JP2002302444A - 乾燥による皮膚傷害の抑制剤もしくは修復剤 - Google Patents
乾燥による皮膚傷害の抑制剤もしくは修復剤Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 乾燥により皮膚傷害を抑制しうる調製剤の提
供。 【解決手段】 気相暴露による培養ヒトケラチノサイト
におけるフィラグリン遺伝子の発現の低下を防止しうる
エクトインを有効成分とする調製剤。
供。 【解決手段】 気相暴露による培養ヒトケラチノサイト
におけるフィラグリン遺伝子の発現の低下を防止しうる
エクトインを有効成分とする調製剤。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、化粧料および皮膚
科用調製剤に関し、より具体的には乾燥による皮膚傷害
の抑制もしくは修復のための化粧料および調製剤に関す
る。
科用調製剤に関し、より具体的には乾燥による皮膚傷害
の抑制もしくは修復のための化粧料および調製剤に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】角層水分量の保持に天然保湿因子（ＮＭ
Ｆ）が重要な働きをしている（BlankI.H. J.I．Dermato
l., １８, ４３３（１９５２）, Blank I.H. J.I．Derm
atol., ２１, ２５９（１９５３））。ＮＭＦの主成分
であるアミノ酸は、ケラトヒアリン顆粒に由来するフィ
ラグリンタンパクの分解によって産生されることが報告
されている（Scott I.R. et al. Biochem Biophys. Act
a., ７１９, １１０−１１７（１９８２）, Horii I. e
t al., J. Dermatol., １０, ２５−３３（１９８
３））。フィラグリンは３１７個のアミノ酸からなるタ
ンパク質である。ＮＭＦの主成分であるアミノ酸がフィ
ラグリンに由来することが明らかになって以来、乾燥肌
を呈する病態とフィラグリンの関連性についての研究が
進められている。近年、老人性乾皮症、アトピー性疾患
などの乾燥肌において角層中のアミノ酸が減少している
こと（Horii I. et al., Br. J. Dermatol., １２１,５
８7−５９２（１９８９）, Tanaka M. et al., Br.
J. Dermatol., １３９，６１８−６２１（１９９
８））、およびフィラグリンの発現が減少していること
（TezukaT. et al., Dermatology, １８８, ２１−２４
（１９９４）, Seguchi T, et al., Arch. Dermatol. R
es. ２８８，４４２−４４６,（１９９６））が明らか
になってきている。また、乾燥環境によって肌荒れ等の
皮膚トラブルを生じることは良く知られている。
Ｆ）が重要な働きをしている（BlankI.H. J.I．Dermato
l., １８, ４３３（１９５２）, Blank I.H. J.I．Derm
atol., ２１, ２５９（１９５３））。ＮＭＦの主成分
であるアミノ酸は、ケラトヒアリン顆粒に由来するフィ
ラグリンタンパクの分解によって産生されることが報告
されている（Scott I.R. et al. Biochem Biophys. Act
a., ７１９, １１０−１１７（１９８２）, Horii I. e
t al., J. Dermatol., １０, ２５−３３（１９８
３））。フィラグリンは３１７個のアミノ酸からなるタ
ンパク質である。ＮＭＦの主成分であるアミノ酸がフィ
ラグリンに由来することが明らかになって以来、乾燥肌
を呈する病態とフィラグリンの関連性についての研究が
進められている。近年、老人性乾皮症、アトピー性疾患
などの乾燥肌において角層中のアミノ酸が減少している
こと（Horii I. et al., Br. J. Dermatol., １２１,５
８7−５９２（１９８９）, Tanaka M. et al., Br.
J. Dermatol., １３９，６１８−６２１（１９９
８））、およびフィラグリンの発現が減少していること
（TezukaT. et al., Dermatology, １８８, ２１−２４
（１９９４）, Seguchi T, et al., Arch. Dermatol. R
es. ２８８，４４２−４４６,（１９９６））が明らか
になってきている。また、乾燥環境によって肌荒れ等の
皮膚トラブルを生じることは良く知られている。
【０００３】このような背景からか、ＦＲ２ ７７７ １
８５−Ａ１には、保水能の調節に有利に作用するための
フィラグリン合成を刺激する物質を他の活性物質と組み
合わせたシワの処置用組成物が提案されている。しか
し、フィラグリン合成を刺激する物質が、具体的に如何
なる物質であるかについては記載がない。また、特開２
０００−２６２７２号公報には、白色ルピン［またはシ
ロバナルピナス（Lupinus albus）］の種子の粉末に由
来するタンパク質分解処理物がヒトのケラチノサイトの
フィラグリンのｍＲＮＡを増加させ、角層の厚みを増加
する作用がある旨の記載がある。さらに、ＷＯ９９／４
７１１７には、ビタミンＢ３化合物を含む組成物が保湿
剤として作用し、そしてフィラグリン、ケラチンおよび
インボクリンより選ばれる皮膚タンパク質のレベルを増
加させ、水分の角質層への吸着もしくは吸収能を高める
ことが記載されている。
８５−Ａ１には、保水能の調節に有利に作用するための
フィラグリン合成を刺激する物質を他の活性物質と組み
合わせたシワの処置用組成物が提案されている。しか
し、フィラグリン合成を刺激する物質が、具体的に如何
なる物質であるかについては記載がない。また、特開２
０００−２６２７２号公報には、白色ルピン［またはシ
ロバナルピナス（Lupinus albus）］の種子の粉末に由
来するタンパク質分解処理物がヒトのケラチノサイトの
フィラグリンのｍＲＮＡを増加させ、角層の厚みを増加
する作用がある旨の記載がある。さらに、ＷＯ９９／４
７１１７には、ビタミンＢ３化合物を含む組成物が保湿
剤として作用し、そしてフィラグリン、ケラチンおよび
インボクリンより選ばれる皮膚タンパク質のレベルを増
加させ、水分の角質層への吸着もしくは吸収能を高める
ことが記載されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上述のように、フィラ
グリンの産生量を上昇させ、角質層の厚みを増加させる
とか、または角質層への水分の吸収能を高める物質が提
案されている。しかし、フィラグリンの産生に関与し、
しかも健康な皮膚状態を維持するとの、より広範な観点
から有効性が認められる物質または化合物の提供は依然
として望まれるであろう。
グリンの産生量を上昇させ、角質層の厚みを増加させる
とか、または角質層への水分の吸収能を高める物質が提
案されている。しかし、フィラグリンの産生に関与し、
しかも健康な皮膚状態を維持するとの、より広範な観点
から有効性が認められる物質または化合物の提供は依然
として望まれるであろう。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒトケラ
チノサイトにおいて、乾燥と角層水分量に関与する因子
について検討した結果、フィラグリンタンパク質のレベ
ルと該遺伝子の発現が乾燥により低下することを見い出
した。
チノサイトにおいて、乾燥と角層水分量に関与する因子
について検討した結果、フィラグリンタンパク質のレベ
ルと該遺伝子の発現が乾燥により低下することを見い出
した。
【０００６】さらに、特定の培養ヒトケラチノサイトを
気相暴露した場合に、フィラグリン遺伝子の発現量が有
意に低下し、この現象が上記乾燥による皮膚傷害と相関
性を有することを見出した。他方、該培養ヒトケラチノ
サイトを用いる培養系で、気相暴露によるフィラグリン
遺伝子の発現量の低下を防止しうる特定の物質、エクト
インが、現実に、上記乾燥による皮膚傷害を抑制ないし
は修復しうることを見出した。
気相暴露した場合に、フィラグリン遺伝子の発現量が有
意に低下し、この現象が上記乾燥による皮膚傷害と相関
性を有することを見出した。他方、該培養ヒトケラチノ
サイトを用いる培養系で、気相暴露によるフィラグリン
遺伝子の発現量の低下を防止しうる特定の物質、エクト
インが、現実に、上記乾燥による皮膚傷害を抑制ないし
は修復しうることを見出した。
【０００７】本発明はかかる知見に基づくものである。
【０００８】したがって、本発明によれば、エクトイン
を有効成分とするフィラグリン遺伝子の発現の低下を抑
制もしくは修復するための調製剤が提供される。
を有効成分とするフィラグリン遺伝子の発現の低下を抑
制もしくは修復するための調製剤が提供される。
【０００９】
【発明の好適な態様の説明】本発明の調製剤の有効成分
であるエクトインは、下記式：
であるエクトインは、下記式：
【００１０】
【化１】
【００１１】で表され、ある種の細菌が浸透圧を調節す
るために蓄積する化合物として既知のものである。本発
明の目的に沿う限り、エクトインは起源、製造法または
純度を問うことなく使用できる。
るために蓄積する化合物として既知のものである。本発
明の目的に沿う限り、エクトインは起源、製造法または
純度を問うことなく使用できる。
【００１２】本発明の調製剤には、上記エクトインの他
に、化粧料および／または皮膚科用製剤に使用される有
効成分または賦形剤を含めてもよい。本発明の目的に沿
う、他の有効成分としては、エクトイン以外のベタイン
類やポリオール類が挙げられる。かようなベタイン類
は、エクトインに対して悪影響を及ぼさない限り、如何
なる化合物であってもよく、ベタイン（また、グリシン
ベタインとも称されている）およびその誘導体、ならび
に対応するスルテイン（ベタインのカルボキシルがスル
ホにいれ替わっている）の双性イオン化合物を挙げるこ
とができる。かような誘導体の代表的なものとしてはベ
タインのＮ−メチル基の１ないし３個が他の分枝してい
てもよい飽和もしくは不飽和炭化水素鎖または下記式で
示されるアミド結合で中断された該炭化水素鎖（式中、
ｍおよびｎは独立して１〜３０の整数である）
に、化粧料および／または皮膚科用製剤に使用される有
効成分または賦形剤を含めてもよい。本発明の目的に沿
う、他の有効成分としては、エクトイン以外のベタイン
類やポリオール類が挙げられる。かようなベタイン類
は、エクトインに対して悪影響を及ぼさない限り、如何
なる化合物であってもよく、ベタイン（また、グリシン
ベタインとも称されている）およびその誘導体、ならび
に対応するスルテイン（ベタインのカルボキシルがスル
ホにいれ替わっている）の双性イオン化合物を挙げるこ
とができる。かような誘導体の代表的なものとしてはベ
タインのＮ−メチル基の１ないし３個が他の分枝してい
てもよい飽和もしくは不飽和炭化水素鎖または下記式で
示されるアミド結合で中断された該炭化水素鎖（式中、
ｍおよびｎは独立して１〜３０の整数である）
【００１３】
【化２】
【００１４】で入れ替わっているか、または、第四級ア
ンモニウム基とカルボキシル基もしくはスルホ基との間
の炭化水素鎖の長さが変動（例えば、炭素原子数２〜
６）しているか、あるいはベタイン残基をペンダント基
として複数有する重合体が挙げられる。限定されるもの
でないが、このような誘導体の具体例としては、上記し
たものの他、γ−ブチロベタイン、デシルベタイン、ラ
ウリルベタイン、ミリスチルベタイン、セチルベタイ
ン、ステアリルベタイン、ベヘニルベタイン、ラウラミ
ドプロピルベタイン、オレアミドプロピルベタイン、パ
ルミタミドプロピルベタイン、γ−ブチロベタイン、ラ
ウリルスルタイン、ココースルタイン、ポリ（メタクリ
ロイルオキシエチルベタイン）、ポリ（メタクリロイル
オキシエチルベタインーコ−２−ヒドロキシエチルメタ
クリル酸）等を挙げることができる。
ンモニウム基とカルボキシル基もしくはスルホ基との間
の炭化水素鎖の長さが変動（例えば、炭素原子数２〜
６）しているか、あるいはベタイン残基をペンダント基
として複数有する重合体が挙げられる。限定されるもの
でないが、このような誘導体の具体例としては、上記し
たものの他、γ−ブチロベタイン、デシルベタイン、ラ
ウリルベタイン、ミリスチルベタイン、セチルベタイ
ン、ステアリルベタイン、ベヘニルベタイン、ラウラミ
ドプロピルベタイン、オレアミドプロピルベタイン、パ
ルミタミドプロピルベタイン、γ−ブチロベタイン、ラ
ウリルスルタイン、ココースルタイン、ポリ（メタクリ
ロイルオキシエチルベタイン）、ポリ（メタクリロイル
オキシエチルベタインーコ−２−ヒドロキシエチルメタ
クリル酸）等を挙げることができる。
【００１５】他方、ポリオール類は、１分子当たり２個
以上の水酸基を有する化合物およびそれらの誘導体、例
えば、ポリオールのエチレンオキシド付加物等を挙げる
ことができる。かかるポリオールの具体的なものとして
は、グリセリン、１,３−プロパンジオール、２−メチ
ル−１,３−プロパンジオール、１,４−ブタンジオー
ル、１,５−ペンタンジオール、ジグリセリン、エリス
リト−ル、グルコン酸、１,２,６−ヘキサントリオー
ル、イノシトール、ラクチトール、マルチトール、マン
ニトール、キシリトール等を挙げることができる。
以上の水酸基を有する化合物およびそれらの誘導体、例
えば、ポリオールのエチレンオキシド付加物等を挙げる
ことができる。かかるポリオールの具体的なものとして
は、グリセリン、１,３−プロパンジオール、２−メチ
ル−１,３−プロパンジオール、１,４−ブタンジオー
ル、１,５−ペンタンジオール、ジグリセリン、エリス
リト−ル、グルコン酸、１,２,６−ヘキサントリオー
ル、イノシトール、ラクチトール、マルチトール、マン
ニトール、キシリトール等を挙げることができる。
【００１６】本発明の調製剤では、エクトインを、調製
剤の総重量あたり、０.０００１〜２０重量％、好まし
くは０.００１〜０.１重量％とすることができる。いず
れにしても、それぞれ特有の使用態様について後述する
試験方法または評価方法に従って得られる結果をもと
に、さらには試験的にボランティア等で実使用した結果
等を勘案すれば、皮膚科学分野の専門家は上記有効成分
が効能を発揮するのに最適の使用量を容易に決定できる
であろう。
剤の総重量あたり、０.０００１〜２０重量％、好まし
くは０.００１〜０.１重量％とすることができる。いず
れにしても、それぞれ特有の使用態様について後述する
試験方法または評価方法に従って得られる結果をもと
に、さらには試験的にボランティア等で実使用した結果
等を勘案すれば、皮膚科学分野の専門家は上記有効成分
が効能を発揮するのに最適の使用量を容易に決定できる
であろう。
【００１７】本発明の調製剤は、化粧料、医薬品、医薬
部外品、外皮に適用されるものをさし、従ってその剤型
も水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、ゲル系、軟膏
系、クリーム、水−油２層系、水−油−粉末３層系な
ど、幅広い形態をとり得る。すなわち基礎化粧品であれ
ば、洗顔料、化粧水、乳液、クリーム、ジェル、エッセ
ンス（美容液）、パック、マスクなどの形態に、上記の
多様な剤型において広く適用可能である。メーキャップ
化粧品であれば、ファンデーション 等の形態に広く適
用可能である。さらに、医薬品または医薬部外品であれ
ば、各種の軟膏等の形態に広く適用可能である。そし
て、これらの剤型および形態に本発明皮膚外用剤のとり
得る形態が限定されるものでは無い。
部外品、外皮に適用されるものをさし、従ってその剤型
も水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、ゲル系、軟膏
系、クリーム、水−油２層系、水−油−粉末３層系な
ど、幅広い形態をとり得る。すなわち基礎化粧品であれ
ば、洗顔料、化粧水、乳液、クリーム、ジェル、エッセ
ンス（美容液）、パック、マスクなどの形態に、上記の
多様な剤型において広く適用可能である。メーキャップ
化粧品であれば、ファンデーション 等の形態に広く適
用可能である。さらに、医薬品または医薬部外品であれ
ば、各種の軟膏等の形態に広く適用可能である。そし
て、これらの剤型および形態に本発明皮膚外用剤のとり
得る形態が限定されるものでは無い。
【００１８】調製剤を製造するのに用いる成分は、これ
らの剤型および形態に応じて、選ぶことができ、そして
かような成分もしくは添加剤としては、液体油脂、固体
油脂、ロウ類、エステル油、炭化水素油、シリコーン樹
脂、シリコーン、陰イオン性界面活性剤、アニオン系界
面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非
イオン性界面活性剤、低級アルコール、ステロール類、
水溶性高分子、金属イオン封鎖剤、中和剤、ｐＨ調整
剤、抗菌剤、香料、色素等を挙げることができる。
らの剤型および形態に応じて、選ぶことができ、そして
かような成分もしくは添加剤としては、液体油脂、固体
油脂、ロウ類、エステル油、炭化水素油、シリコーン樹
脂、シリコーン、陰イオン性界面活性剤、アニオン系界
面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非
イオン性界面活性剤、低級アルコール、ステロール類、
水溶性高分子、金属イオン封鎖剤、中和剤、ｐＨ調整
剤、抗菌剤、香料、色素等を挙げることができる。
【００１９】以上に述べた調製剤は、直接ボランティア
に適用して効能を確認することができるが、それに先立
って、もう一つの態様の本発明である、乾燥による皮膚
傷害を抑制するか否かについての物質の評価方法によっ
て確認することもできる。
に適用して効能を確認することができるが、それに先立
って、もう一つの態様の本発明である、乾燥による皮膚
傷害を抑制するか否かについての物質の評価方法によっ
て確認することもできる。
【００２０】かかる評価方法で用いるヒトケラチノサイ
トは、被験物の存在下と不存在下で、それぞれ培養する
ことにより、フィラグリンタンパク質の量および遺伝子
発現量の変動が有意に識別できるものであれば、いかな
る細胞であってもよい。しかし、好適にはヒト包皮由来
の正常細胞とフィーダーレイヤー（支持細胞）としてマ
ウス由来の３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５８）
からなる培養細胞系を都合よく用いることができる。こ
れらの細胞系は例えば、Rheinwald et al., Cell ６,
３３１−３４４（１９７５）に記載の方法に従って、３
Ｔ３細胞を適当なシャーレにて培養し、マイトマイシン
Ｃ処理を行ない、こうして支持細胞層を形成した後に、
該層上にヒト正常ケラチノサイトを播種し、例えば、９
５％空気−５％炭素ガス環境下で、３７℃にてコンフル
エントになるまで培養することで、作成できる。
トは、被験物の存在下と不存在下で、それぞれ培養する
ことにより、フィラグリンタンパク質の量および遺伝子
発現量の変動が有意に識別できるものであれば、いかな
る細胞であってもよい。しかし、好適にはヒト包皮由来
の正常細胞とフィーダーレイヤー（支持細胞）としてマ
ウス由来の３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５８）
からなる培養細胞系を都合よく用いることができる。こ
れらの細胞系は例えば、Rheinwald et al., Cell ６,
３３１−３４４（１９７５）に記載の方法に従って、３
Ｔ３細胞を適当なシャーレにて培養し、マイトマイシン
Ｃ処理を行ない、こうして支持細胞層を形成した後に、
該層上にヒト正常ケラチノサイトを播種し、例えば、９
５％空気−５％炭素ガス環境下で、３７℃にてコンフル
エントになるまで培養することで、作成できる。
【００２１】通常、調製剤の不存在下で培養する系（対
照）は、調製剤の存在下で培養する（評価系）と平行し
て処理されるのが好ましい。
照）は、調製剤の存在下で培養する（評価系）と平行し
て処理されるのが好ましい。
【００２２】
【実施例】以下、具体例を挙げて本発明をさらに説明す
るが、これらの例は本発明を限定することを意図するも
のでは無い。説明中に用いるパーセンテージは、特記し
ない限り重量基準である。 フィラグリン遺伝子発現量の測定試験： （１）培養細胞 ヒト包皮由来の正常ケラチノサイトとマウス由来の３Ｔ
３細胞を用いた。 （２）培養細胞用培地 培地はＤＭＥＭ−Ｈａｍ'ｓＦ１２（３：１）に、ヒド
ロコルチゾン、コレラエンテロトキシン、上皮増殖因
子、インスリンおよび１０％ＦＢＳを含む。 （３）培養 Rheinwald et al., Cell ６, ３３１−３４４（１９７
５）の方法に従って培養する。
るが、これらの例は本発明を限定することを意図するも
のでは無い。説明中に用いるパーセンテージは、特記し
ない限り重量基準である。 フィラグリン遺伝子発現量の測定試験： （１）培養細胞 ヒト包皮由来の正常ケラチノサイトとマウス由来の３Ｔ
３細胞を用いた。 （２）培養細胞用培地 培地はＤＭＥＭ−Ｈａｍ'ｓＦ１２（３：１）に、ヒド
ロコルチゾン、コレラエンテロトキシン、上皮増殖因
子、インスリンおよび１０％ＦＢＳを含む。 （３）培養 Rheinwald et al., Cell ６, ３３１−３４４（１９７
５）の方法に従って培養する。
【００２３】概要を以下に示す。３Ｔ３細胞をマイトマ
イシンＣによって処理し、フィーダーレイヤー（支持細
胞）として使用した。ヒト正常ケラチノサイト１×１０
5個細胞をマイトマイシンＣで処理した３Ｔ３細胞上に
播種し、９５％空気−５％炭素ガス環境下で、３７℃に
てコンフルエントになるまで培養した。次いで、培養上
清を除去することにより気相暴露を行なった。なお、各
試料は気相暴露３０分前に添加し、３７℃にて培養を行
なった。試料を添加しないものを対照とした。気相暴露
は３７℃にて０−１０時間行なった。 （４）フィラグリンタンパク質量の測定 上記培養系に、試料を添加後、一定時間気相暴露した細
胞からタンパク質を抽出した。常法に従いウエスタンブ
ロッティングにてフィラグリンタンパク質またはフィラ
グリンタンパク質前駆体（プロフィラグリン）を定量し
た。概要を以下に示す。抽出したタンパク質をＳＤＳ−
ＰＡＧＥで泳動させた後に、ＰＤＶＦ膜に転写し、一次
抗体としてフィラグリンに特異的なマウスモノクローナ
ル抗体（anti-HUMAN Filaggrin MAb）を用いて抗原−抗
体反応を行なった。その後、二次抗体に Horseradish p
eroxidase か Alkaline phosphatase で標識した抗体を
用いて抗原−抗体反応を行なった。反応後、標識酵素に
対応する色素原基質を用いて酵素反応を行う発色法また
は化学発色法を用いて、測定を行なった。バンドの定量
はＮＩＨイメージ（解析プログラム）を用いて行なっ
た。 （５）フィラグリン遺伝子発現量の測定 上記培養系に、各被験物を添加後、一定時間気相暴露し
た細胞からＡＧＰＣ法を用いてＲＮＡを抽出した。これ
らのＲＮＡに対して下記のようにＲＴ−ＰＣＲを行なっ
た。フィラグリンに特異的なプライマーを McKinley-Gr
ant L.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.,
８６，４８４８−４８５２（１９８９）が報告している
フィラグリンの塩基配列に基づき作成した。ＲＴ−ＰＣ
Ｒは、ｍＲＮＡを一度逆転写酵素でｃＤＮＡにし、それ
を鋳型にして、上記プライマーを用いてポリメラーゼ反
応（公知の反応）を行ない、フィラグリンのｍＲＮＡを
測定した。ＰＣＲ産物はアガロ-スゲルにて電気泳動
し、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイド溶液に浸
漬したのちに、ＤＮＡを測定した。ＤＮＡバンドの定量
はＮＩＨイメージ（解析プログラム）を用いて行なっ
た。補正はアルデヒドグリセル−３−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）を用いて行なった。 （６）結果 （６−１）ヒトケラチノサイトを気相暴露したときのフ
ィラグリンタンパク質量の経時的な変動を図1に示す。
図より、乾燥によりヒトケラチノサイトのフィラグリン
タンパク質は有意に低下することが明らかである。 （６−２）上記気相暴露によりヒトケラチノサイトのフ
ィラグリン遺伝子発現量の経時的な変動を図2に示す。
図より、乾燥によりヒトケラチノサイトのフィラグリン
遺伝子発現は有意に低下することが明らかである。ま
た、その低下は比較的短時間のうちに生じている。 （６−３）ヒトケラチノサイトにおける気相暴露（乾燥
刺激）によるフィラグリンタンパク質量への傷害を抑制
する作用を、培養系へ添加する試料としてエクトインを
用いた場合と未使用の場合によるフィラグリンタンパク
質量で評価した。結果を図３に示す。 （６−４）ヒトケラチノサイトにおける気相暴露（乾燥
刺激）によるフィラグリン遺伝子発現を低下させる傷害
を抑制する作用を、培養系へのエクトインの添加の有無
によるフィラグリン遺伝子発現量で評価した。結果を図
４に示す。
イシンＣによって処理し、フィーダーレイヤー（支持細
胞）として使用した。ヒト正常ケラチノサイト１×１０
5個細胞をマイトマイシンＣで処理した３Ｔ３細胞上に
播種し、９５％空気−５％炭素ガス環境下で、３７℃に
てコンフルエントになるまで培養した。次いで、培養上
清を除去することにより気相暴露を行なった。なお、各
試料は気相暴露３０分前に添加し、３７℃にて培養を行
なった。試料を添加しないものを対照とした。気相暴露
は３７℃にて０−１０時間行なった。 （４）フィラグリンタンパク質量の測定 上記培養系に、試料を添加後、一定時間気相暴露した細
胞からタンパク質を抽出した。常法に従いウエスタンブ
ロッティングにてフィラグリンタンパク質またはフィラ
グリンタンパク質前駆体（プロフィラグリン）を定量し
た。概要を以下に示す。抽出したタンパク質をＳＤＳ−
ＰＡＧＥで泳動させた後に、ＰＤＶＦ膜に転写し、一次
抗体としてフィラグリンに特異的なマウスモノクローナ
ル抗体（anti-HUMAN Filaggrin MAb）を用いて抗原−抗
体反応を行なった。その後、二次抗体に Horseradish p
eroxidase か Alkaline phosphatase で標識した抗体を
用いて抗原−抗体反応を行なった。反応後、標識酵素に
対応する色素原基質を用いて酵素反応を行う発色法また
は化学発色法を用いて、測定を行なった。バンドの定量
はＮＩＨイメージ（解析プログラム）を用いて行なっ
た。 （５）フィラグリン遺伝子発現量の測定 上記培養系に、各被験物を添加後、一定時間気相暴露し
た細胞からＡＧＰＣ法を用いてＲＮＡを抽出した。これ
らのＲＮＡに対して下記のようにＲＴ−ＰＣＲを行なっ
た。フィラグリンに特異的なプライマーを McKinley-Gr
ant L.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.,
８６，４８４８−４８５２（１９８９）が報告している
フィラグリンの塩基配列に基づき作成した。ＲＴ−ＰＣ
Ｒは、ｍＲＮＡを一度逆転写酵素でｃＤＮＡにし、それ
を鋳型にして、上記プライマーを用いてポリメラーゼ反
応（公知の反応）を行ない、フィラグリンのｍＲＮＡを
測定した。ＰＣＲ産物はアガロ-スゲルにて電気泳動
し、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイド溶液に浸
漬したのちに、ＤＮＡを測定した。ＤＮＡバンドの定量
はＮＩＨイメージ（解析プログラム）を用いて行なっ
た。補正はアルデヒドグリセル−３−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）を用いて行なった。 （６）結果 （６−１）ヒトケラチノサイトを気相暴露したときのフ
ィラグリンタンパク質量の経時的な変動を図1に示す。
図より、乾燥によりヒトケラチノサイトのフィラグリン
タンパク質は有意に低下することが明らかである。 （６−２）上記気相暴露によりヒトケラチノサイトのフ
ィラグリン遺伝子発現量の経時的な変動を図2に示す。
図より、乾燥によりヒトケラチノサイトのフィラグリン
遺伝子発現は有意に低下することが明らかである。ま
た、その低下は比較的短時間のうちに生じている。 （６−３）ヒトケラチノサイトにおける気相暴露（乾燥
刺激）によるフィラグリンタンパク質量への傷害を抑制
する作用を、培養系へ添加する試料としてエクトインを
用いた場合と未使用の場合によるフィラグリンタンパク
質量で評価した。結果を図３に示す。 （６−４）ヒトケラチノサイトにおける気相暴露（乾燥
刺激）によるフィラグリン遺伝子発現を低下させる傷害
を抑制する作用を、培養系へのエクトインの添加の有無
によるフィラグリン遺伝子発現量で評価した。結果を図
４に示す。
【００２４】これらの図から、本発明に従う調製剤は、
ヒトケラチノサイトが乾燥によりうける角層水分量の低
下を、角層水分を保持するために必須なアミノ酸の原材
料となるフィラグリンのタンパク質量と遺伝子発現の低
下を有意に抑制できることが確認される。こうして、本
発明の調製剤を皮膚に施用した場合には、仮りに乾燥環
境下であっても健康な肌状態が保持される。
ヒトケラチノサイトが乾燥によりうける角層水分量の低
下を、角層水分を保持するために必須なアミノ酸の原材
料となるフィラグリンのタンパク質量と遺伝子発現の低
下を有意に抑制できることが確認される。こうして、本
発明の調製剤を皮膚に施用した場合には、仮りに乾燥環
境下であっても健康な肌状態が保持される。
【００２５】以下、本発明に従う調製剤の処方例を示
す。 処方例１ ベヘニルアルコール １.０％ ステアリルアルコール ２.０％ スクワラン １０.０％ テトラオクタン酸ペンタエリスチル ５.０％ ラノリン ５.０％ パラベン ０.３％ ポリオキシエチレンベヘニルアルコール １.０％ グリセリン １０.０％ エクトイン ０.１％ アセチルヒアルロン酸ナトリウム ０.１％ 精製水 残部 処方例２ 流動パラフィン １０.０％ オクタメチルシクロテトラシロキサン ５.０％ １,３−ブチルグリコール １０.０％ グリセリン ３.０％ アスコルビン酸誘導体 ３.０％ エクトイン ０.５％ カルボキシルビニルポリマー ０.１５％ キサンタンガム ０.２５％ ステアリン酸 １.５％ セチルアルコール ０.５％ ポリオキシエチレン(10)モノオレイン酸エステル １.０％ ステアリン酸モノグリセリド １.０％ エタノール ３.０％ 香料 適量 精製水 残部 処方例３ セトステアリルアルコール ３.５％ スクワラン ２０.０％ ミツロウ ３.０％ ラノリン ５.０％ パラベン ０.３％ ポリオキシエチレン(20)ソノビタンモノパルミチン酸エステル ２.０％ ステアリン酸モノグリセリド ２.０％ エクトイン ０.２％ ビタミンＡ ２.０％ 香料 適量 精製水 残部 処方例４ タルク ３.０％ 二酸化チタン ５.０％ ベンガラ ０.５％ 黄酸化鉄 １.４％ 黒酸化鉄 １.０％ モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン ０.９％ トリエタノールアミン １.０％ プロピレングリコール ５.０％ エクトイン ０.５％ ステアリン酸 ２.２％ イソヘキサデシルアルコール ７.０％ ステアリン酸モノグリセリド ２.０％ ラノリン ２.０％ パラフィン ８.０％ パラベン 適量 香料 適量
す。 処方例１ ベヘニルアルコール １.０％ ステアリルアルコール ２.０％ スクワラン １０.０％ テトラオクタン酸ペンタエリスチル ５.０％ ラノリン ５.０％ パラベン ０.３％ ポリオキシエチレンベヘニルアルコール １.０％ グリセリン １０.０％ エクトイン ０.１％ アセチルヒアルロン酸ナトリウム ０.１％ 精製水 残部 処方例２ 流動パラフィン １０.０％ オクタメチルシクロテトラシロキサン ５.０％ １,３−ブチルグリコール １０.０％ グリセリン ３.０％ アスコルビン酸誘導体 ３.０％ エクトイン ０.５％ カルボキシルビニルポリマー ０.１５％ キサンタンガム ０.２５％ ステアリン酸 １.５％ セチルアルコール ０.５％ ポリオキシエチレン(10)モノオレイン酸エステル １.０％ ステアリン酸モノグリセリド １.０％ エタノール ３.０％ 香料 適量 精製水 残部 処方例３ セトステアリルアルコール ３.５％ スクワラン ２０.０％ ミツロウ ３.０％ ラノリン ５.０％ パラベン ０.３％ ポリオキシエチレン(20)ソノビタンモノパルミチン酸エステル ２.０％ ステアリン酸モノグリセリド ２.０％ エクトイン ０.２％ ビタミンＡ ２.０％ 香料 適量 精製水 残部 処方例４ タルク ３.０％ 二酸化チタン ５.０％ ベンガラ ０.５％ 黄酸化鉄 １.４％ 黒酸化鉄 １.０％ モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン ０.９％ トリエタノールアミン １.０％ プロピレングリコール ５.０％ エクトイン ０.５％ ステアリン酸 ２.２％ イソヘキサデシルアルコール ７.０％ ステアリン酸モノグリセリド ２.０％ ラノリン ２.０％ パラフィン ８.０％ パラベン 適量 香料 適量
【図１】培養ヒトケラチノサイトの乾燥（気相暴露）に
よるフィラグリンタンパク質レベルの経時的変化を示す
グラフである。試行ｎ＝４〜５における平均±ＳＥＭ値
で表示している。なお**はｐ＜０.０１を意味する。
よるフィラグリンタンパク質レベルの経時的変化を示す
グラフである。試行ｎ＝４〜５における平均±ＳＥＭ値
で表示している。なお**はｐ＜０.０１を意味する。
【図２】培養ヒトケラチノサイトの乾燥（気相暴露）に
よるフィラグリン遺伝子の経時的な発現レベルの変化を
示すグラフである。試行ｎ＝４〜６における、平均±Ｓ
ＥＭ値で表示している。なお、**はｐ＜０.０１を、*は
ｐ＜０.０５を意味する。
よるフィラグリン遺伝子の経時的な発現レベルの変化を
示すグラフである。試行ｎ＝４〜６における、平均±Ｓ
ＥＭ値で表示している。なお、**はｐ＜０.０１を、*は
ｐ＜０.０５を意味する。
【図３】培養ヒトケラチノサイトの乾燥によるフィラグ
リン遺伝子発現低下に対するエクトインの効果を示すグ
ラフである。試行ｎ＝３における、平均±ＳＥＭ値によ
り表示している。なお、**はｐ＜０.０１である。
リン遺伝子発現低下に対するエクトインの効果を示すグ
ラフである。試行ｎ＝３における、平均±ＳＥＭ値によ
り表示している。なお、**はｐ＜０.０１である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4C083 AA082 AB232 AB242 AB432 AC022 AC072 AC092 AC102 AC122 AC182 AC242 AC392 AC402 AC422 AC442 AC482 AC542 AC851 AC852 AD092 AD172 AD332 AD352 AD512 AD622 AD642 4C086 AA01 AA02 BC42 MA01 MA04 NA14 ZA89 ZC01
Claims (3)
- 【請求項１】 エクトインを有効成分とするフィラグリ
ン遺伝子の発現の低下を抑制もしくは修復するための調
製剤。 - 【請求項２】 フィラグリン遺伝子の発現がヒトケラチ
ノサイトにおける事象である請求項１記載の調製剤。 - 【請求項３】 フィラグリン遺伝子の発現の低下が皮膚
の乾燥によりもたらされる請求項１または２記載の調製
剤。
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| WO2021018990A1 (en) | 2019-08-01 | 2021-02-04 | Merck Patent Gmbh | Prevention and reduction of cornification disorders and related cosmetic agents |
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| JP2000026272A (ja) * | 1998-05-14 | 2000-01-25 | Soc Industrielle Limousine D'appl Biologique | 甘い白色ルピンの種子から植物活性成分を抽出する方法、得られた抽出液および該抽出液の少なくとも一部分を用いる組成物 |
| WO2000007558A1 (de) * | 1998-08-01 | 2000-02-17 | Merck Patent Gmbh | Verwendung von ectoin oder ectoin-derivaten in kosmetischen formulierungen |
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