JP2002306189A - アルコールデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、ベクター、発現系、該アルコールデヒドロゲナーゼの使用並びにアルコールの還元的製造方法 - Google Patents
アルコールデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、ベクター、発現系、該アルコールデヒドロゲナーゼの使用並びにアルコールの還元的製造方法Info
- Publication number
- JP2002306189A JP2002306189A JP2002068878A JP2002068878A JP2002306189A JP 2002306189 A JP2002306189 A JP 2002306189A JP 2002068878 A JP2002068878 A JP 2002068878A JP 2002068878 A JP2002068878 A JP 2002068878A JP 2002306189 A JP2002306189 A JP 2002306189A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- alcohol dehydrogenase
- seq
- alcohol
- acid sequence
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Abandoned
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 簡単に入手されることができかつ有機合成に
おいてアルコール類をケトン類に酸化するため又はケト
ン類をアルコール類に還元するために使用されることが
できるアルコールデヒドロゲナーゼ類。 【解決手段】 アミノ酸配列（配列番号１）を有する蛍
光菌(DSM 50106)由来の新規のアルコールデヒドロゲナ
ーゼ（ＡＤＨＦ１）、又はその対立遺伝子若しくは機能
変異体又はその機能的な部分的配列。
おいてアルコール類をケトン類に酸化するため又はケト
ン類をアルコール類に還元するために使用されることが
できるアルコールデヒドロゲナーゼ類。 【解決手段】 アミノ酸配列（配列番号１）を有する蛍
光菌(DSM 50106)由来の新規のアルコールデヒドロゲナ
ーゼ（ＡＤＨＦ１）、又はその対立遺伝子若しくは機能
変異体又はその機能的な部分的配列。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光菌(Pseudomon
as fluorescens)からの新規のアルコールデヒドロゲナ
ーゼ（ＡＤＨ）並びにそのようなアルコールデヒドロゲ
ナーゼ類を用いることによりケトン類を相応するアルコ
ール類に選択還元する方法に関する。
as fluorescens)からの新規のアルコールデヒドロゲナ
ーゼ（ＡＤＨ）並びにそのようなアルコールデヒドロゲ
ナーゼ類を用いることによりケトン類を相応するアルコ
ール類に選択還元する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アルコールデヒドロゲナーゼ類(EC 1.1.
1.1)は、酸化還元酵素の群に属する。アルコールデヒド
ロゲナーゼは、アルコール基質が相応するケトン類若し
くはアルデヒド類に酸化されるか又はアルデヒド若しく
はケトンからアルコールへの反対側の還元が触媒される
ような非常に多数の生物学的反応を触媒する。アルコー
ルデヒドロゲナーゼで媒介された生物学的方法は、アル
コール発酵の最終段階のように重要な反応、即ち酵母に
おけるエタノールへのグルコースの変換、網膜における
全トランス−レチノール（ビタミンＡ１）への全トラン
ス−レチナールの還元又は肝臓における血中アルコール
の分解を含む。記載された反応は、通常可逆であり、か
つ補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ）又はニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ）の存在
で行われる。
1.1)は、酸化還元酵素の群に属する。アルコールデヒド
ロゲナーゼは、アルコール基質が相応するケトン類若し
くはアルデヒド類に酸化されるか又はアルデヒド若しく
はケトンからアルコールへの反対側の還元が触媒される
ような非常に多数の生物学的反応を触媒する。アルコー
ルデヒドロゲナーゼで媒介された生物学的方法は、アル
コール発酵の最終段階のように重要な反応、即ち酵母に
おけるエタノールへのグルコースの変換、網膜における
全トランス−レチノール（ビタミンＡ１）への全トラン
ス−レチナールの還元又は肝臓における血中アルコール
の分解を含む。記載された反応は、通常可逆であり、か
つ補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ）又はニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ）の存在
で行われる。
【０００３】大抵のアルコールデヒドロゲナーゼ類にお
いて、基質の酸素原子が配位することができる亜鉛が触
媒中心として利用される。
いて、基質の酸素原子が配位することができる亜鉛が触
媒中心として利用される。
【０００４】生物学的方法におけるアルコールデヒドロ
ゲナーゼ類の決定的重要性とは別に、アルコール類、ケ
トン類又はアルデヒド類を製造するために、有機化学合
成のためのこれらの酵素を使用することが提案される。
技術的観点からは特に、相応するケトン類の接触還元に
よる光学活性アルコール類のエナンチオ選択合成が重要
である。これまで、とりわけウマ肝臓、酵母（ＹＡＤ
Ｈ）又はThermoanaerobium brockiiからのアルコールデ
ヒドロゲナーゼ類が有機合成に使用されている。
ゲナーゼ類の決定的重要性とは別に、アルコール類、ケ
トン類又はアルデヒド類を製造するために、有機化学合
成のためのこれらの酵素を使用することが提案される。
技術的観点からは特に、相応するケトン類の接触還元に
よる光学活性アルコール類のエナンチオ選択合成が重要
である。これまで、とりわけウマ肝臓、酵母（ＹＡＤ
Ｈ）又はThermoanaerobium brockiiからのアルコールデ
ヒドロゲナーゼ類が有機合成に使用されている。
【０００５】個々のアルコールデヒドロゲナーゼ類は、
それらの基質特異性及びそれらの選択性について大いに
異なるので、新規の酵素的性質を有する別のアルコール
デヒドロゲナーゼ類を見出すことに極めて関心がある。
このために、近年、かなり多数のアルコールデヒドロゲ
ナーゼ類が、異なる生物から単離され、かつ特性決定さ
れている。
それらの基質特異性及びそれらの選択性について大いに
異なるので、新規の酵素的性質を有する別のアルコール
デヒドロゲナーゼ類を見出すことに極めて関心がある。
このために、近年、かなり多数のアルコールデヒドロゲ
ナーゼ類が、異なる生物から単離され、かつ特性決定さ
れている。
【０００６】現在公知の極めて大部分のアルコールデヒ
ドロゲナーゼは酵母に由来し、かつそれらの基質特異性
は大きく変化する。現在まで同定された一部のＡＤＨ類
は、Pseudomonas種に由来し、例えばShen、G. J.他(Che
m. Soc.、Chem. Commun. 9、677-679;1990)により記載
され、僅かな基質許容性を有する株ATCC49688由来の特
異性デヒドロゲナーゼ、アリル型アルコールに変換する
Pseudomonas putida ＡＤＨ(Malone、V. F.、Appl. Env
ironm. Microbiol. 1999、65、2622-2630)又はBradsha
w、C. W.他(J. Org. Chem. 57、1526-1532;1992)により
記載され、幅広い基質受容性を有する相対的に非特異性
のデヒドロゲナーゼである。しかしながら、これまで、
公知のPseudomonas種 ＡＤＨ類をクローニングすること
は不可能であり、ひいては有機合成目的のための幅広い
用途に利用不可能である。
ドロゲナーゼは酵母に由来し、かつそれらの基質特異性
は大きく変化する。現在まで同定された一部のＡＤＨ類
は、Pseudomonas種に由来し、例えばShen、G. J.他(Che
m. Soc.、Chem. Commun. 9、677-679;1990)により記載
され、僅かな基質許容性を有する株ATCC49688由来の特
異性デヒドロゲナーゼ、アリル型アルコールに変換する
Pseudomonas putida ＡＤＨ(Malone、V. F.、Appl. Env
ironm. Microbiol. 1999、65、2622-2630)又はBradsha
w、C. W.他(J. Org. Chem. 57、1526-1532;1992)により
記載され、幅広い基質受容性を有する相対的に非特異性
のデヒドロゲナーゼである。しかしながら、これまで、
公知のPseudomonas種 ＡＤＨ類をクローニングすること
は不可能であり、ひいては有機合成目的のための幅広い
用途に利用不可能である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、簡単に入手されることができかつ有機合成において
アルコール類をケトン類に酸化するため又はケトン類を
アルコール類に還元するために使用されることができる
新規のアルコールデヒドロゲナーゼ類を提供することで
ある。
は、簡単に入手されることができかつ有機合成において
アルコール類をケトン類に酸化するため又はケトン類を
アルコール類に還元するために使用されることができる
新規のアルコールデヒドロゲナーゼ類を提供することで
ある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、次のアミノ酸
配列（配列番号１）：
配列（配列番号１）：
【０００９】
【表１】
【００１０】を有する蛍光菌(DSM 50106)由来の新規の
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＦ１）、又はその
対立遺伝子若しくは機能変異体又はその機能的な部分的
配列に関する。
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＦ１）、又はその
対立遺伝子若しくは機能変異体又はその機能的な部分的
配列に関する。
【００１１】本発明による機能変異体は、６０％を上回
り、好ましくは８０％を上回る配列相同を有するアミノ
酸配列を含むアルコールデヒドロゲナーゼを意味する。
加えて、機能的な部分的配列は好ましくは、少なくとも
５０個のアミノ酸、特に好ましくは１００個を上回るア
ミノ酸からなるアミノ酸断片を含むアルコールデヒドロ
ゲナーゼ類を意味するが、しかし１００個までのアミノ
酸、好ましくは５０個までのアミノ酸の欠失を有する機
能変異体も、“機能的な部分的配列”の用語のもとに含
まれる。
り、好ましくは８０％を上回る配列相同を有するアミノ
酸配列を含むアルコールデヒドロゲナーゼを意味する。
加えて、機能的な部分的配列は好ましくは、少なくとも
５０個のアミノ酸、特に好ましくは１００個を上回るア
ミノ酸からなるアミノ酸断片を含むアルコールデヒドロ
ゲナーゼ類を意味するが、しかし１００個までのアミノ
酸、好ましくは５０個までのアミノ酸の欠失を有する機
能変異体も、“機能的な部分的配列”の用語のもとに含
まれる。
【００１２】加えて、本発明のアルコールデヒドロゲナ
ーゼは、翻訳後修飾、例えば糖鎖形成又はリン酸化を有
していてよい。
ーゼは、翻訳後修飾、例えば糖鎖形成又はリン酸化を有
していてよい。
【００１３】本発明は更に、本発明のアルコールデヒド
ロゲナーゼ類のためにコードする核酸、又はその対立遺
伝子若しくは機能変異体又はその部分的配列、又はコー
ドする核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするそれらの核酸配列と相補性であるＤＮＡ断片に関
する。
ロゲナーゼ類のためにコードする核酸、又はその対立遺
伝子若しくは機能変異体又はその部分的配列、又はコー
ドする核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするそれらの核酸配列と相補性であるＤＮＡ断片に関
する。
【００１４】蛍光菌(DSM 50106)由来のアルコールデヒ
ドロゲナーゼ遺伝子は、次のコードする核酸配列（配列
番号２）：
ドロゲナーゼ遺伝子は、次のコードする核酸配列（配列
番号２）：
【００１５】
【表２】
【００１６】を含む。
【００１７】本発明の好ましい核酸は、配列番号２及び
５０％を上回り、好ましくは７５％を上回り、特に好ま
しくは９０％を上回り相同であるか又はその部分的配列
であり、好ましくは少なくとも１５０個のヌクレオチ
ド、特に好ましくは少なくとも３００個のヌクレオチド
からなるその対立遺伝子若しくは機能変異体、又はコー
ドする核酸配列番号２又はその対立遺伝子若しくは機能
変異体又は部分的配列とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするそれらの核酸配列と相補性であるＤＮ
Ａ断片を含む。このために、共通のハイブリダイゼーシ
ョン条件、例えば、６０℃、０．１ｘＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳを利用することが可能である。
５０％を上回り、好ましくは７５％を上回り、特に好ま
しくは９０％を上回り相同であるか又はその部分的配列
であり、好ましくは少なくとも１５０個のヌクレオチ
ド、特に好ましくは少なくとも３００個のヌクレオチド
からなるその対立遺伝子若しくは機能変異体、又はコー
ドする核酸配列番号２又はその対立遺伝子若しくは機能
変異体又は部分的配列とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするそれらの核酸配列と相補性であるＤＮ
Ａ断片を含む。このために、共通のハイブリダイゼーシ
ョン条件、例えば、６０℃、０．１ｘＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳを利用することが可能である。
【００１８】配列番号２からの情報は、例えば他のPseu
domonas種株におけるＰＣＲを用いて直接に対立遺伝子
の形を同定しかつクローニングするために、プライマー
類を生じさせるのに利用されうる。加えて、配列情報の
ために、更にａｄｈＦ１遺伝子の天然の機能変異体、ひ
いては相応するエンコードされた酵素変異体を見つけ出
すためのプローブを使用することも可能である。配列番
号２又は、それに対する対立遺伝子若しくは天然の機能
変異体から出発して、例えば、欠陥のあるＤＮＡポリメ
ラーゼを用いることにより、ＰＣＲを経て人工的に生じ
た機能的酵素変異体のバンクを得ることも可能である。
domonas種株におけるＰＣＲを用いて直接に対立遺伝子
の形を同定しかつクローニングするために、プライマー
類を生じさせるのに利用されうる。加えて、配列情報の
ために、更にａｄｈＦ１遺伝子の天然の機能変異体、ひ
いては相応するエンコードされた酵素変異体を見つけ出
すためのプローブを使用することも可能である。配列番
号２又は、それに対する対立遺伝子若しくは天然の機能
変異体から出発して、例えば、欠陥のあるＤＮＡポリメ
ラーゼを用いることにより、ＰＣＲを経て人工的に生じ
た機能的酵素変異体のバンクを得ることも可能である。
【００１９】コードするＤＮＡ配列は、常用のベクター
類中へクローニングされてよく、かつそのようなベクタ
ー類で宿主細胞をトランスフェクションした後に、細胞
培養中で発現されることができる。適した発現ベクター
類の例は、大腸菌用のｐＵＣ、ｐＧＥＸ又はｐＪＯＥで
あるが、しかし他の原核単細胞生物の発現ベクター類を
使用することも可能である。酵母に適していることが実
証されている発現ベクターの例は、ｐＲＥＰベクター及
びｐＩＮＴベクターである。昆虫細胞中での発現に適し
た例は、EP-B1-0127839又はEP-B1-0549721に開示されて
いるようなバキュロウイルスベクターであり、かつほ乳
動物細胞中での発現に適した例は、一般的に入手可能な
ＳＶ４０ベクターである。特にｐＧＥＸ、ｐＪＯＥ、ｐ
ＲＥＰ及びｐＩＮＴからなる群からの単細胞の原核生物
及び真核生物のための発現ベクター類が特に好ましい。
類中へクローニングされてよく、かつそのようなベクタ
ー類で宿主細胞をトランスフェクションした後に、細胞
培養中で発現されることができる。適した発現ベクター
類の例は、大腸菌用のｐＵＣ、ｐＧＥＸ又はｐＪＯＥで
あるが、しかし他の原核単細胞生物の発現ベクター類を
使用することも可能である。酵母に適していることが実
証されている発現ベクターの例は、ｐＲＥＰベクター及
びｐＩＮＴベクターである。昆虫細胞中での発現に適し
た例は、EP-B1-0127839又はEP-B1-0549721に開示されて
いるようなバキュロウイルスベクターであり、かつほ乳
動物細胞中での発現に適した例は、一般的に入手可能な
ＳＶ４０ベクターである。特にｐＧＥＸ、ｐＪＯＥ、ｐ
ＲＥＰ及びｐＩＮＴからなる群からの単細胞の原核生物
及び真核生物のための発現ベクター類が特に好ましい。
【００２０】通常のマーカー、例えばアンピシリン耐性
とは別に、ベクター類は、ＡＤＨ遺伝子及び／又はレポ
ーター遺伝子の発現を調節するため、特にリプレッショ
ンする又は誘導するための別の機能的ヌクレオチド配列
を含んでいてよい。好ましくは使用されるプロモーター
類は、誘導性プロモーター類、例えば、ｒｈａプロモー
ター又はｎｍｔ１プロモーター、又は強いプロモーター
類、例えばｌａｃ、ａｒａ、λ、ｐＬ、Ｔ７又はＴ３プ
ロモーターである。コードするＤＮＡ断片は、プロモー
ターで出発するベクター類中に転写可能でなければなら
ない。更に、証明されたプロモーターの例は、昆虫細胞
中の発現のためのバキュロウイルスpolyhedrinプロモー
ター(例えば、EP-B1-0127839参照)又は初期ＳＶ４０プ
ロモーター又は、例えばＭＭＴＶ(Mouse Mammary Tumor
Virus;Lee他(1981) Nature、214、228)のＬＴＲプロモ
ーター類である。
とは別に、ベクター類は、ＡＤＨ遺伝子及び／又はレポ
ーター遺伝子の発現を調節するため、特にリプレッショ
ンする又は誘導するための別の機能的ヌクレオチド配列
を含んでいてよい。好ましくは使用されるプロモーター
類は、誘導性プロモーター類、例えば、ｒｈａプロモー
ター又はｎｍｔ１プロモーター、又は強いプロモーター
類、例えばｌａｃ、ａｒａ、λ、ｐＬ、Ｔ７又はＴ３プ
ロモーターである。コードするＤＮＡ断片は、プロモー
ターで出発するベクター類中に転写可能でなければなら
ない。更に、証明されたプロモーターの例は、昆虫細胞
中の発現のためのバキュロウイルスpolyhedrinプロモー
ター(例えば、EP-B1-0127839参照)又は初期ＳＶ４０プ
ロモーター又は、例えばＭＭＴＶ(Mouse Mammary Tumor
Virus;Lee他(1981) Nature、214、228)のＬＴＲプロモ
ーター類である。
【００２１】本発明の発現ベクター類は、別の機能的配
列領域、例えば、複製開始点、オペレーター又は終止コ
ドンを含んでいてよい。
列領域、例えば、複製開始点、オペレーター又は終止コ
ドンを含んでいてよい。
【００２２】記載されたベクター類は、常用の方法、例
えば、ＰＥＧ／ＤＭＳＯ方法によるか又は電気穿孔法に
より、宿主細胞を形質転換するのに使用されてよい。
えば、ＰＥＧ／ＤＭＳＯ方法によるか又は電気穿孔法に
より、宿主細胞を形質転換するのに使用されてよい。
【００２３】結果として、本発明は更に、ちょうど記載
されたベクター系でトランスフェクションされる宿主細
胞又は宿主細胞培養を含む発現系に関する。好ましい宿
主は、単細胞の原核生物、特に大腸菌である。本発明の
真核ａｄｈ遺伝子を発現するために、例えば、真核生物
に典型的な翻訳後修飾をａｄｈ遺伝子産物に導入するた
めに、真核発現系を使用することも有利でありうる。特
に適した真核宿主細胞は酵母である。
されたベクター系でトランスフェクションされる宿主細
胞又は宿主細胞培養を含む発現系に関する。好ましい宿
主は、単細胞の原核生物、特に大腸菌である。本発明の
真核ａｄｈ遺伝子を発現するために、例えば、真核生物
に典型的な翻訳後修飾をａｄｈ遺伝子産物に導入するた
めに、真核発現系を使用することも有利でありうる。特
に適した真核宿主細胞は酵母である。
【００２４】好ましい発現系は、大腸菌中での発現に適
したベクター、例えば、ｐＪＯＥ２７７５ベクター中
に、配列番号２によるアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝
子又はその対立遺伝子若しくは機能変異体若しくは部分
的配列を含み、かつデヒドロゲナーゼ遺伝子は、転写可
能であるように、前記ベクター中へクローニングされな
ければならない。特に好ましい１実施態様において、導
入されたａｄｈ遺伝子は更に、ベクターにより供給され
るヒスチジンタグに固定される。転写がベクター中に存
在するラムノース−誘導性プロモーターの調節下にある
ようにして、導入されるａｄｈ遺伝子をｐＪＯＥ２７７
５ベクター中へクローニングすることが好ましい。
したベクター、例えば、ｐＪＯＥ２７７５ベクター中
に、配列番号２によるアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝
子又はその対立遺伝子若しくは機能変異体若しくは部分
的配列を含み、かつデヒドロゲナーゼ遺伝子は、転写可
能であるように、前記ベクター中へクローニングされな
ければならない。特に好ましい１実施態様において、導
入されたａｄｈ遺伝子は更に、ベクターにより供給され
るヒスチジンタグに固定される。転写がベクター中に存
在するラムノース−誘導性プロモーターの調節下にある
ようにして、導入されるａｄｈ遺伝子をｐＪＯＥ２７７
５ベクター中へクローニングすることが好ましい。
【００２５】発現系は、当業者に公知の標準のプロトコ
ルを用いて培養されることができる。転写調節及び使用
されるベクターに応じて、発現系中に導入される遺伝子
の発現は、例えば、ラムノースを添加しながら発現プラ
スミドとしてｐＪＯＥ２７７５を用いるような場合に、
構成性であってよいか又は調節されてよい。本発明のア
ルコールデヒドロゲナーゼの発現に続いて、例えばアフ
ィニティークロマトグラフィー又は遠心分離を用いてそ
の精製が行われる。こうして精製された酵素だけではな
く粗抽出物又は遠心分離の上澄み又は画分を、接触反応
を実施するのに直接に使用することも可能である。
ルを用いて培養されることができる。転写調節及び使用
されるベクターに応じて、発現系中に導入される遺伝子
の発現は、例えば、ラムノースを添加しながら発現プラ
スミドとしてｐＪＯＥ２７７５を用いるような場合に、
構成性であってよいか又は調節されてよい。本発明のア
ルコールデヒドロゲナーゼの発現に続いて、例えばアフ
ィニティークロマトグラフィー又は遠心分離を用いてそ
の精製が行われる。こうして精製された酵素だけではな
く粗抽出物又は遠心分離の上澄み又は画分を、接触反応
を実施するのに直接に使用することも可能である。
【００２６】意外なことに、本発明の発現可能なタンパ
ク質が酵素的アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する
ことが示された。本発明のアルコールデヒドロゲナーゼ
は、特に環式、芳香族、脂肪族のケトン類及びケト酸類
を、それぞれ相応する環式、芳香族、脂肪族のアルコー
ル類及びヒドロキシカルボン酸類に還元する。
ク質が酵素的アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する
ことが示された。本発明のアルコールデヒドロゲナーゼ
は、特に環式、芳香族、脂肪族のケトン類及びケト酸類
を、それぞれ相応する環式、芳香族、脂肪族のアルコー
ル類及びヒドロキシカルボン酸類に還元する。
【００２７】更に、特許の保護が請求されたアルコール
デヒドロゲナーゼは、それらの卓越した立体選択率によ
り区別される。従って、例えば、アセトフェノンは、事
実上専ら、９５％収量で、（Ｒ）−α−フェニルエタノ
ールに変換される（＞９９％ｅｅ、ＧＣ分析により測
定）（これに関して第１表も参照）。従って、更に本発
明は、アルコール類又はケトン類、好ましくは脂肪族、
脂肪族-環式又はアリール脂肪族のアルコール類又はケ
トン類の接触製造のための本発明のアルコールデヒドロ
ゲナーゼ類の使用に関する。
デヒドロゲナーゼは、それらの卓越した立体選択率によ
り区別される。従って、例えば、アセトフェノンは、事
実上専ら、９５％収量で、（Ｒ）−α−フェニルエタノ
ールに変換される（＞９９％ｅｅ、ＧＣ分析により測
定）（これに関して第１表も参照）。従って、更に本発
明は、アルコール類又はケトン類、好ましくは脂肪族、
脂肪族-環式又はアリール脂肪族のアルコール類又はケ
トン類の接触製造のための本発明のアルコールデヒドロ
ゲナーゼ類の使用に関する。
【００２８】本発明のアルコールデヒドロゲナーゼ類の
ために特に好ましい基質は、環式（Ｃ３〜Ｃ１０）−ア
ルカノン類、（Ｃ２〜Ｃ４０）−ケト酸類及びアセトフ
ェノン誘導体であり、その際芳香環が、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ
１２）−アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１２）−アルキルＯ、
Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＲ２、ＣＯＯＨからなる群から
の置換基を、好ましくは２、３及び／又は４位に有して
いてよく、その際置換基Ｒは、互いに独立してＨ、（Ｃ
１〜Ｃ１０）−アルキル又は（Ｃ３〜Ｃ１０）−アリー
ルである。
ために特に好ましい基質は、環式（Ｃ３〜Ｃ１０）−ア
ルカノン類、（Ｃ２〜Ｃ４０）−ケト酸類及びアセトフ
ェノン誘導体であり、その際芳香環が、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ
１２）−アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１２）−アルキルＯ、
Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＲ２、ＣＯＯＨからなる群から
の置換基を、好ましくは２、３及び／又は４位に有して
いてよく、その際置換基Ｒは、互いに独立してＨ、（Ｃ
１〜Ｃ１０）−アルキル又は（Ｃ３〜Ｃ１０）−アリー
ルである。
【００２９】更に本発明は、本発明のアルコールデヒド
ロゲナーゼを用いてケトンを酵素的変換しながらアルコ
ール類を製造する方法に関する。
ロゲナーゼを用いてケトンを酵素的変換しながらアルコ
ール類を製造する方法に関する。
【００３０】還元は、好ましくは−１０℃と４５℃の
間、特に好ましくは５℃と２５℃の間で行われる（これ
に関して図３参照）。ここで、ＡＤＨＦ１が１０〜２５
℃の温度で基質アセトフェノンで最も高い収量を達成す
ることは意外であるけれども、蛍光菌は、中温性生物で
ある。選択率は、温度範囲に亘り極めて高く、かつ基質
アセトフェノンについて最も高い選択率は、５℃〜１２
℃及び３７℃〜４２℃で達成される。本発明のアルコー
ルデヒドロゲナーゼ類を用いる環式又は芳香族のケトン
類の酵素的に触媒された還元のために好ましいｐＨは、
ｐＨ５．５とｐＨ１０の間、特に好ましくはｐＨ７とｐ
Ｈ９の間である（これに関して図４参照）。
間、特に好ましくは５℃と２５℃の間で行われる（これ
に関して図３参照）。ここで、ＡＤＨＦ１が１０〜２５
℃の温度で基質アセトフェノンで最も高い収量を達成す
ることは意外であるけれども、蛍光菌は、中温性生物で
ある。選択率は、温度範囲に亘り極めて高く、かつ基質
アセトフェノンについて最も高い選択率は、５℃〜１２
℃及び３７℃〜４２℃で達成される。本発明のアルコー
ルデヒドロゲナーゼ類を用いる環式又は芳香族のケトン
類の酵素的に触媒された還元のために好ましいｐＨは、
ｐＨ５．５とｐＨ１０の間、特に好ましくはｐＨ７とｐ
Ｈ９の間である（これに関して図４参照）。
【００３１】本発明のアルコールデヒドロゲナーゼを用
いて、ケトン類を相応するアルコール類に還元するのを
実施するために、還元工程を支持する補酵素、例えばＮ
ＡＤＰＨ又は好ましくはＮＡＤＨを反応混合物に添加す
ることが有利である。例えば、ＮＡＤＨを再循環させる
デヒドロゲナーゼの添加は、変換の間に遊離されるＮＡ
Ｄ＋を変換してＮＡＤＨへと戻すことも可能である。
いて、ケトン類を相応するアルコール類に還元するのを
実施するために、還元工程を支持する補酵素、例えばＮ
ＡＤＰＨ又は好ましくはＮＡＤＨを反応混合物に添加す
ることが有利である。例えば、ＮＡＤＨを再循環させる
デヒドロゲナーゼの添加は、変換の間に遊離されるＮＡ
Ｄ＋を変換してＮＡＤＨへと戻すことも可能である。
【００３２】使用されてもよい溶剤は、水及び有機溶剤
又はそれらの混合物であってよい。好ましい溶剤の例
は、水に加えて、アルコール類、例えばエタノール、又
はアセトンである。ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを再生する
ために、該工程でアセトンに酸化されるイソプロパノー
ルを反応混合物に添加することが有利である。２〜３５
％（ｖ／ｖ）、特に好ましくは１０〜２５％の出発イソ
プロパノール含量が好ましい。
又はそれらの混合物であってよい。好ましい溶剤の例
は、水に加えて、アルコール類、例えばエタノール、又
はアセトンである。ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを再生する
ために、該工程でアセトンに酸化されるイソプロパノー
ルを反応混合物に添加することが有利である。２〜３５
％（ｖ／ｖ）、特に好ましくは１０〜２５％の出発イソ
プロパノール含量が好ましい。
【００３３】
【実施例】蛍光菌(DSM 50106)由来のアルコールデヒド
ロゲナーゼのクローニング及び発現。
ロゲナーゼのクローニング及び発現。
【００３４】一般的な注釈：ＤＮＡプラスミド類での形
質転換のための宿主は、大腸菌JM109株(Yanish-Perron
他、Gene 33、103-119(1985))であり、かつλＲＥＳフ
ァージでの形質転換の為に使用される宿主は、大腸菌Ｈ
Ｂ１０１ Ｆ′ｌａｃ［Ｔｎ１７３９ｔｎｐＲ］株(Alte
nbuchner、J.、Gene 123、63-68 (1993))であった。こ
れらの株は、ＬＢ液体培地中又はＬＢ寒天プレート上で
３７℃で培養される。アンピシリン１００μｇ／ｍｌ又
はカナマイシン５０μｇ／ｍｌは、プラスミドを有する
宿主細胞を選択するために培地に添加される。ＤＮＡ配
列のクローニングに使用されるベクターは、プラスミド
ｐＩＣ２０Ｈ(Marsh他、Gene 32、481-485(1984))であ
り、かつ大腸菌ＪＭ１０９中のＡＤＨＦ１のラムノース
−誘導性発現のために使用されるベクターは、ｒｈａＢ
ＡＤプロモーターを含むプラスミドｐＪＯＥ２７７５で
ある(Stumpp他、BIOspectrum 6、33-36 (2000))。
質転換のための宿主は、大腸菌JM109株(Yanish-Perron
他、Gene 33、103-119(1985))であり、かつλＲＥＳフ
ァージでの形質転換の為に使用される宿主は、大腸菌Ｈ
Ｂ１０１ Ｆ′ｌａｃ［Ｔｎ１７３９ｔｎｐＲ］株(Alte
nbuchner、J.、Gene 123、63-68 (1993))であった。こ
れらの株は、ＬＢ液体培地中又はＬＢ寒天プレート上で
３７℃で培養される。アンピシリン１００μｇ／ｍｌ又
はカナマイシン５０μｇ／ｍｌは、プラスミドを有する
宿主細胞を選択するために培地に添加される。ＤＮＡ配
列のクローニングに使用されるベクターは、プラスミド
ｐＩＣ２０Ｈ(Marsh他、Gene 32、481-485(1984))であ
り、かつ大腸菌ＪＭ１０９中のＡＤＨＦ１のラムノース
−誘導性発現のために使用されるベクターは、ｒｈａＢ
ＡＤプロモーターを含むプラスミドｐＪＯＥ２７７５で
ある(Stumpp他、BIOspectrum 6、33-36 (2000))。
【００３５】ａｄｈＦ１遺伝子の発見、塩基配列決定及
びクローニング：λＲＥＳＩＩＩファージ中の蛍光菌(D
SM 50106)のゲノムライブラリーの構成及び大腸菌中の
エステラーゼ活性を示すｐＪＯＥ２９６７プラスミドの
単離は、Khalameyzer他;Appl. Environm. Microbiol. 6
5、477-482(1999)に記載されている。オープンリーディ
ングフレームＤＮＡ配列（シクロヘキサノン一酸素添加
酵素類と相同性を有するＯＲＦ１；図１）を補足するた
めに、１５０ｂｐにわたり重なっているＡｐａＩ断片は
クローニングされ、その際、エステラーゼ活性（ｅｓｔ
Ｆ１）を示したベクターｐＪＯＥ２９６７の３．２ｋＢ
ＭｕｎＩ／ＢａｍＨＩ断片から出発する。意外なこと
に、他のオープンリーディングフレーム（ＯＦＲ３；図
１）は、示されうるように、新規のアルコールデヒドロ
ゲナーゼのためにコードするＡｐａＩ制限断片に関して
見いだされた。図１は、蛍光菌(DSM 50106)のＯＲＦ３
を含む４３６０ｂｐ物理的地図を略示的に示す。
びクローニング：λＲＥＳＩＩＩファージ中の蛍光菌(D
SM 50106)のゲノムライブラリーの構成及び大腸菌中の
エステラーゼ活性を示すｐＪＯＥ２９６７プラスミドの
単離は、Khalameyzer他;Appl. Environm. Microbiol. 6
5、477-482(1999)に記載されている。オープンリーディ
ングフレームＤＮＡ配列（シクロヘキサノン一酸素添加
酵素類と相同性を有するＯＲＦ１；図１）を補足するた
めに、１５０ｂｐにわたり重なっているＡｐａＩ断片は
クローニングされ、その際、エステラーゼ活性（ｅｓｔ
Ｆ１）を示したベクターｐＪＯＥ２９６７の３．２ｋＢ
ＭｕｎＩ／ＢａｍＨＩ断片から出発する。意外なこと
に、他のオープンリーディングフレーム（ＯＦＲ３；図
１）は、示されうるように、新規のアルコールデヒドロ
ゲナーゼのためにコードするＡｐａＩ制限断片に関して
見いだされた。図１は、蛍光菌(DSM 50106)のＯＲＦ３
を含む４３６０ｂｐ物理的地図を略示的に示す。
【００３６】図１に示されている蛍光菌(DSM 50106)ゲ
ノム領域は、Sangerにより塩基配列決定され、その際、
２つの戦略を追跡した。最初に、ＮａｅＩ及びＭｓｃＩ
制限断片は、ｐＩＣ２０Ｈへとサブクローニングされ
た。更に、ｐＦＩＳ５プラスミド及びその欠失誘導体
は、Ｃｙ５-ラベルしたＭ１３普遍的及び逆（ＵＰ及び
ＲＰ）プライマー類及びALFexpress AutoRead sequenci
ng kit(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて塩基配列
決定された。プライマー歩行は、MWG Biotech、Ebersbe
rgからのオリゴヌクレオチド類及びＣｙ５-ｄＡＴＰ-ラ
ベルしたヌクレオチドを用い、ALFexpress AutoRead se
quencing kit(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて実
施された。反応生成物は、ALFexpress ＤＮＡシーケン
サー中５．５％ Hydrolink Long Rangerゲルマトリック
ス中で、５５℃及び８００Ｖで０．５ｘ ＴＢＥ緩衝液
中に１２時間に亘り分画される。ヌクレオチド配列は、
ＧＣＧプログラム(Devereux他、Nucleic Acid Res. 1
2、387-395、(1984)、version 8.01)を用いて測定され
た。配列番号２で表される核酸配列は、ａｄｈＦ１遺伝
子のために得られた。緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)
由来の推定の酸化還元酵素(Stover他、Nature 406、959
-964、(2000))；遺伝子銀行受入番号Ｈ８３４５２と６
０％相同でありかつPseudomonas paucimobilis由来のＣ
α-デヒドロゲナーゼと２９％相同である(Masai他、Bi
osci. Biotechnol. Biochem. 57、1655-1659(1993))Ｄ
ＮＡ配列は、データベース検索を介して見出された。
ノム領域は、Sangerにより塩基配列決定され、その際、
２つの戦略を追跡した。最初に、ＮａｅＩ及びＭｓｃＩ
制限断片は、ｐＩＣ２０Ｈへとサブクローニングされ
た。更に、ｐＦＩＳ５プラスミド及びその欠失誘導体
は、Ｃｙ５-ラベルしたＭ１３普遍的及び逆（ＵＰ及び
ＲＰ）プライマー類及びALFexpress AutoRead sequenci
ng kit(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて塩基配列
決定された。プライマー歩行は、MWG Biotech、Ebersbe
rgからのオリゴヌクレオチド類及びＣｙ５-ｄＡＴＰ-ラ
ベルしたヌクレオチドを用い、ALFexpress AutoRead se
quencing kit(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて実
施された。反応生成物は、ALFexpress ＤＮＡシーケン
サー中５．５％ Hydrolink Long Rangerゲルマトリック
ス中で、５５℃及び８００Ｖで０．５ｘ ＴＢＥ緩衝液
中に１２時間に亘り分画される。ヌクレオチド配列は、
ＧＣＧプログラム(Devereux他、Nucleic Acid Res. 1
2、387-395、(1984)、version 8.01)を用いて測定され
た。配列番号２で表される核酸配列は、ａｄｈＦ１遺伝
子のために得られた。緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)
由来の推定の酸化還元酵素(Stover他、Nature 406、959
-964、(2000))；遺伝子銀行受入番号Ｈ８３４５２と６
０％相同でありかつPseudomonas paucimobilis由来のＣ
α-デヒドロゲナーゼと２９％相同である(Masai他、Bi
osci. Biotechnol. Biochem. 57、1655-1659(1993))Ｄ
ＮＡ配列は、データベース検索を介して見出された。
【００３７】Sambrook他、Molecular cloning: a labor
atory manual、NY: Cold Spring Harbor(1989)に記載さ
れた標準方法は、制限分析及びクローニング実験に使用
された。プラスミドＤＮＡは、Kieser、T.、Plasmid 1
2、19-36 (1984)に類似して単離される。そのために使
用される制限酵素及びＤＮＡを修飾する酵素は、Boehri
nger Mannheimからのものであった。
atory manual、NY: Cold Spring Harbor(1989)に記載さ
れた標準方法は、制限分析及びクローニング実験に使用
された。プラスミドＤＮＡは、Kieser、T.、Plasmid 1
2、19-36 (1984)に類似して単離される。そのために使
用される制限酵素及びＤＮＡを修飾する酵素は、Boehri
nger Mannheimからのものであった。
【００３８】大腸菌は、Chung他、Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 86、2172-2175(1989)に従って形質変換され
る。
ci. USA 86、2172-2175(1989)に従って形質変換され
る。
【００３９】ＯＲＦ３によりエンコードされたＤＮＡ配
列（以下にａｄｈＦ１遺伝子と呼ぶ）を濃縮するため
に、ＰＣＲ増幅は、ａｄｈＦ１遺伝子を含むプラスミド
から出発して、かつ次のＰＣＲプライマー類：
列（以下にａｄｈＦ１遺伝子と呼ぶ）を濃縮するため
に、ＰＣＲ増幅は、ａｄｈＦ１遺伝子を含むプラスミド
から出発して、かつ次のＰＣＲプライマー類：
【００４０】
【表３】
【００４１】を用いて実施される。
【００４２】ＰＣＲ増幅は、プラスミドＤＮＡ １ｎ
ｇ、プライマー３０ｐｍｏｌ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ混
合物、１０％ ＤＭＳＯ、１ｘ 反応緩衝液（１００μ
ｌ）中のＰｗｏポリメラーゼ２．５単位の懸濁液中で実
施される。このために、ＤＮＡは、最初に１００℃で２
分間加熱され、ついでMinicycler(Biozym Diagnostics
GmbH)中で３０サイクルで９４℃で１分間の変性を含む
温度プログラム、プライマーの溶融温度を５℃下回る温
度でのプライマーの１．５分間のアニーリング、７２℃
での１．５分間の重合を用いて増幅される。
ｇ、プライマー３０ｐｍｏｌ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ混
合物、１０％ ＤＭＳＯ、１ｘ 反応緩衝液（１００μ
ｌ）中のＰｗｏポリメラーゼ２．５単位の懸濁液中で実
施される。このために、ＤＮＡは、最初に１００℃で２
分間加熱され、ついでMinicycler(Biozym Diagnostics
GmbH)中で３０サイクルで９４℃で１分間の変性を含む
温度プログラム、プライマーの溶融温度を５℃下回る温
度でのプライマーの１．５分間のアニーリング、７２℃
での１．５分間の重合を用いて増幅される。
【００４３】このようにして得られた増幅断片中へ、Ｎ
ｄｅｌ制限切断個所は、ＡＴＧ開始コドンの前に直接に
導入され、かつＢａｍＨＩ制限切断個所は、終止コドン
の前に直接に導入された。こうして修飾された増幅配列
のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ消化後、得られたＤＮＡ断片
は、同様にＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩを消化させたＬ-ラ
ムノース−誘導性発現ベクターｐＪＯＥ３０７５(Stump
p他、BIOspectrum 6、33-36(2000))中へクローニングさ
れる。この点について、ａｄｈＦ１遺伝子領域をエンコ
ードするＣ−終止末端は、ベクターに６個のヒスチジン
をエンコードするタグが固定される。引き続き、大腸菌
ＪＭ１０９株は、生じるプラスミドｐＪＯＥ４０１６で
形質変換され、かつＯＤ６００＝０．５〜０．６での早
期指数相に達するまでアンピシリン１００μｇ／ｍｌを
含む５００ｍｌ ＬＢ培地中で３７℃で培養される。
ｄｅｌ制限切断個所は、ＡＴＧ開始コドンの前に直接に
導入され、かつＢａｍＨＩ制限切断個所は、終止コドン
の前に直接に導入された。こうして修飾された増幅配列
のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ消化後、得られたＤＮＡ断片
は、同様にＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩを消化させたＬ-ラ
ムノース−誘導性発現ベクターｐＪＯＥ３０７５(Stump
p他、BIOspectrum 6、33-36(2000))中へクローニングさ
れる。この点について、ａｄｈＦ１遺伝子領域をエンコ
ードするＣ−終止末端は、ベクターに６個のヒスチジン
をエンコードするタグが固定される。引き続き、大腸菌
ＪＭ１０９株は、生じるプラスミドｐＪＯＥ４０１６で
形質変換され、かつＯＤ６００＝０．５〜０．６での早
期指数相に達するまでアンピシリン１００μｇ／ｍｌを
含む５００ｍｌ ＬＢ培地中で３７℃で培養される。
【００４４】ＡＤＨＦ１の発現：ＡＤＨＦ１発現は、
０．２％（最終濃度）ラムノースを培地に添加されるこ
とにより誘導され、かつ細胞培養は、約３７℃で５時間
培養される。得られた細胞は、遠心分離され（Heraeus
Labfuge 400R、４０００ｘｇ、１０分、４℃）、かつリ
ン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５、４℃）
で２回洗浄される。このようにして精製された細胞は、
氷上での１２分間の超音波処理（５０％エネルギーで５
０％パルス、Bandelin HD 2070、MS73、Berlin、German
y）で分断される。細胞成分は、遠心分離により除去さ
れ、かつ上澄みは、還元反応を実施されるために直接に
利用されるか又は凍結乾燥され、かつ4℃で貯蔵され
る。タンパク質含量は、タンパク質標準としてウシ血清
アルブミンを有するbicinchoninic acidキット(Pierc
e、Rockford、IL、USA)を用いて測定される。凍結乾燥
された抽出物４５０μｇタンパク質／ｍｇは、上澄み中
に検出される。
０．２％（最終濃度）ラムノースを培地に添加されるこ
とにより誘導され、かつ細胞培養は、約３７℃で５時間
培養される。得られた細胞は、遠心分離され（Heraeus
Labfuge 400R、４０００ｘｇ、１０分、４℃）、かつリ
ン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５、４℃）
で２回洗浄される。このようにして精製された細胞は、
氷上での１２分間の超音波処理（５０％エネルギーで５
０％パルス、Bandelin HD 2070、MS73、Berlin、German
y）で分断される。細胞成分は、遠心分離により除去さ
れ、かつ上澄みは、還元反応を実施されるために直接に
利用されるか又は凍結乾燥され、かつ4℃で貯蔵され
る。タンパク質含量は、タンパク質標準としてウシ血清
アルブミンを有するbicinchoninic acidキット(Pierc
e、Rockford、IL、USA)を用いて測定される。凍結乾燥
された抽出物４５０μｇタンパク質／ｍｇは、上澄み中
に検出される。
【００４５】ＡＤＨＦ１発現は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析
（図２ａ、レーン１〜３）を用いて及びＮｉ−ＮＴＡ−
ＡＰ接合アッセイ（図２ａ、レーン４〜６）を用いてチ
ェックされた。詳細には、図２ａは、次のように示され
る：レーン１：標準(Sigma)、レーン２及び４：ＡＤＨ
Ｆ１粗抽出物１０μｇ、レーン３及び５：ＡＤＨＦ１粗
抽出物５μｇ、レーン６：Sigmaマーカー（炭酸脱水酵
素、２９ｋＤａ、これはＮｉ-ＮＴＡ接合体と反応す
る）。図２ｂは、組換型ＡＤＨＦ１（２９６ ａａ、３
１．９９７ｋＤａ）の生産のための他のＳＤＳ-ＰＡＧ
Ｅ発現分析の結果を示し；レーンＭは、低分子量用のマ
ーカー、Sigmaを示し、レーン１、２及び３はそれぞれ
発現を誘導する前、誘導１時間後及び培養完了後の分画
された細胞培養画分を示し、レーン４、５及び６は、濃
縮された上澄み、１回洗浄された上澄み及び２回洗浄さ
れた上澄み（遠心分離）を示し、レーン７及び８は、そ
れぞれ細胞ペレット画分を示す。ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル
中のタンパク質は、クーマシーブリリアントブルーで直
接に染色されるか又はゲル−電気泳動的に、半乾式ブロ
ッティング系(Panther、半乾式エレクトロブロッター、
Model HEP-1、Peqlab、Erlangen)を用いて１ｍＡ／ｃｍ
２で１ｈに亘りニトロセルロース膜上にブロッティング
された。ヒスチジン−ラベルしたタンパク質は、製造業
者の使用説明書に従って、ニトロセルロース上で検出さ
れる(QIApress検出系、Ｎｉ−ＮＴＡアルカリ性ホスフ
ェート接合体、Qiagen、Hilden)。炭酸脱水酵素（２９
ｋＤａ）は、Ｎｉ-ＮＴＡ接合体-結合質量標準（レーン
３、図２ａ）として使用される。
（図２ａ、レーン１〜３）を用いて及びＮｉ−ＮＴＡ−
ＡＰ接合アッセイ（図２ａ、レーン４〜６）を用いてチ
ェックされた。詳細には、図２ａは、次のように示され
る：レーン１：標準(Sigma)、レーン２及び４：ＡＤＨ
Ｆ１粗抽出物１０μｇ、レーン３及び５：ＡＤＨＦ１粗
抽出物５μｇ、レーン６：Sigmaマーカー（炭酸脱水酵
素、２９ｋＤａ、これはＮｉ-ＮＴＡ接合体と反応す
る）。図２ｂは、組換型ＡＤＨＦ１（２９６ ａａ、３
１．９９７ｋＤａ）の生産のための他のＳＤＳ-ＰＡＧ
Ｅ発現分析の結果を示し；レーンＭは、低分子量用のマ
ーカー、Sigmaを示し、レーン１、２及び３はそれぞれ
発現を誘導する前、誘導１時間後及び培養完了後の分画
された細胞培養画分を示し、レーン４、５及び６は、濃
縮された上澄み、１回洗浄された上澄み及び２回洗浄さ
れた上澄み（遠心分離）を示し、レーン７及び８は、そ
れぞれ細胞ペレット画分を示す。ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル
中のタンパク質は、クーマシーブリリアントブルーで直
接に染色されるか又はゲル−電気泳動的に、半乾式ブロ
ッティング系(Panther、半乾式エレクトロブロッター、
Model HEP-1、Peqlab、Erlangen)を用いて１ｍＡ／ｃｍ
２で１ｈに亘りニトロセルロース膜上にブロッティング
された。ヒスチジン−ラベルしたタンパク質は、製造業
者の使用説明書に従って、ニトロセルロース上で検出さ
れる(QIApress検出系、Ｎｉ−ＮＴＡアルカリ性ホスフ
ェート接合体、Qiagen、Hilden)。炭酸脱水酵素（２９
ｋＤａ）は、Ｎｉ-ＮＴＡ接合体-結合質量標準（レーン
３、図２ａ）として使用される。
【００４６】ケトン類の還元のための発現されたアルコ
ールデヒドロゲナーゼの使用：凍結乾燥したアルコール
デヒドロゲナーゼの活性は、モデル基質としてアセトフ
ェノンを用いて測定される。標準化された反応混合物
（２５０μｌ）は、イソプロパノール中に溶解した基質
６．４μｍｏｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．
０）及び２０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール中の酵素
（粗抽出物）１．２５ｍｇを基質としてＮＡＤＨを再循
環させるデヒドロゲナーゼのために含有する。反応は、
他に明示して述べられていない限り、室温で実施され
る。全ての値は３回測定された。反応が完了した後に、
反応混合物は、クロロホルムの２倍量で抽出され、つい
で有機相は、硫酸ナトリウム上で乾燥される。反応生成
物は、キラルカラム（ヘプタキス（２，６−Ｏ−メチル
−３−Ｏ−ペンチル）−β−シクロデキストリン、25mx
0.25mm ID、Macherey & Nagel、Dueren)を用いて、１２
０℃でＧＣ測定により等温的に分析された(Shimadzu GC
14A、Tokyo、水素炎イオン化検出器、積分器C5RA)。保
持時間は、アセトフェノンでは１．５５分、（Ｒ）−α
−フェニルエタノールでは２．７７分及び（Ｓ）−α−
フェニルエタノールでは２．９９分である。絶対配置
は、商用の標準を用いることにより測定された。更にＧ
Ｃ分析は、５℃／分の速度で９０℃から１２０℃に上昇
する温度で実施された。ここで保持時間は、シクロペン
タノンでは０．９５分、シクロペンタノールでは１．３
７分、シクロヘプタノンでは２．８５分、シクロヘプタ
ノールでは４．２９分、シクロヘキサノンでは１．４２
分及びシクロヘキサノールでは２．１２分であった。
ールデヒドロゲナーゼの使用：凍結乾燥したアルコール
デヒドロゲナーゼの活性は、モデル基質としてアセトフ
ェノンを用いて測定される。標準化された反応混合物
（２５０μｌ）は、イソプロパノール中に溶解した基質
６．４μｍｏｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．
０）及び２０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール中の酵素
（粗抽出物）１．２５ｍｇを基質としてＮＡＤＨを再循
環させるデヒドロゲナーゼのために含有する。反応は、
他に明示して述べられていない限り、室温で実施され
る。全ての値は３回測定された。反応が完了した後に、
反応混合物は、クロロホルムの２倍量で抽出され、つい
で有機相は、硫酸ナトリウム上で乾燥される。反応生成
物は、キラルカラム（ヘプタキス（２，６−Ｏ−メチル
−３−Ｏ−ペンチル）−β−シクロデキストリン、25mx
0.25mm ID、Macherey & Nagel、Dueren)を用いて、１２
０℃でＧＣ測定により等温的に分析された(Shimadzu GC
14A、Tokyo、水素炎イオン化検出器、積分器C5RA)。保
持時間は、アセトフェノンでは１．５５分、（Ｒ）−α
−フェニルエタノールでは２．７７分及び（Ｓ）−α−
フェニルエタノールでは２．９９分である。絶対配置
は、商用の標準を用いることにより測定された。更にＧ
Ｃ分析は、５℃／分の速度で９０℃から１２０℃に上昇
する温度で実施された。ここで保持時間は、シクロペン
タノンでは０．９５分、シクロペンタノールでは１．３
７分、シクロヘプタノンでは２．８５分、シクロヘプタ
ノールでは４．２９分、シクロヘキサノンでは１．４２
分及びシクロヘキサノールでは２．１２分であった。
【００４７】変換の結果は、第１表に挙げられている。
【００４８】第１表：
【００４９】
【表４】
【００５０】コントロールとして、組換型ＡＤＨ遺伝子
を含まない大腸菌株の粗抽出物が同様に試験された。こ
れらの抽出物は、相応する酵素活性を示さない。
を含まない大腸菌株の粗抽出物が同様に試験された。こ
れらの抽出物は、相応する酵素活性を示さない。
【００５１】第２表は、上記のプロトコルに従って変換
される別の反応混合物の結果を示す（これに関してダイ
アグラム１も参照）：
される別の反応混合物の結果を示す（これに関してダイ
アグラム１も参照）：
【００５２】
【表５】
【００５３】１２０℃（２分）から出発し、引き続き１
０℃／分だけ１５０℃まで加熱する温度プログラムに
は、次の保持時間が得られる：２−メトキシアセトフェ
ノン３、３．６８分、２-メトキシ−α−（Ｒ）−フェ
ニルエタノール４．９０分、３−メトキシアセトフェノ
ン４、３．９８分、（Ｒ）−３−メトキシ−α−フェニ
ルエタノール４ａ、５．６１分、（Ｓ）−４ａ、５．８
６分；４−フルオロアセトフェノン６、１．５８分、
（Ｒ）−フルオロ−α−フェニルエタノール６ａ、３．
０３分、（Ｓ）−６ａ、３．２８分。
０℃／分だけ１５０℃まで加熱する温度プログラムに
は、次の保持時間が得られる：２−メトキシアセトフェ
ノン３、３．６８分、２-メトキシ−α−（Ｒ）−フェ
ニルエタノール４．９０分、３−メトキシアセトフェノ
ン４、３．９８分、（Ｒ）−３−メトキシ−α−フェニ
ルエタノール４ａ、５．６１分、（Ｓ）−４ａ、５．８
６分；４−フルオロアセトフェノン６、１．５８分、
（Ｒ）−フルオロ−α−フェニルエタノール６ａ、３．
０３分、（Ｓ）−６ａ、３．２８分。
【００５４】９０℃（１分）から出発し、引き続き５℃
／分だけ１２０℃まで加熱する温度プログラムには、次
の保持時間が得られる：４−クロロアセトフェノン７、
３．６２分、（Ｒ）−４−クロロ−α−フェニルエタノ
ール７ａ、５．５２分、（Ｓ）−７ａ、５．９０分；４
−メチルアセトフェノン２、２．６３分、（Ｒ）−４−
メチル−α−フェニルエタノール２ａ、３．４０分、
（Ｓ）−２ａ、３．７６分；４-メトキシアセトフェノ
ン５、４．９４分、（Ｒ）−４−メトキシ−α−フェニ
ルエタノール５ａ、５．５２分、（Ｓ）−５ａ、５．７
４分。７０℃での等温ＧＣ分析は、次の保持時間を生じ
る：メチル３−オキソブチラート８、２．２０分、メチ
ル（Ｒ）−３−ヒドロキシブチラート８ａ、３．８４
分、（Ｓ）−８ａ、３．９９分。
／分だけ１２０℃まで加熱する温度プログラムには、次
の保持時間が得られる：４−クロロアセトフェノン７、
３．６２分、（Ｒ）−４−クロロ−α−フェニルエタノ
ール７ａ、５．５２分、（Ｓ）−７ａ、５．９０分；４
−メチルアセトフェノン２、２．６３分、（Ｒ）−４−
メチル−α−フェニルエタノール２ａ、３．４０分、
（Ｓ）−２ａ、３．７６分；４-メトキシアセトフェノ
ン５、４．９４分、（Ｒ）−４−メトキシ−α−フェニ
ルエタノール５ａ、５．５２分、（Ｓ）−５ａ、５．７
４分。７０℃での等温ＧＣ分析は、次の保持時間を生じ
る：メチル３−オキソブチラート８、２．２０分、メチ
ル（Ｒ）−３−ヒドロキシブチラート８ａ、３．８４
分、（Ｓ）−８ａ、３．９９分。
【００５５】１ａ及び８ａの絶対配置は、商用の（Ｒ）
アルコール類を経て確かめられ、かつアセトフェノン類
似体の溶離が、α−フェニルエタノールのそれと同じ順
序（Ｓの前にＲ）であると思われる。
アルコール類を経て確かめられ、かつアセトフェノン類
似体の溶離が、α−フェニルエタノールのそれと同じ順
序（Ｓの前にＲ）であると思われる。
【００５６】ＡＤＨＦ１活性に関する溶剤効果の測定：
このために、イソプロパノール、アセトン又はエタノー
ルは、反応混合物に１０％（ｖ／ｖ）の最終濃度で添加
された。付加的に、アセトン反応混合物のイソプロパノ
ール割合は、変化された。使用された基質は、アセトフ
ェノンであった。測定は、２０℃で実施され、かつ他の
反応条件は、上記のプロトコルから採用された。結果
は、図５にグラフで示される。
このために、イソプロパノール、アセトン又はエタノー
ルは、反応混合物に１０％（ｖ／ｖ）の最終濃度で添加
された。付加的に、アセトン反応混合物のイソプロパノ
ール割合は、変化された。使用された基質は、アセトフ
ェノンであった。測定は、２０℃で実施され、かつ他の
反応条件は、上記のプロトコルから採用された。結果
は、図５にグラフで示される。
【図１】本発明のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＯＲＦ
３）のコードする領域を含む、蛍光菌(DSM 50106)ゲノ
ムの部分領域の物理的地図の略示図。
３）のコードする領域を含む、蛍光菌(DSM 50106)ゲノ
ムの部分領域の物理的地図の略示図。
【図２ａ】蛍光菌(DSM 50106)由来の本発明のアルコー
ルデヒドロゲナーゼの成功した発現を検出するためのＳ
ＤＳ-ＰＡＧＥ分析（レーン１〜３）及びＮｉ-ＮＴＡ-
ＡＰ接合分析（レーン４〜６）を示す電気泳動写真。
ルデヒドロゲナーゼの成功した発現を検出するためのＳ
ＤＳ-ＰＡＧＥ分析（レーン１〜３）及びＮｉ-ＮＴＡ-
ＡＰ接合分析（レーン４〜６）を示す電気泳動写真。
【図２ｂ】組換型ＡＤＨＦ１（２９６ ａａ、３１．９
９７ｋＤａ）の生産のためのＳＤＳ-ＰＡＧＥ発現分析
を示し、その際レーンＭは、低分子量用マーカー、Sigm
aを示し、レーン１は発現を誘導する前の分画された細
胞培養画分を示し、レーン２は発現を誘導した１時間後
のそのような画分を示し、かつレーン３は、培養が完了
した後の相応する画分を示し、レーン４は、濃縮された
上澄み（遠心分離）を示し、レーン５は、１回洗浄した
上澄みを示し、レーン６は２回洗浄した上澄みを示し、
レーン７及び８は、細胞ペレット画分を示す電気泳動写
真。
９７ｋＤａ）の生産のためのＳＤＳ-ＰＡＧＥ発現分析
を示し、その際レーンＭは、低分子量用マーカー、Sigm
aを示し、レーン１は発現を誘導する前の分画された細
胞培養画分を示し、レーン２は発現を誘導した１時間後
のそのような画分を示し、かつレーン３は、培養が完了
した後の相応する画分を示し、レーン４は、濃縮された
上澄み（遠心分離）を示し、レーン５は、１回洗浄した
上澄みを示し、レーン６は２回洗浄した上澄みを示し、
レーン７及び８は、細胞ペレット画分を示す電気泳動写
真。
【図３】ａ）アセトフェノン（▲）及びシクロヘキサノ
ン（■）の収量について及びｂ）アセトフェノンの収量
（▲）及び選択率（■）について選択された基質をベー
スとするＡＤＨＦ１活性への温度効果を示すグラフ。
ン（■）の収量について及びｂ）アセトフェノンの収量
（▲）及び選択率（■）について選択された基質をベー
スとするＡＤＨＦ１活性への温度効果を示すグラフ。
【図４】基質アセトフェノンをベースとするＡＤＨＦ１
の酵素活性へのｐＨ効果を示すグラフ。
の酵素活性へのｐＨ効果を示すグラフ。
【図５】イソプロパノール濃度の関数として、基質アセ
トフェノンが（Ｒ）−α−フェニルエタノールに還元す
るのをベースとするＡＤＨＦ１活性への溶剤効果を示す
グラフ（図５ａ：収量：斜線、鏡像異性体過剰率：白
色；図５ｂ：収量（▲）及び選択率（■））。
トフェノンが（Ｒ）−α−フェニルエタノールに還元す
るのをベースとするＡＤＨＦ１活性への溶剤効果を示す
グラフ（図５ａ：収量：斜線、鏡像異性体過剰率：白
色；図５ｂ：収量（▲）及び選択率（■））。
【外１】
【外２】
【外３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:39） (72)発明者 ヨーゼフ アルテンブーフナー ドイツ連邦共和国 ヌフリンゲン ヒンデ ンブルクシュトラーセ ６ (72)発明者 ペトラ ヒルデブラント ドイツ連邦共和国 ヴァイテンハーゲン アム シェパーホフ ８ Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA08 CA04 DA06 DA12 EA04 GA11 HA03 4B050 CC01 CC03 DD02 LL05 4B064 AC01 CA21 CB18 CC06 CC07 CD06 CD12 DA16 4B065 AA26X AA43Y AA72X AB01 AC14 BA01 CA28 CA60
Claims (22)
- 【請求項１】 配列番号１で表されるアミノ酸配列を有
している蛍光菌(Pseudomonas fluorescens)(DSM 50106)
由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＦ１）、又
はその対立遺伝子若しくは機能変異体又はその機能的な
部分的配列。 - 【請求項２】 配列番号１と６０％を上回り相同である
アミノ酸配列を含む、請求項１記載のアルコールデヒド
ロゲナーゼ。 - 【請求項３】 配列番号１と８０％を上回り相同である
アミノ酸配列を含む、請求項１記載のアルコールデヒド
ロゲナーゼ。 - 【請求項４】 少なくとも５０個のアミノ酸からなり、
配列番号１又はその対立遺伝子若しくは機能変異体から
の部分的配列を含んでいる、請求項１記載のアルコール
デヒドロゲナーゼ。 - 【請求項５】 １００個までのアミノ酸の欠失を有して
おり、配列番号１又はその対立遺伝子若しくは機能変異
体からの部分的配列を含んでいる、請求項１記載のアル
コールデヒドロゲナーゼ。 - 【請求項６】 配列番号２で表されるコードする核酸配
列及び５０％を上回り相同であるその対立遺伝子若しく
は機能変異体又はその部分的配列を有している蛍光菌(D
SM 50106)由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子。 - 【請求項７】 配列番号２と７５％を上回り相同である
核酸配列を含む、請求項６記載のアルコールデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子。 - 【請求項８】 少なくとも１５０個のヌクレオチドを有
する配列番号２の部分的配列を含む、請求項６又は７記
載のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子。 - 【請求項９】 配列番号２で表されるコードする核酸又
はその対立遺伝子若しくは機能変異体若しくは部分的配
列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするそ
れらの核酸配列と相補性である核酸配列を含む、請求項
６から８までのいずれか１項記載のアルコールデヒドロ
ゲナーゼ遺伝子。 - 【請求項１０】 請求項６から９までのいずれか１項記
載の核酸配列を含むベクター。 - 【請求項１１】 宿主細胞及び請求項１０記載の少なく
とも１つのベクターを含む発現系。 - 【請求項１２】 宿主生物が酵母又は原核生物である発
現系。 - 【請求項１３】 ケトン類を相応するアルコール類に酵
素的に還元するための、請求項１から５までのいずれか
１項記載のアルコールデヒドロゲナーゼ類の使用。 - 【請求項１４】 ケトン類からアルコール類を還元的に
製造する方法において、ケトンを、請求項１から５まで
のいずれか１項記載のアルコールデヒドロゲナーゼを用
いて変換することを特徴とする、ケトン類からのアルコ
ール類の還元的製造方法。 - 【請求項１５】 変換を-１０℃と４５℃の間で実施す
る、請求項１４記載の方法。 - 【請求項１６】 変換をｐＨ５．５と１０の間で実施す
る、請求項１４又は１５記載の方法。 - 【請求項１７】 更に助剤物質を反応混合物に添加す
る、請求項１４から１６までのいずれか１項記載の方
法。 - 【請求項１８】 添加した助剤物質がＮＡＤＨ及び／又
はＮＡＤＰＨである、請求項１７記載の方法。 - 【請求項１９】 ＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨを再循
環するデヒドロゲナーゼを反応混合物に添加する、請求
項１８記載の方法。 - 【請求項２０】 ２％と３５％（ｖ／ｖ）の間のイソプ
ロパノールを、反応混合物に添加する、請求項１９記載
の方法。 - 【請求項２１】 使用される基質が、脂肪族、環式、芳
香族、芳香−脂肪族のケトン又はケト酸である、請求項
１４から２０までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項２２】 使用される基質が、環式（Ｃ３〜Ｃ
１０）−アルカノン、（Ｃ２〜Ｃ４０）−ケト酸及びア
セトフェノン誘導体であり、その際、芳香環が、Ｈ、
（Ｃ１〜Ｃ１２）−アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１２）−アル
キルＯ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＯＯＨ、ＮＲ２からな
る群からの置換基を有し、その際置換基Ｒが、互いに独
立してＨ、（Ｃ１〜Ｃ１０）−アルキル又は（Ｃ３〜Ｃ
１０）−アリールであってよい、請求項１４から２１ま
でのいずれか１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10112401.5 | 2001-03-13 | ||
| DE10112401A DE10112401A1 (de) | 2001-03-13 | 2001-03-13 | Alkohol-Dehydrogenase und deren Verwendung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002306189A true JP2002306189A (ja) | 2002-10-22 |
Family
ID=7677523
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002068878A Abandoned JP2002306189A (ja) | 2001-03-13 | 2002-03-13 | アルコールデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、ベクター、発現系、該アルコールデヒドロゲナーゼの使用並びにアルコールの還元的製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20030171544A1 (ja) |
| EP (1) | EP1241263A1 (ja) |
| JP (1) | JP2002306189A (ja) |
| DE (1) | DE10112401A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5959087A (en) * | 1989-08-07 | 1999-09-28 | Peptide Technology, Ltd. | Tumour necrosis factor binding ligands |
| US20080090274A1 (en) * | 2004-12-16 | 2008-04-17 | Moore Jeffrey C | Process For The Synthesis Of (S)-1-(3,5-Bis (Trifluoromethyl)-Phenyl-Ethan-1-Ol |
| CN101437949B (zh) * | 2006-05-09 | 2012-08-22 | 三井化学株式会社 | 利用辅酶再生进行的羟基羧酸类的生产方法 |
| AU2007293373A1 (en) * | 2006-09-01 | 2008-03-13 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Inhibitors of 5 -lipoxygenase activating protein (FLAP) |
| MX2012007583A (es) | 2009-12-29 | 2012-07-30 | Butamax Tm Advanced Biofuels | Alcohol deshidrogenasas (adh) utiles para la produccion fermentativa de alcoholes alquilicos de cadena corta. |
| AU2018360502B2 (en) * | 2017-11-01 | 2024-05-02 | Melinta Therapeutics, Inc. | Synthesis of boronate ester derivatives and uses thereof |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4209022B4 (de) * | 1992-03-20 | 2006-01-19 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur enzymatischen Herstellung von sekundären (S)-Alkoholen |
-
2001
- 2001-03-13 DE DE10112401A patent/DE10112401A1/de not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-02-18 EP EP02003634A patent/EP1241263A1/de not_active Withdrawn
- 2002-03-13 US US10/096,494 patent/US20030171544A1/en not_active Abandoned
- 2002-03-13 JP JP2002068878A patent/JP2002306189A/ja not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE10112401A1 (de) | 2002-09-19 |
| EP1241263A1 (de) | 2002-09-18 |
| US20030171544A1 (en) | 2003-09-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7575909B2 (en) | Oxidoreductase from pichia capsulata | |
| JP4630486B2 (ja) | 新規な（ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素、その製造方法、及びこれを利用した光学活性アルコールの製造方法 | |
| JPH1028590A (ja) | アルコールデヒドロゲナーゼ及びキラルヒドロキシ化合物の酵素的生産へのその使用 | |
| JP4791664B2 (ja) | 新規のシトクロムｐ４５０モノオキシゲナーゼ及び有機化合物の酸化のためのその使用 | |
| JP2009502148A (ja) | ケト化合物の立体選択的還元に用いる酸化還元酵素 | |
| KR20070050461A (ko) | 신규 카르보닐 환원 효소, 그의 유전자 및 그의 이용 방법 | |
| JP4213524B2 (ja) | 新規なカルボニル還元酵素、その酵素をコードするｄｎａを含むポリヌクレオチド、その製造方法、およびこれを利用した光学活性アルコールの製造方法 | |
| US20210371829A1 (en) | Engineered ketoreductase polypeptides and uses thereof | |
| US20040157305A1 (en) | Alcohol dehydrogenases with increased solvent and temperature stability | |
| JP2002306189A (ja) | アルコールデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、ベクター、発現系、該アルコールデヒドロゲナーゼの使用並びにアルコールの還元的製造方法 | |
| JP2004357639A (ja) | （２ｓ，３ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素 | |
| JP4414337B2 (ja) | 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法 | |
| JPWO2007094178A1 (ja) | 新規な（ｓ，ｓ）−ブタンジオール脱水素酵素、その遺伝子、及びその利用法 | |
| JP4426437B2 (ja) | 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法 | |
| JP4668176B2 (ja) | トリテルペン水酸化酵素 | |
| JP2003033185A (ja) | エノン還元酵素 | |
| JP2004215666A (ja) | オキシドレダクターゼ | |
| JP4688313B2 (ja) | 新規なエノン還元酵素、その製造方法、およびこれを利用したα，β−不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合を選択的に還元する方法 | |
| JP5103616B2 (ja) | （ｒ）−２−クロロマンデル酸メチルエステルの製造方法 | |
| JP4396972B2 (ja) | 新規ｒ体特異的アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子、及び、これを利用した光学活性アルコールの製造方法 | |
| JP2008212144A (ja) | アルコール脱水素酵素、これをコードする遺伝子、およびそれを用いた光学活性（ｒ）−３−キヌクリジノールの製造方法 | |
| JPWO2005123921A1 (ja) | 新規グリセロール脱水素酵素、その遺伝子、及びその利用法 | |
| JP5030067B2 (ja) | 新規アルカンポリオール脱水素酵素 | |
| EP1543125B1 (en) | Enone reductase gene and microbial production of levodione | |
| KR20040086425A (ko) | 레보다이온의 제조방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050120 |
|
| A762 | Written abandonment of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A762 Effective date: 20050711 |