KR20120090850A

KR20120090850A - 환자 맞춤형 암 치료

Info

Publication number: KR20120090850A
Application number: KR1020120012144A
Authority: KR
Inventors: 정양식
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2011-02-07
Filing date: 2012-02-07
Publication date: 2012-08-17
Also published as: KR101371697B1

Abstract

본 발명은 (a) 상기 암 환자로부터 생물학적 시료를 얻는 단계; (b) 상기 생물학적 시료에서 ABL1, ABL2, ALAD, AR, CD33, CHD1, CSF1R, Cyp19a1, DHFR, DNMT1, EGFR, EPHA2, ERα, ERβ, ERBB2(HER2), FLT1, FLT3, FLT4, FYN, GART(GARFT), HDAC1, HDAC6, KDR, c-KIT, LCK, MS4A1(CD20), mTOR, PDGFRα, PDGFRβ, POLA1, POLB, PSMB5, RAF1 (c-RAF), RET, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRα, RXRβ, RXRγ, B-RAF, SRC, TARC1 (NK1R), TLR7, TOP1, TOP2A, TYMS 및 YES1로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 2개의 타겟의 발현 레벨을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 고발현 되는 것으로 측정된 타겟에 작용하는 의약(drug)을 선별하는 단계를 포함하는 암 환자 맞춤형 의약 선별 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 특정 암 환자에게 적합한 의약을 선별할 수 있고 이를 통하여 암 환자 개인별 맞춤형 화학요법을 매우 효과적으로 실시할 수 있다.

Description

환자 맞춤형 암 치료{Patient-Tailored Cancer Chemotherapy}

본 발명은 암 환자 맞춤형 의약 선별 방법 및 이에 사용되는 키트에 관한 것이다.

미국 FDA(Food and Drug Administration)에서 허가되어 임상에서 이미 사용되고 있는 암 치료제는 대략 220여 종류이다. 이들 중 많은 항암제들은 분자 타겟이 알려져 있지 않거나 또는 분자 타겟이 알려져 있어도 특이성을 가지지 않는다. 그러나, 약 48개의 항암제들은 특이적 분자 타겟들을 지표로 하고 있으며, 암에 있어서 그 생물학적인 기전 또한 어느 정도 규명되어 있다.

한편, 종래의 항암 화학요법(cancer chemotherapy)에 따르면, 암 환자 개인이 아니라 암의 종류 및 암의 심각도에 따라 적합한 항암제를 선별하고 투여를 하고 있다. 그러나, 대체적인 임상 결과는 환자에 따라 이러한 항암 화학요법의 치료 효과가 크게 차이가 있으며, 이를 극복하기 위하여 다양한 방법들이 제시되어 있다. 상술한 화학요법의 단점을 극복하기 위하여 개인별 SNP(single nucleotide polymorphism)을 분석하여 이에 따라 적합한 항암제를 선별 투여하려는 시도가 많이 이루어지고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 암 환자들의 화학약물 치료(chemotherapy)를 보다 효율적으로 실시할 수 있는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 암 환자 별로 상술한 48개의 타겟들이 서로 다른 양상으로 발현되며 이러한 발현 양상에 기초하여 항암제를 투여하면 암 환자 맞춤형 항암제 투여에 의한 암 치료가 보다 효과적으로 될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 암 환자 맞춤형 의약 선별 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 암 환자 맞춤형 의약 선별용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 암 환자 맞춤형 의약 선별 방법을 제공한다:

(a) 상기 암 환자로부터 생물학적 시료를 얻는 단계;

(b) 상기 생물학적 시료에서 ABL1, ABL2, ALAD, AR, CD33, CHD1, CSF1R, Cyp19a1, DHFR, DNMT1, EGFR, EPHA2, ERα, ERβ, ERBB2(HER2), FLT1, FLT3, FLT4, FYN, GART(GARFT), HDAC1, HDAC6, KDR, c-KIT, LCK, MS4A1(CD20), mTOR, PDGFRα, PDGFRβ, POLA1, POLB, PSMB5, RAF1 (c-RAF), RET, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRα, RXRβ, RXRγ, B-RAF, SRC, TARC1 (NK1R), TLR7, TOP1, TOP2A, TYMS 및 YES1로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 2개의 타겟의 발현 레벨을 측정하는 단계; 및

(c) 상기 단계 (b)에서 고발현 되는 것으로 측정된 타겟에 작용하는 의약(drug)을 선별하는 단계.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) ABL1, ABL2, ALAD, AR, CD33, CHD1, CSF1R, Cyp19a1, DHFR, DNMT1, EGFR, EPHA2, ERα, ERβ, ERBB2(HER2), FLT1, FLT3, FLT4, FYN, GART(GARFT), HDAC1, HDAC6, KDR, c-KIT, LCK, MS4A1(CD20), mTOR, PDGFRα, PDGFRβ, POLA1, POLB, PSMB5, RAF1 (c-RAF), RET, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRα, RXRβ, RXRγ, B-RAF, SRC, TARC1 (NK1R), TLR7, TOP1, TOP2A, TYMS 및 YES1로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 2개의 타겟 유전자 각각에 특이적으로 혼성화 되는 프라이머 또는 프로브; 또는 (b) ABL1, ABL2, ALAD, AR, CD33, CHD1, CSF1R, Cyp19a1, DHFR, DNMT1, EGFR, EPHA2, ERα, ERβ, ERBB2(HER2), FLT1, FLT3, FLT4, FYN, GART(GARFT), HDAC1, HDAC6, KDR, c-KIT, LCK, MS4A1(CD20), mTOR, PDGFRα, PDGFRβ, POLA1, POLB, PSMB5, RAF1 (c-RAF), RET, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRα, RXRβ, RXRγ, B-RAF, SRC, TARC1 (NK1R), TLR7, TOP1, TOP2A, TYMS 및 YES1로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 2개의 타겟의 단백질 각각에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결정기를 포함하는 암 환자 맞춤형 의약 선별용 키트를 제공한다.

본 발명자들은 암 환자들의 화학약물 치료(chemotherapy)를 보다 효율적으로 실시할 수 있는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 암 환자 별로 상술한 48개의 타겟들이 서로 다른 양상으로 발현되며 이러한 발현 양상에 기초하여 항암제를 투여하면 암 환자 맞춤형 항암제 투여에 의한 암 치료가 보다 효과적으로 될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 방법에 따르면, 우선 암 환자로부터 생물학적 시료를 얻는다. 본 발명이 적용될 수 있는 암은 다양한 고형암 및 혈액암을 포함하며, 예를 들어 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용될 수 있는 생물학적 시료는 다양한 생물학적 시료를 포함하며, 바람직하게는 혈액, 혈청, 혈장, 조직, 세포, 림프, 골수액, 타액, 소변, 분변, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수 또는 양막액이고, 보다 바람직하게는 조직 또는 세포이며, 가장 바람직하게는 암 조직 또는 암 세포이다.

본 발명에서 발현 레벨을 분석하는 타겟은 ABL1, ABL2, ALAD, AR, CD33, CHD1, CSF1R, Cyp19a1, DHFR, DNMT1, EGFR, EPHA2, ERα, ERβ, ERBB2(HER2), FLT1, FLT3, FLT4, FYN, GART(GARFT), HDAC1, HDAC6, KDR, c-KIT, LCK, MS4A1(CD20), mTOR, PDGFRα, PDGFRβ, POLA1, POLB, PSMB5, RAF1 (c-RAF), RET, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRα, RXRβ, RXRγ, B-RAF, SRC, TARC1 (NK1R), TLR7, TOP1, TOP2A, TYMS 및 YES1로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 2개의 타겟, 바람직하게는 최소 5개의 타겟, 보다 바람직하게는 최소 10개의 타겟, 보다 더 바람직하게는 최소 20개의 타겟, 보다 더욱 더 바람직하게는 최소 30개의 타겟, 가장 바람직하게는 최소 40개의 타겟이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟의 발현 레벨 측정은 유전자 혼성화 방법, 유전자 증폭 방법 또는 면역분석(immunoassay) 방법에 따라 실시된다.

본 발명은 면역분석 방식 즉 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 타겟 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결정기를 이용하여 실시된다.

본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology , 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명의 방법을 항체를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시할 수 있다.

이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 단백질 칩, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C₁₄, I₁₂₅, P₃₂ 및 S₃₅)로 레이블링된 항체가 본 발명의 타겟의 발현 레벨을 검출하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 타겟에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트 (BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움 (NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트 (naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF (enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌 (비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB (tetramethylbenzidine), ABTS (2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민 (OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT (nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS (phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시 예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 본 발명의 타겟에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고 타겟에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질 (예컨대, 바이오틴), 효소 (알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질 (예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질 (chemiluminescent) 및 FRET (fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed. Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널의 검출은 본 발명의 타겟의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 타겟의 발현 레벨을 측정할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 단계 (b)는 유전자 혼성화 방법 또는 유전자 증폭 방법에 따라 실시할 수 있다. 유전자 혼성화 방법에 따라 실시하는 경우에는 프로브, 유전자 증폭 방법에 따라 실시하는 경우에는 프라이머 또는 프라이머와 프로브가 이용된다.

본 발명에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 타겟 분자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 본 명세서에서 용어“상보적(complementary)”은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서 용어 “상보적”은 용어 완전 상보적 (perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명에서 이용되는 프라이머 또는 프로브는 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건 (즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄 (linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.

프라이머 또는 프로브 제작 시 참조하여야 하는 본 발명 타겟의 뉴클레오타이드 서열은 GenBank에서 확인할 수 있으며, 이 서열을 참조하여 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명에서 프로브를 이용하는 경우, 마이크로어레이를 제작하여 키트화 할 수 있다. 본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체 (substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

본 발명은 혼성화에 기초하여 실시할 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 타겟의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 이용된다.

프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단 (예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생물학적 시료에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있으며, 바람직하게는 암 조직세포에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제 (예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌 (비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약 (10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB (tetramethylbenzidine), ABTS (2,2‘-Azine-di[3-ethyl benzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트 (naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT (nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS (phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 타겟 분자를 검출하는 방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 타겟 분자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 유전자 증폭 방법에 따라 실시하며, 가장 바람직하게는 정량적 실시간 유전자 증폭 방법에 따라 실시한다.

본 명세서에 기재된 용어“증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR (differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명을 프라이머로 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 본 발명의 타겟의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 본 발명의 타겟의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료에서 본 발명의 타겟의 뉴클레오티드 서열의 mRNA 양을 조사하여 본 발명의 타겟의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 결정한다.

따라서 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.

mRNA를 얻기 위하여, 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol . Biol . Rep ., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal . Biochem. 162:156(1987)). 예컨대, TRIzol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 또한, 랜덤 헥사머 (random hexamer) 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 합성할 수 있다. 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg² ⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

이렇게 증폭된 본 발명의 타겟의 뉴클레오티드 서열의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 본 발명의 타겟의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 본 발명의 타겟의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다.

따라서 본 발명의 타겟의 검출 방법을 cDNA를 이용하는 증폭반응에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (ⅰ) 본 발명의 타겟의 뉴클레오티드 서열에 어닐링되는 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 증폭 반응의 산물을 분석하여 본 발명의 타겟의 뉴클레오티드 서열의 발현정도를 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 단계 (b)를 정량적 실시간 PCR 방법에 따라 실시하는 경우, 미국 특허 제5,210,015호, 제5,538,848호 및 제6,326,145호에 기재된 TaqMan probe 방법 또는 Syb green 분석 방법에 따라 실시할 수 있다.

단계 (b)에서 고발현 되는 것으로 측정된 타겟에 작용하는 의약(drug)을 선별함으로써, 환자 개인 맞춤형 항암제 치료를 할 수 있다. 즉, 환자 개인의 생물학적 시료를 이용하여 측정된 경우, 고발현 되는 것으로 측정된 상기 타겟에 작용하는 의약을 선별적으로 투여함으로써 암을 효과적으로 치료할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “고발현”은 조사 대상의 시료에서의 대상이 되는 타겟의 발현 정도가 정상 시료와 비교하여 높은 경우를 의미한다. 예컨대, 당업계에서 통상적으로 이용되는 발현 분석 방법, 예컨대 RT-PCR 방법 또는 ELISA 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 따라 발현 분석을 한 경우, 발현이 많은 것으로 분석되는 경우를 의미한다. 예를 들어, 상술한 분석 방법에 따라 분석한 결과, 상기의 타겟 분자가 정상세포와 비교하여 2-10 배 정도 고발현 되는 경우, 본 발명에서의 “고발현”으로 판정하고 적합한 항암제를 선별한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (c)는 단계 (b)에서 측정된 발현 레벨을 상대적으로 비교하여 최고 발현 레벨을 나타내는 타겟으로부터 발현 레벨 5순위까지의 타겟 중에서 선택되는 최소 하나(보다 바람직하게는 최소 두 개)의 타겟에 작용하는 의약을 선별하여 실시한다.

본 발명에서 최종적으로 선별되며 상술한 48개의 타겟에 작용하는 항암제의 예는 Axitinib, Pazopanib, Sunitinib, Sorafenib, Toceranib, Herceptin, Avastin, Tarceva, Iressa, Gleevec, Rituxan, Velcade, Ibritumomab 및 Dasatinib 등과 같이 표적이 잘 규명된 의약이다.

예컨대, FLT4가 고발현 되는 것으로 조사되는 경우에는 FLT4에 작용하는 항암제인 Axitinib, Pazopanib, Sunitinib, Sorafenib 또는 Toceranib를 이 암 환자의 치료제로 선별한다. 만일, FLT4 및 Erb-2(HER2)가 고발현 되는 것으로 조사되는 경우에는 FLT4에 작용하는 항암제인 Sorafenib 및 Erb-2에 작용하는 Herceptin을 이 암 환자의 병용 투여제로 선별할 수 있다.

이와 같은 방식으로, 암 환자의 생물학적 시료에서 발현 되는 항암제 타겟의 발현 레벨을 측정하여, 암 환자 개인별 맞춤형 화학요법을 매우 효과적으로 실시할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 암 환자 개인 별로 항암제 타겟들에 대한 발현 양상이 차이가 있다는 발견에 기초하여 새로운 환자 맞춤형 화학요법 방법을 제시한다.

(b) 본 발명에서 분석 대상이 되는 타겟은 종래 항암제의 타겟으로 공지된 48개의 타겟 분자으로서, 이 들 타겟 분자의 발현 레벨을 측정함으로써 특정 암 환자에게 적합한 의약을 선별할 수 있고 이를 통하여 암 환자 개인별 맞춤형 화학요법을 매우 효과적으로 실시할 수 있다.

도 1은 폐암 세포주 패널에서 항암제 치료 분자 타겟들의 발현 양상을 보여주는 그래프이다. x 축은 폐암 세포주 종류, y 축은 분자 타겟들의 상대적 발현양을 나타낸다.
도 2는 폐암 세포주 패널에서 항암제 치료 분자 타겟인 FLT4 및 KDR의 발현 양상을 보다 구체적으로 보여주는 그래프이다.
도 3은 폐암 세포주에서의 AR 및 ERα의 mRNA 발현 수준을 확인한 그래프이다.
도 4는 AR의 발현 여부에 따라 폐암 세포주를 구별하여 AR의 작용제인 DHT를 처리했을 때 각 폐암 세포주들의 세포 성장 정도를 확인한 그래프이다.
도 5는 ER의 발현 여부에 따라 폐암 세포주를 구별하여 ERα의 작용제인 DHT 및 ERα의 길항제인 타목시펜을 처리했을 때 각 폐암 세포주들의 세포 성장 정도를 확인한 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 실험방법

본 발명은, 미국 FDA에서 허가된 항암제에 대하여 공지된 모든 분자생물학적인 타겟들의 mRNA 발현 프로파일을 QPCR(Quantitative real-time PCR) 방법을 이용하여 환자 조직에서 조사하여 그 환자에 맞는 ‘맞춤형 치료’ 방법을 제시하는 것을 목적으로 한다. 따라서, FDA 허가된 약 220 여종의 항암제에 대한 치료 타겟들로부터 본 발명에 적합한 분자생물학적 타겟 48개를 선별하였고(표 1), 이러한 타겟들에 대한 QPCR 프라이머를 디자인하여 그 작동성(workability)를 입증하였다. 또한, 입증된 프라이머를 사용하여 48 종류의 폐암 세포주를 이용하여 48개의 타겟 중에서 47개의 유전자의 발현 프로파일을 완성하였다(도 2). ABI 7900HT Sequence Detection System인 384 well QPCR 기계를 사용하였다. 본 데이터는 Sybr 그린 방법으로 얻었으며, 그 실험 프로토콜은‘Current Protocols in Molecular Biology (2006) 15.8.1 15.8.28’에 기재되어 있다.

또한, 상기와 같이 얻은 본 발명의 발현 프로파일을 기초로 하여 각각 실제 폐암 세포주에 적용하여 타겟 유전자들의 평가를 실시하였다.

항암 치료에 대한 분자 타겟

유전자명	공식적인 전체 이름
ABL1	c-abl oncogene 1, receptor tyrosine kinase
ABL2	v-abl Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 2
ALAD	aminoleuvulinate dehydratase
AR	Androgen receptor
CD33	CD33 molecule
CHD1	chromodomain helicase DNA binding protien 1
CSF1R	colony stimulating factor 1 receptor
Cyp19a1	Aromatase
DHFR	dihydrofolate reductase
DNMT1	DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 1
EGFR	Epidermal Growth Factor Receptor
EPHA2	EPH receptor A2
ERa	estrogen receptor alpha
ERb	estrogen receptor beta
ERBB2 (HER2)	v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2, neuro/glioblastoma derived oncogene homolog (avian)
FLT1	fms-related tyrosine kinase 1
FLT3	fms-related tyrosine kinase 3
FLT4	fms-related tyrosine kinase 4
FYN	FYN oncogene related to SRC, FGR, YES
GART (GARFT)	phosphoribosylglycinamide formyltransferase, phosphoribosylglycinamide synthetase, phosphoribosyladminoimidazole synthetase
HDAC1	histone deacetylase 1
HDAC6	histone deacetylase 6
KDR	kinase insert domain receptor (a type III receptor tyrosine kinase)
c-KIT	v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog
LCK	lymphocyte-specific protein tyrosine kinase
MS4A1 (CD20)	membrane-spanning 4-domains, subfamily A, member 1
mTOR	mechanistic target of rapamycin (serine/threonine kinase)
PDGFRa	platelet-derived growth factor receptor, alpha polypeptide
PDGFRb	platelet-derived growth factor receptor, beta polypeptide
POLA1	polymerase (DNA directed), alpha 1, catalytic subunit
POLB	polymerase (DNA directed), beta
PSMB5	proteasome (prosome, macropain) subunit, beta type, 5
RAF1 (c-RAF)	v-raf-1 murine leukemia viral oncogene homolog 1
RET	ret proto-oncogene
RRM1	ribonucleotide reductase M1
RRM2	ribonucleotide reductase M2
RRM2B	ribonucleotide reductase M2 B (TP53 inducible)
RXRa	Retinoid X Receptor alpha
RXRb	Retinoid X Receptor beta
RXRg	Retinoid X Receptor gamma
B-RAF	v-raf-1 murine leukemia viral oncogene homolog B1
SRC	v-src sarcoma (Schmidt-Ruppin A-2) viral oncogene homolog (avian)
TARC1 (NK1R)	tachykinin receptor 1
TLR7	toll-like receptor 7
TOP1	topoisomerase I
TOP2A	topoisomerase II alpha 170kDa
TYMS	thymidylate synthetase
YES1	v-yes-1 Yamaguchi sarcoma viral oncogene homolog 1

RNA 준비 및 역전사 반응

RNA 준비

동일한 조건에서 배양한 폐암 세포주(ATCC 및 University of Texas Southwestern Medical Center)로부터 Qiagen RNeasy Kit(Cat# 74134)를 이용하여 총 RNA를 정제한 후, 2 ㎍의 RNA를 2 unit의 DNAse I(4.2 μM MgCl₂) 조건에서 20 ㎕ 부피에서 역전사 반응을 실시하였다. 반응액은 다음과 같은 조성이다: 총 RNA 2 ㎍, 50 mM MgCl₂ 3.68 ㎕, DNAse I 0.96 ㎕ 및 DEPC-water로 반응액 부피 20 ㎕로 조정.

역전사 반응

앞서 DNAse I이 처리된 샘플에 대하여 Superscript II Reverse transcription Kit(Invitrogen cat# 18064-071)을 이용하여 다음과 같은 조건에서 역전사 반응을 실시하였다: 5X First Strand buffer 20 ㎕. 100 mM DTT 10 ㎕, 10 mM dNTPs 20 ㎕, pdN6 (1.6 ㎍/㎕) 5 ㎕, RTase(200 U/㎕) 0.5 ㎕, RNA 20 ㎕ 및 DEPC-water 24.5 ㎕uL. 총 반응액 부피 100 ㎕.

역전사 반응은 다음과 같은 온도 조건으로 실시하였다: 25℃ 10 min, 42℃ 50 min, 72℃ 10 min, 4℃ 홀드.

역전사 반응 종료 후, 100 ㎕의 DEPC-water를 넣어 최종 2 ㎍의 cDNA에 대하여 200 ㎕의 부피로 조정하였다.

정량적 실시간 PCR 및 분석

ABI 7900HT SDS 기계에서 표준곡선 방법(1)을 이용하여 QPCR을 다음과 같은 조건에서 실시한 후에 PCR efficiency-corrected method(2)를 이용하여 데이터를 분석 하였다. 각 유전자에 대하여 3회 반복으로 실험을 구성하였다. 이때 표준곡선 방법은 인간의 유니버설 cDNA를 이용하여 RNA 농도 기준으로 0 ng, 0.016 ng, 0.08 ng, 0.4 ng, 2.0 ng, 10 ng 및 50 ng에서 각 유전자에 대한 표준곡선을 유추하고, 이때 레퍼런스 유전자로 18S를 이용하여 0 ng, 0.008 ng, 0.04 ng, 0.2 ng, 1 ng, 5 ng 및 25 ng 농도에서 표준곡선을 유도하여 유전자를 정량화하였다. PCR efficiency-corrected method는 e = 10^[-1/ ^slope ^] 를 이용하여 PCR efficiency (e)를 계산하였다. 이때 기울기는 각 유전자의 표준곡선에서 유도된 값이다. 이렇게 하여 quantity = (e)^- ^Ct를 이용하여 각 유전자들에 대한 양을 계산하였다. QPCR 반응액의 조성은 다음과 같다: (3회 반복실험 기준, 30 ㎕). 384 웰 플레이트에서 각 웰은 10 ㎕의 반응 혼합물을 포함한다: DEPC-water 10.05 ㎕; 2X SYBR Buffer 15 ㎕, SYBR GreenER(Invitrogen, Cat 11760-500); 1:1 프라이머 혼합 1.2 ㎕, 주형 cDNA 3.75 ㎕.

30 ㎕의 마스터 혼합물을 각 웰 당 10 ㎕씩 분주한 후에 SDS 2.4 소프트웨어를 통하여 ABI 7900 HT 기계를 운용하였다.

QPCR 프라이머 서열

유전자명	공개여부	GenBank 접근번호	프라이머 서열
18S	공개	X00686	5'ACCGCAGCTAGGAATAATGGA3' 5'GCCTCAGTTCCGAAAACCA3'
ABL1	-	NM_005157.3	5'TAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT3' 5'CACACCATTCCCCATTGTGATT3'
ABL2	-	NM_007314.2	5'TGACCCTAATCTCTTCGTTGCA3' 5'TGTAACCAAGGACTCGTAGCTTTT3'
ALAD	-	NM_001003945.1	5'TGAGGCCCTTGGTGGA3' 5'CGCTCGTCCTTGGGAACT3'
AR	공개	NM_000044	5’GAATTCCTGTGCATGAAAGCA3’ 5’CGAAGTTGATGAAAGAATTTTTGATT3’
B-RAF1	-	NM_004333.3	5'CAACAACAGGGACCAGATAATTTT3' 5'CGTACCTTACTGAGATCTGGAGACA3'
CD20	-	NM_152866.2	5'TGTCTTCACTGGTGGGCC3' 5'AGCCCATTCATAATCTGGACA3'
CD33	-	NM_001772.3	5'CGCTCTTTGTCTCTGCCTCAT3' 5'CTGCTGTCCTGGCTGCTTT3'
c-Kit	-	NM_000222.2	5'CAACCAAGGCCGACAAAA3' 5'TGATGGCGGGAGTCACAT3'
c-RAF	-	NM_002880.2	5'GGTAGCTGACTGTGTGAAGA3' 5'CAGTGTTGGAGCAGCTCAAT3'
CSF1R	-	NM_005211.2	5’AGCAGGCCCAAGAGGAC3’ 5’CCGCTGCCACCGCTTC3’
CHD1	-	NM_001270.2	5'CTTCAGGAACAGAACGAACAGG3' 5'GGAGATGACTAGTTTGGCATTCA3'
Cyp19a1	-	NM_00103	5'GGATCCCTTTGGACGAAAGT3' 5'AGCTTGCCATGCATCAAAAT3'
DHFR	-	NM_00791.3	5'CTGCATCGTCGCTGTGTCC3' 5'GTTGTGGTCATTCTCTGGAAATAT3'
DNMT1	-	NM_001379.1	5'GCACCTCATTTGCCGAATAC3' 5'CTCCTGCATCAGCCCAAATA3'
EGFR	-	NM_005228	5'TGCCCGCATTAGCTCTTAGA3' 5'GTGCCCGAGGTGGAAGTACT3'
EPHA2	-	NM_004431.2	5'GTCCGAGTGGCTGGAGT3' 5'ACCACCTTCTCGATGGCA3'
ERa	공개	NM_007956	5'AGAGAAGTATTCAAGGACATAACGACTATAT3’ 5'TCTTCCTCCTGTTTTTATCAATGG3'
ERb	공개	NM_001437	5'AAGTTGGCCGACAAGGAGTT3' 5'ACAGGCTGAGCTCCACAAAG3'
ERBB2 (HER2)	-		5’CGGCAGCAGAAGATCCGG3’ 5'CGCTAGGTGTCAGCGGCT3'
FLT1	-	NM_002019.3	5’TGCGAGCTCCGGCTTT3’ 5’CCTTGTAGAAACCGTCAGAATC3’
FLT3	-	NM_004119.2	5’ACCCCACTTTCCAATCACATC3’ 5’CGAGTCCGGGTGTATCTGAA3’
FLT4	-	NM_002020.3	5’TCCTGGCTTCCCGAAAGT3' 5’GGCCAAAGTCACAGATCTTCAC3’
FYN	-	NM_002037.3	5’ATCCGCGAGAGTGAAACCA3’ 5’TCATCCCAATCACGGATAGAA3’
GARFT	-	NM_00819.3	5’GCAGCCCGAGTACTTATAATTGG3’ 5’GATGAGACTGTGCAAGTTTCCA3’
HDAC1	-	NM_004964.2	5’TCCGCATGACTCATAATTTGC3' 5’TGAGGGCGATAGATTTCCATT3'
HDAC6	-	NM_006044.2	5’GGAATGGCATGGCCATCATTAG3' 5'CGTGGTTGAACATGCAATAGC3'
KDR	-	NM_002253.1	5’TTCTTGGCATCGCGAAAGTG3' 5'ATTTTAACCACGTTCTTCTCCGATA3’
LCK	-	NM_005356.3	5’TCCTGCTGACGGAAATTGTC3’ 5’ACCTCCGGGTTGGTCATC3’
mTOR	-	NM_004958.2	5’CCGAGCGACGAGAGATCAT3' 5’CAAGGGACCGCACCATAAG3’
NK1R (TARC1)	-	NM_001058.2 NM_015727	5’CAACGAATGGTACTACGGCC3’ 5’GGATGTATGATGGCCATGTAC3’
PDGFRa	-	NM_006206.3	5’TGCCCGAGGAATGGAGTT3’ 5’CTTGTGCCAGGAGGACGTT3’
PDGFRb	-	NM_002609.3 NM_177435	5’GCGCTGGCGAAATCG3' 5'TTCACGCGAACCAGTGTCA3’
POLA1	-	NM_016937.2	5’AGTGAAACAAGAGGCGGATTC3’ 5’CAAGAGACATCCGGGAGAAAA3’
POLB	-	NM_002690.3	5’GAATCACCGACATGCTCACA3’ 5’GGATAGCTTGGCTCACGTTCT3’
PSMB5	-	NM_002797.2	5’CAGAAGAGCCAGGAATCGAA3’ 5’CAACTATGACTCCATGGCGGA3’
RET	-	NM_020975.4	5’TGGAGACCCAAGACATCAACAT3' 5’TCCCCCAACAATGCTGC3’
RRM1	-	NM_001033.3	5’TGCACTTCTACGGCTGGAA3’ 5’AGCCGCTGGTCTTGTCCTTA3’
RRM2	-	NM_001034.2	5’TCTGGCTTTCTTTGCAGCAA3’ 5’CTTCTTGGCTAAATCGCTCCA3’
RRM2B	-	NM_015713.3	5’AGGCACAGGCTTCCTTCTG3’ 5’GCTTGTTCCAGTGAGGGAGAT3’
RXRa	공개	NM_002957	5’GAGCCCAAGACCGAGACCTA3' 5’AGCTGTTTGTCGGCTGCTT3'
RXRb	공개	NM_021976	5'AGCCCCCAGATTAACTCAACA3' 5'GATTGCACATAGCCGTTTGC3'
RXRg	공개	NM_006917	5'GAAGTTTCCCGCAGGCTATG3' 5'TGATGGGCTCATGGATGTAGA3'
SRC	-	NM_005417.3	5’TTCAGAGGAGCCCATTTACATC3’ 5’CCTTGAGAAAGTCCAGCAAACT3’
TLR7	-	NM_016562.3	5’ACCAGACCTCTACATTCCATTT3' 5'GATAAGAATTTGTCTCTTCAGTGT3'
TOP1	-	NM_003286.2	5’GCTAAAAGAACTGACAGCCC3' 5'AAGAATTGCAACAGCTCGATTG3’
TOP2A	-	NM_001067.2	5’CAGTGAAGAAGACAGCAGCAAAAA3' 5'AGCTGGATCCCTTTTAGTTCCTT3’
TYMS	-	NM_001071.1	5’ATCACATCGAGCCACTGAAAA3’ 5’TCCTGAGCTTTGGGAAAGGT3’
YES1	-	NM_005433.3	5’GGCCGAGTGCCATATCC3’ 5’GAGGGCACGGCATCCT3’

세포주 적용 실험

세포주 적용 실험은 각 타겟 평가를 위하여 하기와 같은 순서로 폐암 세포주(ATCC 및 University of Texas Southwestern Medical Center)들의 성장을 확인하는 실험을 수행하였다;

1. 선택된 세포주(도 3에서 화살표로 표기)는 열처리된 5% FBS (heat-inactivated, charcoal-stripped FBS)를 포함한 페놀-레드 프리 RPMI 배양액에 1 X 10⁵ 개의 폐암 세포들이 포함되도록 6-웰 플레이트에 처리 농도별로 분주한다.

2. 분주 2 일째에 각각 0, 0.1 nM, 10 nM 및 1 M의 농도별로 작용제 또는 길항제인 약물들을 연속 3 일 동안 처리하였으며, 이때 각 약물은 에탄올에 용해시켰다. 각각 처리한 약물들은, AR의 경우 AR의 평가를 위한 처리 약물로서 작용제인 DHT(Dihydrotestosterone, Sigma)을 사용하였으며, ERα의 경우 ERα의 평가를 위한 처리 약물로서 작용제인 17β- 에스트라디올(17β-estradiol, Sigma) 및 길항제인 타목시펜(ICI 182780, TOCRIS)을 사용하였다.

3. 분주 5 일째에 트립판 블루 염색 방법을 이용하여 살아 있는 세포수를 센 후 상대적인 세포 성장을 계산하고, 리간드를 처리하지 않은 대조군을 기준으로 백분율로 환산하였다.

실험 결과

1. 발현 프로파일

48 개의 폐암 세포주로부터 위에서 언급된 항암 치료 타겟 유전자들의 발현 양상을 QPCR 방법을 이용하여 프로파일링 하였다(도 1). 도 1에서 볼 수 있듯이, 폐암 세포주의 종류에 따라 항암 치료 타겟 유전자들의 발현 양상이 차이가 있었다.

대표적인 발암 관련 유전자인 FLT4 및 KDR에 대한 유전자 발현 양상은 도 2에 나타나 있다. 44 개의 폐암 세포주 패널에서, 암 세포의 혈관신생 저해에 의한 치료 표적으로 사용되고 있는 의약인 Sorafenib 및 Sutent는 FLT4 및 KDR을 치료 타겟으로 한다. 도 2에서 볼 수 있듯이, FLT4 및 KDR은 폐암 세포주에 따라 그 발현 양상이 크게 차이가 있음을 알 수 있다.

도 1 및 도 2에서 볼 수 있듯이, 특정 유전자들은 암 세포주마다 특이적인 발현 양상을 보여주고 있다. 암 세포주들은 발현량이 높은 유전자들을 타겟팅하여 항암 치료제를 사용하면 보다 효율적인 치료가 될 것이다. 특히, 각 폐암 세포주들은 각기 다른 환자들에게서 유도되었기에 한 명의 환자로 고려될 수 있다.

2. 프로파일 평가를 위한 세포주 적용

상기와 같이 얻은 본 발명의 발현 프로파일을 기초로 하여 각각 실제 세포주에 적용하여 타겟 유전자들의 평가를 실시하였고 이는 폐암에 대한 새로운 환자 맞춤형 화학요법 방법을 제시하는 근거가 될 수 있다.

상기와 같은 평가를 위해 도 3과 같이, 폐암 세포주에서 각각 AR(Androgen receptor) 및 ERα(Estrogen receptor alpha)에 대한 mRNA 수준의 발현 양상을 확인하였다. 상기 AR과 ERα은 각각 전립선암과 유방암의 대표적인 타겟으로 알려져 있으나 폐암에서는 알려지지 않았다.

그 결과 각각 폐암 세포주에서 발현하는 세포주와 발현하지 않은 세포주를 구별할 수 있었다. AR의 경우 폐암 세포주인 H1184 및 H2122에서 발현이 확인되었으나 H2009 및 H1299에서는 발현이 확인되지 않았다. ERα의 경우 폐암 세포주인 H2052에서는 발현이 확인되었으나 H2009 및 H1299에서는 발현이 확인되지 않았다.

도 4와 같이, 도 3의 프로파일에 근거하여 폐암세포주에서 AR을 발현하는 세포주 H1184 및 H2122와 AR을 발현하지 않은 세포주 H2009 및 H1299를 선택하여 실제 AR의 작용제(agonist)로 알려진 DHT(Dihydrotestosterone)를 처리하였다. 또한 LnCaP 세포주는 AR을 발현하는 세포주로써, DHT처리에 대한 양성대조군으로 이용하였다.

그 결과 AR을 발현하지 않는 세포주들과 달리 AR을 발현하는 세포주에서 AR-의존적인 세포 성장의 증가가 관찰되었다.

도 5와 같이, 도 3의 프로파일에 근거하여 폐암 세포주에서 ERα을 발현하는 세포주 H2052와 ERα을 발현하지 않은 세포주 H2009 및 H1299를 선택하여 실제 ERα의 작용제(agonist)로 알려진 17β- 에스트라디올(17β-estradiol) 및 ERα의 길항제(antagonist)로 알려진 타목시펜(tamoxifen)을 처리하였다. 또한 MCF 세포주는 ERα을 발현하는 세포주로써, 17β- 에스트라디올 및 타목시펜 처리에 대한 양성대조군으로 이용하였다.

그 결과 ERα을 발현하지 않는 세포주들과 달리 AR을 발현하는 세포주에서 ERα-의존적인 세포 성장 증가(17β- 에스트라디올 처리시) 또는 ERα-의존적인 세포 성장 감소(타목시펜 처리시)가 관찰되었다.

이러한 결과들은 동종의 폐암이라고 하더라도 각각의 폐암 세포주별로 특이성이 다르며 이를 바탕으로 환자 각각에 대한 개별적인 프로파일링을 통해 그 특이성을 파악하여야 효과적인 치료가 이뤄질 수 있음을 나타낸다.

따라서 본 발명은 암 환자의 암 세포에서 48 개의 항암제 타겟 유전자의 발현 양상을 분석하고 이러한 발현 양상에 기초하여 기존의 항암제 또는 항후 개발될 항암제를 선별적으로 환자에게 투여하면 환자 개인별 맞춤 치료가 될 수 있음을 제시하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참조 문헌

1. Bookout AL, Cummins CL, Mangelsdorf DJ, Pesola JM, Kramer MF. High-throughput real-time quantitative reverse transcription PCR. Curr Protoc Mol Biol 2006 Feb; Chapter 15:Unit 15.8.

2. Bookout AL, Jeong Y, Downes M, Yu RT, Evans RM, Mangelsdorf DJ. Anatomical profiling of nuclear receptor expression reveals a hierarchical transcriptional network. Cell 2006; 126(4):789-99.

3. Xie CQ, Jeong Y, Fu M, Bookout AL, Garcia-Barrio MT, Sun T, Kim BH, Xie Y, Root S, Zhang J, Xu RH, Chen YE, Mangelsdorf DJ. Expression profiling of nuclear receptors in human and mouse embryonic stem cells. Mol Endocrinol 2009; 23(5): 724-33.

4. Yangsik Jeong, Yang Xie, Guanghua Xiao, Carmen Beherns, Luc Girard, Ignacio I. Wituba, John D. Minna, David J. Mangelsdorf.Nuclear Receptor Expression Defines a Set of Prognostic Biomarkers for Lung Cancer. PLoS Medicine 2010; 7(12):e1000378.

Claims

다음 단계를 포함하는 암 환자 맞춤형 의약 선별 방법:
(a) 상기 암 환자로부터 생물학적 시료를 얻는 단계;
(b) 상기 생물학적 시료에서 ABL1, ABL2, ALAD, AR, CD33, CHD1, CSF1R, Cyp19a1, DHFR, DNMT1, EGFR, EPHA2, ERα, ERβ, ERBB2(HER2), FLT1, FLT3, FLT4, FYN, GART(GARFT), HDAC1, HDAC6, KDR, c-KIT, LCK, MS4A1(CD20), mTOR, PDGFRα, PDGFRβ, POLA1, POLB, PSMB5, RAF1 (c-RAF), RET, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRα, RXRβ, RXRγ, B-RAF, SRC, TARC1 (NK1R), TLR7, TOP1, TOP2A, TYMS 및 YES1로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 2개의 타겟의 발현 레벨을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)에서 고발현 되는 것으로 측정된 타겟에 작용하는 의약(drug)을 선별하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 조직, 세포, 림프, 골수액, 타액, 소변, 분변, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수 또는 양막액인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 발현 측정되는 타겟은 ABL1, ABL2, ALAD, AR, CD33, CHD1, CSF1R, Cyp19a1, DHFR, DNMT1, EGFR, EPHA2, ERα, ERβ, ERBB2(HER2), FLT1, FLT3, FLT4, FYN, GART(GARFT), HDAC1, HDAC6, KDR, c-KIT, LCK, MS4A1(CD20), mTOR, PDGFRα, PDGFRβ, POLA1, POLB, PSMB5, RAF1 (c-RAF), RET, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRα, RXRβ, RXRγ, B-RAF, SRC, TARC1 (NK1R), TLR7, TOP1, TOP2A, TYMS 및 YES1로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 5개의 타겟인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 발현 측정되는 타겟은 ABL1, ABL2, ALAD, AR, CD33, CHD1, CSF1R, Cyp19a1, DHFR, DNMT1, EGFR, EPHA2, ERα, ERβ, ERBB2(HER2), FLT1, FLT3, FLT4, FYN, GART(GARFT), HDAC1, HDAC6, KDR, c-KIT, LCK, MS4A1(CD20), mTOR, PDGFRα, PDGFRβ, POLA1, POLB, PSMB5, RAF1 (c-RAF), RET, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRα, RXRβ, RXRγ, B-RAF, SRC, TARC1 (NK1R), TLR7, TOP1, TOP2A, TYMS 및 YES1로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 10개의 타겟인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 발현 측정되는 타겟은 ABL1, ABL2, ALAD, AR, CD33, CHD1, CSF1R, Cyp19a1, DHFR, DNMT1, EGFR, EPHA2, ERα, ERβ, ERBB2(HER2), FLT1, FLT3, FLT4, FYN, GART(GARFT), HDAC1, HDAC6, KDR, c-KIT, LCK, MS4A1(CD20), mTOR, PDGFRα, PDGFRβ, POLA1, POLB, PSMB5, RAF1 (c-RAF), RET, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRα, RXRβ, RXRγ, B-RAF, SRC, TARC1 (NK1R), TLR7, TOP1, TOP2A, TYMS 및 YES1로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 20 개의 타겟인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 발현 측정되는 타겟은 ABL1, ABL2, ALAD, AR, CD33, CHD1, CSF1R, Cyp19a1, DHFR, DNMT1, EGFR, EPHA2, ERα, ERβ, ERBB2(HER2), FLT1, FLT3, FLT4, FYN, GART(GARFT), HDAC1, HDAC6, KDR, c-KIT, LCK, MS4A1(CD20), mTOR, PDGFRα, PDGFRβ, POLA1, POLB, PSMB5, RAF1 (c-RAF), RET, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRα, RXRβ, RXRγ, B-RAF, SRC, TARC1 (NK1R), TLR7, TOP1, TOP2A, TYMS 및 YES1로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 30개의 타겟인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 발현 측정되는 타겟은 ABL1, ABL2, ALAD, AR, CD33, CHD1, CSF1R, Cyp19a1, DHFR, DNMT1, EGFR, EPHA2, ERα, ERβ, ERBB2(HER2), FLT1, FLT3, FLT4, FYN, GART(GARFT), HDAC1, HDAC6, KDR, c-KIT, LCK, MS4A1(CD20), mTOR, PDGFRα, PDGFRβ, POLA1, POLB, PSMB5, RAF1 (c-RAF), RET, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRα, RXRβ, RXRγ, B-RAF, SRC, TARC1 (NK1R), TLR7, TOP1, TOP2A, TYMS 및 YES1로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 40개의 타겟인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 타겟의 발현 측정은 유전자 증폭 방법 또는 면역분석 방법에 따라 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 유전자 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 PCR은 정량적 실시간 PCR에 따라 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)는 단계 (b)에서 측정된 발현 레벨을 상대적으로 비교하여 최고 발현 레벨을 나타내는 타겟으로부터 발현 레벨 5순위까지의 타겟 중에서 선택되는 최소 하나의 타겟에 작용하는 의약을 선별하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
(a) ABL1, ABL2, ALAD, AR, CD33, CHD1, CSF1R, Cyp19a1, DHFR, DNMT1, EGFR, EPHA2, ERα, ERβ, ERBB2(HER2), FLT1, FLT3, FLT4, FYN, GART(GARFT), HDAC1, HDAC6, KDR, c-KIT, LCK, MS4A1(CD20), mTOR, PDGFRα, PDGFRβ, POLA1, POLB, PSMB5, RAF1 (c-RAF), RET, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRα, RXRβ, RXRγ, B-RAF, SRC, TARC1 (NK1R), TLR7, TOP1, TOP2A, TYMS 및 YES1로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 2개의 타겟 유전자 각각에 특이적으로 혼성화 되는 프라이머 또는 프로브; 또는 (b) ABL1, ABL2, ALAD, AR, CD33, CHD1, CSF1R, Cyp19a1, DHFR, DNMT1, EGFR, EPHA2, ERα, ERβ, ERBB2(HER2), FLT1, FLT3, FLT4, FYN, GART(GARFT), HDAC1, HDAC6, KDR, c-KIT, LCK, MS4A1(CD20), mTOR, PDGFRα, PDGFRβ, POLA1, POLB, PSMB5, RAF1 (c-RAF), RET, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRα, RXRβ, RXRγ, B-RAF, SRC, TARC1 (NK1R), TLR7, TOP1, TOP2A, TYMS 및 YES1로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 2개의 타겟의 단백질 각각에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결정기를 포함하는 암 환자 맞춤형 의약 선별용 키트.
제 12 항에 있어서, 상기 타겟은 ABL1, ABL2, ALAD, AR, CD33, CHD1, CSF1R, Cyp19a1, DHFR, DNMT1, EGFR, EPHA2, ERα, ERβ, ERBB2(HER2), FLT1, FLT3, FLT4, FYN, GART(GARFT), HDAC1, HDAC6, KDR, c-KIT, LCK, MS4A1(CD20), mTOR, PDGFRα, PDGFRβ, POLA1, POLB, PSMB5, RAF1 (c-RAF), RET, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRα, RXRβ, RXRγ, B-RAF, SRC, TARC1 (NK1R), TLR7, TOP1, TOP2A, TYMS 및 YES1로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 5개의 타겟인 것을 특징으로 하는 키트.
제 13 항에 있어서, 상기 타겟은 ABL1, ABL2, ALAD, AR, CD33, CHD1, CSF1R, Cyp19a1, DHFR, DNMT1, EGFR, EPHA2, ERα, ERβ, ERBB2(HER2), FLT1, FLT3, FLT4, FYN, GART(GARFT), HDAC1, HDAC6, KDR, c-KIT, LCK, MS4A1(CD20), mTOR, PDGFRα, PDGFRβ, POLA1, POLB, PSMB5, RAF1 (c-RAF), RET, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRα, RXRβ, RXRγ, B-RAF, SRC, TARC1 (NK1R), TLR7, TOP1, TOP2A, TYMS 및 YES1로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 10개의 타겟인 것을 특징으로 하는 키트.
제 14 항에 있어서, 상기 타겟은 ABL1, ABL2, ALAD, AR, CD33, CHD1, CSF1R, Cyp19a1, DHFR, DNMT1, EGFR, EPHA2, ERα, ERβ, ERBB2(HER2), FLT1, FLT3, FLT4, FYN, GART(GARFT), HDAC1, HDAC6, KDR, c-KIT, LCK, MS4A1(CD20), mTOR, PDGFRα, PDGFRβ, POLA1, POLB, PSMB5, RAF1 (c-RAF), RET, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRα, RXRβ, RXRγ, B-RAF, SRC, TARC1 (NK1R), TLR7, TOP1, TOP2A, TYMS 및 YES1로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 20개의 타겟인 것을 특징으로 하는 키트.
제 15 항에 있어서, 상기 타겟은 ABL1, ABL2, ALAD, AR, CD33, CHD1, CSF1R, Cyp19a1, DHFR, DNMT1, EGFR, EPHA2, ERα, ERβ, ERBB2(HER2), FLT1, FLT3, FLT4, FYN, GART(GARFT), HDAC1, HDAC6, KDR, c-KIT, LCK, MS4A1(CD20), mTOR, PDGFRα, PDGFRβ, POLA1, POLB, PSMB5, RAF1 (c-RAF), RET, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRα, RXRβ, RXRγ, B-RAF, SRC, TARC1 (NK1R), TLR7, TOP1, TOP2A, TYMS 및 YES1로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 30개의 타겟인 것을 특징으로 하는 키트.
제 16 항에 있어서, 상기 타겟은 ABL1, ABL2, ALAD, AR, CD33, CHD1, CSF1R, Cyp19a1, DHFR, DNMT1, EGFR, EPHA2, ERα, ERβ, ERBB2(HER2), FLT1, FLT3, FLT4, FYN, GART(GARFT), HDAC1, HDAC6, KDR, c-KIT, LCK, MS4A1(CD20), mTOR, PDGFRα, PDGFRβ, POLA1, POLB, PSMB5, RAF1 (c-RAF), RET, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRα, RXRβ, RXRγ, B-RAF, SRC, TARC1 (NK1R), TLR7, TOP1, TOP2A, TYMS 및 YES1로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 40개의 타겟인 것을 특징으로 하는 키트.
제 12 항에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭용 키트 또는 면역분석용 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
제 18 항에 있어서, 상기 키트는 정량적 실시간 PCR 용 키트인 것을 특징으로 하는 키트.