液の代わりに蒸留水を試薬混液に
加えて、以下同様に吸光度変化を測定する。上記条件に
て１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成する酵素
量を１単位（Ｕ）とする。
【００９４】メタノール資化性酵母ハンゼヌラ・ノンフ
ァーメンタンスＩＦＯ１４７３株を６０ｍｌのＹＰＤ培
地（１％ Ｄ−グルコース、１％ ポリペプトン、１％
酵母エキス；ｐＨ５．０）に一白金耳植菌し、３０℃、
２４時間振とう培養後、６Ｌのグルタチオン依存性ホル
ムアルデヒド脱水素酵素生産培地（２％ メタノール、
０．５％ Ｄ−グルコース、１％ ポリペプトン、１．６
％ 酵母エキス、０．２％ リン酸水素二カリウム、０．
７％ リン酸二水素一カリウム）に移し、３０℃、４８
時間通気攪拌培養した。培養終了後、培養液を遠心分離
し、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸
濁した。次いで、菌体をガラスビーズで破砕し、遠心分
離を行って上清液を得た。得られた酵素液をポリエチレ
ンイミンによる除核酸処理および硫安分画後、セファデ
ックスＧ−２５による脱塩処理、ＤＥＡＥセファロース
クロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグ
ラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー
およびスーパーデックス２００ゲル濾過クロマトグラフ
ィーにより分離精製し、精製酵素標品約９０ｍｇを得
た。該方法により得た標品は電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）的に単一なバンドを示し、この時の比活性は約２５
０Ｕ／ｍｇ蛋白質であった。
ァーメンタンスＩＦＯ１４７３株を６０ｍｌのＹＰＤ培
地（１％ Ｄ−グルコース、１％ ポリペプトン、１％
酵母エキス；ｐＨ５．０）に一白金耳植菌し、３０℃、
２４時間振とう培養後、６Ｌのグルタチオン依存性ホル
ムアルデヒド脱水素酵素生産培地（２％ メタノール、
０．５％ Ｄ−グルコース、１％ ポリペプトン、１．６
％ 酵母エキス、０．２％ リン酸水素二カリウム、０．
７％ リン酸二水素一カリウム）に移し、３０℃、４８
時間通気攪拌培養した。培養終了後、培養液を遠心分離
し、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸
濁した。次いで、菌体をガラスビーズで破砕し、遠心分
離を行って上清液を得た。得られた酵素液をポリエチレ
ンイミンによる除核酸処理および硫安分画後、セファデ
ックスＧ−２５による脱塩処理、ＤＥＡＥセファロース
クロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグ
ラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー
およびスーパーデックス２００ゲル濾過クロマトグラフ
ィーにより分離精製し、精製酵素標品約９０ｍｇを得
た。該方法により得た標品は電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）的に単一なバンドを示し、この時の比活性は約２５
０Ｕ／ｍｇ蛋白質であった。
【００９５】また、上記方法で得たグルタチオン依存性
ホルムアルデヒド脱水素酵素の酵素活性を、試薬Ｂの酸
化型ＮＡＤの代わりに酸化型チオＮＡＤを用いた以外は
上記活性測定条件と同じ条件で測定した結果、この酵素
の酸化型チオＮＡＤに対する反応性は、酸化型ＮＡＤに
対するそれの６１％であった。
ホルムアルデヒド脱水素酵素の酵素活性を、試薬Ｂの酸
化型ＮＡＤの代わりに酸化型チオＮＡＤを用いた以外は
上記活性測定条件と同じ条件で測定した結果、この酵素
の酸化型チオＮＡＤに対する反応性は、酸化型ＮＡＤに
対するそれの６１％であった。
【００９６】一方、比較例として、市販のグルタチオン
依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素（Candida boidinii
由来；ＳＩＧＭＡ社製）の酵素活性を、同様に測定した
結果、当該酵素の酸化型チオＮＡＤに対する反応性は、
酸化型ＮＡＤに対するそれの２２％であった。
依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素（Candida boidinii
由来；ＳＩＧＭＡ社製）の酵素活性を、同様に測定した
結果、当該酵素の酸化型チオＮＡＤに対する反応性は、
酸化型ＮＡＤに対するそれの２２％であった。
【００９７】実施例２ ベタイン−ホモシステインメチ
ル転移酵素の取得 本発明のベタイン−ホモシステインメチル転移酵素の活
性測定は以下の試薬及び測定条件で行った。 〈試薬〉 試薬Ａ ５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
５） 試薬Ｂ １００ｍＭ ＤＬ−ホモシステイン溶液（試薬
Ａで溶解） 試薬Ｃ １００ｍＭ ベタイン（試薬Ａで溶解） 試薬Ｄ ０．２％ ペンタシアノアンミン鉄（III）ナト
リウム水溶液 試薬Ｅ 酢酸 試薬Ｆ １０％ 亜硝酸ナトリウム水溶液 〈測定条件〉酵素溶液２．３ｍｌに試薬Ｂ、試薬Ｃを各
０．０７５ｍｌ、０．１２５ｍｌを加えて混和後、３７
℃で１時間反応させる。反応終了後、直ちに試薬Ｄを５
ｍｌ加えて攪拌し、一分間放置後、更に試薬Ｅ、試薬Ｆ
の順に各１ｍｌずつ加えて攪拌する。室温で３０分間放
置後５２０ｎｍにおける吸光度を測定する。試薬Ａに溶
解したＬ−メチオニンを酵素溶液の代わりに用いて同様
の手順にて測定した吸光度より標準曲線を作成し、これ
から酵素反応により生成したメチオニンの量を測定す
る。上記条件にて１時間に１マイクロモルのメチオニン
を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
ル転移酵素の取得 本発明のベタイン−ホモシステインメチル転移酵素の活
性測定は以下の試薬及び測定条件で行った。 〈試薬〉 試薬Ａ ５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
５） 試薬Ｂ １００ｍＭ ＤＬ−ホモシステイン溶液（試薬
Ａで溶解） 試薬Ｃ １００ｍＭ ベタイン（試薬Ａで溶解） 試薬Ｄ ０．２％ ペンタシアノアンミン鉄（III）ナト
リウム水溶液 試薬Ｅ 酢酸 試薬Ｆ １０％ 亜硝酸ナトリウム水溶液 〈測定条件〉酵素溶液２．３ｍｌに試薬Ｂ、試薬Ｃを各
０．０７５ｍｌ、０．１２５ｍｌを加えて混和後、３７
℃で１時間反応させる。反応終了後、直ちに試薬Ｄを５
ｍｌ加えて攪拌し、一分間放置後、更に試薬Ｅ、試薬Ｆ
の順に各１ｍｌずつ加えて攪拌する。室温で３０分間放
置後５２０ｎｍにおける吸光度を測定する。試薬Ａに溶
解したＬ−メチオニンを酵素溶液の代わりに用いて同様
の手順にて測定した吸光度より標準曲線を作成し、これ
から酵素反応により生成したメチオニンの量を測定す
る。上記条件にて１時間に１マイクロモルのメチオニン
を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【００９８】遺伝子の塩基配列が公知であるヒト由来の
ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素（J. Biol. C
hem., 271(37), 22831 (1998)）をコードする遺伝子の
全長を増幅可能な２種のプライマー（配列表の配列番号
１および２に記載）を作成し、これを用いてヒト肝臓ｃ
ＤＮＡ（クロンテック製）を鋳型として、ポリメラーゼ
チェーンリアクション（ＰＣＲ）法によりヒト由来のベ
タイン−ホモシステインメチル転移酵素をコードするＤ
ＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲは以下に示す反応液組成及
び反応条件にて実施した。 〈反応液組成〉 ＫＯＤPlus ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製） １Ｕ／５０μｌ １０倍濃度添付バッファー ５μｌ／５０μｌ 鋳型ｃＤＮＡ １．５μｇ／５０μｌ ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ 各０．２ｍＭ プライマー 各２５pmol／５０μｌ 〈反応条件；下記（２）〜（４）を計３０サイクル実施した〉 （１）９５℃、２分間 （変性） （２）９５℃、３０秒間（変性） （３）６０℃、３０秒間（アニーリング） （４）６８℃、１分間 （伸長反応）
ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素（J. Biol. C
hem., 271(37), 22831 (1998)）をコードする遺伝子の
全長を増幅可能な２種のプライマー（配列表の配列番号
１および２に記載）を作成し、これを用いてヒト肝臓ｃ
ＤＮＡ（クロンテック製）を鋳型として、ポリメラーゼ
チェーンリアクション（ＰＣＲ）法によりヒト由来のベ
タイン−ホモシステインメチル転移酵素をコードするＤ
ＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲは以下に示す反応液組成及
び反応条件にて実施した。 〈反応液組成〉 ＫＯＤPlus ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製） １Ｕ／５０μｌ １０倍濃度添付バッファー ５μｌ／５０μｌ 鋳型ｃＤＮＡ １．５μｇ／５０μｌ ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ 各０．２ｍＭ プライマー 各２５pmol／５０μｌ 〈反応条件；下記（２）〜（４）を計３０サイクル実施した〉 （１）９５℃、２分間 （変性） （２）９５℃、３０秒間（変性） （３）６０℃、３０秒間（アニーリング） （４）６８℃、１分間 （伸長反応）
【００９９】ＰＣＲ反応後、反応液の一部をアガロース
ゲル電気泳動に供し、約１．２Ｋｂｐの単一の増幅バン
ドを確認した。この増幅断片をＤＮＡ断片精製キット
（MagExtractor PCR&Gel Clean Up；東洋紡績製）を用
いて回収した後、このＤＮＡ断片をＮｄｅＩおよびＢａ
ｍＨＩ制限酵素にて処理した。次いで、ｐＥＴ１１ａプ
ラスミド（ストラタジーン製）をＮｄｅＩおよびＢａｍ
ＨＩ制限酵素で処理し、これを上記ＤＮＡ断片とＴ４
ＤＮＡリガーゼ（東洋紡績製）を用いて連結した。これ
を用いてEpicurian Coli BL21 (DE3)-CodonPlusTM-RIL
コンピテントセル（ストラタジーン製）を形質転換し、
アンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、
０．５％ 酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ、１００μｇ
／ｍｌアンピシリン；ｐＨ７．２）に塗布し、３７℃で
１６時間培養した。
ゲル電気泳動に供し、約１．２Ｋｂｐの単一の増幅バン
ドを確認した。この増幅断片をＤＮＡ断片精製キット
（MagExtractor PCR&Gel Clean Up；東洋紡績製）を用
いて回収した後、このＤＮＡ断片をＮｄｅＩおよびＢａ
ｍＨＩ制限酵素にて処理した。次いで、ｐＥＴ１１ａプ
ラスミド（ストラタジーン製）をＮｄｅＩおよびＢａｍ
ＨＩ制限酵素で処理し、これを上記ＤＮＡ断片とＴ４
ＤＮＡリガーゼ（東洋紡績製）を用いて連結した。これ
を用いてEpicurian Coli BL21 (DE3)-CodonPlusTM-RIL
コンピテントセル（ストラタジーン製）を形質転換し、
アンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、
０．５％ 酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ、１００μｇ
／ｍｌアンピシリン；ｐＨ７．２）に塗布し、３７℃で
１６時間培養した。
【０１００】得られたコロニーは、アンピシリンを含む
ＬＢ培地６０ｍｌで３０℃、１６時間振とう培養後、塩
化亜鉛およびアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（１．６
％ポリペプトン、１％ 酵母エキス、０．５％ ＮａＣ
ｌ、３４μｇ／ｍｌ 塩化亜鉛、１００ｍｇ／ｍｌ アン
ピシリン；ｐＨ７．２）６Ｌに接種し、３７℃で通気攪
拌培養した。約２．５時間後、培養液の６００ｎｍの吸
光度が約１．０に達した時点で、イソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトピラノシドを１ｍＭになるように添加
し、更に４時間培養を行った。培養終了後、培養液を遠
心分離し、菌体を５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、
１ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７．５）に懸濁した。次いで、菌体をフレンチプ
レスで破砕し、遠心分離を行って上清液を得た。得られ
た酵素液をポリエチレンイミンによる除核酸処理後、セ
ファデックスＧ−２５による脱塩処理、ＤＥＡＥセファ
ロースクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロ
マトグラフィー、スーパーデックス２００ゲル濾過クロ
マトグラフィーにより分離精製し、精製酵素標品約５０
ｍｇを得た。該方法により得た標品は電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）的に単一なバンドを示し、この時の比活性
は約２．１Ｕ／ｍｇ−蛋白質であった。
ＬＢ培地６０ｍｌで３０℃、１６時間振とう培養後、塩
化亜鉛およびアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（１．６
％ポリペプトン、１％ 酵母エキス、０．５％ ＮａＣ
ｌ、３４μｇ／ｍｌ 塩化亜鉛、１００ｍｇ／ｍｌ アン
ピシリン；ｐＨ７．２）６Ｌに接種し、３７℃で通気攪
拌培養した。約２．５時間後、培養液の６００ｎｍの吸
光度が約１．０に達した時点で、イソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトピラノシドを１ｍＭになるように添加
し、更に４時間培養を行った。培養終了後、培養液を遠
心分離し、菌体を５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、
１ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７．５）に懸濁した。次いで、菌体をフレンチプ
レスで破砕し、遠心分離を行って上清液を得た。得られ
た酵素液をポリエチレンイミンによる除核酸処理後、セ
ファデックスＧ−２５による脱塩処理、ＤＥＡＥセファ
ロースクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロ
マトグラフィー、スーパーデックス２００ゲル濾過クロ
マトグラフィーにより分離精製し、精製酵素標品約５０
ｍｇを得た。該方法により得た標品は電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）的に単一なバンドを示し、この時の比活性
は約２．１Ｕ／ｍｇ−蛋白質であった。
【０１０１】実施例３ ジメチルグリシンオキシダーゼ
の取得 本発明のジメチルグリシンオキシダーゼの活性測定は以
下の試薬及び測定条件により行った。〈試薬〉 試薬Ａ １００ｍＭ ジメチルグリシン溶液（１００ｍ
Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で溶解） 試薬Ｂ ０．１％ ４−アミノアンチピリン水溶液 試薬Ｃ ０．１％ フェノール水溶液 試薬Ｄ ２５Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ（東洋紡績
製；ＰＥＯ−３０１）水溶液 〈測定条件〉試薬Ａ、試薬Ｂ、試薬Ｃおよび試薬Ｄを各
１．５ｍｌ、０．３ｍｌ、０．６ｍｌ、０．６ｍｌの割
合で混合し、試薬混液を作成する。この試薬混液３ｍｌ
を３７℃で約５分間予備加温した後、０．１ｍｌの酵素
溶液を加えて混和し、３７℃で４分間反応させる。この
時、５００ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化を測
定する。盲検は酵素溶液の代わりに蒸留水を試薬混液に
加えて、以下同様に吸光度変化を測定する。上記条件に
て１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成する酵素
量を１単位（Ｕ）とする。
の取得 本発明のジメチルグリシンオキシダーゼの活性測定は以
下の試薬及び測定条件により行った。〈試薬〉 試薬Ａ １００ｍＭ ジメチルグリシン溶液（１００ｍ
Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で溶解） 試薬Ｂ ０．１％ ４−アミノアンチピリン水溶液 試薬Ｃ ０．１％ フェノール水溶液 試薬Ｄ ２５Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ（東洋紡績
製；ＰＥＯ−３０１）水溶液 〈測定条件〉試薬Ａ、試薬Ｂ、試薬Ｃおよび試薬Ｄを各
１．５ｍｌ、０．３ｍｌ、０．６ｍｌ、０．６ｍｌの割
合で混合し、試薬混液を作成する。この試薬混液３ｍｌ
を３７℃で約５分間予備加温した後、０．１ｍｌの酵素
溶液を加えて混和し、３７℃で４分間反応させる。この
時、５００ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化を測
定する。盲検は酵素溶液の代わりに蒸留水を試薬混液に
加えて、以下同様に吸光度変化を測定する。上記条件に
て１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成する酵素
量を１単位（Ｕ）とする。
【０１０２】（１）アルスロバクター・ニコチアナエＩ
ＦＯ１４２３４株からの単離 アルスロバクター・ニコチアナエＩＦＯ１４２３４株を
６０ｍｌのＬＢ培地（１％ ポリペプトン、０．５％ 酵
母エキス、０．５％ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に一白金
耳植菌し、３０℃、１６時間振とう培養後、６Ｌのジメ
チルグリシンオキシダーゼ生産培地（２％ ベタイン、
１％ ポリペプトン、１．６％ 酵母エキス、１．４％
リン酸水素二カリウム、０．５５％ リン酸二水素一カ
リウム）に移し、３０℃、４０時間通気攪拌培養した。
培養終了後、培養液を遠心分離し、２０ｍＭ リン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。次いで、菌体
をガラスビーズで破砕し、遠心分離を行って上清液を得
た。得られた酵素液をポリエチレンイミンによる除核酸
処理および硫安分画後、セファデックスＧ−２５による
脱塩処理、ＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィー、
フェニルセファロースクロマトグラフィー、スーパーデ
ックス２００ゲル濾過クロマトグラフィーにより分離精
製し、精製酵素標品約１１０ｍｇを得た。該方法により
得た標品は電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一なバ
ンドを示し、この時の比活性は約９．３Ｕ／ｍｇ蛋白質
であった。
ＦＯ１４２３４株からの単離 アルスロバクター・ニコチアナエＩＦＯ１４２３４株を
６０ｍｌのＬＢ培地（１％ ポリペプトン、０．５％ 酵
母エキス、０．５％ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に一白金
耳植菌し、３０℃、１６時間振とう培養後、６Ｌのジメ
チルグリシンオキシダーゼ生産培地（２％ ベタイン、
１％ ポリペプトン、１．６％ 酵母エキス、１．４％
リン酸水素二カリウム、０．５５％ リン酸二水素一カ
リウム）に移し、３０℃、４０時間通気攪拌培養した。
培養終了後、培養液を遠心分離し、２０ｍＭ リン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。次いで、菌体
をガラスビーズで破砕し、遠心分離を行って上清液を得
た。得られた酵素液をポリエチレンイミンによる除核酸
処理および硫安分画後、セファデックスＧ−２５による
脱塩処理、ＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィー、
フェニルセファロースクロマトグラフィー、スーパーデ
ックス２００ゲル濾過クロマトグラフィーにより分離精
製し、精製酵素標品約１１０ｍｇを得た。該方法により
得た標品は電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一なバ
ンドを示し、この時の比活性は約９．３Ｕ／ｍｇ蛋白質
であった。
【０１０３】また、上記方法で得たジメチルグリシンオ
キシダーゼの酵素活性を、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ ジチ
オスレイトール存在下で測定した以外は上記活性測定条
件と同じ条件で測定した結果、その活性値はジチオスレ
イトール非存在下と比べて７１％であった。
キシダーゼの酵素活性を、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ ジチ
オスレイトール存在下で測定した以外は上記活性測定条
件と同じ条件で測定した結果、その活性値はジチオスレ
イトール非存在下と比べて７１％であった。
【０１０４】（２）ストレプトマイセス・ミュータビリ
スＩＦＯ１２８００株からの単離 ストレプトマイセス・ミュータビリスＩＦＯ１２８００
株を、６０ｍｌのジメチルグリシン生産培地（２％ ベ
タイン、１％ ポリペプトン、１．６％ 酵母エキス、
１．４％ リン酸ニ水素カリウム、０．５５％ リン酸水
素ニカリウム）に一白金耳接種し、３０℃、７２時間振
とう培養した。培養終了後、培養液を遠心分離し、回収
した菌体を２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
５）に懸濁した。次いで、菌体をガラスビーズで破砕
し、遠心分離を行い、得られた抽出液をセファデックス
Ｇ−２５により脱塩処理した。
スＩＦＯ１２８００株からの単離 ストレプトマイセス・ミュータビリスＩＦＯ１２８００
株を、６０ｍｌのジメチルグリシン生産培地（２％ ベ
タイン、１％ ポリペプトン、１．６％ 酵母エキス、
１．４％ リン酸ニ水素カリウム、０．５５％ リン酸水
素ニカリウム）に一白金耳接種し、３０℃、７２時間振
とう培養した。培養終了後、培養液を遠心分離し、回収
した菌体を２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
５）に懸濁した。次いで、菌体をガラスビーズで破砕
し、遠心分離を行い、得られた抽出液をセファデックス
Ｇ−２５により脱塩処理した。
【０１０５】また、上記抽出液について、ジメチルグリ
シンオキシダーゼの酵素活性を、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ
ジチオスレイトール存在下で測定した以外は上記活性
測定条件と同じ条件で測定した結果、その活性値はジチ
オスレイトール非存在下と比べて９８％であった。
シンオキシダーゼの酵素活性を、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ
ジチオスレイトール存在下で測定した以外は上記活性
測定条件と同じ条件で測定した結果、その活性値はジチ
オスレイトール非存在下と比べて９８％であった。
【０１０６】さらに、上記２種のジメチルグリシンオキ
シダーゼのジメチルグリシンに対するＫｍ値を測定した
結果、アルスロバクター・ニコチアナエＩＦＯ１４２３
４株由来の酵素は１３．６ｍＭ、ストレプトマイセス・
ミュータビリスＩＦＯ１２８００株由来の酵素は１４．
３ｍＭであった。
シダーゼのジメチルグリシンに対するＫｍ値を測定した
結果、アルスロバクター・ニコチアナエＩＦＯ１４２３
４株由来の酵素は１３．６ｍＭ、ストレプトマイセス・
ミュータビリスＩＦＯ１２８００株由来の酵素は１４．
３ｍＭであった。
【０１０７】実施例４ ホルムアルデヒド標準液の測定
（１） 本実施例で使用するＳ−ホルミルグルタチオンハイドロ
ラーゼの活性測定はBiochimica. et Biophysica Acta,
614 81-91 (1980)に記載の方法に、また、ギ酸脱水素酵
素の酵素活性はEur. J. Biochem., Feb 2;62(1), 151-1
60 (1976)に記載の方法にそれぞれ従って実施した。
（１） 本実施例で使用するＳ−ホルミルグルタチオンハイドロ
ラーゼの活性測定はBiochimica. et Biophysica Acta,
614 81-91 (1980)に記載の方法に、また、ギ酸脱水素酵
素の酵素活性はEur. J. Biochem., Feb 2;62(1), 151-1
60 (1976)に記載の方法にそれぞれ従って実施した。
【０１０８】本実施例で使用するＳ−ホルミルグルタチ
オンハイドロラーゼは以下にようにして取得した。メタ
ノール資化性酵母キャンジダ・ボイディニイ（Candida
boidinii）ＩＦＯ１４７３株を６０ｍｌのＹＰＤ培地
（１％ Ｄ−グルコース、１％ ポリペプトン、１％ 酵
母エキス；ｐＨ５．０）に一白金耳植菌し、３０℃、２
４時間振とう培養後、６ＬのＳ−ホルミルグルタチオン
ハイドロラーゼ生産培地（２％ メタノール、０．５％
Ｄ−グルコース、１％ ポリペプトン、１．６％ 酵母エ
キス、０．２％ リン酸水素二カリウム、０．７％ リン
酸二水素一カリウム）に移し、３０℃、４８時間通気攪
拌培養した。培養終了後、培養液を遠心分離し、２０ｍ
Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。
次いで、菌体をガラスビーズで破砕した後、遠心分離を
行って上清液を得た。得られた酵素液をポリエチレンイ
ミンによる除核酸処理および硫安分画後、セファデック
スＧ−２５による脱塩処理、ＤＥＡＥセファロースクロ
マトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフ
ィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよ
びスーパーデックス２００ゲル濾過クロマトグラフィー
により分離精製し、精製酵素標品約１０ｍｇを得た。該
方法により得た標品は電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的
にほぼ単一なバンドを示し、この時の比活性は約９００
Ｕ／ｍｇ蛋白質であった。
オンハイドロラーゼは以下にようにして取得した。メタ
ノール資化性酵母キャンジダ・ボイディニイ（Candida
boidinii）ＩＦＯ１４７３株を６０ｍｌのＹＰＤ培地
（１％ Ｄ−グルコース、１％ ポリペプトン、１％ 酵
母エキス；ｐＨ５．０）に一白金耳植菌し、３０℃、２
４時間振とう培養後、６ＬのＳ−ホルミルグルタチオン
ハイドロラーゼ生産培地（２％ メタノール、０．５％
Ｄ−グルコース、１％ ポリペプトン、１．６％ 酵母エ
キス、０．２％ リン酸水素二カリウム、０．７％ リン
酸二水素一カリウム）に移し、３０℃、４８時間通気攪
拌培養した。培養終了後、培養液を遠心分離し、２０ｍ
Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。
次いで、菌体をガラスビーズで破砕した後、遠心分離を
行って上清液を得た。得られた酵素液をポリエチレンイ
ミンによる除核酸処理および硫安分画後、セファデック
スＧ−２５による脱塩処理、ＤＥＡＥセファロースクロ
マトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフ
ィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよ
びスーパーデックス２００ゲル濾過クロマトグラフィー
により分離精製し、精製酵素標品約１０ｍｇを得た。該
方法により得た標品は電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的
にほぼ単一なバンドを示し、この時の比活性は約９００
Ｕ／ｍｇ蛋白質であった。
【０１０９】種々の濃度のホルムアルデヒド水溶液１０
μＬを試料とし、これを１００Ｕ／ｍｌ グルタチオン
依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素（実施例１で調
製）、１ｍＭ 酸化型ＮＡＤ、３ｍＭ グルタチオン、５
Ｕ／ｍｌ Ｓ−ホルミルグルタチオンハイドロラーゼ
（上記で調製したもの）、５Ｕ／ｍｌ ギ酸脱水素酵素
（シグマ製）をそれぞれ含む５０ｍＭ リン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ７．５）３００μｌと混合し、３７℃で１
０分間反応させ、３４０ｎｍの吸光度を測定した。盲検
はホルムアルデヒド水溶液の代わりに蒸留水を試薬混液
に加えて、以下同様に吸光度変化を測定した。反応終了
時の吸光度と試料のホルムアルデヒド濃度の関係は表１
および図１に示す通りであり、ホルムアルデヒド濃度が
０〜５００μＭの範囲において直線性を示し、定量が可
能であった。なお、この測定系はサイクリング法ではな
い。
μＬを試料とし、これを１００Ｕ／ｍｌ グルタチオン
依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素（実施例１で調
製）、１ｍＭ 酸化型ＮＡＤ、３ｍＭ グルタチオン、５
Ｕ／ｍｌ Ｓ−ホルミルグルタチオンハイドロラーゼ
（上記で調製したもの）、５Ｕ／ｍｌ ギ酸脱水素酵素
（シグマ製）をそれぞれ含む５０ｍＭ リン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ７．５）３００μｌと混合し、３７℃で１
０分間反応させ、３４０ｎｍの吸光度を測定した。盲検
はホルムアルデヒド水溶液の代わりに蒸留水を試薬混液
に加えて、以下同様に吸光度変化を測定した。反応終了
時の吸光度と試料のホルムアルデヒド濃度の関係は表１
および図１に示す通りであり、ホルムアルデヒド濃度が
０〜５００μＭの範囲において直線性を示し、定量が可
能であった。なお、この測定系はサイクリング法ではな
い。
【０１１０】
【表１】
【０１１１】実施例５ ホルムアルデヒド標準液の測定
（２） 種々の濃度のホルムアルデヒド水溶液１０μＬを試料と
し、これを１００Ｕ／ｍｌ グルタチオン依存性ホルム
アルデヒド脱水素酵素（実施例１で調製）、１ｍＭ 酸
化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、０．
５ｍＭ 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド、３ｍＭ グルタチオン、０．１％ トリトンＸ−１０
０をそれぞれ含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ
８．０）３００μｌと混合し、３７℃で５分間サイクリ
ング反応を実施し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。盲
検はホルムアルデヒド水溶液の代わりに蒸留水を試薬混
液に加えて、以下同様に吸光度変化を測定した。反応開
始後１分後と５分後の吸光度の増加と、試料中のホルム
アルデヒド濃度の関係は表２および図２に示す通りであ
り、ホルムアルデヒド濃度が０〜５０μＭの範囲におい
て直線性を示し、定量が可能であった。
（２） 種々の濃度のホルムアルデヒド水溶液１０μＬを試料と
し、これを１００Ｕ／ｍｌ グルタチオン依存性ホルム
アルデヒド脱水素酵素（実施例１で調製）、１ｍＭ 酸
化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、０．
５ｍＭ 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド、３ｍＭ グルタチオン、０．１％ トリトンＸ−１０
０をそれぞれ含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ
８．０）３００μｌと混合し、３７℃で５分間サイクリ
ング反応を実施し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。盲
検はホルムアルデヒド水溶液の代わりに蒸留水を試薬混
液に加えて、以下同様に吸光度変化を測定した。反応開
始後１分後と５分後の吸光度の増加と、試料中のホルム
アルデヒド濃度の関係は表２および図２に示す通りであ
り、ホルムアルデヒド濃度が０〜５０μＭの範囲におい
て直線性を示し、定量が可能であった。
【０１１２】
【表２】
【０１１３】さらに、表２および図２からは、サイクリ
ング法において１μｍｏｌ／Ｌのホルムアルデヒドが測
定できていることがわかる。
ング法において１μｍｏｌ／Ｌのホルムアルデヒドが測
定できていることがわかる。
【０１１４】実施例６ クレアチニン標準液の測定 種々の濃度のクレアチニン水溶液５μＬを試料とし、こ
れを１００Ｕ／ｍｌクレアチニンアミドハイドロラーゼ
（東洋紡績製；ＣＮＨ−３１１）、５０Ｕ／ｍｌ クレ
アチンアミジノハイドロラーゼ（東洋紡績製；ＣＲＨ−
２２１）、１０Ｕ／ｍｌ サルコシンオキシダーゼ（東
洋紡績製；ＳＡＯ−３４１）、０．１％ トリトンＸ−
１００をそれぞれ含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）２００μｌと混合し、３７℃で５分間反応さ
せた後、３００Ｕ／ｍｌ グルタチオン依存性ホルムア
ルデヒド脱水素酵素（実施例１で調製）、３ｍＭ 酸化
型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、１．５
ｍＭ 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、
９ｍＭ グルタチオン、０．１％ トリトンＸ−１００を
それぞれ含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．
０）１００μｌを加え、３７℃で５分間サイクリング反
応を実施し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。盲検はク
レアチニン水溶液の代わりに蒸留水を試薬混液に加え
て、以下同様に吸光度変化を測定した。反応開始後１分
後と５分後の吸光度の増加と、試料中のクレアチニン濃
度の関係は表３および図３に示す通りであり、クレアチ
ニン濃度が０〜１００μＭの範囲において直線性を示
し、定量が可能であった。
れを１００Ｕ／ｍｌクレアチニンアミドハイドロラーゼ
（東洋紡績製；ＣＮＨ−３１１）、５０Ｕ／ｍｌ クレ
アチンアミジノハイドロラーゼ（東洋紡績製；ＣＲＨ−
２２１）、１０Ｕ／ｍｌ サルコシンオキシダーゼ（東
洋紡績製；ＳＡＯ−３４１）、０．１％ トリトンＸ−
１００をそれぞれ含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）２００μｌと混合し、３７℃で５分間反応さ
せた後、３００Ｕ／ｍｌ グルタチオン依存性ホルムア
ルデヒド脱水素酵素（実施例１で調製）、３ｍＭ 酸化
型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、１．５
ｍＭ 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、
９ｍＭ グルタチオン、０．１％ トリトンＸ−１００を
それぞれ含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．
０）１００μｌを加え、３７℃で５分間サイクリング反
応を実施し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。盲検はク
レアチニン水溶液の代わりに蒸留水を試薬混液に加え
て、以下同様に吸光度変化を測定した。反応開始後１分
後と５分後の吸光度の増加と、試料中のクレアチニン濃
度の関係は表３および図３に示す通りであり、クレアチ
ニン濃度が０〜１００μＭの範囲において直線性を示
し、定量が可能であった。
【０１１５】
【表３】
【０１１６】さらに、表３および図３からは、サイクリ
ング法において１０μｍｏｌ／Ｌのクレアチニンが測定
できていることがわかる。
ング法において１０μｍｏｌ／Ｌのクレアチニンが測定
できていることがわかる。
【０１１７】実施例７ ホモシステイン標準液の測定 ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素およびジメチ
ルグリシンオキシダーゼは、それぞれ実施例２および実
施例３（１）で取得したものを使用した。また、ベタイ
ン−ホモシステインメチル転移酵素およびジメチルグリ
シンオキシダーゼの活性測定は、それぞれ実施例２およ
び実施例３と同様にして行った。
ルグリシンオキシダーゼは、それぞれ実施例２および実
施例３（１）で取得したものを使用した。また、ベタイ
ン−ホモシステインメチル転移酵素およびジメチルグリ
シンオキシダーゼの活性測定は、それぞれ実施例２およ
び実施例３と同様にして行った。
【０１１８】種々の濃度のＬ−ホモシスチン水溶液を、
０．５ｍＭ ジチオスレイトール中で、３７℃、３０分
間加温して生成したＬ−ホモシステイン１０μＬを試料
とし、これを２０ｍＭ ベタイン、１Ｕ／ｍｌ ベタイン
−ホモシステインメチル転移酵素（上記で調製したも
の）、７Ｕ／ｍｌ ジメチルグリシンオキシダーゼ（上
記で調製したもの）、５Ｕ／ｍｌ サルコシンオキシダ
ーゼ（東洋紡績製；ＳＡＯ−３４１）をそれぞれ含む２
０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）２００μｌと
混合し、３７℃で５分間反応させた後、３００Ｕ／ｍｌ
グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素（実
施例１で調製）、３ｍＭ 酸化型チオニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド、１．５ｍＭ 還元型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド、９ｍＭ グルタチオン、
０．１％ トリトンＸ−１００をそれぞれ含む５０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）１００μｌを加え、３
７℃で５分間サイクリング反応を実施し、４０５ｎｍの
吸光度を測定した。盲検はＬ−ホモシステイン溶液の代
わりに０．５ｍＭ ジチオスレイトールを試薬混液に加
えて、以下同様に吸光度変化を測定した。反応開始後１
分後と５分後の吸光度の増加と、試料中のホモシステイ
ン濃度の関係は表４および図４に示す通りであり、ホモ
システイン濃度が０〜１００μＭの範囲において直線性
を示し、定量が可能であった。
０．５ｍＭ ジチオスレイトール中で、３７℃、３０分
間加温して生成したＬ−ホモシステイン１０μＬを試料
とし、これを２０ｍＭ ベタイン、１Ｕ／ｍｌ ベタイン
−ホモシステインメチル転移酵素（上記で調製したも
の）、７Ｕ／ｍｌ ジメチルグリシンオキシダーゼ（上
記で調製したもの）、５Ｕ／ｍｌ サルコシンオキシダ
ーゼ（東洋紡績製；ＳＡＯ−３４１）をそれぞれ含む２
０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）２００μｌと
混合し、３７℃で５分間反応させた後、３００Ｕ／ｍｌ
グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素（実
施例１で調製）、３ｍＭ 酸化型チオニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド、１．５ｍＭ 還元型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド、９ｍＭ グルタチオン、
０．１％ トリトンＸ−１００をそれぞれ含む５０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）１００μｌを加え、３
７℃で５分間サイクリング反応を実施し、４０５ｎｍの
吸光度を測定した。盲検はＬ−ホモシステイン溶液の代
わりに０．５ｍＭ ジチオスレイトールを試薬混液に加
えて、以下同様に吸光度変化を測定した。反応開始後１
分後と５分後の吸光度の増加と、試料中のホモシステイ
ン濃度の関係は表４および図４に示す通りであり、ホモ
システイン濃度が０〜１００μＭの範囲において直線性
を示し、定量が可能であった。
【０１１９】
【表４】
【０１２０】さらに、表４および図４からは、サイクリ
ング法において１μｍｏｌ／Ｌのホモシステインが測定
できていることがわかる。
ング法において１μｍｏｌ／Ｌのホモシステインが測定
できていることがわかる。
【０１２１】
【発明の効果】本発明のグルタチオン依存性ホルムアル
デヒド脱水素酵素はサイクリング反応が可能であるた
め、従来よりも高感度なホルムアルデヒドの測定が可能
である。従って、当該酵素を用いたホルムアルデヒドの
測定は、測定系における反応中間体としてホルムアルデ
ヒドを生成させる、ホモシステイン、クレアチニン、ク
レアチン等の生体成分の臨床検査に好適に適用できる点
で極めて有用である。一方、本発明のジメチルグリシン
オキシダーゼはチオール化合物に対して安定であるた
め、ホモシステインの多くが蛋白質や他のアミノ酸とジ
スルフィド結合した状態で存在する、血液や尿などのよ
うな生体試料における総ホモシステインの測定に好適に
使用することができ、より試薬性能に優れたホモシステ
イン定量試薬を提供できる点で有用である。
デヒド脱水素酵素はサイクリング反応が可能であるた
め、従来よりも高感度なホルムアルデヒドの測定が可能
である。従って、当該酵素を用いたホルムアルデヒドの
測定は、測定系における反応中間体としてホルムアルデ
ヒドを生成させる、ホモシステイン、クレアチニン、ク
レアチン等の生体成分の臨床検査に好適に適用できる点
で極めて有用である。一方、本発明のジメチルグリシン
オキシダーゼはチオール化合物に対して安定であるた
め、ホモシステインの多くが蛋白質や他のアミノ酸とジ
スルフィド結合した状態で存在する、血液や尿などのよ
うな生体試料における総ホモシステインの測定に好適に
使用することができ、より試薬性能に優れたホモシステ
イン定量試薬を提供できる点で有用である。
【０１２２】
配列番号１ ヒトベタイン−ホモシステインメチル転移酵素ｃＤＮＡ
を増幅するためのＰＣＲプライマーとして機能すべく設
計されたオリゴヌクレオチド。 配列番号２ ヒトベタイン−ホモシステインメチル転移酵素ｃＤＮＡ
を増幅するためのＰＣＲプライマーとして機能すべく設
計されたオリゴヌクレオチド。
を増幅するためのＰＣＲプライマーとして機能すべく設
計されたオリゴヌクレオチド。 配列番号２ ヒトベタイン−ホモシステインメチル転移酵素ｃＤＮＡ
を増幅するためのＰＣＲプライマーとして機能すべく設
計されたオリゴヌクレオチド。
【０１２３】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Toyo Boseki Kabushiki Kaisha <120> Determination Method of Biological Component and Reagent Kit Used Therefor <130> A4959 <150> JP 2000-370445 <151> 2000-12-05 <150> JP 2001-96724 <151> 2001-03-29 <160> 2 <170> PatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc feature <222> ()..() <223> Oligonucleotide designed to act as PCR primer for amplifying human betaine-homocysteine methyltransferase cDNA. <400> 1 gcaattccat atgccacccg ttgggggcaa aaaggccaag 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial/Unknown <220> <221> misc feature <222> ()..() <223> Oligonucleotide designed to act as PCR primer for amplifying human betaine-homocysteine methyltransferase cDNA. <400> 2 atcgcggatc caggctactg tgatttgaat ttttgttttt 40
【図１】実施例４における、吸光度とホルムアルデヒド
濃度との関係を示すグラフである。
濃度との関係を示すグラフである。
【図２】実施例５における、吸光度とホルムアルデヒド
濃度との関係を示すグラフである。
濃度との関係を示すグラフである。
【図３】実施例６における、吸光度とクレアチニン濃度
との関係を示すグラフである。
との関係を示すグラフである。
【図４】実施例７における、吸光度とホモシステイン濃
度との関係を示すグラフである。
度との関係を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｃ１２Ｑ 1/48 // Ｃ１２Ｎ 9/10 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 9/10 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:78 Ｃ１２Ｒ 1:78） 1:06 (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｒ 1:06） (72)発明者 服部 静夫 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内 (72)発明者 岡 正則 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内 Ｆターム(参考） 4B050 CC01 DD02 DD04 EE10 FF11E FF12E LL03 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ16 QQ18 QQ61 QQ64 QQ84 QR03 QR04 QR06 QR10 QR41 QR42 QS26 QX01
Claims (46)
- 【請求項１】 ＮＡＤに対する反応性に対してのチオＮ
ＡＤに対する反応性の比が３０％以上であるグルタチオ
ン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素、グルタチオンお
よび酸化型補酵素を試料に接触させ、該酵素反応より生
成した化合物を分析することを特徴とするホルムアルデ
ヒドの測定方法。 - 【請求項２】 グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱
水素酵素の、ＮＡＤに対する反応性に対してのチオＮＡ
Ｄに対する反応性の比が６０％以上である、請求項１記
載のホルムアルデヒドの測定方法。 - 【請求項３】 グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱
水素酵素が以下の理化学的性質を有するものである、請
求項１または２記載のホルムアルデヒドの測定方法。 (a) 作用：ＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、チオ
ＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる１つの酸化型補酵素
および還元型グルタチオンの存在下にホルムアルデヒド
に作用して、Ｓ−ホルミルグルタチオンおよび還元型補
酵素を生成する。 (b) 至適ｐＨ：約７．５〜約８．５ (c) ｐＨ安定性：約６．０〜約９．０ (d) 熱安定性：約４０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間処
理） - 【請求項４】 グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱
水素酵素が微生物由来である、請求項１〜３のいずれか
に記載のホルムアルデヒドの測定方法。 - 【請求項５】 グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱
水素酵素がメタノール資化性酵母由来である、請求項４
記載のホルムアルデヒドの測定方法。 - 【請求項６】 グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱
水素酵素がハンゼヌラ属酵母由来である、請求項５記載
のホルムアルデヒドの測定方法。 - 【請求項７】 グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱
水素酵素が、ハンゼヌラ・ノンファーメンタンスＩＦＯ
１４７３株由来である、請求項６記載のホルムアルデヒ
ドの測定方法。 - 【請求項８】 ＮＡＤに対する反応性に対してのチオＮ
ＡＤに対する反応性の比が３０％以上であるグルタチオ
ン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素、グルタチオン、
チオＮＡＤ類およびチオＮＡＤＰ類からなる群より選ば
れる１つの化合物、並びに還元型ＮＡＤ類および還元型
ＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる1つの化合物を試料
に接触させて、サイクリング反応を行わせしめ、該反応
により変化した化合物の量を分析することを特徴とす
る、ホルムアルデヒドの測定方法。 - 【請求項９】 ＮＡＤに対する反応性に対してのチオＮ
ＡＤに対する反応性の比が３０％以上であるグルタチオ
ン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素、グルタチオン、
還元型チオＮＡＤ類および還元型チオＮＡＤＰ類からな
る群より選ばれる1つの化合物、並びにＮＡＤ類および
ＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる1つの化合物を試料
に接触させて、サイクリング反応を行わせしめ、該反応
により変化した化合物の量を分析することを特徴とす
る、ホルムアルデヒドの測定方法。 - 【請求項１０】 生成した還元型チオＮＡＤＰ類または
還元型チオＮＡＤ類化合物の量を分析することを特徴と
する請求項８記載のホルムアルデヒドの測定方法。 - 【請求項１１】 ホルムアルデヒドの最低検出感度が１
μｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項８〜１０のいずれかに
記載のホルムアルデヒドの測定方法。 - 【請求項１２】 反応中間体としてホルムアルデヒドを
生成する生体成分の測定方法において、生成したホルム
アルデヒドを、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法
により測定することを特徴とする、該生体成分の測定方
法。 - 【請求項１３】 ベタイン、ベタイン−ホモシステイン
メチル転移酵素、ジメチルグリシンオキシダーゼおよび
必要に応じてサルコシンオキシダーゼを試料に接触さ
せ、該酵素反応により生成したホルムアルデヒドを、請
求項１〜１１のいずれかに記載の方法により測定するこ
とを特徴とする、ホモシステインの測定方法。 - 【請求項１４】 クレアチンアミジノハイドロラーゼ、
サルコシンオキシダーゼ、および必要に応じてクレアチ
ニンアミドハイドロラーゼを作用させ、該酵素反応によ
り生成したホルムアルデヒドを、請求項１〜１１のいず
れかに記載の方法により測定することを特徴とする、ク
レアチンまたはクレアチニンの測定方法。 - 【請求項１５】 ベタイン、ベタイン−ホモシステイン
メチル転移酵素、チオール化合物に対し安定なジメチル
グリシンオキシダーゼおよび必要に応じてサルコシンオ
キシダーゼを試料に接触させ、該酵素反応により生成し
た過酸化水素を、ペルオキシダーゼ存在下、酸化系発色
試薬および必要に応じてカップラーと反応させ、生成す
る色素を測定することを特徴とする、ホモシステインの
測定方法。 - 【請求項１６】 ベタイン、ベタイン−ホモシステイン
メチル転移酵素、チオール化合物に対し安定なジメチル
グリシンオキシダーゼおよび必要に応じてサルコシンオ
キシダーゼを試料に接触させ、該酵素反応により生成し
たホルムアルデヒドを、ホルムアルデヒド脱水素酵素お
よび酸化型補酵素と反応させ、生成する還元型補酵素を
測定することを特徴とする、ホモシステインの測定方
法。 - 【請求項１７】 ベタイン、ベタイン−ホモシステイン
メチル転移酵素、チオール化合物に対し安定なジメチル
グリシンオキシダーゼおよび必要に応じてサルコシンオ
キシダーゼを試料に接触させ、該酵素反応により生成し
たホルムアルデヒドを、グルタチオン、グルタチオン依
存性ホルムアルデヒド脱水素酵素および酸化型補酵素と
反応させ、生成する還元型補酵素を測定することを特徴
とする、ホモシステインの測定方法。 - 【請求項１８】 チオール化合物が、ジチオスレイトー
ル、ジチオエリスリトール、２−メルカプトエタノー
ル、２−メルカプトエタンスルホン酸、２−メルカプト
エチルアミン、システイン、ホモシステイン、Ｎ−アセ
チルシステイン、チオグリセロール、チオグリコール
酸、還元型グルタチオンまたはこれらの塩から選択され
る少なくとも１種である、請求項１５〜１７のいずれか
に記載のホモシステインの測定方法。 - 【請求項１９】 チオール化合物がジチオスレイトール
である、請求項１８記載のホモシステインの測定方法。 - 【請求項２０】 ジメチルグリシンオキシダーゼが、ジ
チオスレイトール非存在下に対し、０．０５ｍｍｏｌ／
Ｌジチオスレイトール存在下で、少なくとも５０％酵素
活性が保持されるものであることを特徴とする、請求項
１５〜１９のいずれかに記載のホモシステインの測定方
法。 - 【請求項２１】 ジメチルグリシンオキシダーゼが、以
下の理化学的性質を有する酵素である、請求項１５〜２
０のいずれかに記載のホモシステインの測定方法。 (a) 作用：酸素の存在下にジメチルグリシンに作用し
て、サルコシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を
生成する。 (b) ジメチルグリシンに対するＫm値：１５ｍＭ以下 - 【請求項２２】 ジメチルグリシンオキシダーゼが微生
物由来である、請求項２１記載のホモシステインの測定
方法。 - 【請求項２３】 ジメチルグリシンオキシダーゼが、ア
ルスロバクター属またはストレプトマイセス属に属する
微生物由来である、請求項２２記載のホモシステインの
測定方法。 - 【請求項２４】 ジメチルグリシンオキシダーゼが、ア
ルスロバクター・ニコチアナエＩＦＯ１４２３４株また
はストレプトマイセス・ミュータビリスＩＦＯ１２８０
０株由来である、請求項２３記載のホモシステインの測
定方法。 - 【請求項２５】 ホモシステインの最低検出感度が１μ
ｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項１７〜２４のいずれかに
記載のホモシステインの測定方法。 - 【請求項２６】 以下の理化学的性質を有するグルタチ
オン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素。 (a) 作用：ＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、チオ
ＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる１つの補酵素、還元
型グルタチオンの存在下にホルムアルデヒドに作用し
て、Ｓ−ホルミルグルタチオン、還元型補酵素を生成す
る。 (b) ＮＡＤに対する反応性に対してのチオＮＡＤに対す
る反応性の比が３０％以上である。 (c) 至適ｐＨ：約７．５〜約８．５ (d) ｐＨ安定性：約６．０〜約９．０ (e) 熱安定性：約４０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間処
理） - 【請求項２７】 微生物由来である、請求項２６記載の
グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素。 - 【請求項２８】 メタノール資化性酵母由来である、請
求項２７記載のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱
水素酵素。 - 【請求項２９】 ハンゼヌラ属酵母由来である、請求項
２８記載のグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素
酵素。 - 【請求項３０】 ハンゼヌラ・ノンファーメンタンスＩ
ＦＯ１４７３株由来である、請求項２９記載のグルタチ
オン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素。 - 【請求項３１】 以下の理化学的性質を有するジメチル
グリシンオキシダーゼ。 (a) 作用：酸素の存在下にジメチルグリシンに作用し
て、サルコシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を
生成する。 (b) ジチオスレイトール非存在下に対し、０．０５ｍｍ
ｏｌ／Ｌジチオスレイトール存在下で、少なくとも５０
％酵素活性が保持される。 (c) ジメチルグリシンに対するＫm値：１５ｍＭ以下 - 【請求項３２】 微生物由来である、請求項３１記載の
ジメチルグリシンオキシダーゼ。 - 【請求項３３】 アルスロバクター属またはストレプト
マイセス属に属する微生物由来である、請求項３２記載
のジメチルグリシンオキシダーゼ。 - 【請求項３４】 アルスロバクター・ニコチアナエＩＦ
Ｏ１４２３４株、または、ストレプトマイセス・ミュー
タビリスＩＦＯ１２８００株由来である、請求項３３記
載のジメチルグリシンオキシダーゼ。 - 【請求項３５】 緩衝液、グルタチオン、ＮＡＤに対す
る反応性に対してのチオＮＡＤに対する反応性の比が３
０％以上であるグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱
水素酵素、および該酵素反応により生成する化合物を分
析するための試薬を少なくとも含有してなることを特徴
とするホルムアルデヒド測定用試薬キット。 - 【請求項３６】 緩衝液、グルタチオン、ＮＡＤに対す
る反応性に対してのチオＮＡＤに対する反応性の比が３
０％以上であるグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱
水素酵素、チオＮＡＤ類およびチオＮＡＤＰ類からなる
群より選ばれる1つの化合物、並びに還元型ＮＡＤ類お
よび還元型ＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる1つの化
合物を少なくとも含有してなることを特徴とするホルム
アルデヒド測定用試薬キット。 - 【請求項３７】 緩衝液、グルタチオン、ＮＡＤに対す
る反応性に対してのチオＮＡＤに対する反応性の比が３
０％以上であるグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱
水素酵素、還元型チオＮＡＤ類および還元型チオＮＡＤ
Ｐ類からなる群より選ばれる1つの化合物、並びにＮＡ
Ｄ類およびＮＡＤＰ類からなる群より選ばれる1つの化
合物を少なくとも含有してなることを特徴とするホルム
アルデヒド測定用試薬キット。 - 【請求項３８】 グルタチオン依存性ホルムアルデヒド
脱水素酵素が、請求項２６〜３０のいずれかに記載の酵
素である、請求項３５〜３７のいずれかに記載のホルム
アルデヒド測定用試薬キット。 - 【請求項３９】 請求項３５〜３８のいずれかに記載の
試薬に加えて、ベタイン、ベタイン−ホモシステインメ
チル転移酵素、ジメチルグリシンオキシダーゼおよび必
要に応じてサルコシンオキシダーゼを更に含有してなる
ことを特徴とする、ホモシステイン測定用試薬キット。 - 【請求項４０】 請求項３５〜３８のいずれかに記載の
試薬に加えて、クレアチンアミジノハイドロラーゼ、サ
ルコシンオキシダーゼおよび必要に応じてクレアチニン
アミドハイドロラーゼを更に含有してなることを特徴と
する、クレアチニンまたはクレアチン測定用試薬キッ
ト。 - 【請求項４１】 緩衝液、ベタイン、ベタイン−ホモシ
ステインメチル転移酵素、チオール化合物に対し安定な
ジメチルグリシンオキシダーゼおよび必要に応じてサル
コシンオキシダーゼ、並びに該酵素反応により生成した
過酸化水素を測定するための試薬を含有してなることを
特徴とする、ホモシステイン測定用試薬キット。 - 【請求項４２】 過酸化水素を測定するための試薬とし
て、ペルオキシダーゼ、酸化系発色試薬および必要に応
じてカップラーを含有することを特徴とする、請求項４
１記載のホモシステイン測定用試薬キット。 - 【請求項４３】 緩衝液、ベタイン、ベタイン−ホモシ
ステインメチル転移酵素、チオール化合物に対し安定な
ジメチルグリシンオキシダーゼおよび必要に応じてサル
コシンオキシダーゼ、並びに該酵素反応により生成した
ホルムアルデヒドを測定するための試薬を含有してなる
ことを特徴とする、ホモシステイン測定用試薬キット。 - 【請求項４４】 ホルムアルデヒドを測定するための試
薬として、ホルムアルデヒド脱水素酵素および酸化型補
酵素を含有することを特徴とする、請求項４３記載のホ
モシステイン測定用試薬キット。 - 【請求項４５】 ホルムアルデヒドを測定するための試
薬として、グルタチオン、グルタチオン依存性ホルムア
ルデヒド脱水素酵素および酸化型補酵素を含有すること
を特徴とする、請求項４３記載のホモシステイン測定用
試薬キット。 - 【請求項４６】 ジメチルグリシンオキシダーゼが、請
求項３１〜３４のいずれかに記載の酵素である、請求項
４１〜４５のいずれかに記載のホモシステイン測定用試
薬キット。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
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