JP2002315581A

JP2002315581A - リアルタイム検出ｐｃｒ法並びにそれに用いられるプライマー及びヌクレオチド

Info

Publication number: JP2002315581A
Application number: JP2001120409A
Authority: JP
Inventors: Hisashi Hisatomi; 寿久富
Original assignee: SRL Inc
Current assignee: SRL Inc
Priority date: 2001-04-18
Filing date: 2001-04-18
Publication date: 2002-10-29

Abstract

(57)【要約】【課題】リアルタイム検出ＰＣＲの高い定量性を活か
し、かつ、リアルタイム検出ＰＣＲの検出限界以下の増
幅が起きている場合でも被検核酸の検出が可能となる被
検核酸の測定方法、並びにそれに用いられるプライマー
及びヌクレオチドを提供すること。【解決手段】ローダミンＸ又はその誘導体で標識し
たリアルタイム検出ＰＣＲ用プライマー又はヌクレオチ
ドを用いて、リアルタイム検出ＰＣＲを行うことにより
ＰＣＲ増幅産物をローダミンＸ又はその誘導体で標識す
る。この増幅産物は、そのまま変性ＨＰＬＣにかけて高
感度に被検核酸を検出することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、リアルタイム検出
ＰＣＲ用のプライマー及びそれを用いたリアルタイム検
出ＰＣＲ法に関する。

【０００２】

【従来の技術】TaqMan （登録商標）PCR法、インターカ
レーションモニタリングPCR法、モレキュラービーコン
プローブ法、ハイブリダイゼーションプローブ法、サン
ライズプライマー法などが挙げられ、最も一般的に使用
されているのはTaqMan（登録商標）PCR法である。

【０００３】TaqMan（登録商標）PCR法を含めリアルタ
イム検出PCR法では、その原理において蛍光色素である6
-FAM(FAM)の強度を測定する場合が多い。TaqMan（登録
商標）PCR法では、標的遺伝子に特異的な塩基配列を有
するプローブの5'末端にFAMを3'末端にTAMRAをラベル
(標識)し、反応溶液中のRox色素の蛍光強度をバックグ
ラウンドとして、反応中のFAM由来シグナルの増加をモ
ニタリングする。

【０００４】一方、高感度に核酸を検出する方法とし
て、変性ＨＰＬＣ法(denaturing HPLC)が知られてお
り、そのためのキットも市販されている（例えば、Tran
sgenomicInc.のWAVE System（登録商標））。変性ＨＰ
ＬＣ法による検出感度は、被検核酸を蛍光標識すること
により大幅に増大することが知られており、ＰＣＲ産物
（リアルタイム検出ＰＣＲの産物ではない）を蛍光標識
して変性ＨＰＬＣ法にかけることも知られている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】リアルタイム検出ＰＣ
Ｒは、定量性が高く、被検核酸の定量には優れた方法で
ある。しかしながら、リアルタイム検出ＰＣＲは、臨床
検査の目的で利用するには、検出感度が満足できる程度
に高くないという欠点を有する。このため、被検試料中
に極微量の被検核酸が含まれており、ある程度の増幅が
起きている場合であっても、リアルタイム検出ＰＣＲの
検出限界以下となる場合がある。リアルタイム検出ＰＣ
Ｒの検出限界以下となった場合に、増幅が全く起きてい
ないのか、起きてはいるが検出限界以下となっているの
かを知ることができれば、臨床検査をより正確に行うこ
とができ、好ましい。

【０００６】従って、本発明の目的は、リアルタイム検
出ＰＣＲの高い定量性を活かし、かつ、リアルタイム検
出ＰＣＲの検出限界以下の増幅が起きている場合でも被
検核酸の検出が可能となる被検核酸の測定方法、並びに
それに用いられるプライマー及びヌクレオチドを提供す
ることである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本願発明者らは、リアル
タイム検出ＰＣＲによる増幅産物を、変性ＨＰＬＣで分
析することに想到した。しかし、リアルタイム検出ＰＣ
Ｒによる増幅産物を一々蛍光標識することは、非常に手
間のかかることであり、臨床検査センターや病院等にお
いて、限られた時間内に多数の検体について検査する必
要がある臨床検査においてこのような方法を採用するこ
とは非現実的である。そこで、本願発明者らは、リアル
タイム検出ＰＣＲに用いられるプライマーを蛍光標識し
ておき、それによってＰＣＲ増幅産物を自動的に蛍光標
識し、このような蛍光標識されたＰＣＲ増幅産物を変性
ＨＰＬＣにかけることに想到した。しかし、このような
ことを可能にするためには、(1)蛍光標識の存在によっ
て、ＰＣＲ時のＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が妨
害されないこと、(2)リアルタイム検出ＰＣＲでは、FAM
等の蛍光を測定するが、プライマーに標識する蛍光標識
によってこの蛍光測定が妨害されないこと、及び(3)Ｐ
ＣＲ産物の蛍光標識によって変性ＨＰＬＣによる検出が
妨害されないこと（例えば蛍光標識がＨＰＬＣカラムに
吸着されてＨＰＬＣによる検出ができなくなる等）が必
要であり、これらの要件を満足する蛍光色素が果たして
存在するのか否かさえ不明であった。

【０００８】本願発明者らは、鋭意研究の結果、ローダ
ミンＸでリアルタイム検出ＰＣＲ用のプライマー又はヌ
クレオチドを標識することにより、リアルタイム検出Ｐ
ＣＲが満足に実施でき、かつ、リアルタイム検出ＰＣＲ
による増幅産物をそのまま変性ＨＰＬＣにかけて高感度
な検出を行うことが可能であることを見出し、本発明を
完成した。

【０００９】すなわち、本発明は、ローダミンＸ又はそ
の誘導体で標識したリアルタイム検出ＰＣＲ用プライマ
ーを提供する。また、本発明は、ローダミンＸ又はその
誘導体で標識したリアルタイム検出ＰＣＲ用ヌクレオチ
ドを提供する。さらに、本発明は、上記本発明のプライ
マーを少なくとも一方のプライマーとして用い、又は上
記本発明のヌクレオチドを相補鎖伸長の材料として用い
てリアルタイム検出ＰＣＲを行う、リアルタイム検出Ｐ
ＣＲ法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明のリ
アルタイム検出ＰＣＲ法により得られた増幅産物を、変
性ＨＰＬＣ法にかけることをさらに含む、被検核酸の測
定方法を提供する。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明の第１の方法では、リアル
タイム検出ＰＣＲに用いるプライマーとして、ローダミ
ンＸ（以下、「ROX」と言うことがある）又はその誘導
体で標識したプライマーを用いる。なお、リアルタイム
検出ＰＣＲには、フォワード側プライマーとリバース側
プライマーの２種類が用いられるが、これらのうちのい
ずれか一方がROX又はその誘導体で標識されていればよ
く、両者とも標識されていてもよい。また、プライマー
中の標識部位は、３’末端、５’末端、及び末端以外の
中間部のいずれであってもよい。

【００１１】ROXは、下記式[I]で表される化学構造を有
する。また、ROXの吸収波長は585 nm、極大波長は605 n
mである。

【００１２】

【化１】

【００１３】本発明では、ROXの誘導体も用いることが
できる。ROXの基本骨格を有し、リアルタイム検出ＰＣ
Ｒによる定量、及びその増幅産物の変性ＨＰＬＣ法によ
る検出が可能であれば、いずれのROX誘導体をも用いる
ことができる。例えば、縮合環の任意の位置に１個又は
複数、好ましくは１個〜３個程度の、炭素数１〜４の低
級アルキル基、=NR¹（Ｒ^１は炭素数１〜４の低級アルキ
ル基、-NHR¹（Ｒ^１は炭素数１〜４の低級アルキル基）
が置換したもの、ベンゼン環の２位のカルボキシル基が
炭素数１〜４の低級アルキル基でエステル化されたもの
等を挙げることができる。

【００１４】ROX又はその誘導体による標識は、常法に
より、下記一般式[II]で表されるROX又はそのエステル
誘導体、カルボン酸塩若しくはカルボン酸ハライド等を
プライマーと反応させて結合させることにより行うこと
ができる。

【００１５】

【化２】

【００１６】（ただし、Ｒは水素原子、アルカリ金属、
ハロゲン又は任意の有機基）（縮合環やベンゼン環の２位のカルボキシル基等が上記
のように置換されていてもよい。-COORの結合位置は限
定されないが、４位又は５位が好ましい）

【００１７】なお、一般式[II]におけるＲで表される有
機基としては、炭素数１〜８のアルキル基、炭素数３〜
８のシクロアルキル基、フェニル基、ピロリジル基、ピ
リジル基、ピロール基、及び

【００１８】

【化３】

【００１９】で表される基を挙げることができるが、こ
れらに限定されるものではない。

【００２０】エステル誘導体の場合には、COORのＲが離
脱してカルボキシル基となり、これを介してプライマー
に結合されるか、又はＲの構造を介してプライマーに結
合される。従って、プライマーに結合された状態でＲ由
来の構造が残っているものもROXの誘導体として好まし
く用いることができる。従って、本明細書において、
「ROXで標識された」プライマーは、下記式[III]で示さ
れる基が直接的又は上記Ｒ由来の構造を介してプライマ
ーに結合されたものを包含する。なお、プライマーの側
にもROX標識化試薬と結合するためのアミノ基等の官能
基を導入することができる。

【００２１】

【化４】

【００２２】なお、オリゴヌクレオチドをローダミン系
の蛍光色素で標識する方法はこの分野において周知であ
り、周知の方法によりオリゴヌクレオチドをROX又はそ
の誘導体で標識することができる。例えば、下記式[IV]
で示されるROXのエステル誘導体がROX-NHSという商品名
でPE Applied Biosystems社より市販されているので、
このような市販のROX標識化試薬を用い、その使用説明
書に従って容易にプライマーをROX標識することができ
る。

【００２３】

【化５】

【００２４】本発明の第１の方法では、上記の標識プラ
イマーを用い、従来と全く同様にしてリアルタイム検出
ＰＣＲを行うことができる。リアルタイム検出ＰＣＲ
は、TaqMan （登録商標）PCR法、インターカレーション
モニタリングPCR法、モレキュラービーコンプローブ
法、ハイブリダイゼーションプローブ法、サンライズプ
ライマー法など、公知のいずれの方法でも良く、これら
のうち、TaqMan（登録商標）PCR法が特に好ましい。Taq
Man（登録商標）PCR法は、この分野において周知であ
り、そのためのキット及び装置も市販されているので、
市販品を用いて容易に実施することができる。下記実施
例で実験的に明らかにされるように、ROX又はその誘導
体で標識されたプライマーを用いても、リアルタイム検
出ＰＣＲは支障なく実施することができ、高い定量性を
もって被検核酸を定量することができる。

【００２５】本発明は、また、上記したROX又はその誘
導体で標識した、リアルタイム検出ＰＣＲ用ヌクレオチ
ドを提供する。ここで、用いられるROX又はその誘導体
については、上記の説明をそのまま援用することができ
る。また、ヌクレオチドのROX標識も、例えば上記したR
OX-NHS(PE Applied Biosystems社製）のような市販のRO
X標識化試薬を用いた常法により容易に行うことができ
る。

【００２６】本発明の第２の方法では、このようなROX
又はその誘導体で標識したヌクレオチドの存在下におい
て、従来と全く同様にしてリアルタイム検出ＰＣＲを行
うことができる。ROX又はその誘導体で標識したヌクレ
オチドは、ＰＣＲにおいて相補鎖伸長の材料として用い
られ、その結果、増幅産物中には標識ヌクレオチドが取
り込まれ、ROX又はその誘導体で標識された増幅産物が
得られる。

【００２７】本発明の第１又は第２の方法によれば、リ
アルタイム検出ＰＣＲ法により増幅された増幅産物は、
ROX又はその誘導体により標識されており、この標識さ
れた増幅産物をそのまま変性ＨＰＬＣ法にかけることが
できる。従って、リアルタイム検出ＰＣＲによって増幅
が検出されなかった場合に、その増幅産物をそのまま変
性ＨＰＬＣ法にかけることができ、より高感度に検体中
の被検核酸を検出することができる。変性ＨＰＬＣ法自
体は、この分野において周知であり、そのためのキット
及び装置も市販されている（例えば、Transgenomic In
c.のWAVE System（登録商標））ので、このような市販
品を用いて、従来と全く同様に、容易に変性ＨＰＬＣ法
を実施することができる。

【００２８】なお、本発明の方法が適用される被検核酸
としては、何ら限定されるものではなく、測定（定量又
は検出）が望まれるあらゆる核酸を測定対象とすること
ができる。例えば、体液中の各種ウイルスやバクテリア
等の病原体由来の遺伝子、白血病に特有なキメラｍＲＮ
Ａ等を挙げることができる。なお、核酸はＤＮＡでもＲ
ＮＡでもよく、ＲＮＡの場合には先ず、逆転写によりｃ
ＤＮＡを調製し、そのｃＤＮＡについてリアルタイム検
出ＰＣＲを行うことができる。

【００２９】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。

【００３０】実施例１ (1) 鋳型ｃＤＮＡの調製測定の対象とするAML1-MTG8キメラ mRNAからReal-time
PCR反応のテンプレートとなるcDNAを合成するために、
以下の反応を実施した。

【００３１】AML1-MTG8キメラ mRNA陽性であるSKNO-1セ
ルライン(ATCCより入手) 10⁶ 細胞にRNA抽出試薬Isogen
(日本ジーン)１mlを添加し、30秒撹拌した。撹拌後、20
0μｌのクロロホルムを添加し、再度30秒撹拌した。撹
拌後、12000 x g 15分間し、水相に等量のイソプロパノ
ールを加え、12000 x gで20分間遠心した。遠心後、１m
lの75%エタノールで２回洗浄し50μｌのRNase阻害剤加D
EPC処理水で溶解した。

【００３２】溶解したRNA溶液から、以下のcDNA合成溶
液を用いてcDNAを合成した。cDNA合成は37℃で１時間実
施した。cDNAに使用するRNA溶液の濃度を1.0μg総RNAか
ら段階的に3倍希釈し、12本のcDNAを合成した。

【００３３】 cDNA反応 5×RT buffer* (Gibco BRL社製) 4.0 μｌ 0.1M DTT* (Gibco BRL社製) 2.0 μｌ 10mM dNTP(宝酒造社製) 1.0 μｌランダムプライマー(Gibco BRL社製) 1.0 μｌ RNase 阻害剤(宝酒造社製) 10 U M-MLV 逆転写酵素(Gibco BRL社製) 10 U RNA溶液 5.0 μｌ合計 20μｌ * M-MLV 逆転写酵素に付属

【００３４】（２）プライマーの合成 22塩基から成る
塩基配列を有する22merのオリゴDNA 5'-GAG CCA TCA AA
A TCA CAG TGG A-3' を化学合成し、フォワード側プラ
イマーとした。また、22塩基から成る塩基配列を有する
22merのオリゴDNA 5'-GAG CCATCA AAA TCA CAG TGG A-
3' を化学合成し、リバース側プライマーとした。リバ
ース側プライマーは、ROXで標識した。ROXによる標識は
次のようにして行った。アミノ基を導入したオリゴヌク
レオチド（合成プライマー）をアルカリ性の溶液に融解
させ、その中にRox蛍光試薬(蛍光ラベル化剤 ROX-NHS :
PE Applied biosystems社製)のエステルを加え、８時
間以上室温でシーソーシェイカーで揺らしながら放置し
た。その後、未反応の試薬を除去し、HPLC精製してROX
標識プライマーを得た。

【００３５】（３）TaqMan（登録商標）プローブの合成
32塩基から成る塩基配列を有する32merのオリゴDNA
5'-CAC CTG TGG ATG TGA AGA CGC AAT CTA GGC TG-3'
を化学合成した。常法により、このオリゴDNAの5'末端
にFAMを3'末端にTAMRAを結合しプローブとした。

【００３６】（４）PCR反応反応液の組成は次の通りであった。 TaqMan 2×Universal Master Mix (PE Applied Biosystems) 200 μｌフォワードプライマー (100pmol/μｌ) 2.4 μｌリバースプライマー (100pmol/μｌ) 2.4 μｌプローブ (100pmol/μｌ) 0.4 μｌ合計 400μｌ

【００３７】MicroAmp Optical 96 well Reaction Plat
e (商品名、PE Applied Biosystems社製) １ wellあた
り50 μｌを加え、そこに上記cDNA合成溶液5.0 μｌを
添加した。キャップ(MicroAmp Caps : 商品名、PE Appl
ied Biosystems 社製)をした後、ABI PRIZM 7700 Seque
nce Detecter (商品名、PE Applied Biosystems 社製)
にセットし、以下の条件で反応をおこなった。PCRの各
サイクル毎に蛍光強度を測定し、データを収集した。

【００３８】 PCR反応は95℃/30秒、60℃/30秒、72℃/30秒を１サイク
ルとし、53サイクル実施した。また、対照として、蛍光
標識しないプライマーを用いて同様にリアルタイム検出
ＰＣＲを行った。

【００３９】（５）リアルタイム検出ＰＣＲの測定結果 ROXで標識したプライマーを用いた場合の結果を図１
に、蛍光標識していないプライマーを用いた場合の結果
を図２に示す。図１及び図２の上段は、横軸にＰＣＲの
サイクル数、縦軸にFAMの蛍光強度の対数をとったもの
であり、低減希釈した複数濃度のＲＮＡ由来のｃＤＮＡ
溶液についての結果を示している（後述する各比較例の
結果を示す図４〜図１２についても上段の図は横軸にＰ
ＣＲのサイクル数、縦軸にFAMの蛍光強度の対数をとっ
たもの）。図１の上段に示される曲線は、図２と同様で
あり、理想的なリアルタイム検出ＰＣＲの曲線を示して
おり、ｃＤＮＡ合成に使用したＲＮＡの濃度依存的にシ
グナルの検出されるサイクル数（閾値）が増加してい
る。図１及び図２の下段は、１つの試料について、横軸
にＰＣＲのサイクル数、縦軸にFAMの蛍光をとったもの
である。図１に示されるように、ROXで標識したプライ
マーを用いた場合、FAMのシグナル(青色)（図中、一番
上の曲線）が蛍光強度(Y軸) 8000付近から反応の経過(X
軸)とともに15000付近まで上昇していることが観察され
る。上昇格差(シグナル強度)は7000程度である。バック
グランドのRoxのシグナル（図１中、上から２番目の曲
線）もほぼ一定である。

【００４０】図１から明らかなように、ROXで標識した
プライマーを用いても、満足にリアルタイム検出ＰＣＲ
を行うことができた。

【００４１】(6) 変性ＨＰＬＣリアルタイム検出ＰＣＲ反応が終了したMicroAmp Optic
al 96 well ReactionPlate (商品名、PE Applied Biosy
stems 社製) からキャップ(MicroAmp Caps :商品名、PE
Applied Biosystems 社製)を取り除き、市販の変性Ｈ
ＰＬＣ用のシステムであるWAVE system (商品名、Trans
genomic 社製) にセットした。すなわち、PCR増幅産物
を10μＬカラムに自動分取させ、0.1M トリエチルアン
モニウムアセテート、25%アセトニトリル溶液を50%から
40分かけて68%まで上昇させながらカラムに通した。検
出波長は、ROXの吸収波長(585 nm)及び極大波長(605 n
m)を用いた。

【００４２】(7) 変性ＨＰＬＣの測定結果結果を図３に示す。図３に示されるように、ＰＣＲ増幅
産物のピークは１７分の位置に確認された。このことか
ら、ROXで標識したプライマーを用いて行ったリアルタ
イム検出ＰＣＲの増幅産物をそのまま変性ＨＰＬＣにか
けて増幅産物を検出することができることが確認され
た。

【００４３】比較例１〜９ ROXでの標識に代えて、FAM(吸収波長492nm、極大波長51
5nm)（比較例１）、FITC(同491nm、515nm)（比較例
２）、TET(同521nm、536nm)（比較例３）、HEX(同535 n
m、556 nm)（比較例４）、TAMRA(同565nm、580nm)（比
較例５）、Cy-3(同550nm、570nm)（比較例６）、Texred
(同583nm、603nm)（比較例７）、Cy-5(同649nm、670nm)
（比較例８）、Cy-5.5(同675nm、694nm)（比較例９）で
プライマーを標識したこと以外は実施例１と同じ操作を
行った。

【００４４】比較例１〜９についてのリアルタイム検出
ＰＣＲの結果を図４〜図１２にそれぞれ示す。これらの
図から明らかなように、ｃＤＮＡの合成に用いたＲＮＡ
の濃度依存的に閾値が増大し、かつ、バックグランドと
の差が十分にあり、リアルタイム検出ＰＣＲに採用可能
なものは、TexRed（比較例７、図１０）、Cy-5（比較例
８、図１１）及びCy-5.5（比較例９、図１２）の３つで
ある。

【００４５】そこで、これら３種類の蛍光色素で標識し
たプライマーを用いて行ったリアルタイム検出ＰＣＲ増
幅産物を実施例１と同様にして変性ＨＰＬＣ法にかけ
た。また、対照として、これらの各蛍光色素又はROXで
標識したプライマー自体も同様に変性ＨＰＬＣにかけ
た。その結果、図３に示すように、Roxのプライマー由
来ピークは5分、Cy-5のプライマー由来ピークは35分
に、確認されたが、TexRedおよびCy-5.5由来ピークは確
認されなかった。また、TexRed（比較例７）、Cy-5（比
較例８）及びCy-5.5（比較例９）のいずれの蛍光色素を
用いた場合にも増幅産物のピークは観察されなかった。
これは、蛍光色素がＨＰＬＣの分離カラムに強く吸着さ
れ、溶出が困難な状態になったことに起因するものと推
測される。

【００４６】以上のように、比較例１〜９で用いた９種
類の蛍光色素のうち、リアルタイム検出ＰＣＲを満足に
行うことができ、かつ、増幅産物をそのまま変性ＨＰＬ
Ｃにかけて分析できるものは存在しなかった。

【００４７】

【発明の効果】本発明により、リアルタイム検出ＰＣＲ
後の増幅産物をそのまま変性ＨＰＬＣ法にかけて高感度
に被検核酸を検出することができる、リアルタイム検出
ＰＣＲ用のプライマー及びそれを用いた被検核酸の測定
方法が初めて提供された。本発明によれば、リアルタイ
ム検出ＰＣＲ後の増幅産物をそのまま変性ＨＰＬＣ法に
かけて分析することができるので、リアルタイム検出Ｐ
ＣＲで増幅が確認できなかった試料についても、簡便に
変性ＨＰＬＣ法による高感度検出を行うことができ、臨
床検査等で極微量の被検核酸を検出する場合等における
検査の精度が向上する。

【００４８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> SRL, INC. <120> Primer for real-time detection PCR and method for real-time detec tion PCR using the same <130> 01721 <160> 2

【００４９】 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic Acid Used as forward primer for amplifying cDNA prepared from AML1-MTG8 chimeric mRNA <400> 1 gagccatcaa aatcacagtg ga 22

【００５０】 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic Acid Used as reverse primer for amplifying cDNA prepared from AML1-MTG8 chimeric mRNA <400> 2 gagccatcaa aatcacagtg ga 22

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例１で行った、ROXで標識したプ
ライマーを用いて行ったリアルタイム検出ＰＣＲの結果
を示す図である。

【図２】本発明の実施例１において対照として行った、
無標識のプライマーを用いて行ったリアルタイム検出Ｐ
ＣＲの結果を示す図である。

【図３】実施例１で行った変性ＨＰＬＣ法の結果を示す
図である。

【図４】比較例１で行った、FAMで標識したプライマー
を用いて行ったリアルタイム検出ＰＣＲの結果を示す図
である。

【図５】比較例２で行った、FITCで標識したプライマー
を用いて行ったリアルタイム検出ＰＣＲの結果を示す図
である。

【図６】比較例３で行った、TETで標識したプライマー
を用いて行ったリアルタイム検出ＰＣＲの結果を示す図
である。

【図７】比較例４で行った、HEXで標識したプライマー
を用いて行ったリアルタイム検出ＰＣＲの結果を示す図
である。

【図８】比較例５で行った、TAMRAで標識したプライマ
ーを用いて行ったリアルタイム検出ＰＣＲの結果を示す
図である。

【図９】比較例６で行った、Cy-3で標識したプライマー
を用いて行ったリアルタイム検出ＰＣＲの結果を示す図
である。

【図１０】比較例７で行った、Texredで標識したプライ
マーを用いて行ったリアルタイム検出ＰＣＲの結果を示
す図である。

【図１１】比較例８で行った、Cy-5で標識したプライマ
ーを用いて行ったリアルタイム検出ＰＣＲの結果を示す
図である。

【図１２】比較例９で行った、Cy-5.5で標識したプライ
マーを用いて行ったリアルタイム検出ＰＣＲの結果を示
す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 2G045 DA12 DA13 DA14 FB06 FB07 FB12 4B024 AA11 AA20 CA01 CA11 CA20 HA11 4B063 QA01 QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR35 QR38 QR42 QR56 QR62 QS17 QS25 QS36 QX01 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ローダミンＸ又はその誘導体で標識した
リアルタイム検出ＰＣＲ用プライマー。
【請求項２】ローダミンＸで標識した請求項１記載の
プライマー。
【請求項３】ローダミンＸ又はその誘導体で標識した
リアルタイム検出ＰＣＲ用ヌクレオチド。
【請求項４】ローダミンＸで標識した請求項３記載の
ヌクレオチド。
【請求項５】請求項１若しくは２記載のプライマーを
少なくとも一方のプライマーとして用い、又は請求項３
若しくは４記載のヌクレオチドを相補鎖伸長の材料とし
て用いてリアルタイム検出ＰＣＲを行う、リアルタイム
検出ＰＣＲ法。
【請求項６】請求項１若しくは２記載のプライマーを
少なくとも一方のプライマーとして用いて行う請求項５
記載の方法。
【請求項７】請求項５又は６記載の方法により得られ
た増幅産物を、変性ＨＰＬＣ法にかけることをさらに含
む、被検核酸の測定方法。