JP2002355079A

JP2002355079A - 内分泌かく乱物質の検出方法

Info

Publication number: JP2002355079A
Application number: JP2002069354A
Authority: JP
Inventors: Akihiro Kondo; 昭宏近藤; Takeshi Takeda; 健武田; Shigetoshi Mizutani; 滋利水谷; Yoshimasa Tsujimoto; 善政辻本; Ryokichi Takashima; 良吉高嶋; Yoshiki Enoki; 由樹榎; Ikunoshin Kato; 郁之進加藤
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 2001-03-14
Filing date: 2002-03-13
Publication date: 2002-12-10

Abstract

(57)【要約】【課題】内分泌かく乱作用により影響を受ける遺伝
子、内分泌かく乱作用により影響を受ける遺伝子を利用
した、内分泌かく乱作用を有する物質の検出方法及び内
分泌かく乱作用を有する物質の検出方法に使用されるＤ
ＮＡアレイあるいはそれに準ずるものを提供すること。【解決手段】内分泌かく乱作用により影響を受ける遺
伝子、内分泌かく乱作用により影響を受ける遺伝子を利
用した、内分泌かく乱作用を有する物質の検出方法及び
内分泌かく乱作用を有する物質の検出方法に使用される
装置。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、内分泌かく乱作用
が疑われる物質について内分泌かく乱作用の有無を評価
する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】内分泌かく乱物質（環境ホルモンともい
われる）は、環境中に放出された化学物質のうちモルモ
ン類似作用あるいは抗ホルモン作用が見出されたものの
総称をいう。野生動物の生態系への影響としては、生殖
能の変化、特に雄の雌化、生殖能の低下、孵化率の低
下、胎仔の生存率の低下、生殖行動の異常等が報告され
ている。また、ヒトの健康への影響としては、精子数の
減少、子宮内膜症、不妊、卵巣ガン、子宮ガン、前立腺
ガン等が疑われているが、証明はされていない。上記の
内分泌かく乱を引き起こすと考えられている物質として
アルキルフェノール、ビスフェノールＡ、ダイオキシン
類、ＤＤＴおよびその代謝物、フタル酸エステル、トリ
ブチルスズ、塩素化炭化水素類、有機金属、植物エスト
ロゲン等が知られている。

【０００３】これらの物質の一次作用としては、１）ホ
ルモンレセプターとの直接作用（合成ホルモン剤、ＤＤ
Ｔ、フタル酸エステル等）、２）他のレセプターを介す
る作用（ダイオキシン等）、３）代謝阻害作用（ステロ
イド代謝阻害剤、アロマターゼや５α―レダクターゼの
阻害剤等）、４）他のシステムを介する作用（神経系や
免疫系に影響を与える物質）などが知られており、作用
様式は多様である[化学、第５３巻、第７号、第１２〜
１５頁（１９９８）]。

【０００４】一方、内分泌かく乱物質の測定法として
は、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）とインビボ（ｉｎ
ｖｉｖｏ）の２通りの方法が知られており、前者では
エストロゲンレセプターやアンドロゲンレセプターとの
結合活性を測定する方法や、ホルモン合成酵素系の阻害
活性を測定する方法が知られている。後者では、出生後
日齢の異なるラットの各種ホルモン産生および組織形成
異常を測定する方法、カエルの変態異常を測定する方
法、サカナの成熟異常を測定する方法等が知られている
[アナリティカルケミストリー(Analytical Chemistr
y)、第７０巻、第１５号、第５２８Ａ〜５３２Ａ頁（１
９９８）]。

【０００５】しかし、現在のところ注目されている内分
泌かく乱物質と疑われている物質が本当に内分泌かく乱
を引き起こすのか、もし引き起こすのならどのようなメ
カニズムで影響を及ぼしているのか、さらにどのくらい
の量をどれくらいの時間摂取すると危険なのかについて
の明解な解答は得られていない。例えば、現在行われて
いるホルモンレセプターとの結合試験は、一次スクリー
ニングという見地からすれば、必要かつ重要な方法であ
る。しかしながら、この方法で得られる結果は、内分泌
かく乱物質であることを保証するものではない。すなわ
ち、エストラジオール（女性ホルモン）もジエチルスチ
ルベストロール（ＤＥＳ、内分泌かく乱物質）もイソフ
ラボン（豆に含まれるヒトには無害な成分）もビスフェ
ノールＡ（内分泌かく乱物質と疑われている物質）もＥ
Ｃ５０の値に差はあるものの、すべてエストロゲンレセ
プターに結合するため、このアッセイ方法ではどの内分
泌かく乱作用を持っているのか区別できない。これは、
従来の酵母を用いたアッセイ系、培養細胞を用いる系、
ネズミの子宮重量を測定する系などのいずれの方法でも
同じである。

【０００６】このように現在のホルモンレセプターへの
結合活性やホルモン合成酵素系の阻害活性をインビトロ
で測定する方法は、内分泌かく乱物質測定法としての必
要条件は満たしているが、決して十分条件ではない。ま
た、ラット、カエル、サカナ等の生育や形態形成に及ぼ
す影響をインビボで調べる方法は、感度が低い上、複雑
で、多数のサンプルを調べるには長時間を必要とする。
また、環境ホルモンと称されるものは、ごく少量で内分
泌系に影響するといわれ、これをいわゆるバイオアッセ
イで評価するのは極めて困難である。従って、環境ホル
モンの問題において、その作用が疑われる物質について
内分泌かく乱作用の有無を判定し、毒性という観点では
なく動物の種の存続という観点において危険なものであ
るかどうかを判定する方法の開発が望まれていた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、内分
泌かく乱作用により影響を受ける遺伝子を利用した、当
該作用を有する物質の検出方法及び該方法に使用される
ＤＮＡアレイあるいはそれに準ずるものを提供すること
にある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者はかかる目的を
達成するために鋭意検討した結果、内分泌かく乱物質の
作用により影響を受ける遺伝子を多数見出し、迅速、高
感度でしかも同時に多数の試料について内分泌かく乱作
用の有無を評価する方法を構築し本発明を完成した。

【０００９】即ち、本発明の第１の発明は、内分泌かく
乱物質を検出するための方法であって、試料を暴露させ
た細胞、組織又は生物体における表５〜表１１４、表１
１７〜表３９７に記載の遺伝子であって、トリブチルス
ズによって発現量が変化する遺伝子群、４−オクチルフ
ェノールによって発現量が変化する遺伝子群、４−ノニ
ルフェノールによって発現量が変化する遺伝子群、フタ
ル酸ジ−ｎ−ブチルによって発現量が変化する遺伝子
群、フタル酸ジシクロヘキシルによって発現量が変化す
る遺伝子群、オクタクロロスチレンによって発現量が変
化する遺伝子群、ベンゾフェノンによって発現量が変化
する遺伝子群、フタル酸ジエチルヘキシルによって発現
量が変化する遺伝子群、ジエチルスチルベストロールに
よって発現量が変化する遺伝子群、１７β−エストラジ
オールによって発現量が変化する遺伝子群のそれぞれか
ら選択される少なくとも１種以上の遺伝子の発現量を、
該試料を暴露させなかった細胞、組織又は生物体におけ
る該遺伝子の発現量と比較する工程を包含することを特
徴とする内分泌かく乱物質の検出方法に関する。

【００１０】本発明の第１の発明においては、細胞、組
織又は生物体におけるｍＲＮＡ量を指標として遺伝子の
発現量を比較することができる。この場合、ｍＲＮＡ量
は、ハイブリダイゼーション法または核酸増幅法により
測定することができる。また、発現量を測定しようとす
る遺伝子、もしくはその断片が支持体上のあらかじめ定
められた領域に固定化されたアレイを使用するハイブリ
ダイゼーション法によってｍＲＮＡ量を測定することが
できる。あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応または鎖置換
反応を核酸増幅法として用いることができる。

【００１１】本発明の第１の発明においては、遺伝子の
発現量の指標として細胞、組織又は生物体におけるタン
パク質の発現量の変化を用いることができ、該タンパク
質の発現の変化は、該タンパク質を認識する抗体を利用
して測定することができる。

【００１２】本発明の第２の発明は、本発明の内分泌か
く乱物質の検出方法により内分泌かく乱物質を検出する
ためのＤＮＡアレイであって、表５〜表１１４、表１１
７〜表３９７に記載の遺伝子であって、トリブチルスズ
によって発現量が変化する遺伝子群、４−オクチルフェ
ノールによって発現量が変化する遺伝子群、４−ノニル
フェノールによって発現量が変化する遺伝子群、フタル
酸ジ−ｎ−ブチルによって発現量が変化する遺伝子群、
フタル酸ジシクロヘキシルによって発現量が変化する遺
伝子群、オクタクロロスチレンによって発現量が変化す
る遺伝子群、ベンゾフェノンによって発現量が変化する
遺伝子群、フタル酸ジエチルヘキシルによって発現量が
変化する遺伝子群、ジエチルスチルベストロールによっ
て発現量が変化する遺伝子群、１７β−エストラジオー
ルによって発現量が変化する遺伝子群のそれぞれから選
択される少なくとも１種以上の遺伝子、もしくはその断
片がそれぞれ支持体上の定められた領域に固定化されて
いることを特徴とするアレイに関する。

【００１３】本発明の第２の発明において遺伝子もしく
はその断片は、スライドグラスに固定されているものが
好適に使用できる。

【００１４】本発明の第３の発明は、内分泌かく乱物質
を検出するためのキットであって、表５〜表１１４、表
１１７〜表３９７に記載の遺伝子であって、トリブチル
スズによって発現量が変化する遺伝子群、４−オクチル
フェノールによって発現量が変化する遺伝子群、４−ノ
ニルフェノールによって発現量が変化する遺伝子群、フ
タル酸ジ−ｎ−ブチルによって発現量が変化する遺伝子
群、フタル酸ジシクロヘキシルによって発現量が変化す
る遺伝子群、オクタクロロスチレンによって発現量が変
化する遺伝子群、ベンゾフェノンによって発現量が変化
する遺伝子群、フタル酸ジエチルヘキシルによって発現
量が変化する遺伝子群、ジエチルスチルベストロールに
よって発現量が変化する遺伝子群、１７β−エストラジ
オールによって発現量が変化する遺伝子群のそれぞれか
ら選択される少なくとも１種以上の遺伝子から転写され
るｍＲＮＡにハイブリダイズするプローブを含むことを
特徴とするキットに関する。

【００１５】本発明の第４の発明は、内分泌かく乱物質
を検出するためのキットであって、表５〜表１１４、表
１１７〜表３９７に記載の遺伝子であって、トリブチル
スズによって発現量が変化する遺伝子群、４−オクチル
フェノールによって発現量が変化する遺伝子群、４−ノ
ニルフェノールによって発現量が変化する遺伝子群、フ
タル酸ジ−ｎ−ブチルによって発現量が変化する遺伝子
群、フタル酸ジシクロヘキシルによって発現量が変化す
る遺伝子群、オクタクロロスチレンによって発現量が変
化する遺伝子群、ベンゾフェノンによって発現量が変化
する遺伝子群、フタル酸ジエチルヘキシルによって発現
量が変化する遺伝子群、ジエチルスチルベストロールに
よって発現量が変化する遺伝子群、１７β−エストラジ
オールによって発現量が変化する遺伝子群のそれぞれか
ら選択される少なくとも１種以上の遺伝子から転写され
るｍＲＮＡ、もしくはその断片由来の核酸を増幅するた
めに使用されるプライマーを含むことを特徴とするキッ
トに関する。

【００１６】本発明の第５の発明は、内分泌かく乱物質
を検出するためのキットであって、表５〜表１１４、表
１１７〜表３９７に記載の遺伝子であって、トリブチル
スズによって発現量が変化する遺伝子群、４−オクチル
フェノールによって発現量が変化する遺伝子群、４−ノ
ニルフェノールによって発現量が変化する遺伝子群、フ
タル酸ジ−ｎ−ブチルによって発現量が変化する遺伝子
群、フタル酸ジシクロヘキシルによって発現量が変化す
る遺伝子群、オクタクロロスチレンによって発現量が変
化する遺伝子群、ベンゾフェノンによって発現量が変化
する遺伝子群、フタル酸ジエチルヘキシルによって発現
量が変化する遺伝子群、ジエチルスチルベストロールに
よって発現量が変化する遺伝子群、１７β−エストラジ
オールによって発現量が変化する遺伝子群のそれぞれか
ら選択される少なくとも１種以上の遺伝子から発現され
るタンパク質を認識する抗体またはその断片を含むこと
を特徴とするキットに関する。

【００１７】

【発明の実施の形態】本明細書において内分泌かく乱物
質とは、外因性内分泌かく乱物質もしくは環境ホルモン
とも称されるが、動物の生体内に取り込まれた場合に、
本来その生体内で営まれている正常なホルモン作用に影
響を与える外因性の物質を意味し、正常なホルモン作用
を維持するもの、促進するものも含まれる。また、正常
なホルモン作用に影響を与える可能性のある物質も含ま
れる。該物質については特に限定されるものではない
が、例えばヒトの膣癌を引き起こすことが知られている
ＤＥＳや骨粗鬆症治療に有効であり、かつ乳癌のリスク
を低減させることが知られている植物エストロゲンのイ
ソフラボン等が挙げられる。さらに、上記内分泌かく乱
物質には、ヒト以外の動物において内分泌かく乱作用が
確認されているが、ヒトにおいて該作用が調べられてい
ない物質、すなわち内分泌かく乱作用の可能性がある物
質あるいは内分泌かく乱作用の疑いがある物質も包含さ
れる。

【００１８】本明細書において内分泌かく乱物質の影響
を受ける遺伝子とは、上記の内分泌かく乱物質によって
その発現が対照と比較して亢進（促進）または抑制され
る遺伝子を意味する。該遺伝子は、１種類でも複数の種
類であってもよい。さらに、内分泌かく乱物質が直接的
に影響を与えるもの及び間接的にその発現に影響を与え
る遺伝子も含まれる。該遺伝子としては特に限定される
ものではないが、例えば、上記ＤＥＳやイソフラボンが
結合することが知られているエストロゲンレセプター遺
伝子およびそのシグナル伝達経路に関与する遺伝子等が
挙げられる。以下、本発明を詳細に説明する。

【００１９】（１）本発明の内分泌かく乱物質の検出方
法本発明の内分泌かく乱物質の検出方法は、試料と接触さ
せた細胞、組織又は生物体における表５〜表１１４、表
１１７〜表３９７に記載の遺伝子であって、トリブチル
スズによって発現量が変化する遺伝子群、４−オクチル
フェノールによって発現量が変化する遺伝子群、４−ノ
ニルフェノールによって発現量が変化する遺伝子群、フ
タル酸ジ−ｎ−ブチルによって発現量が変化する遺伝子
群、フタル酸ジシクロヘキシルによって発現量が変化す
る遺伝子群、オクタクロロスチレンによって発現量が変
化する遺伝子群、ベンゾフェノンによって発現量が変化
する遺伝子群、フタル酸ジエチルヘキシルによって発現
量が変化する遺伝子群、ジエチルスチルベストロールに
よって発現量が変化する遺伝子群、１７β−エストラジ
オール（Ｅ_２）によって発現量が変化する遺伝子群のそ
れぞれから選択される少なくとも１種以上の遺伝子の発
現量を、該試料を接触させなかった細胞、組織又は生物
体における発現量と比較する工程を包含することを特徴
とする。すなわち、本発明の内分泌かく乱物質の検出方
法は、下記ステップ：被検試料を細胞、組織又は生物体に接触させるステ
ップ、上記細胞、組織又は生物体において、表５〜表１１
４、表１１７〜表３９７に記載の遺伝子であって、トリ
ブチルスズによって発現量が変化する遺伝子群、４−オ
クチルフェノールによって発現量が変化する遺伝子群、
４−ノニルフェノールによって発現量が変化する遺伝子
群、フタル酸ジ−ｎ−ブチルによって発現量が変化する
遺伝子群、フタル酸ジシクロヘキシルによって発現量が
変化する遺伝子群、オクタクロロスチレンによって発現
量が変化する遺伝子群、ベンゾフェノンによって発現量
が変化する遺伝子群、フタル酸ジエチルヘキシルによっ
て発現量が変化する遺伝子群、ジエチルスチルベストロ
ールによって発現量が変化する遺伝子群、１７β−エス
トラジオールによって発現量が変化する遺伝子群のそれ
ぞれから選択される少なくとも１種以上の遺伝子の発現
量を測定するステップ、及びで得られた各遺伝子の発現量を該試料を接触させ
なかった細胞、組織又は生物体のものと比較し、この結
果よりに基づき、内分泌かく乱物質の存在を確認するス
テップを行なうことを１つの特徴とする。

【００２０】本発明の検出方法によれば、表５〜表１１
４、表１１７〜表３９７に記載された遺伝子群の発現を
変化させることが知られている内分泌かく乱物質、なら
びに該物質と同等の作用を有する物質を検出することが
できる。従って、簡便で、かつ迅速に高い信頼度で内分
泌かく乱物質を検出することができるという優れた効果
を発揮する。

【００２１】前記被検試料としては、特に限定はされな
いが例えば、これまでに内分泌かく乱を引き起こすと考
えられている物質、アルキルフェノール、ビスフェノー
ルＡ、ダイオキシン類、ＤＤＴおよびその代謝物、フタ
ル酸エステル、トリブチルスズ、塩素化炭化水素類、有
機金属、植物エストロゲン等により表５〜表１１４、表
１１７〜表２５９に記載された遺伝子群の発現の変化と
同じパターンを示す可能性のある物質を含む試料が例示
される。

【００２２】本発明の評価方法に用いられる表５〜表１
１４、表１１７〜表３９７に記載された遺伝子群は、
「内分泌かく乱物質の作用によってその発現が影響を受
ける遺伝子」であり、言い換えれば、前記物質の作用に
よってその発現が有意に亢進又は抑制される遺伝子をい
う。特に限定はされないが、例えば、表５〜表１１４、
表１１７〜表３９７に記載の遺伝子であって、トリブチ
ルスズによって発現量が変化する遺伝子群、４−オクチ
ルフェノールによって発現量が変化する遺伝子群、４−
ノニルフェノールによって発現量が変化する遺伝子群、
フタル酸ジ−ｎ−ブチルによって発現量が変化する遺伝
子群、フタル酸ジシクロヘキシルによって発現量が変化
する遺伝子群、オクタクロロスチレンによって発現量が
変化する遺伝子群、ベンゾフェノンによって発現量が変
化する遺伝子群、フタル酸ジエチルヘキシルによって発
現量が変化する遺伝子群、ジエチルスチルベストロール
によって発現量が変化する遺伝子群、１７β−エストラ
ジオールによって発現量が変化する遺伝子群が挙げられ
る。本発明に使用される遺伝子の検出においては、遺伝
子操作技術の進歩に伴い、その解析に様々な手法が開発
されているｍＲＮＡを指標とするのが効率的である。

【００２３】上記ｍＲＮＡを指標にした遺伝子発現の変
化を確認する手法としては、ノーザンハイブリダイゼー
ション法、ＲＴ−ＰＣＲ法、サブトラクション法、ディ
ファレンシャル・ディスプレイ法等が挙げられ、これら
の方法を適宜選択して本発明に使用される遺伝子を見出
すことができる。さらに、数百、数千といった多数の遺
伝子の発現の変化を同時に検出する方法としては、ＤＮ
Ａアレイを使用した方法（ＤＮＡチップハイブリダイゼ
ーション解析、ＤＮＡマクロアレイハイブリダイゼーシ
ョン解析等）が知られている。

【００２４】本発明を特に限定するものではないが、例
えば「内分泌かく乱物質の作用によってその発現が影響
を受ける遺伝子」は、内分泌かく乱物質の作用を調べよ
うとする生物が保有する種々の遺伝子に対応する核酸又
はその断片が固定化されたＤＮＡアレイを使用すること
により得られる。例えば、ヒトやマウス由来の各種遺伝
子の断片を固定化したＤＮＡマイクロアレイが市販され
ており（IntelliGeneHuman Cancer CHIP 、宝酒造社
製）、これを使用して本発明に使用される遺伝子を見出
すことができる。前記「内分泌かく乱物質の作用によっ
てその発現が影響を受ける遺伝子」は、例えば以下のよ
うな遺伝子選別方法により得ることができる。

【００２５】遺伝子選別方法：例えば、既知の内分泌か
く乱物質に暴露された細胞からｍＲＮＡを調製し、該ｍ
ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応を行なう。この際、例え
ば適切な標識を付したプライマーや標識ヌクレオチドを
使用することにより、標識されたｃＤＮＡを得ることが
できる。上記、内分泌かく乱物質に暴露させる細胞は、
生物体から採取したものでも培養細胞でもよい。また、
組織は、内分泌かく乱物質によって影響が出ていると思
われる部位であれば特に限定はない。さらに使用する細
胞、組織もしくは生物体は、特にヒトに限定されるわけ
ではない。一方、対照とする細胞、組織または生物体よ
りｍＲＮＡもしくはそのｃＤＮＡを含む核酸試料につい
ても上記と同様に調製し、ハイブリダイゼーションさせ
る。核酸試料がＤＮＡアレイ上のＤＮＡとハイブリダイ
ゼーションしているか否かの結果を容易に確認できるよ
うに下記のように適当な標識をしておくことができる。

【００２６】上記標識方法としては特に限定されるもの
ではないが、例えば放射性同位元素、蛍光物質、化学発
光物質、ビオチンのようなリガンド、適当な抗体により
認識される抗原等の物質を使用することができる。ま
た、核酸試料を認識することなくハイブリダイゼーショ
ンを行い、その後に蛍光、化学発光を発するインターカ
レーター物質を使用してもよい。

【００２７】次に、上記の標識ｃＤＮＡと、適当な遺伝
子に対応する核酸又はその断片を固定化されたＤＮＡア
レイとの間でハイブリダイゼーションを実施する。ハイ
ブリダイゼーションは公知の方法で実施すればよく、そ
の条件は使用するＤＮＡアレイや標識ｃＤＮＡに適した
ものを適宜選択すればよい。例えばモレキュラー・クロ
ーニング、ア・ラボラトリーマニュアル（Molecular cl
oning, A laboratorymanual）、第２版、第９．５２−
９．５５頁（１９８９）に記載の条件で行なうことがで
きる。

【００２８】また、前記と同様のハイブリダイゼーショ
ン条件下に対照試料（内分泌かく乱物質に暴露しない細
胞）由来の核酸と前記ＤＮＡアレイとのハイブリダイゼ
ーションを行なう。これらのヒト由来の試料は、採取か
ら遺伝子発現量の測定までに時間がかかり、ＲＮＡ分解
酵素の作用によりｍＲＮＡが分解を受ける可能性があ
る。被検試料と対照試料との遺伝子発現の差を測定する
ためには、比較的発現変動の少ない標準的な遺伝子を用
いて両者のｍＲＮＡ量を補正する必要がある。さらに、
以下に述べる２種類の蛍光を用いて１枚のＤＮＡアレイ
上で競合ハイブリダイゼーションを行なう場合には、２
種の蛍光物質間の強度差を補正する必要もある。このよ
うな補正の目的に使用される核酸としては、非病変部位
由来の核酸；ハウスキーピング遺伝子〔例えば、グリセ
ルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPD）遺伝
子、シクロフィリン遺伝子、β−アクチン遺伝子、α−
チューブリン遺伝子、ホスフォリパーゼＡ２遺伝子等〕
に対応する核酸等が挙げられ、また、非特異的なハイブ
リダイゼーションでないことを確認するための陰性対照
としては、プラスミドｐＵＣ１８が挙げられる。

【００２９】ついで、内分泌かく乱物質に暴露された細
胞由来の試料とのハイブリダイゼーション及び対照試料
とのハイブリダイゼーションのそれぞれ結果を比較する
ことにより、両者で発現量異なる遺伝子を検出すること
ができる。具体的には、上記の方法で標識された核酸試
料とハイブリダイゼーションを行なったアレイについ
て、使用された標識方法に応じて適切なシグナルの検出
を行ない、アレイ上の各遺伝子の内分泌かく乱物質に暴
露された細胞由来の試料、対照試料中の発現量を比較す
ることができる。好ましくは、複数の標識、例えば２種
類の蛍光を検出することができる多波長検出蛍光アナラ
イザーを用いれば、内分泌かく乱物質に暴露された細胞
由来の試料における遺伝子発現量と対照試料での遺伝子
発現量との差を同じＤＮＡアレイ上で競合ハイブリダイ
ゼーションにて比較することができる。例えば、内分泌
かく乱物質に暴露された細胞由来の試料についてはＣｙ
５−ｄＵＴＰで蛍光標識を行ない、対照の核酸試料につ
いてはＣｙ３−ｄＵＴＰで蛍光標識する。両者を等量混
合してＤＮＡアレイとハイブリダイゼーションを行なう
ことで両者の遺伝子発現量の差を、シグナルの色及び蛍
光強度の違いとして検出することができる。

【００３０】こうして得られたシグナルの強度に有意な
差のある遺伝子は、内分泌かく乱物質への暴露に伴って
発現量が変化する遺伝子であり、内分泌かく乱物質検出
の指標として使用可能な遺伝子である。本発明に用いら
れる「内分泌かく乱物質の作用によってその発現が影響
を受ける遺伝子」は、発現量の差の大きな遺伝子ほど指
標として望ましい。

【００３１】前記した遺伝子選別方法における目的遺伝
子の選別基準は、特に限定するものではないが、例え
ば、被検試料または対照試料における発現強度が、陰性
対照遺伝子の発現強度の２倍以上もしくは１／２以下で
あることが挙げられる。なお、具体的選別法を実施例１
に記載する。

【００３２】以上に例示された方法によって取得され
る、本発明に使用することができる「内分泌かく乱物質
の作用によってその発現が影響を受ける遺伝子」として
は、例えばトリブチルスズ、４−オクチルフェノール、
４−ノニルフェノール、フタル酸ジ−Ｎ−ブチル、フタ
ル酸ジシクロヘキシル、オクタクロロスチレン、ベンゾ
フェノン、フタル酸ジエチルヘキシル、ジエチルスチル
ベストロール、１７β−エストラジオール等に暴露され
た際にその発現が影響を受ける遺伝子を挙げることがで
き、これらは下記表５〜表１１４、表１１７〜表３９７
に記載されている。

【００３３】本発明の内分泌かく乱物質の検出方法にお
いては、遺伝子の発現量は、該遺伝子より転写されるｍ
ＲＮＡ量又は該遺伝子にコードされたポリペプチド量か
ら測定することができる。

【００３４】前記ｍＲＮＡ量の測定には、公知の種々の
方法、例えば、ノーザン・ハイブリダイゼーション法、
ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ドット・ブ
ロット・ハイブリダイゼーション法、ＤＮＡアレイを使
用する方法等に代表されるハイブリダイゼーション法、
ＲＴ−ＰＣＲ法に代表される核酸増幅法等が使用でき
る。十分なｍＲＮＡの検出感度を得る観点から、ハイブ
リダイゼーション法又は核酸増幅法が好ましく、より具
体的には、発現量を測定しようとする遺伝子に対応する
核酸又はその断片が支持体上のそれぞれ定められた領域
に固定化されたアレイ（例えば、ＤＮＡアレイ）を使用
するハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲ法が好適
である。多数の遺伝子の発現を同時に測定する観点か
ら、ＤＮＡアレイを使用するハイブリダイゼーション法
が特に好適である。特に限定はされないが、例えば下記
（２）記載のＤＮＡアレイが好適に使用できる。

【００３５】このようなＤＮＡアレイを使用することに
より、核酸試料中に含まれる多種類の核酸分子の量を同
時に測定することができる。また、少量の核酸試料でも
測定できるという利点がある。例えば、試料中のｍＲＮ
Ａを標識するか、もしくはｍＲＮＡを鋳型として標識さ
れたｃＤＮＡを調製し、これとＤＮＡアレイの間でハイ
ブリダイゼーションを実施することにより、試料中で発
現されているｍＲＮＡを同時に検出し、さらにその発現
量を測定することができる。

【００３６】標識に用いられる標識物質としては、放射
性同位元素、蛍光物質、化学発光物質、発光団を有する
物質等の物質を用いることができる。例えば、蛍光物質
としては、Ｃｙ２、ＦｌｕｏｒＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．
５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、イソチオシアン酸フ
ルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド、ローダミ
ン等が挙げられる。また、同時に検出できる点から、２
種類以上の蛍光物質を用いて、被検試料、対照として用
いる試料をそれぞれ異なった蛍光物質で標識することが
望ましい。ここで試料の標識は、試料中のｍＲＮＡ、該
ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡもしくは該ｃＤＮＡより転写あ
るいは増幅された核酸を標識することによって実施され
る。

【００３７】標識の検出法は、用いられる標識物質の種
類により、適宜選択することができる。例えば、前記Ｃ
ｙ３及びＣｙ５を標識物質として用いる場合、Ｃｙ３は
５３２ｎｍ、Ｃｙ５は６３５ｎｍの波長でスキャンする
ことにより検出することができる。なお、標識の強度を
遺伝子の発現量の指標とする。

【００３８】核酸増幅法、特にＲＴ−ＰＣＲ法によりｍ
ＲＮＡ量を測定する場合、例えば、競合ＰＣＲ法、Ｔａ
ｑＭａｎ法〔例えば、リンダ・ジー・リー（Ｌｉｎｄａ
Ｇ．Ｌｅｅ）ら、ヌクレイックアシッズリサーチ
（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．）、第２１
巻、第３７６１−３７６６頁（１９９３）〕等により、
ｍＲＮＡ量を測定できる。

【００３９】前記遺伝子にコードされたポリペプチド量
は、該ポリペプチド又はその断片に対する抗体を用いて
測定することができる。具体的には、例えば、標識抗体
を用い、慣用のＥＬＩＳＡ法等により行なうことができ
る。

【００４０】（２）本発明のＤＮＡアレイ本明細書において「ＤＮＡアレイ」とは、遺伝子又は遺
伝子由来のＤＮＡ断片が支持体上の定められた領域に固
定されているものを指し、例えばＤＮＡチップと呼称さ
れているものを包含する。また、遺伝子又は遺伝子由来
のＤＮＡ断片が支持体上に高密度に固定されているもの
はＤＮＡマイクロアレイとも呼ばれる。

【００４１】ここで、「それぞれ定められた位置に固定
化される」とは、おのおのの遺伝子に対応する核酸又は
その断片の固定化されている位置が支持体上においてあ
らかじめ決定されていることを意味する。すなわち、こ
のようなアレイを使用した場合には、検出されたシグナ
ルの位置からこのシグナルがどの遺伝子の核酸又はその
断片に由来するのかを知ることができる。

【００４２】本発明のアレイに用いる支持体は、ハイブ
リダイゼーションに使用可能なものであれば特に限定は
なく、通常スライドグラス、シリコンチップ、ニトロセ
ルロースやナイロンの膜等が使用される。更に好ましく
は、非多孔性で、表面滑らかな構造を有する材質であれ
ばよく、特に限定はないが、例えばスライドガラス等の
ガラスが好適に使用できる。支持体の表面は、共有結合
又は非共有結合により一本鎖ＤＮＡを固定化できるもの
であればいずれでもよく、支持体の表面に親水性又は疎
水性の官能基を有しているものが好適に使用でき、特に
限定はないが、例えば、水酸基、アミノ基、チオール
基、アルデヒド基、カルボキシル基、アシル基等を有し
ているものが好適に使用できる。これらの官能基は、支
持体自体の表面特性として存在していてもよいが、表面
処理によって導入してもよい。このような表面処理物と
しては、例えば、ガラスをアミノアルキルシラン等の市
販のシランカップリング剤で処理したものや、ポリリジ
ンやポリエチレンイミン等のポリ陽イオンで処理したも
の等が挙げられる。また、これらの処理を施したスライ
ドガラスの一部は市販されている。

【００４３】本発明のアレイにおいては、核酸又はその
断片は、一本鎖、二本鎖のどちらが固定されていてもよ
い。例えば、該核酸又はその断片が、変性された二本の
鎖として支持体に整列固定化されたＤＮＡアレイや、固
定化されたＤＮＡの少なくとも一部が一本鎖ＤＮＡであ
るＤＮＡアレイでもよい。また、本発明のアレイは、二
本鎖ＤＮＡを変性下において、同一支持体に整列させて
スポットしたＤＮＡアレイでもよい。

【００４４】さらに、本発明のアレイにおいては、固定
化される遺伝子の核酸あるいはその断片の支持体上にお
ける密度について特に限定はないが、例えば多数の遺伝
子の発現量を測定する場合には、高密度のアレイでもよ
く、１００ドット／ｃｍ^２以上の密度で核酸、特にＤＮ
Ａが固定化されたアレイが好適に使用できる。

【００４５】支持体上に固定化される核酸又はその断片
には特に限定はなく、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレ
オチドのいずれであってもよい。また、その製法にも特
に限定はなく、化学的に合成したもの、天然の核酸から
単離、精製したもの、酵素的に合成したもの、さらには
これらを組み合わせて使用することができる。

【００４６】支持体上に固定される核酸又はその断片と
しては、特に限定するものではないが、例えば、鎖長が
５０塩基長以上の二本鎖ポリヌクレオチド又はその誘導
体であって、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉ
ｎｒｅａｃｔｉｏｎ）法等により、酵素的に増幅して
調製されるものを、ＤＮＡの固定化支持体への固定化時
に変性し、一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体としたものが好
適に使用できる。該誘導体としては、支持体表面への固
定化を可能にするような修飾を付されたものであれば良
く、特に限定するものではないが、例えばＤＮＡの５’
末端にアミノ基やチオール基等の官能基が導入されたＤ
ＮＡが挙げられる。

【００４７】例えば、ゲノムＤＮＡライブラリーあるい
はｃＤＮＡライブラリーを鋳型としたＰＣＲ等によって
増幅されたＤＮＡを使用することができる。この場合、
核酸増幅方法に適したプライマーは、目的の領域を効率
よく増幅できるものであれば特に限定はなく、例えば市
販のプライマー構築ソフト、ＯＬＩＧＯ^ＴＭＰｒｉｍ
ｅｒＡｎａｌｙｓｉｓｓｏｆｔｗａｒｅ（宝酒造社
製）を使用して選択する事ができる。また、上記ＯＬＩ
ＧＯ^ＴＭＰｒｉｍｅｒＡｎａｌｙｓｉｓｓｏｆｔｗ
ａｒｅを用いて、ハイブリダイズに好適な領域を検索
し、該領域を市販のＤＮＡ合成機等で合成してもよい。

【００４８】上記の遺伝子に対応する核酸又はその断片
は、公知の方法、例えばアミノ基を導入した支持体上に
固定することにより該アレイを作製することができる。
また、上記固定化の操作をＤＮＡアレイ作製装置、例え
ばアフィメトリックス社製のＤＮＡチップ作製装置を使
用して行なうことにより、遺伝子に対応する核酸が整
列、固定化された本発明のアレイを作製することができ
る。

【００４９】アレイに核酸の断片を固定する場合、該断
片の鎖長は、特に限定されるものではなく、例えば、約
１００塩基長〜約１キロ塩基長であることが望ましく、
また、該鎖長より短いあるいは長いものであっても被検
試料由来の核酸とハイブリダイゼーションにおいて特異
的にハイブリダイズするものであればよい。

【００５０】本発明のアレイに用いられる遺伝子は、内
分泌かく乱物質の作用によってその発現が影響を受ける
遺伝子であればよく、特に限定されるものではないが、
例えば、表５〜表１１４、表１１７〜表３９７に記載の
遺伝子であって、トリブチルスズによって発現量が変化
する遺伝子群、４−オクチルフェノールによって発現量
が変化する遺伝子群、４−ノニルフェノールによって発
現量が変化する遺伝子群、フタル酸ジ−ｎ−ブチルによ
って発現量が変化する遺伝子群、フタル酸ジシクロヘキ
シルによって発現量が変化する遺伝子群、オクタクロロ
スチレンによって発現量が変化する遺伝子群、ベンゾフ
ェノンによって発現量が変化する遺伝子群、フタル酸ジ
エチルヘキシルによって発現量が変化する遺伝子群、ジ
エチルスチルベストロールによって発現量が変化する遺
伝子群、１７β−エストラジオールによって発現量が変
化する遺伝子群のそれぞれから選択される少なくとも１
種以上の遺伝子が挙げられる。

【００５１】特に限定はされないが、例えばホルモンの
作用発現に関連した機能を有するタンパクをコードする
遺伝子またはその断片が固定される。このような遺伝子
としては、特に限定されるものではないが、例えばホル
モンレセプター遺伝子、レセプターのコファクターをコ
ードする遺伝子、レセプターからのシグナル伝達に関与
するタンパクをコードする遺伝子、ホルモンの生合成も
しくは代謝に関与するタンパクをコードする遺伝子、ま
たはオンコジーン等が挙げられる。

【００５２】また、別の態様として、内分泌かく乱物質
の影響を受ける遺伝子の発現を指標とした内分泌かく乱
作用の評価に用いることができる。すなわち、上記内分
泌かく乱物質の影響を受けていることが確認できた遺伝
子について、上記のような方法で固定化したＤＮＡアレ
イを作製する。次に内分泌かく乱物質によって影響を受
けていると考えられる細胞、組織または生物体より上記
のように核酸試料を調製し、上記と同様にハイブリダイ
ズさせて、シグナル強度の差から遺伝子発現の変化を測
定することができる。その結果から内分泌かく乱作用の
有無を評価することができる。あるいは、内分泌かく乱
物質の影響を受けていることが確認できた遺伝子のｍＲ
ＮＡの競合ＲＴ−ＰＣＲ法により影響を受けている遺伝
子の発現の度合いを定量的に測定することからも内分泌
かく乱作用の有無を確認することもできる。

【００５３】さらに別の態様としては、内分泌かく乱を
引き起こす可能性のある物質の検出に用いることができ
る。この場合、内分泌かく乱を引き起こす可能性のある
物質とは、本来その生体内で営まれている正常なホルモ
ン作用に影響を与える可能性のある物質を意味し、その
作用が確認されたものおよびいまだ確認されていないも
のも含まれる。内分泌かく乱を引き起こす可能性のある
物質の検出のためのＤＮＡアレイは、上記（１）記載の
方法で内分泌かく乱物質の影響を受けていることが確認
できた遺伝子を上記と同様の方法で固定化して作製す
る。次に内分泌かく乱を引き起こす可能性のある物質を
含むと予想される試料と接触させた細胞、組織または生
物体より上記のように核酸試料を調製し、上記と同様に
ハイブリダイズさせて、遺伝子発現の変化をシグナル強
度差として測定することができる。その結果から該物質
が、内分泌かく乱作用を有しているかどうかを判断する
ことができる。また、該ＤＮＡアレイ上の全ＤＮＡにお
いてシグナルの変化が確認される場合のみならずその一
部のＤＮＡにおいてシグナルの変化が確認される場合に
おいても同様にその結果から該物質が、内分泌かく乱作
用を有していると判断することができる。

【００５４】特にその一部のＤＮＡにおいてシグナルの
変化が、複数の内分泌かく乱物質の作用で共通に影響が
みられる遺伝子あるいはその産物においては、バイオマ
ーカーとしてこれらを別に選別して検出方法を最適化
し、さらに的確に該物質の内分泌かく乱作用を有するか
どうかを評価することができる。あるいは、上記のよう
に内分泌かく乱物質の影響を受けていることが確認でき
た遺伝子のｍＲＮＡの競合ＲＮＡもしくはＤＮＡを作製
し、それを内部標準とした競合ＲＴ−ＰＣＲ法により内
分泌かく乱を引き起こす度合いを遺伝子の発現より定量
的に検出することもできる。

【００５５】以上のように本発明のＤＮＡアレイは、例
えば動物であれば何世代にも渡って、単なる毒性だけで
なく形態の異常、生殖の異常、生態系そのものの異常を
評価しなければならないのに比べ、極めて迅速に、しか
も少量の試料を用いて、その物質が内分泌かく乱作用を
有するかどうかを判定することができる。また、多数の
試料中の内分泌かく乱物質の存在を迅速、高感度でしか
も同時に評価することができる。

【００５６】（３）本発明の内分泌かく乱物質を検出す
るためのキット本発明の内分泌かく乱物質を検出するためのキットとし
ては、表５〜表１１４、表１１７〜表３９７に記載の
遺伝子であって、トリブチルスズによって発現量が変化
する遺伝子群、４−オクチルフェノールによって発現量
が変化する遺伝子群、４−ノニルフェノールによって発
現量が変化する遺伝子群、フタル酸ジ−ｎ−ブチルによ
って発現量が変化する遺伝子群、フタル酸ジシクロヘキ
シルによって発現量が変化する遺伝子群、オクタクロロ
スチレンによって発現量が変化する遺伝子群、ベンゾフ
ェノンによって発現量が変化する遺伝子群、フタル酸ジ
エチルヘキシルによって発現量が変化する遺伝子群、ジ
エチルスチルベストロールによって発現量が変化する遺
伝子群、１７β−エストラジオールによって発現量が変
化する遺伝子群のそれぞれから選択される少なくとも１
種以上の遺伝子から転写されるｍＲＮＡ又はその断片を
検出するためのプライマー及び／又はプローブを含有し
たキット、並びに表５〜表１１４、表１１７〜表３９
７に記載の遺伝子であって、トリブチルスズによって発
現量が変化する遺伝子群、４−オクチルフェノールによ
って発現量が変化する遺伝子群、４−ノニルフェノール
によって発現量が変化する遺伝子群、フタル酸ジ−ｎ−
ブチルによって発現量が変化する遺伝子群、フタル酸ジ
シクロヘキシルによって発現量が変化する遺伝子群、オ
クタクロロスチレンによって発現量が変化する遺伝子
群、ベンゾフェノンによって発現量が変化する遺伝子
群、フタル酸ジエチルヘキシルによって発現量が変化す
る遺伝子群、ジエチルスチルベストロールによって発現
量が変化する遺伝子群、１７β−エストラジオールによ
って発現量が変化する遺伝子群のそれぞれから選択され
る少なくとも１種以上の遺伝子にコードされたポリペプ
チド又はその断片に対する抗体又はその断片を含有した
キットが挙げられる。

【００５７】上記のキットは、上記（１）記載の本発明
の内分泌かく乱物質の検出方法に用いることができ、よ
り簡便、かつ迅速な操作を可能にする。

【００５８】前記のキットは、表５〜表１１４、表１
１７〜表３９７に記載の遺伝子であって、トリブチルス
ズによって発現量が変化する遺伝子群、４−オクチルフ
ェノールによって発現量が変化する遺伝子群、４−ノニ
ルフェノールによって発現量が変化する遺伝子群、フタ
ル酸ジ−ｎ−ブチルによって発現量が変化する遺伝子
群、フタル酸ジシクロヘキシルによって発現量が変化す
る遺伝子群、オクタクロロスチレンによって発現量が変
化する遺伝子群、ベンゾフェノンによって発現量が変化
する遺伝子群、フタル酸ジエチルヘキシルによって発現
量が変化する遺伝子群、ジエチルスチルベストロールに
よって発現量が変化する遺伝子群、１７β−エストラジ
オールによって発現量が変化する遺伝子群のそれぞれか
ら選択される少なくとも１種以上の遺伝子から転写され
るｍＲＮＡ又はその断片を核酸増幅する方法、具体的に
は、例えばＲＴ−ＰＣＲ法によって検出するためのプラ
イマー及び／又はプローブを含有する。さらに、本発明
のキットは、検出用試薬等を適宜含有してもよい。

【００５９】前記プライマー及び／又はプローブは、内
分泌かく乱物質の作用によってその発現が影響を受ける
遺伝子、又は該遺伝子に相補的な塩基配列を有する核酸
にストリンジェントな条件下にハイブリダイズするもの
であればよい。

【００６０】上記「ストリンジェントな条件」とは、特
に限定されないが、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤ
Ｓ、５×デンハルト、１００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮ
Ａを含む溶液中、〔前記プライマー及び／又はプローブ
のＴｍ−２５℃〕の温度で一晩保温する条件等をいう。

【００６１】また、上記のプライマーの塩基配列は、通
常の核酸増幅法、特にＲＴ−ＰＣＲにおける反応条件下
に、前記遺伝子に対応する核酸を特異的に増幅しうる配
列であればよい。特に限定はされないが、例えば市販の
プライマー構築ソフト、Ｏｌｉｇｏ^ＴＭＰｒｉｍｅｒ
Ａｎａｌｙｓｉｓｓｏｆｔｗａｒｅを用いて選択し
たプライマー対であってもよい。

【００６２】一方、プローブの塩基配列も、前記遺伝子
に対応する核酸に前記ストリンジェントな条件下にハイ
ブリダイズしうる核酸の配列であればよい。特に限定は
されないが、例えば上記Ｏｌｉｇｏ^ＴＭＰｒｉｍｅｒ
Ａｎａｌｙｓｉｓｓｏｆｔｗａｒｅを用いて選択し
たプローブであってもよい。

【００６３】なお、プローブ又はプライマーのＴｍは、
例えば、下記式：Ｔｍ＝８１．５−１６．６（ｌｏｇ_１０［Ｎａ^＋］）＋
０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）（式中、Ｎはプローブ又はプライマーの鎖長であり、％
Ｇ＋Ｃはプローブ又はプライマー中のグアニン及びシト
シン残基の含有量である）により求められる。

【００６４】また、プローブ又はプライマーの鎖長が１
８塩基より短い場合、Ｔｍは、例えば、Ａ＋Ｔ（アデニ
ン＋チミン）残基の含有量と２℃との積と、Ｇ＋Ｃ（グ
アニン＋シトシン）残基の含有量と４℃との積との和
〔（Ａ＋Ｔ）×２＋（Ｇ＋Ｃ）×４〕により推定するこ
とができる。

【００６５】前記プローブの鎖長は、特に限定はない
が、非特異的なハイブリダイゼーションを防止する観点
から、１５塩基以上であり、好ましくは１８塩基以上で
あることが望ましい。

【００６６】また、プライマーの鎖長は、特に限定はな
いが、例えば、１５〜４０塩基長であり、好ましくは１
７〜３０塩基長であることが望ましい。

【００６７】前記のキットにおいて、ポリペプチド
は、表５〜表１１４、表１１７〜表３９７に記載の遺伝
子であって、トリブチルスズによって発現量が変化する
遺伝子群、４−オクチルフェノールによって発現量が変
化する遺伝子群、４−ノニルフェノールによって発現量
が変化する遺伝子群、フタル酸ジ−ｎ−ブチルによって
発現量が変化する遺伝子群、フタル酸ジシクロヘキシル
によって発現量が変化する遺伝子群、オクタクロロスチ
レンによって発現量が変化する遺伝子群、ベンゾフェノ
ンによって発現量が変化する遺伝子群、フタル酸ジエチ
ルヘキシルによって発現量が変化する遺伝子群、ジエチ
ルスチルベストロールによって発現量が変化する遺伝子
群、１７β−エストラジオールによって発現量が変化す
る遺伝子群のそれぞれから選択される少なくとも１種以
上の遺伝子にコードされたポリペプチドが挙げられる。

【００６８】抗体は、前記ポリペプチドに特異的に結合
する能力を有するものであれば、特に限定はなく、ポリ
クローナル抗体、モノクローナル抗体のどちらでもよ
い。さらに、公知技術により修飾された抗体や抗体の誘
導体、例えばヒト化抗体、Ｆabフラグメント、単鎖抗体
等を使用することもできる。前記抗体は、例えば、1992
年、ジョン・ワイリー＆サンズ社（ＪｏｈｎＷｉｅｌ
ｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）発行、ジョン・Ｅ・コリガ
ン（ＪｏｈｎＥ．Ｃｏｌｉｇａｎ）編集、カレント
・プロトコルズ・イン・イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ
ＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）
に記載の方法により、前記ポリペプチドの全部又は一部
を用いてウサギやラット、マウス等を免疫することによ
り、容易に作製され得る。こうして得られた抗体を精製
後、ペプチダーゼ等により処理することにより、抗体の
断片が得られる。また、遺伝子工学的に抗体を作製する
こともできる。さらに、本発明の抗体又はその断片は、
酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法等に
よる検出を容易にするために、各種修飾をしてもよい。

【００６９】また、上記の抗体又はその断片には、ポリ
ペプチドのある部分断片に特異的に結合しうるものも含
まれる。

【００７０】以上のように本発明の方法により迅速、高
感度でしかも同時に多数の試料について内分泌かく乱作
用の有無を評価することができる。また、該方法のため
のツール、例えばＤＮＡアレイを作製することができ、
迅速、高感度でしかも同時に多数の試料について内分泌
かく乱作用の有無を評価することができる。さらに、本
発明の試料の内分泌かく乱作用の有無を評価するキット
を用いることにより、安価で迅速、高感度でしかも同時
に多数の試料について内分泌かく乱作用の有無を評価す
ることができる。

【００７１】

【実施例】以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定され
るものではない。

【００７２】実施例１妊娠マウス由来の雄胎仔を用い
た遺伝子の解析（１）内分泌かく乱物質の投与量の設定妊娠後１０日目のＢＡＬＢ／ｃマウスを日本ＳＬＣより
購入し、温度２４〜２６℃、湿度約５０％でＳＰＦに準
ずる条件下で飼育した。それぞれのマウスにはストレス
を与えないように個別のケージに入れて飼育した。妊娠
マウスへの投与量は、げっ歯類への経口投与によるＬＤ
５０を基準とした。無作用量と考えられる１００分の１
量のさらに１０分の１量、すなわちＬＤ５０の１０００
分の１量と設定した。経口投与での毒性が認められず、
ＬＤ５０が分からない物質については、最大投与量の１
０００分の１量とした。表１に投与量を示す。

【００７３】

【表１】

【００７４】内分泌かく乱物質を表1の投与量で、１％
ＤＭＳＯを含む落花生油をＶｅｈｉｃｌｅとして妊娠
１０日目に購入したＢＡＬＢ／ｃに、購入当日より連日
７日間、皮下に投与した。コントロールにはＶｅｈｉｃ
ｌｅのみを注射した。最終投与の翌日、すなわち妊娠１
７日目に解剖し胎仔を摘出した。組織の一部を別に採取
し、ＰＣＲによる雌雄判別に用いるためにＲＮＡｌａｔ
ｅｒ試薬（Ａｍｂｉｏｎ社製）に入れ、試験の当日まで
−８０℃で保存した。また、胎仔は頭部をＲＮＡｌａｔ
ｅｒ試薬に入れ、ＲＮＡ抽出の当日まで−８０℃で保存
した。

【００７５】（２）胎仔の雌雄の判別胎仔の雌雄の判別には、凍結保存されていた組織の一部
を解凍し、すみやかにＬｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ（１０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ
ＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、３９ｍＭＤＴＴ、２
％ＳＤＳ）１００μｌに入れ、１００μｇ／ｍｌとな
るようにＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを加えて、６０℃で
３時間インキュベートした。ここにＲＮａｓｅＡを１
０μｇ／ｍｌとなるように加え、さらに３７℃で１時間
インキュベートした。０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）で飽和したフェノール／クロロホルム／イソア
ミルアルコール（２５：２４：１ｖ／ｖ）で抽出し、
通常のエタノール沈殿法によりゲノムＤＮＡを回収し
た。これを適量のＴＥｂｕｆｆｅｒに溶解し、その一
部をとってＯＤ２６０とＯＤ２８０を測定し、ゲノムＤ
ＮＡの濃度を算出し、ＰＣＲ反応に供した。

【００７６】上記ゲノムＤＮＡ０．０３〜０．１μｇ
を鋳型にして、５０ｐｍｏｌの雌雄判別用プライマーＺ
ｆｙ−ｓｅｎｓｅ（配列番号１）及びＺｆｙ−ａｎｔｉ
ｓｅｎｓｅ（配列番号２）を用い、５０μｌの容量でＰ
ＣＲを行なった。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはタカ
ラＥｘタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従
って用い、９４℃で３分保持した後９６℃で４０秒、６
５℃で７０秒、７２℃で１００秒を１サイクルとし、３
０サイクル行い最後に７２℃で１０分保持した。上記の
ＰＣＲ反応液の一部をとり染色液と一緒に２％アガロー
スゲルにアプライし、電気泳動を行なった。雄のゲノム
ＤＮＡがあれば、６１８ｂｐの大きさの位置にバンド
が検出される。内分泌かく乱物質各群には妊娠マウスを
３匹ずつ用いた。Ｖｅｈｉｃｌｅ群は５匹を用いた。そ
の結果、各群より得られた総胎仔数、胎仔の雌雄の数を
表２に示す。

【００７７】

【表２】

【００７８】妊娠マウスより得られた胎仔の雄と雌の比
率は、各個体でバラツキはみられるもののＶｅｈｉｃｌ
ｅ群と比較して大きな差があるとは考えられなかった。

【００７９】（３）雄の胎仔の頭部からのｔｏｔａｌ
ＲＮＡの抽出胎仔の個体差が出ないように、各群より５匹分の胎仔を
選別し、一緒にしてからＲＮＡを抽出した。選別方法
は、各母体から少なくとも１匹ずつを選んだ。凍結保存
してあった頭部の組織を解凍し、選別した５匹分を一緒
に２０ｍｌ容のホモゲナイザーに入れ、ＴＲＩｒｅａ
ｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ社製）を１０ｍｌ加えて、組織片
がみえなくなるまでホモゲナイズした。これを予め乾熱
滅菌したステンレスの遠沈管に入れ、４℃条件下１
２，０００×ｇで１０分間遠心した。上清を１ｍｌずつ
１０本のエッペンチューブに入れ、これにクロロホルム
（ナカライテスク社製）を０．２ｍｌずつ加え、ミキサ
ーでよく攪拌した。これを室温で５分間静置後、４℃条
件下で１２，０００×ｇ１０分間遠心分離した。この上
清を新たに用意したエッペンチューブに移し、２―プロ
パノール０．５ｍｌを加えてミキサーで混合し５〜１０
分間静置した。これを４℃条件下１２，０００×ｇで１
０分間遠心し上清を除去した。７０％エタノール０．５
ｍｌを入れＲＮＡのペレットを洗浄し１２，０００×ｇ
で５分間遠心して上清を除去した。ペレットを風乾した
後、エッペンチューブ１本あたり１００μｌのジエチル
ピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理した水を加えて溶解
した。各群１０本分のＲＮＡを一緒にして混ぜた後、再
度分注することにより均一化した。その１μｌをとり１
１９μｌのＴＥｂｕｆｆｅｒで希釈して吸光度ＯＤ２
６０とＯＤ２８０を測定し、ｔｏｔａｌＲＮＡ量と純
度を算出した。その結果を表３に示す。残りのＲＮＡは
ｍＲＮＡを抽出するまで−８０℃で保存した。

【００８０】

【表３】

【００８１】各群５匹から得られたｔｏｔａｌＲＮＡ
の量は、各群間で大きな差は認められなかった。

【００８２】（４）ｔｏｔａｌＲＮＡからのｍＲＮＡ
の抽出実施例１−（３）で組織から抽出したｔｏｔａｌＲＮ
Ａ約１ｍｇを用いてｍＲＮＡを抽出した。抽出はＯｌｉ
ｇｏｔｅｘ−ＭＡＧｍＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｉｔ
ｏｎｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて行なった。エッ
ペンチューブ一本につきｔｏｔａｌＲＮＡ量が約１２
５μｇとなるように８本あるいはＶｅｈｉｃｌｅ群では
４８本に分注し、ＤＥＰＣ処理した水を加えて全量で１
５０μｌとした。これに同量の２×Ｂｉｎｄｉｎｇｂ
ｕｆｆｅｒを加え混合した後Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ＭＡＧ
を３０μｌ入れ軽く混合し７０℃の温浴中で３分間イン
キュベートした。その後室温で１０分間静置した後Ｍａ
ｇｎｅｔｉｇｈｔＳｅｐａｒａｔｉｏｎＳｔａｎｄ
（宝酒造社製）にセットし２分間静置後、Ｏｌｉｇｏｔ
ｅｘ−ＭＡＧビーズを吸い取らないように上清を除去し
た。チューブをスタンドからはずし、３５０μｌのＷａ
ｓｈｂｕｆｆｅｒを加えて混和した後、同じスタンド
にセットし２分間静置後、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ＭＡＧビ
ーズを吸い取らないように上清を除去した。同量のＷａ
ｓｈｂｕｆｆｅｒを用いて同じ操作を繰り返しＯｌｉ
ｇｏｔｅｘ−ＭＡＧビーズを洗浄した後、予め７０℃に
加温しておいたＤＥＰＣ処理水をチューブ１本あたり１
００μｌ加えよく混和してからスタンドにセットし２分
間静置した。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ＭＡＧビーズを吸い取
らないようにｍＲＮＡを溶出した上清を別のチューブに
回収した。同量のＤＥＰＣ処理水を用いてさらに１回、
同じ操作を繰り返しｍＲＮＡを回収した。回収したｍＲ
ＮＡを含む溶出液は４００〜５００μｌずつ分注した後
１０分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加え、さらに
全量と等量の２―プロパノール（ナカライテスク社製）
を加えて５分間程度室温で静置した後１２，０００×ｇ
で１０分間遠心分離した。上清を除いた後、ｍＲＮＡの
沈殿を７０％エタノール水溶液を用いて洗浄し乾燥させ
た後、沈殿をチューブ１本あたり４〜５μｌのＴＥｂ
ｕｆｆｅｒに溶解した。最後に各群で１本のチューブに
まとめ混合し均一化した。ここから１μｌをとり１１９
μｌのＴＥｂｕｆｆｅｒで希釈してＯＤ２６０とＯＤ
２８０の吸光度を測定しＲＮＡ量を算出した。残りのｍ
ＲＮＡはＤＮＡチップの解析に使用するまで−８０℃で
保存した。使用したｔｏｔａｌＲＮＡ量と得られたｍ
ＲＮＡの量を表４に示す。

【００８３】

【表４】

【００８４】ｔｏｔａｌＲＮＡからのｍＲＮＡの回収
率は、２．２〜３．８％であった。回収したｍＲＮＡ
は、アジレント２１００バイオアナライザ（アジレント
テクノロジー社製）を用いて解析を行なったところｒＲ
ＮＡの量はｔｏｔａｌＲＮＡに含まれている量に比べ
てかなり少なくなっており、ｍＲＮＡが純度よく回収さ
れていることが確認された。

【００８５】（５）ＤＮＡチップを用いた遺伝子解析ａ．蛍光プローブの調製実施例１−（４）で調製したｍＲＮＡを０．２μｇ／μ
ｌとなるようにＴＥｂｕｆｆｅｒで希釈し、その５μｌ
とＯｌｉｇｏｄＴｐｒｉｍｅｒ（１００ｐｍｏｌ
／μｌ）の５μｌを混ぜ、７０℃で５分間インキュベー
トした後、直ちに氷上に置いた。これに５×ＡＭＶｂ
ｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）を４μｌ、１０×ｄＮＴＰ
ｍｉｘｔｕｒｅ（宝酒造社製）を２μｌ、ＲＮａｓｅ
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを２０Ｕ（宝酒造社製）、ＡＭＶ
ＲＴａｓｅ（宝酒造社製）を３０Ｕ、１ｍＭＣｙ３又
はＣｙ５−ｄＵＴＰ（アマシャムファルマシア社製）を
０．７μｌ加えた。４２℃で６０分間インキュベートし
た後再度ＡＭＶＲＴａｓｅを３０Ｕを加え、４２℃で
６０分間、続いて７０℃で１０分間インキュベートし
た。以上の方法で調製した蛍光プローブをＣｅｎｔｒｉ
Ｓｅｐ（ＰｒｉｎｃｅｔｏｎＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓ
社製）で精製し、通常のとおりエタノール沈殿した後、
７０％エタノールで沈殿を洗浄し、風乾させ１０μｌの
ハイブリダイゼーションバッファー（６×ＳＳＣｂｕ
ｆｆｅｒ、０．２％ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒｄ’ｔ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１ｍｇ／ｍｌｓａｌｍｏｎｓ
ｐｅｒｍＤＮＡ）に溶解した。

【００８６】ｂ．ＤＮＡチップのプレハイブリダイゼー
ション１０μｌのプレハイブリバッファーをＤＮＡチップ（Ｉ
ｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅＭｏｕｓｅＣＨＩＰＳｅｔ
Ｉｖｅｒ．１．０；宝酒造社製）上にのせ、カバーガ
ラスをのせてペーパーボンドにてシールし密封し、これ
を室温で２時間インキュベートした。ペーパーボンドと
カバーガラスを除去し２×ＳＳＣｂｕｆｆｅｒでＤＮ
Ａチップを洗浄した後、さらに０．２％ＳＳＣｂｕ
ｆｆｅｒで洗浄した。１０００ｒｐｍで５分間遠心し、
ＤＮＡチップを乾燥させた。

【００８７】ｃ．ハイブリダイゼーションａ．の操作で調製した蛍光プローブ溶液のうち１０μｌ
を９５℃で２分間処理し、直ちに氷上に置いた。１５０
００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を回収した。これを
プレハイブリダイゼーションの時と同様に、あらかじめ
プレハイブリダイゼーションを行ったＤＮＡチップにの
せ、カバーガラスとペーパーボンドで密封し、６５℃で
一晩ハイブリダイゼーションをおこなった。ハイブリダ
イゼーション終了後、２×ＳＳＣｂｕｆｆｅｒ中でペ
ーパーボンドとカバーガラスを取り除いた。このＤＮＡ
チップを０．２％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣｂｕｆｆｅ
ｒで振とうしながら５５℃で３０分間洗浄した後、ｂｕ
ｆｆｅｒを交換して再度洗浄した。次に同じｂｕｆｆｅ
ｒを用いて同様に６５℃で５分間洗浄し、さらに０．０
５×ＳＳＣｂｕｆｆｅｒを用いて室温で５分間振とう
しながら洗浄した。１０００ｒｐｍ、５分間の遠心によ
りＤＮＡチップを乾燥させ、これをスキャニングして解
析した。その結果を表５から表１１４に示す。蛍光色素
Ｃｙ３の蛍光強度を蛍光色素Ｃｙ５の蛍光強度で割った
数値がＣｙ３／Ｃｙ５＊（Ｈ）の値であり、この数値が
２以上のものは薬物の作用により発現が誘導された遺伝
子を示し、０．５以下のものは発現が抑制された遺伝子
を表す。

【００８８】

【表５】

【００８９】

【表６】

【００９０】

【表７】

【００９１】

【表８】

【００９２】

【表９】

【００９３】

【表１０】

【００９４】

【表１１】

【００９５】

【表１２】

【００９６】

【表１３】

【００９７】

【表１４】

【００９８】

【表１５】

【００９９】

【表１６】

【０１００】

【表１７】

【０１０１】

【表１８】

【０１０２】

【表１９】

【０１０３】

【表２０】

【０１０４】

【表２１】

【０１０５】

【表２２】

【０１０６】

【表２３】

【０１０７】

【表２４】

【０１０８】

【表２５】

【０１０９】

【表２６】

【０１１０】

【表２７】

【０１１１】

【表２８】

【０１１２】

【表２９】

【０１１３】

【表３０】

【０１１４】

【表３１】

【０１１５】

【表３２】

【０１１６】

【表３３】

【０１１７】

【表３４】

【０１１８】

【表３５】

【０１１９】

【表３６】

【０１２０】

【表３７】

【０１２１】

【表３８】

【０１２２】

【表３９】

【０１２３】

【表４０】

【０１２４】

【表４１】

【０１２５】

【表４２】

【０１２６】

【表４３】

【０１２７】

【表４４】

【０１２８】

【表４５】

【０１２９】

【表４６】

【０１３０】

【表４７】

【０１３１】

【表４８】

【０１３２】

【表４９】

【０１３３】

【表５０】

【０１３４】

【表５１】

【０１３５】

【表５２】

【０１３６】

【表５３】

【０１３７】

【表５４】

【０１３８】

【表５５】

【０１３９】

【表５６】

【０１４０】

【表５７】

【０１４１】

【表５８】

【０１４２】

【表５９】

【０１４３】

【表６０】

【０１４４】

【表６１】

【０１４５】

【表６２】

【０１４６】

【表６３】

【０１４７】

【表６４】

【０１４８】

【表６５】

【０１４９】

【表６６】

【０１５０】

【表６７】

【０１５１】

【表６８】

【０１５２】

【表６９】

【０１５３】

【表７０】

【０１５４】

【表７１】

【０１５５】

【表７２】

【０１５６】

【表７３】

【０１５７】

【表７４】

【０１５８】

【表７５】

【０１５９】

【表７６】

【０１６０】

【表７７】

【０１６１】

【表７８】

【０１６２】

【表７９】

【０１６３】

【表８０】

【０１６４】

【表８１】

【０１６５】

【表８２】

【０１６６】

【表８３】

【０１６７】

【表８４】

【０１６８】

【表８５】

【０１６９】

【表８６】

【０１７０】

【表８７】

【０１７１】

【表８８】

【０１７２】

【表８９】

【０１７３】

【表９０】

【０１７４】

【表９１】

【０１７５】

【表９２】

【０１７６】

【表９３】

【０１７７】

【表９４】

【０１７８】

【表９５】

【０１７９】

【表９６】

【０１８０】

【表９７】

【０１８１】

【表９８】

【０１８２】

【表９９】

【０１８３】

【表１００】

【０１８４】

【表１０１】

【０１８５】

【表１０２】

【０１８６】

【表１０３】

【０１８７】

【表１０４】

【０１８８】

【表１０５】

【０１８９】

【表１０６】

【０１９０】

【表１０７】

【０１９１】

【表１０８】

【０１９２】

【表１０９】

【０１９３】

【表１１０】

【０１９４】

【表１１１】

【０１９５】

【表１１２】

【０１９６】

【表１１３】

【０１９７】

【表１１４】

【０１９８】実施例２ヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７および
Ｔ−４７Ｄを用いた遺伝子の解析転移性乳癌患者の胸水
浸出細胞から樹立された細胞であるＭＣＦ−７細胞は、
上皮様で多角形の細胞であり、分化した乳腺上皮細胞の
特徴であるドーム形成をおこなうという特徴がある。こ
の細胞はエストロゲン投与によって細胞増殖を促進され
るなど、エストロゲン応答性を示す。また、エストロゲ
ン受容体、プロゲステロン受容体を有する。特にエスト
ロゲン受容体レベルが高く、エストロゲンによる遺伝子
発現や細胞増殖の調節を研究する上で有用な細胞株であ
る。また、転移性乳癌患者の胸水浸出細胞から樹立され
た細胞であるＴ−４７Ｄ細胞も、上皮様で多角形の細胞
であり、分化した乳腺上皮細胞の特徴であるドーム形成
をおこなう。この細胞はエストロゲン投与によって細胞
増殖を促進されるなど、エストロゲン応答性を示す。ま
た、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体を有す
る。特にプロゲステロン受容体レベルが高くこれらを利
用した研究に用いられる。

【０１９９】（１）ＭＣＦ−７細胞およびＴ４７Ｄ細胞
からのｍＲＮＡの調製ａ．活性炭処理した牛胎仔血清の調製活性炭処理した牛胎仔血清の作成は、Ｓｔａｎｌｅｙら
の方法に従って行った［セル（Ｃｅｌｌ）、第１０巻、
第３５〜４４頁（１９７７）］。非働化牛仔児血清（５
６℃，３０分間処理したもの）５００ｍｌに活性化した
活性炭（活性炭２５ｇを蒸留水中で撹拌後、濾紙でろ過
したもの）を５％ｗ／ｖの濃度及びＤｅｘｔｒａｎを
０．５％ｗ／ｖとなるように添加し、この溶液を数回撹
拌後４℃で終夜放置した。その後、２００ｒｐｍで２０
分間遠心分離して上清を回収しろ紙を用いてろ過した。
そして、これをフィルター（０．２２μｍ；ミリポア社
製）滅菌し−２０℃で保管した。

【０２００】ｂ．細胞の培養細胞の培養は、ｐｈｅｎｏｌｒｅｄを含まないＤｕｌ
ｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＥ
ａｇｌｅ'ｓｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地（Ｂｉｏ
Ｗｈｉｔａｋｋｅｒ社製）に２ｍＭのＬ−グルタミンお
よびｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ
（ＢｉｏＷｈｉｔａｋｋｅｒ社製）５ｍｌを添加した培
地（無血清培地）を用いて行い、３７℃、飽和湿度、５
％の二酸化炭素／９５％空気の条件で培養した。ＭＣＦ
−７細胞は５日間、Ｔ−４７Ｄ細胞は４日間プレインキ
ュベートし、トリブチルスズ（ＴＢＴ）、４−オクチル
フェノール（ＯＰ）、４−ノニルフェノール（ＮＰ）、
フタル酸ジ-ｎ-ブチル（ＤＢＰ）、フタル酸ジシクロヘ
キシル（ＤＣＨＰ）、オクタクロロスチレン（ＯＣ
Ｓ）、ベンゾフェノン（ＢＰ）を添加した。すなわち細
胞に添加する濃度は、一般的に用いられるＷＳＴ−１ア
ッセイにおいて細胞増殖活性（アゴニスト活性）を示し
た物質に対しては増殖率が最も高い濃度に、アゴニスト
活性を示さなかった物質に対しては、被験物質添加２４
時間後の所見で細胞毒性が見られなかった最も高い濃度
を用いることにした。つまり、ＴＢＴは１０ｎＭ、ＯＰ
は２００ｎＭ、ＮＰは１μＭ、ＤＢＰは２μＭ、ＤＣＨ
Ｐ２μＭ、ＯＣＳは４７０ｍＭ、ＢＰは２μＭである。
この７物質の処理時間は６時間と設定した。

【０２０１】ＤＮＡチップを用いて実験を行うためのＭ
ＣＦ−７細胞の大量培養は、血清培地で一定期間培養し
たＭＣＦ−７細胞をトリプシン処理し遠心分離で細胞を
回収後（１０００ｒｐｍ、１ｍｉｎ）、無血清培地で細
胞の洗浄を行った。その後、無血清培地でパスツールピ
ペットを用いて単細胞になるまで懸濁し、１×１０^６個
／プレートとなるように直径１０ｃｍの培養プレートに
調製し、３日後に培地を交換後さらに２日間培養を行っ
た。そして細胞を回収後、上記７種類の試験試薬を溶解
したジメチルスルホキシドの持ち込みが０．１％になる
ように添加し、６時間培養を行った。そして、これらの
細胞をＰＢＳで洗浄後トリプシン処理し遠心分離（１０
００ｒｐｍ、３分間）で細胞の回収を行った。

【０２０２】Ｔ−４７Ｄ細胞の培養は、ｐｈｅｎｏｌ
ｒｅｄとＬ−グルタミン酸を含むＤＭＥＭ（ＢｉｏＷｈ
ｉｔａｋｋｅｒ社製）にｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＢｉｏＷｈｉｔａｋｋｅｒ社製）
と１０％になるように非働化牛胎仔血清を添加した培地
（血清培地）で一定期間培養したＴ−４７Ｄ細胞をトリ
プシン処理し遠心分離で細胞を回収後（１０００ｒｐ
ｍ、３分間）、無血清培地で細胞の洗浄を行った。その
後、無血清培地でパスツールピペットを用いて単細胞に
なるまで懸濁し、１×１０^６個／プレートとなるように
１０ｃｍの培養プレートに調製し４日間培養を行った。
そして細胞を回収後、上記７種類の試験試薬を前述と同
様に添加し６時間培養を行った。そして、これらの細胞
をＰＢＳで洗浄後トリプシン処理し遠心分離（１０００
ｒｐｍ、３分間）で細胞の回収を行った。

【０２０３】ｃ．ｔｏｔａｌＲＮＡの回収ｔｏｔａｌＲＮＡの回収は、ストラタジーン社のＳｔ
ｒａｔａＰｒｅｐを用いてマニュアルに従って行った。
ここで得られたｔｏｔａｌＲＮＡの濃度は吸光度ＯＤ
２６０から、また純度はＯＤ２６０／ＯＤ２８０の比よ
り算出した。直径１０ｃｍの培養プレートからｔｏｔａ
ｌＲＮＡの回収を行った結果、ＭＣＦ−７細胞および
Ｔ−４７Ｄ細胞から培養プレート１枚あたり１６〜３１
μｇのｔｏｔａｌＲＮＡが回収された。得られたｔｏ
ｔａｌＲＮＡ量と純度を表１１５と表１１６に示す。

【０２０４】

【表１１５】

【０２０５】

【表１１６】

【０２０６】（２）ＤＮＡｃｈｉｐを用いた遺伝子
の解析ａ．プローブの作製解析する細胞から回収した比較する２種のｔｏｔａｌ
ＲＮＡ２０μｇに１００ｐｍｏｌ／μｌＯｌｉｇｏ
ｄＴプライマー３μｌを加え、７０℃で５分熱変成し
た後に氷上で急冷を行った。その後、４μｌの５×ＡＭ
Ｖｂｕｆｆｅｒ、２．０μｌの１０×ｄＮＴＰｍｉ
ｘｔｕｒｅ（宝酒造社製）、１μｌの１ｍＭＣｙ３も
しくはＣｙ５−ｄＵＴＰ（アマシャムファルマシア社
製）、２０ＵのＲｉｂｏｎｕｃｒｅａｓｅｉｎｈｉｂ
ｉｔｏｒ（宝酒造社製）、３０ＵのＡＭＶ（宝酒造社
製）を加えて全量を２０μｌとした後、４２℃で９０分
インキュベートを行った。ここで、コントロール群はＣ
ｙ５標識、テスト群はＣｙ３標識した。そして、７０℃
で１０分処理した後にＣｅｎｔｒｉＳｅｐを用いてプロ
ーブの精製を行った。この溶出液をＤＥＰＣ処理水で１
００μｌとし等量のクロロホルム：イソアミルアルコー
ル（２４：１ｖ／ｖ）を加え、ボルテックスで撹拌
後、遠心分離（１４５００ｒｐｍ、５分）を行い水層を
回収した。この水層に２μｌの５×Ｃｏｍｐｅｔｉｔｏ
ｒＩ（Ｈｕｍａｎ）（宝酒造社製）を添加しエタノー
ル沈殿を行い１０μｌのハイブリダイゼーション溶液
（６×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒ
ｄ’'ｔｓｏｌｕｔｉｏｎ、０．１ｍｇ／ｍｌｓａ
ｌｍｏｎｓｐｅｒｍＤＮＡ）に溶解し、これをプロ
ーブ溶液とした。

【０２０７】ｂ．プレハイブリダイゼーションＤＮＡチップは、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅＨｕｍａｎ
ＤＮＡＣＨＩＰｆｏｒｅｎｄｏｃｒｉｎｅｄｉ
ｓｒｕｐｔｉｏｎｓｔｕｄｙｖｅｒｓｉｏｎ１．
１（表中ＤＮＡｃｈｉｐｆｏｒＥＤＣｓｔｕｄ
ｙ、宝酒造社製）と、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅＨｕｍ
ａｎＤＮＡＣＨＩＰ１ＫＳｅｔＩｖｅｒｓ
ｉｏｎ１．０（表中ｈｕｍａｎ１ＫＤＮＡｃｈ
ｉｐ、宝酒造社製）を用いた。ＤＮＡチップ上にカバー
ガラス（宝社製）をのせ、１０μｌのプレハイブリダイ
ゼーション溶液を流し込み室温で２時間インキュベート
した。これを２×ＳＳＣ、続いて０．２×ＳＳＣで洗浄
を行った。これを遠心（１０００ｒｐｍ、３分）を行っ
てスライドガラスを乾燥させた。

【０２０８】ｃ．ハイブリダイゼーションおよび洗浄プローブ溶液を９５℃で２分間処理し熱変性を行った後
に室温で数分間インキュベートした。そして、この溶液
を遠心分離（１４５００ｒｐｍ、１０分間、２０℃）を
行い沈殿物を除去した。その後、カバーガラスを載せた
ＤＮＡチップに、この溶液を流し込みハイブリダイゼー
ションチャンバーで６５℃終夜ハイブリダイゼーション
を行った。ハイブリダイゼーション終了後、スライドガ
ラスを２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ溶液中でカバーガラ
スを静かにはがし、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳの溶液
で５５℃、３０分間の洗浄を２回、続いて２×ＳＳＣ、
０．２％ＳＤＳの溶液で６５℃、５分間の洗浄を行っ
た。最後に０．０５×ＳＳＣ室温で５分間の洗浄を行い
ＳＤＳを除去した後、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分
間）しＤＮＡチップを乾燥させた。このＤＮＡチップを
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４１８^ＴＭＡｒｒａｙＳｃａ
ｎｎｅｒ（宝酒造社製）を用いて各スポットのＣｙ３，
Ｃｙ５それぞれの蛍光量を測定した。結果を表１１７か
ら表２２０に示す。なお、表中の数字はＣｙ３／Ｃｙ５
＊（Ｈ）の数値を示し、コントロール（０．１％ジメチ
ルスルホキシドを培地に添加したＶｅｈｉｃｌｅ群）に
対する試験試薬添加群のシグナル強度の比を表す。この
値が２以上であればコントロールに対して、その遺伝子
の発現が亢進されたことを示し、０．５以下であれば抑
制されたことを示す。表１１７〜表１３３、表１５８〜
表１６０、表１６５〜表１９２および表２１１〜表２１
５は、被験物質である７物質のうち少なくとも１物質に
ついて遺伝子の発現の亢進が見られたものを示し、表１
３４〜表１５７、表１６１〜表１６４、表１９３〜表２
１０および表２１６〜表２２０は、被験物質である７物
質のうち少なくとも１物質について遺伝子の発現の抑制
が見られたものを示す。また、ＴＢＴはトリブチルスズ
を、ＯＰは４−オクチルフェノール、ＮＰは４−ノニル
フェノール、ＤＢＰはフタル酸ジ-ｎ-ブチル、ＤＣＨＰ
はフタル酸ジシクロヘキシル、ＯＣＳはオクタクロロス
チレン、ＢＰはベンゾフェノンをそれぞれ表す。

【０２０９】

【表１１７】

【０２１０】

【表１１８】

【０２１１】

【表１１９】

【０２１２】

【表１２０】

【０２１３】

【表１２１】

【０２１４】

【表１２２】

【０２１５】

【表１２３】

【０２１６】

【表１２４】

【０２１７】

【表１２５】

【０２１８】

【表１２６】

【０２１９】

【表１２７】

【０２２０】

【表１２８】

【０２２１】

【表１２９】

【０２２２】

【表１３０】

【０２２３】

【表１３１】

【０２２４】

【表１３２】

【０２２５】

【表１３３】

【０２２６】

【表１３４】

【０２２７】

【表１３５】

【０２２８】

【表１３６】

【０２２９】

【表１３７】

【０２３０】

【表１３８】

【０２３１】

【表１３９】

【０２３２】

【表１４０】

【０２３３】

【表１４１】

【０２３４】

【表１４２】

【０２３５】

【表１４３】

【０２３６】

【表１４４】

【０２３７】

【表１４５】

【０２３８】

【表１４６】

【０２３９】

【表１４７】

【０２４０】

【表１４８】

【０２４１】

【表１４９】

【０２４２】

【表１５０】

【０２４３】

【表１５１】

【０２４４】

【表１５２】

【０２４５】

【表１５３】

【０２４６】

【表１５４】

【０２４７】

【表１５５】

【０２４８】

【表１５６】

【０２４９】

【表１５７】

【０２５０】

【表１５８】

【０２５１】

【表１５９】

【０２５２】

【表１６０】

【０２５３】

【表１６１】

【０２５４】

【表１６２】

【０２５５】

【表１６３】

【０２５６】

【表１６４】

【０２５７】

【表１６５】

【０２５８】

【表１６６】

【０２５９】

【表１６７】

【０２６０】

【表１６８】

【０２６１】

【表１６９】

【０２６２】

【表１７０】

【０２６３】

【表１７１】

【０２６４】

【表１７２】

【０２６５】

【表１７３】

【０２６６】

【表１７４】

【０２６７】

【表１７５】

【０２６８】

【表１７６】

【０２６９】

【表１７７】

【０２７０】

【表１７８】

【０２７１】

【表１７９】

【０２７２】

【表１８０】

【０２７３】

【表１８１】

【０２７４】

【表１８２】

【０２７５】

【表１８３】

【０２７６】

【表１８４】

【０２７７】

【表１８５】

【０２７８】

【表１８６】

【０２７９】

【表１８７】

【０２８０】

【表１８８】

【０２８１】

【表１８９】

【０２８２】

【表１９０】

【０２８３】

【表１９１】

【０２８４】

【表１９２】

【０２８５】

【表１９３】

【０２８６】

【表１９４】

【０２８７】

【表１９５】

【０２８８】

【表１９６】

【０２８９】

【表１９７】

【０２９０】

【表１９８】

【０２９１】

【表１９９】

【０２９２】

【表２００】

【０２９３】

【表２０１】

【０２９４】

【表２０２】

【０２９５】

【表２０３】

【０２９６】

【表２０４】

【０２９７】

【表２０５】

【０２９８】

【表２０６】

【０２９９】

【表２０７】

【０３００】

【表２０８】

【０３０１】

【表２０９】

【０３０２】

【表２１０】

【０３０３】

【表２１１】

【０３０４】

【表２１２】

【０３０５】

【表２１３】

【０３０６】

【表２１４】

【０３０７】

【表２１５】

【０３０８】

【表２１６】

【０３０９】

【表２１７】

【０３１０】

【表２１８】

【０３１１】

【表２１９】

【０３１２】

【表２２０】

【０３１３】実施例３マウス精巣由来セルトリ細胞
（ＴＭ４）とライディッヒ細胞（ＴＭ３）を用いた遺伝
子の解析精細胞に栄養や諸因子を供給するセルトリ細胞とテスト
ステロンを産生するライディッヒ細胞は共に精子形成に
重要な役割を果たす。それぞれの株化細胞ＴＭ４および
ＴＭ３を用いて被験７物質の影響を遺伝子発現レベルで
解析し変動する遺伝子を選別した。

【０３１４】（１）精巣由来細胞からのｍＲＮＡの調製ａ．Ｃｈａｒｃｏａｌ−ｄｅｘｔｒａｎ処理血清（ＤＣ
−ＦＣＳ）培地添加物である血清からステロイドホルモンを抜くた
め、ウシ胎仔血清を以下のようにＣｈａｒｃｏａｌ−ｄ
ｅｘｔｒａｎ（ＣＤ）処理した。５０ｍｌ遠心チューブ
（ＩＷＡＫＩ社製）に蒸留水３３ｍｌ、Ｃｈａｒｃｏａ
ｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ＳＩＧＭＡ社製）３．３ｇを
加えて軽くチューブを振りなじませた。２０００ｒｐ
ｍ、３分間遠心し、水を除去した。これに蒸留水３３ｍ
ｌとＤｅｘｔｒａｎＴ７０（アマシャムファルマシア
社製）１．６５ｇを加えて軽く振ってなじませた後、６
００ｒｐｍ、６分間遠心し、水を除去した。ここへウシ
胎仔血清３０ｍｌを加え、３７℃、１時間緩やかに加温
振盪した。３０００ｒｐｍ、２０分間で遠心後、上清の
血清をフィルター滅菌し、−２０℃で保存した。

【０３１５】ｂ．細胞の培養細胞の培養には、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培
地（通常製品、ＰｈｅｎｏｌＲｅｄＦｒｅｅ製
品）、ＩｎｓｕｌｉｎＴｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ｓｅ
ｌｅｎｉｕｍ−ＸＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（培地添加
物：ＩＴＳ−Ｘ）、トリプシンはＧＩＢＣＯ社製、ウシ
胎仔血清（ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ：Ｆ
ＢＳ）はＪＲＨＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ社製、ＰＢＳ
（−）（細胞培養用ダルベッコｐｈｏｓｐｈａｔｅｂ
ｕｆｆｅｒｓａｌｉｎｅ（−）「ニッスイ」粉末Ｄ）
は日水製薬社製を用いた。その他、特に記述がある場合
以外は、試薬は市販試薬特級を用いた。

【０３１６】ＴＭ４細胞はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ
ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，
Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ：ＣＲＬ−１７１５）より入手
した。この細胞はＢＡＬＢ／ｃマウス精巣正常組織から
分離樹立されたセルトリ細胞である。ＦＳＨ、アンドロ
ゲン、エストロゲン、プロゲステロンの各レセプターを
発現しており、初代培養細胞より弱いながらＦＳＨに応
答しｃＡＭＰを産生する。またトランスフェリン、Ｈ−
Ｙアンチゲン、プラスミノーゲン活性化因子を産生する
ことが報告されている。ＴＭ３はＡＴＣＣ（ＣＲＬ−１
７１４）より入手した。この細胞はＢＡＬＢ／ｃマウス
精巣正常組織から分離樹立されたライディッヒ細胞であ
る。ＬＨ、ＥＧＦ、アンドロゲン、エストロゲン、プロ
ゲステロンの各レセプターを発現しており、ＬＨに応答
しｃＡＭＰを産生するがＦＳＨには応答しない。またプ
ロスタグランジンＦ２ａを産生することが報告されてい
る。

【０３１７】それぞれの細胞の継代維持は以下のように
行った。ＴＭ４細胞：培養ディッシュ（ＩＷＡＫＩ社
製）中の培地を除去し、ＰＢＳ（−）３ｍｌで洗浄後、
０．５ｍｌの０．２５％トリプシン溶液を添加した。３
７℃、５％ＣＯ_２インキュベータに２分間放置した後、
１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地１０ｍｌで細
胞浮遊液として、細胞密度を調製した後、新たな培養デ
ィッシュに移し３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータで培
養した。

【０３１８】ＴＭ３細胞：培養ディッシュ（ＩＷＡＫＩ
社製）中の培地を除去し、ＰＢＳ（−）３ｍｌで洗浄
後、１ｍｌの０．２５％トリプシン溶液を添加した。３
２℃、５％ＣＯ_２インキュベータに３分間放置した後、
１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地１０ｍｌで細
胞浮遊液として、細胞密度を調製した後、新たな培養デ
ィッシュに移し３２℃、５％ＣＯ_２インキュベータで培
養した。

【０３１９】ホルモン低減培養法：通常液体培地に添加
されているｐＨ指示薬であるフェノールレッドは、エス
トロゲン様作用があることが知られている。そこで、実
験系におけるホルモンの影響を除くため、細胞内外のス
テロイドホルモン類を低減する処理をした。通常の培地
により播種した細胞を１８−２４時間静置培養し安定さ
せた。その後、培地を除去しホルモン低減培養用の培地
（ＤＣ−ＦＣＳを含み（ＴＭ４：１％、ＴＭ３：１
％）、ＩＴＳ−Ｘ培地添加物１％を含むフェノールレッ
ド非添加のＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２液体培地）に交換し２４
時間培養した。その培地を除去後、ＩＴＳ−Ｘ１％を含
むフェノールレッド非添加Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２液体培
地に被験試薬を添加し培養した。

【０３２０】ｃ．細胞毒性試験と試薬処理濃度決定被験物質の濃度を決定するため、細胞生存率を指標に被
験物質の細胞毒性を調べた。生細胞の測定にはＷＳＴ−
１法を用いた。６×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞懸濁
液を、９６穴マイクロプレートに各ウェル１８０μｌず
つまき、１日培養後、各ウェルに定められた濃度に調製
した試薬溶液をそれぞれ作用させた。なお、溶媒である
エタノールは最終濃度として０．１％となるように調製
した。被験物質添加後２４時間静置培養し、ＷＳＴ−１
ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ（ＤＯＪＩＮＤＯ
社製）の測定用試薬をＰＢＳで２倍希釈したものを加え
た。各ウェルに２０μｌずつ加え、３７℃、５％ＣＯ_２
インキュベーター内で２〜３時間放置した。放置後適度
な発色が見られていることを確認した後、９６穴マイク
ロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ５５０、バイオラッ
ド社製）を用いて吸光度を測定した。測定波長は、４５
０ｎｍを使用した。生存率算出方法は、細胞の入ってい
ないウェルの吸光度をバックグラウンドとし、全てウェ
ルの吸光度の値から引いた後、溶媒のみを加えた時の値
を１００％として細胞生存率を算出した。

【０３２１】その結果より被験物質の処理濃度は毒性が
出始める濃度の２オーダー下を基準に決定した。ＯＰ、
ＮＰ、ＤＢＰ、ＤＣＨＰ、ＯＣＳ、ＢＰはそれぞれ１０
ｎＭ、ＴＢＴは毒性が強く、１ｎＭとした。

【０３２２】（２）ＤＮＡチップを用いた解析ＴＭ３、ＴＭ４、１５Ｐ−１細胞をそれぞれディッシュ
に播種し１８〜２４時間培養後さらに２４時間ホルモン
低減培養法で培養した。次に、この培地を除去、ＰＢＳ
（−）で洗浄し、ＰｈｅｎｏｌｒｅｄｆｒｅｅＤ
−ＭＥＭ／Ｆ１２培地に１％ＩＴＳ−Ｘを加えた無血清
培地に被験物質を加えたものに交換した。

【０３２３】次に被験７物質および１７β−エストラジ
オール（Ｅ_２）を上記方法により各々の細胞に６時間曝
露した。また同様に溶媒のみを試料添加時と同量曝露し
たものを対照として用意した。実施例２と同様にして得
られたｔｏｔａｌＲＮＡからＯｌｉｇｏｔｅｘｄＴ
−３０ｓｕｐｅｒ（宝酒造社製）によりＰｏｌｙＡ
^＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を抽出した。ｔｏｔａｌＲＮ
Ａ２００μｇを滅菌蒸留水１００μｌに溶解した。こ
の液に、１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２ｍ
ｌ、０．５ＭＥＤＴＡ４００μｌ、１０％ＳＤＳ２
ｍｌを滅菌蒸留水で全量を１００ｍｌとした２×Ｅｌｕ
ｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ１００μｌを加え、予めボルテ
ックスで攪拌したＯｌｉｇｏｔｅｘｄＴ−３０を２０
０μｌ加え混合し、６５℃、５分間加熱後、氷浴上に３
分間放置した。さらに５ＭＮａＣｌ５０μｌを加え
て再度攪拌し、３７℃で１０分間加温した。加温後、１
５０００ｒｐｍ、３分間遠心し上清を除去した後、滅菌
精製水２００μｌを加えピペッティングした。その後、
６５℃、５分間加熱後、氷浴上に３分間放置し、１５０
００ｒｐｍ、３分間遠心した後、上清を別のチューブへ
移した。これを再度繰り返した。得られたｍＲＮＡ溶液
は、３ＭＣＨ_３ＣＯＯＮａ、エタノール１０００μｌ
を加え攪拌し、−８０℃で３０分以上放置した（エタノ
ール沈殿法）。沈殿後、４℃、１５０００ｒｐｍで１５
分間遠心し、上清を除き、７５％エタノール２００μ
ｌを加えて沈殿物を洗浄した。次に４℃、１５０００ｒ
ｐｍで５分間遠心し、上清を除去した後、風乾した。乾
燥後、滅菌蒸留水に溶解し、濃度を測定した。この過程
を２回行うことで、純度の高いｍＲＮＡを得た。

【０３２４】ＤＮＡチップを用いた発現遺伝子の解析
は、米国Ｉｎｃｙｔｅ社が受託分析に用いているＤＮＡ
チップであり８０００種以上の遺伝子がスポットされて
いるＭｏｕｓｅＧＥＭ（ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎＭｉｃｒｏａｒｒａｙ）解析サービスを利用する
ことにより行った。発現変動の大きさは標準化されデー
タベースとなり、必要により閲覧、検索することができ
た。遺伝子配列はＩｎｃｙｔｅｃｌｏｎｅＩＤ（Ｉ
ｎｃｙｔｅ社のクローン番号）によりインターネット
（ｈｐｐｔ：／／ｗｗｗ．ｉｎｃｙｔｅ．ｃｏｍ）で見
ることができ、クローンの市販もされている。また、実
際のハイブリダイゼーションの様子も、ＰＤＦ（ｐｏｒ
ｔａｂｌｅｄｏｃｕｍｅｎｔｆｏｒｍａｔ）ファイ
ルとして閲覧および入手できた。それらのデータを整
理、解析し被験７物質およびＥ_２による遺伝子発現の変
動パターンを比較検討した。

【０３２５】ＴＭ４、ＴＭ３にＥ_２（１ｎＭ）および被
験７物質を上記の濃度で添加し６時間培養した（暴露処
理）後ｍＲＮＡを抽出し、無処理のＴＭ４、ＴＭ３のｍ
ＲＮＡ量と調べるためＤＮＡチップによる解析を行い、
遺伝子発現変動をＥ_２曝露の場合と比較した。その結果
を表２２１〜表２５９に示す。

【０３２６】ＤＮＡチップでの発現量比較は、それぞれ
のスポットの蛍光強度を比較することで行った。すなわ
ち、ある遺伝子について（化学物質に暴露させた細胞か
ら抽出したｍＲＮＡ量）／（無処理細胞から抽出したｍ
ＲＮＡ量）の値が２．００であるということは、暴露す
ることによりその遺伝子の発現量が２倍に亢進したこと
を示しており、値が０．２０であればその遺伝子の発現
量が無処理に比べて５分の１に抑制されたことを示す。
表中の数字は、発現亢進の場合２倍以上、抑制の場合は
２分の１以下を対象とし記載した。それ以外の値（０．
５０より大きく２．００より小さい）の場合はその遺伝
子の発現量の変化は無しとし、表中では−で示した。ま
た、表中のＮＤはシグナルが検出されなかったことを示
す。

【０３２７】ＴＭ４細胞とＴＭ３細胞において、Ｅ_２曝
露では応答しない遺伝子が被験７物質曝露では多数変動
した。しかし被験物質による発現変動パターンはＴＭ４
細胞とＴＭ３細胞においては大きく異なり、ＴＭ４細胞
の方が変動遺伝子数が多かった。ＴＢＴ、ＤＣＨＰ曝露
により両細胞で多くの遺伝子が変動した。一方ＤＢＰお
よびＮＰ曝露はＴＭ３細胞では変動遺伝子がほとんどな
かったのに対し、ＴＭ４細胞では数多くの遺伝子が変動
した。７物質により発現が抑制された遺伝子の割合は、
亢進された遺伝子より少なかった。糖新生の重要な律速
酵素のＦｒｕｃｔｏｓｅｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓ
ｅ１の遺伝子はＴＭ４細胞でＴＢＴ、ＤＣＨＰ、ＤＢ
Ｐ、ＮＰにより、ＴＭ３ではＴＢＴ、ＤＣＨＰ、ＯＣ
Ｓ、ＢＰにより共に発現亢進がみられた。

【０３２８】

【表２２１】

【０３２９】

【表２２２】

【０３３０】

【表２２３】

【０３３１】

【表２２４】

【０３３２】

【表２２５】

【０３３３】

【表２２６】

【０３３４】

【表２２７】

【０３３５】

【表２２８】

【０３３６】

【表２２９】

【０３３７】

【表２３０】

【０３３８】

【表２３１】

【０３３９】

【表２３２】

【０３４０】

【表２３３】

【０３４１】

【表２３４】

【０３４２】

【表２３５】

【０３４３】

【表２３６】

【０３４４】

【表２３７】

【０３４５】

【表２３８】

【０３４６】

【表２３９】

【０３４７】

【表２４０】

【０３４８】

【表２４１】

【０３４９】

【表２４２】

【０３５０】

【表２４３】

【０３５１】

【表２４４】

【０３５２】

【表２４５】

【０３５３】

【表２４６】

【０３５４】

【表２４７】

【０３５５】

【表２４８】

【０３５６】

【表２４９】

【０３５７】

【表２５０】

【０３５８】

【表２５１】

【０３５９】

【表２５２】

【０３６０】

【表２５３】

【０３６１】

【表２５４】

【０３６２】

【表２５５】

【０３６３】

【表２５６】

【０３６４】

【表２５７】

【０３６５】

【表２５８】

【０３６６】

【表２５９】

【０３６７】実施例４化合物の低用量を皮下投与した
妊娠マウス由来の雄胎仔の頭部におけるＩｎｔｅｌｌｉ
ＧｅｎｅＤＮＡチップを用いた遺伝子の解析実施例１の表１で示す化合物のうち、ＤＥＳと１７β−
エストラジオールを除いた８物質について１００分の１
量を同様に皮下投与した妊娠マウスより胎仔を採取し
た。ＰＣＲによる雌雄判別を行い、得られた雄胎仔の頭
部より抽出したｍＲＮＡ１μｇをＤＮＡチップ解析に
供した。ＤＮＡチップを用いた発現遺伝子の解析は、Ｉ
ｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅＭｏｕｓｅＣＨＩＰＳｅｔ
Ｉｖｅｒ．１．０（宝酒造社製）を用いて行なっ
た。

【０３６８】ＤＮＡチップでの発現量の比較は、実施例
１と同様に（化学物質に暴露させた雄胎仔から抽出した
ｍＲＮＡ量）／（無処理雄胎仔から抽出したｍＲＮＡ
量）の値を用いた。その結果を、表２６０〜２８８に示
す。表中の数字は、発現亢進の場合１．５倍以上、抑制
の場合は１．５分の１以下を対象とし記載した。それ以
外の値（１．５分の１より大きく１．５より小さい）の
場合あるいはシグナルが検出されなかった場合は、その
遺伝子の発現量の変化は無し（表では空欄）とした。表
中においてＴＢＴはトリブチルスズを、ＯＰは４−オク
チルフェノールを、ＮＰは４−ノニルフェノールを，Ｄ
ＢＰはフタル酸ジ−Ｎ−ブチルを、ＤＣＨＰはフタル酸
ジシクロヘキシルを、ＯＣＳはオクタクロロスチレン
を、ＢＰはベンゾフェノンを、ＤＥＨＰはフタル酸ジエ
チルヘキシルを各々示すものとする。

【０３６９】

【表２６０】

【０３７０】

【表２６１】

【０３７１】

【表２６２】

【０３７２】

【表２６３】

【０３７３】

【表２６４】

【０３７４】

【表２６５】

【０３７５】

【表２６６】

【０３７６】

【表２６７】

【０３７７】

【表２６８】

【０３７８】

【表２６９】

【０３７９】

【表２７０】

【０３８０】

【表２７１】

【０３８１】

【表２７２】

【０３８２】

【表２７３】

【０３８３】

【表２７４】

【０３８４】

【表２７５】

【０３８５】

【表２７６】

【０３８６】

【表２７７】

【０３８７】

【表２７８】

【０３８８】

【表２７９】

【０３８９】

【表２８０】

【０３９０】

【表２８１】

【０３９１】

【表２８２】

【０３９２】

【表２８３】

【０３９３】

【表２８４】

【０３９４】

【表２８５】

【０３９５】

【表２８６】

【０３９６】

【表２８７】

【０３９７】

【表２８８】

【０３９８】実施例５化合物を経口投与した妊娠マウ
ス由来の雄胎仔の頭部におけるＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅ
ＤＮＡチップを用いた遺伝子の解析実施例１の表１で示す化合物のうち、ＤＥＳ、17β−エ
ストラジオールおよびフタル酸ジエチルヘキシルを除く
７物質について同じ量を妊娠１０日目より連日７日間経
口投与し、同１７日目に胎仔を摘出し、実施例１と同様
に雌雄の判別、ｔｏｔａｌＲＮＡの抽出、ｍＲＮＡの
抽出を行い、ｍＲＮＡ１μｇをＤＮＡチップ解析に供
した。ＤＮＡチップを用いた発現遺伝子の解析は、Ｉｎ
ｔｅｌｌｉＧｅｎｅＭｏｕｓｅＣＨＩＰＳｅｔ
Ｉｖｅｒ．１．０（宝酒造社製）を用いて行なった。

【０３９９】ＤＮＡチップでの発現量の比較は、実施例
１と同様に（化学物質に暴露させた雄胎仔から抽出した
ｍＲＮＡ量）／（無処理雄胎仔から抽出したｍＲＮＡ
量）の値を用いた。結果を表２８９〜３０７に示す。表
中の数字は、発現亢進の場合１．５倍以上、抑制の場合
は１．５分の１以下を対象とし記載した。それ以外の値
（１．５分の１より大きく１．５より小さい）の場合あ
るいはシグナルが検出されなかった場合は、その遺伝子
の発現量の変化は無し（表では空欄）とした。表中にお
いてＴＢＴはトリブチルスズを、ＯＰは４−オクチルフ
ェノールを、ＮＰは４−ノニルフェノールを、ＤＢＰは
フタル酸ジ−Ｎ−ブチルを、ＤＣＨＰはフタル酸ジシク
ロヘキシルを、ＯＣＳはオクタクロロスチレンを、ＢＰ
はベンゾフェノンを各々示すものとする。

【０４００】

【表２８９】

【０４０１】

【表２９０】

【０４０２】

【表２９１】

【０４０３】

【表２９２】

【０４０４】

【表２９３】

【０４０５】

【表２９４】

【０４０６】

【表２９５】

【０４０７】

【表２９６】

【０４０８】

【表２９７】

【０４０９】

【表２９８】

【０４１０】

【表２９９】

【０４１１】

【表３００】

【０４１２】

【表３０１】

【０４１３】

【表３０２】

【０４１４】

【表３０３】

【０４１５】

【表３０４】

【０４１６】

【表３０５】

【０４１７】

【表３０６】

【０４１８】

【表３０７】

【０４１９】実施例６化合物を皮下投与した妊娠マウ
ス由来の雄胎仔の頭部におけるＩｎｃｙｔｅ社ＤＮＡチ
ップを用いた遺伝子の解析実施例１で用いたのと同じｍＲＮＡ１μｇ、あるいは
実施例４で用いた８物質を投与して得られた同じｍＲＮ
Ａ１μｇをＤＮＡチップ解析に供した。ＤＮＡチップ
を用いた発現遺伝子の解析は、実施例３と同様に米国Ｉ
ｎｃｙｔｅ社のＭｏｕｓｅＧＥＭ２Ｍｉｃｒｏａｒ
ｒａｙを用いた解析サービスを利用することにより行な
った。

【０４２０】ＤＮＡチップでの発現量の比較は、実施例
１と同様に（化学物質に暴露させた雄胎仔から抽出した
ｍＲＮＡ量）／（無処理雄胎仔から抽出したｍＲＮＡ
量）の値を用いた。結果を表３０８〜３６１に示す。表
中の数字は、発現亢進の場合１．５倍以上、抑制の場合
は１．５分の１以下を対象とし記載した。それ以外の値
（１．５分の１より大きく１．５より小さい）の場合あ
るいはシグナルが検出されなかった場合は、その遺伝子
の発現量の変化は無し（表では空欄）とした。表中、
（実施例１で用いたｍＲＮＡの結果）／（実施例４で用
いたｍＲＮＡの結果）で表記されている。表中において
ＴＢＴはトリブチルスズを、ＯＰは４−オクチルフェノ
ールを、ＮＰは４−ノニルフェノールを、ＤＢＰはフタ
ル酸ジ−Ｎ−ブチルを、ＤＣＨＰはフタル酸ジシクロヘ
キシルを、ＯＣＳはオクタクロロスチレンを、ＢＰはベ
ンゾフェノンを、ＤＥＨＰはフタル酸ジエチルヘキシル
を、Ｅ _２は１７β−エストラジオールを、ＤＥＳはジエ
チルスチルベストロールを各々示すものとする。

【０４２１】

【表３０８】

【０４２２】

【表３０９】

【０４２３】

【表３１０】

【０４２４】

【表３１１】

【０４２５】

【表３１２】

【０４２６】

【表３１３】

【０４２７】

【表３１４】

【０４２８】

【表３１５】

【０４２９】

【表３１６】

【０４３０】

【表３１７】

【０４３１】

【表３１８】

【０４３２】

【表３１９】

【０４３３】

【表３２０】

【０４３４】

【表３２１】

【０４３５】

【表３２２】

【０４３６】

【表３２３】

【０４３７】

【表３２４】

【０４３８】

【表３２５】

【０４３９】

【表３２６】

【０４４０】

【表３２７】

【０４４１】

【表３２８】

【０４４２】

【表３２９】

【０４４３】

【表３３０】

【０４４４】

【表３３１】

【０４４５】

【表３３２】

【０４４６】

【表３３３】

【０４４７】

【表３３４】

【０４４８】

【表３３５】

【０４４９】

【表３３６】

【０４５０】

【表３３７】

【０４５１】

【表３３８】

【０４５２】

【表３３９】

【０４５３】

【表３４０】

【０４５４】

【表３４１】

【０４５５】

【表３４２】

【０４５６】

【表３４３】

【０４５７】

【表３４４】

【０４５８】

【表３４５】

【０４５９】

【表３４６】

【０４６０】

【表３４７】

【０４６１】

【表３４８】

【０４６２】

【表３４９】

【０４６３】

【表３５０】

【０４６４】

【表３５１】

【０４６５】

【表３５２】

【０４６６】

【表３５３】

【０４６７】

【表３５４】

【０４６８】

【表３５５】

【０４６９】

【表３５６】

【０４７０】

【表３５７】

【０４７１】

【表３５８】

【０４７２】

【表３５９】

【０４７３】

【表３６０】

【０４７４】

【表３６１】

【０４７５】実施例７化合物を経口投与した妊娠マウ
ス由来の雄胎仔の頭部におけるＩｎｃｙｔｅ社ＤＮＡチ
ップを用いた遺伝子の解析実施例１で用いた化合物のうち、オクタクロロスチレ
ン、フタル酸ジエチルヘキシル、ＤＥＳおよび17β−エ
ストラジオールを除く６物質について表１で示すのと同
じ投与量で妊娠１０日目のマウスに連日７日間経口投与
し、妊娠１７日目に母獣より得られた雄胎仔の頭部より
抽出したｍＲＮＡ１μｇをＤＮＡチップ解析に供し
た。ＤＮＡチップを用いた発現遺伝子の解析は、実施例
３と同様に米国Ｉｎｃｙｔｅ社のＭｏｕｓｅＧＥＭ２
Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙを用いた解析サービスを利用す
ることにより行なった。

【０４７６】ＤＮＡチップでの発現量の比較は、実施例
１と同様に（化学物質に暴露させた雄胎仔から抽出した
ｍＲＮＡ量）／（無処理雄胎仔から抽出したｍＲＮＡ
量）の値を用いた。結果を表３６２〜３８５に示す。表
中の数字は、発現亢進の場合１．５倍以上、抑制の場合
は１．５分の１以下を対象とし記載した。それ以外の値
（１．５分の１より大きく１．５より小さい）の場合あ
るいはシグナルが検出されなかった場合は、その遺伝子
の発現量の変化は無し（表では空欄）とした。表中にお
いてＴＢＴはトリブチルスズを、ＯＰは４−オクチルフ
ェノールを、ＮＰは４−ノニルフェノールを、ＤＢＰは
フタル酸ジ−Ｎ−ブチルを、ＤＣＨＰはフタル酸ジシク
ロヘキシルを、ＢＰはベンゾフェノンを、各々示すもの
とする。

【０４７７】

【表３６２】

【０４７８】

【表３６３】

【０４７９】

【表３６４】

【０４８０】

【表３６５】

【０４８１】

【表３６６】

【０４８２】

【表３６７】

【０４８３】

【表３６８】

【０４８４】

【表３６９】

【０４８５】

【表３７０】

【０４８６】

【表３７１】

【０４８７】

【表３７２】

【０４８８】

【表３７３】

【０４８９】

【表３７４】

【０４９０】

【表３７５】

【０４９１】

【表３７６】

【０４９２】

【表３７７】

【０４９３】

【表３７８】

【０４９４】

【表３７９】

【０４９５】

【表３８０】

【０４９６】

【表３８１】

【０４９７】

【表３８２】

【０４９８】

【表３８３】

【０４９９】

【表３８４】

【０５００】

【表３８５】

【０５０１】実施例８ＭＣＦ−７におけるＩｎｃｙｔ
ｅ社ＤＮＡチップを用いた遺伝子の解析実施例２で用いたのと同様に調製したヒト乳癌細胞ＭＣ
Ｆ−７由来のｔｏｔａｌＲＮＡを、実施例１−（４）
で示したのと同じようにＯｌｉｇｏｔｅｘ−ＭＡＧｍ
ＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ（宝酒造社
製）を用いてｍＲＮＡを抽出し、その１μｇをＤＮＡチ
ップ解析に供した。ＤＮＡチップを用いた発現遺伝子の
解析は、実施例３と同様に米国Ｉｎｃｙｔｅ社のＵｎｉ
ＧＥＭＨｕｍａｎＶ２．４１Ｍｉｃｒｏａｒｒａ
ｙを用いた解析サービスを利用することにより行なっ
た。

【０５０２】ＤＮＡチップでの発現量の比較は、実施例
１と同様に（化学物質に暴露させた雄胎仔から抽出した
ｍＲＮＡ量）／（無処理雄胎仔から抽出したｍＲＮＡ
量）の値を用いた。結果を表３８６〜３９７に示す。表
中の数字は、発現亢進の場合１．５倍以上、抑制の場合
は１．５分の１以下を対象とし記載した。表中において
ＴＢＴはトリブチルスズを、ＯＰは４−オクチルフェノ
ールを、ＮＰは４−ノニルフェノールを、ＤＢＰはフタ
ル酸ジ−Ｎ−ブチルを、ＤＣＨＰはフタル酸ジシクロヘ
キシルを、ＯＣＳはオクタクロロスチレンを、ＢＰはベ
ンゾフェノンを、Ｅ２は１７β−エストラジオールを、
ＤＥＳはジエチルスチルベストロールを各々示すものと
する。

【０５０３】

【表３８６】

【０５０４】

【表３８７】

【０５０５】

【表３８８】

【０５０６】

【表３８９】

【０５０７】

【表３９０】

【０５０８】

【表３９１】

【０５０９】

【表３９２】

【０５１０】

【表３９３】

【０５１１】

【表３９４】

【０５１２】

【表３９５】

【０５１３】

【表３９６】

【０５１４】

【表３９７】

【０５１５】

【発明の効果】本発明により内分泌かく乱作用により影
響を受ける遺伝子、これらを特異的に検出できるＤＮＡ
チップあるいはそれに準ずるもの、及びこれらを用いて
内分泌かく乱作用の有無を評価する方法が提供される。

【０５１６】

【配列表フリーテキスト】 SEQ ID NO:1: PCR primer Zfy-sense for sex distinct
ion. SEQ ID NO:2: PCR primer Zfy-antisense for sex dist
inction.

【０５１７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Takara Shuzo Co., Ltd. <120> Method for detection of endocrine disrupting chemicals <130> T-1751 <160> 2 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer Zfy-sense for sex distinction. <400> 1 aagataagct tacataatca catgga 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer Zfy-antisense for sex distinction. <400> 2 cctatgaaat cctttgctgc acatgt 26

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ (72)発明者辻本善政滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号寳酒造株式会社中央研究所内 (72)発明者高嶋良吉滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号寳酒造株式会社中央研究所内 (72)発明者榎由樹滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号寳酒造株式会社中央研究所内 (72)発明者加藤郁之進滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号寳酒造株式会社中央研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA04 CA09 CA12 HA14 4B063 QA01 QA18 QQ08 QQ43 QQ53 QQ79 QR32 QR36 QR48 QR56 QR62 QS12 QS22 QS25 QS34 QS39 QX02 QX07

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】内分泌かく乱物質を検出するための方法
であって、試料を暴露させた細胞、組織又は生物体にお
いて、表５〜表１１４、表１１７〜表３９７に記載の遺
伝子であって、トリブチルスズによって発現量が変化す
る遺伝子群、４−オクチルフェノールによって発現量が
変化する遺伝子群、４−ノニルフェノールによって発現
量が変化する遺伝子群、フタル酸ジ−ｎ−ブチルによっ
て発現量が変化する遺伝子群、フタル酸ジシクロヘキシ
ルによって発現量が変化する遺伝子群、オクタクロロス
チレンによって発現量が変化する遺伝子群、ベンゾフェ
ノンによって発現量が変化する遺伝子群、フタル酸ジエ
チルヘキシルによって発現量が変化する遺伝子群、ジエ
チルスチルベストロールによって発現量が変化する遺伝
子群、１７β−エストラジオールによって発現量が変化
する遺伝子群のそれぞれから選択される少なくとも１種
以上の遺伝子の発現量を、該試料を暴露させなかった細
胞、組織又は生物体における該遺伝子の発現量と比較す
る工程を包含することを特徴とする内分泌かく乱物質の
検出方法。
【請求項２】発現量を測定しようとする遺伝子、もし
くはその断片が支持体上のあらかじめ定められた領域に
固定化されたアレイを使用するハイブリダイゼーション
法によってｍＲＮＡ量を測定することにより内分泌かく
乱物質を検出するためのＤＮＡアレイであって、表５〜
表１１４、表１１７〜表３９７に記載の遺伝子であっ
て、トリブチルスズによって発現量が変化する遺伝子
群、４−オクチルフェノールによって発現量が変化する
遺伝子群、４−ノニルフェノールによって発現量が変化
する遺伝子群、フタル酸ジ−ｎ−ブチルによって発現量
が変化する遺伝子群、フタル酸ジシクロヘキシルによっ
て発現量が変化する遺伝子群、オクタクロロスチレンに
よって発現量が変化する遺伝子群、ベンゾフェノンによ
って発現量が変化する遺伝子群、フタル酸ジエチルヘキ
シルによって発現量が変化する遺伝子群、ジエチルスチ
ルベストロールによって発現量が変化する遺伝子群、１
７β−エストラジオールによって発現量が変化する遺伝
子群のそれぞれから選択される少なくとも１種以上の遺
伝子、もしくはその断片がそれぞれ支持体上の定められ
た領域に固定化されていることを特徴とするアレイ。
【請求項３】ｍＲＮＡ量が、ハイブリダイゼーション
法または核酸増幅法により測定される方法により内分泌
かく乱物質を検出するためのキットであって、表５〜表
１１４、表１１７〜表３９７に記載の遺伝子であって、
トリブチルスズによって発現量が変化する遺伝子群、４
−オクチルフェノールによって発現量が変化する遺伝子
群、４−ノニルフェノールによって発現量が変化する遺
伝子群、フタル酸ジ−ｎ−ブチルによって発現量が変化
する遺伝子群、フタル酸ジシクロヘキシルによって発現
量が変化する遺伝子群、オクタクロロスチレンによって
発現量が変化する遺伝子群、ベンゾフェノンによって発
現量が変化する遺伝子群、フタル酸ジエチルヘキシルに
よって発現量が変化する遺伝子群、ジエチルスチルベス
トロールによって発現量が変化する遺伝子群、１７β−
エストラジオールによって発現量が変化する遺伝子群の
それぞれから選択される少なくとも１種以上の遺伝子か
ら転写されるｍＲＮＡにハイブリダイズするプローブを
含むことを特徴とするキット。