JP2002286639A - 時間分解蛍光検出装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 散乱ノイズのない遅延蛍光画像を取得できる
時間分解蛍光測定装置を提供することである。 【解決手段】 時間分解蛍光検出装置であって、励起光
束を所定タイミングで断続的に照射する励起光断続出射
部と、前記励起光断続出射部から照射された励起光束の
ための光路と、前記光路上に設けられた前記励起光束の
位相を解消するための位相解消部と、前記励起光束によ
る励起により生じる蛍光を取得するための光学系と、お
よび前記励起光断続出射部と前記光学系の両者に接続し
て配置され、前記励起光断続出射部による励起光束の出
射タイミングおよび照射時間と、前記光学系による蛍光
の取得タイミングとを制御するための制御部とを具備す
る時間分解蛍光検出装置。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、時間分解蛍光測定
装置特に関する。特に、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイ
クロアレイの解析に使用するのに適した時間分解蛍光画
像測定装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年開発された時間分解蛍光分析検出器
は、標識物質に遅延蛍光物質を使用し、これに励起光を
照射することにより生じる長寿命蛍光を一定時間遅延し
て得ることにより試料の蛍光光度を選択的に測定する技
術である。例えば、特開平９−４３１４６および特開平
５−１８８００１は、蛍光体からの測定対象光を分離光
学により分離してその遅延蛍光を検出したり、また、励
起光束断連射出部からの断続光束をビームスプリッター
により分離して試料及びディレイラインに照射すること
によって時間分解計測を行う技術を開示している。ま
た、特開平１０−２６７８４４は、励起光束断続射出部
と試料からの蛍光のみを通過させる遅延蛍光取得部と蛍
光強度を測定する光電変換部とから構成される時間分解
蛍光検出器を開示する。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の時間
分解蛍光検出を、特に、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイ
クロアレイを解析する手段として利用することを提案す
る。

【０００４】検出対象であるＤＮＡチップまたはＤＮＡ
マイクロアレイは、微小装置から膨大な情報を得ること
が可能な装置である。ＤＮＡチップおよびＤＮＡマイク
ロアレイの解析手段は、例えば、レーザ蛍光顕微鏡を利
用したシステムが開示されている(Nature, 346, 555-55
6, 1993)。しかしながら、このような方法を含めた従来
の解析方法は、非常に大きなアーチファクトが生じると
いう問題があり、また、蛍光物質の検出に伴う検出感度
や検出精度の不足も問題とされてきた。発明者らは、こ
れらの問題を解決する手段として時間分解蛍光検出を利
用することに着目した。

【０００５】時間分解蛍光検出は、上述の通り、遅延蛍
光物質を標識物質として用いることにより、目的とする
蛍光強度を選択的に測定する手段である。しかしなが
ら、従来には、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレ
イ等の微小系の測定に使用できる装置は存在せず、その
ような従来の装置を使用したのでは、十分な感度および
精度を得ることは不可能である。従って、本発明者等
は、特に、ＤＮＡチップおよびＤＮＡマイクロアレイ等
の微量系にも利用できる高感度且つ高精度な時間分解蛍
光検出装置の開発のための研究を行った。

【０００６】その結果、次のような問題点が明らかとな
った。即ち、従来技術の装置で、励起光断続射出部の光
源にレーザを用いた場合、そのコヒレンシーに起因する
スペックルノイズが生じ、それにより散乱ノイズが生じ
ることが明らかとなった。従って、本発明は、以上の述
べた通り、時間分解蛍光検出をＤＮＡチップおよびＤＮ
Ａマイクロアレイに用いることに着目し、そのように使
用する場合の問題点を見出したことに基づく。

【０００７】即ち、本発明の目的は、散乱ノイズのない
遅延蛍光画像を取得できる時間分解蛍光測定装置を提供
することである。特に、オリゴＤＮＡプローブまたはｃ
ＤＮＡを固相化したＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロ
アレイの蛍光検出手段として提供することを目的とす
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
めに、本発明者は鋭意研究の結果、以下のような手段を
見出したした。即ち、時間分解蛍光検出装置であって、
励起光束を所定タイミングで断続的に照射する励起光断
続出射部と、前記励起光断続出射部から照射された励起
光束のための光路と、前記光路上に設けられた前記励起
光束の位相を解消するための位相解消部と、前記励起光
束による励起により生じる蛍光を取得するための光学系
と、および前記励起光断続出射部と前記光学系の両者に
接続して配置され、前記励起光断続出射部による励起光
束の出射タイミングおよび照射時間と、前記光学系によ
る蛍光の取得タイミングとを制御するための制御部と、
を具備する時間分解蛍光検出装置である。ここで、前記
光学系は、前記蛍光を蛍光強度画像として測定し、これ
を電気信号とする光電変換部を具備することを特徴とす
る。また、特に重要な点は、前記位相解消部が光ファイ
バーバンドルであることである。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、本発明の装置について説明
する。ここでは、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロア
レイにおける蛍光を検出するための装置として、本発明
の時間分解蛍光測定装置の好ましい形態の例を示す。本
発明の装置は、微小装置であるＤＮＡチップまたはＤＮ
Ａマイクロアレイに対して特に有益であるが、しかしな
がら、検出の対象は、これらの微小装置に限定するもの
ではなく、広く他の検出対象に対しても同様に顕著な効
果を示すであろう。

【００１０】［時間分解蛍光測定装置］図１に本発明の
時間分解蛍光測定装置の好ましい例を示す。本装置の励
起光断続出射部は実質的に連続点灯することが可能な光
源が好ましく、特に、パルスレーザ１が好ましく使用で
きる。パルスレーザ９は、短パルス幅でジッターが少な
く、更に、高出力が確保できるもので、例えば、Ｎｄ：
ＹＡＧ／ＹＬＦレーザ、Ｎｄ：ＫＧＷレーザ、Ｎｄ：ガ
ラスレーザ、窒素／色素レーザ、色素レーザ、波長可変
固体レーザ等が用いられる。

【００１１】本装置の光路は、光ファイバーを使用する
ことが好ましい。パルスレーザ１には、コリメーターレ
ンズユニット２が接続され、これにライトガイド用光フ
ァイバー３が結合される（図１）。更に、ライトガイド
用光ファイバー３は、後述する位相解消部４に接続さ
れ、更に、ライトガイド用光ファイバー５を経て光源切
り替え部に繋がる（図１）。

【００１２】ライトガイド用光ファイバー３および５
は、一般的に使用される光ファイバーでよく、またその
太さは、直径０．５μｍから１００μｍでよく、所望に
応じて変更することが可能である。また、ライトガイド
用光ファイバー３および５は、等しい光ファイバーであ
ってもでも異なる光ファイバーであってもよい。

【００１３】ライトガイド用光ファイバー５は、リレー
レンズユニット６によって光源切り替え部８に接続され
る。光源切り替え部８は、水銀ランプまたはキセノンラ
ンプ７の何れかに切り替えることが可能であるように設
計される。

【００１４】本装置の光学系には、後述する光学ユニッ
ト１０とこれに取り付けた蛍光検出用のＣＣＤカメラ９
を使用する（図１）。試料１１からの蛍光は、光学ユニ
ット１０に内蔵される対物レンズを経てＣＣＤカメラ９
に導入される（図１）。ＣＣＤカメラは、前記蛍光を蛍
光強度画像として測定し、測定されたデータは光電変換
部により電気信号に変換される。

【００１５】本発明の制御部は、遅延回路１２、タイミ
ング発生部１３、および演算・表示部１４とからなる。
この制御部により、ＣＣＤカメラ９による画像取得の動
作タイミングと、パルスレーザ１の発光タイミングおよ
び発光時間は制御される。好ましい動作タイミングにつ
いては後で詳しく述べる。パルスレーザ１のパルスは、
光源の実質的な点滅および連続点灯により発生する。光
学系は、パルス照射から一定時間遅延して得られる蛍光
を取得する。このような動作タイミングの制御を前記制
御部が実施する。

【００１６】演算・表示部１４は、演算部および表示部
を具備し、必要な動作タイミングのプログラムに従って
指示を出したり、また、結果等の画像を表示することが
可能である。遅延回路１２は、演算部から指示された遅
延量、即ち、遅延時間に基づいてパルス出力を遅延す
る。遅延回路１２の遅延信号と演算部からの指示によ
り、タイミング発生部１３は、前記励起光断続部の光束
通過タイミングによって一定時間遅延して得られる蛍光
を、機械的チョッパーによって通過させるように制御さ
れている。

【００１７】［位相解消部］位相解消部は、例えば、図
３に示すような光ファイバーバンドルを使用することが
可能である。図３中には、夫々の好ましい寸法の１例を
示すが、これらの数値はｍｍ単位で示す。

【００１８】本発明で使用可能な光ファイバーバンドル
は、夫々長さの異なる複数の光ファイバー２６を組み合
わせて集合体とすることにより構成することが可能であ
る。バンドル部分２６に具備される光ファイバーは、収
束部２５で収束され、接続部２４を介して、本装置のラ
イトガイド用光ファイバーに接続される。

【００１９】また、バンドル部分のファイバーが紫外領
域までを対象とする場合には、該ファイバー材質は石英
であることが望ましい。しかしながら、これに限られる
ものではなく、一般的に光ファイバーとして使用される
何れの材質からなってもよい。また、ファイバーの夫々
の長さは、基本ファイバーの長さプラス７〜１５ｍｍず
つ延長することにより多様化する。また、基本ファイバ
ーの長さは、用いるパルスレーザの発光波長に依存して
変更することが可能である。このように複数の長さの異
なるファイバーを集合した光ファイバーバンドルを使用
することにより、コヒレンシーによるスペックルノイズ
を最低限に抑えることが可能となる。それにより高感度
且つ高精度で蛍光を検出することが可能である。

【００２０】また、本発明の装置で使用される光ファイ
バーバンドルに含まれるファイバーの数は、約１〜５０
０本が好ましく、実用的には２０から２００本が好まし
く、特に約１００本がより好ましい。また、バンドル２
６を構成する１光ファイバーの太さは、０．５μｍから
１００μｍでよく、１０μｍから５０μｍが好ましい。

【００２１】［光学系］本装置に使用できるＣＣＤカメ
ラは、蛍光画像が得られるものであればどのようなもの
でもよい。

【００２２】更に、本発明で使用することが可能な光学
系の例を図２に示す。光源切り替えミラー１７は、通
常、実線で示された位置の状態１で光束を照射してい
る。所望に応じて該光源切り替えミラーを、破線で示す
状態２にした場合には、リレーレンズを通して、パルス
レーザ光がダイクロイックミラー１８で反射後対物レン
ズ２３を経て試料に照射される。この場合、ダイクロイ
ックミラー１８の以前では光源は単色のレーザ光である
ため、波長選択用フェイルターは必要としない。試料１
１から生じた蛍光は、再び対物レンズ２３を経てダイク
ロイックミラー１８を透過し、更に、蛍光選択用フィル
ター２２、結像レンズ２１および中間変倍レンズ２０を
透過した後でＣＣＤカメラにより画像として結像され
る。

【００２３】中間変倍レンズは、試料１１の照明範囲お
よびＣＣＤカメラでの撮像範囲によって決定するこがで
きる。

【００２４】照明範囲は、視野数を２２とすると、対物
レンズの倍率ｍｏが、 視野範囲＝視野数／ｍｏ＝２２／４＝５．５（ｍｏ＝４
のとき） であり、また、撮像範囲は、視野数を２２とすると、中
間変倍倍率ｍｃが、 撮像範囲＝視野数×ｍｃ＝２２×０．５＝１１（ｍｃ＝
０．５のとき） となり、直径５．５ｍｍの範囲が直径１１ｍｍの範囲と
してＣＣＤカメラに結像される。使用するＣＣＦカメラ
の撮像素子サイズに合わせて中間変倍倍率を決めること
が可能である。

【００２５】［動作タイミング］続いて、図１で示され
る装置を用いて実施される時間分解蛍光測定の動作タイ
ミングについて説明する。先ず最初に、パルスレーザ１
の発光タイミング、遅延回路１２による遅延タイミン
グ、およびＣＣＤカメラ９による画像取得のタイミング
について、図４に示すタイミングチャートを用いて説明
する。図４に示すように、パルスレーザ１からのレーザ
光は、発光時間ｔの間で照射される（図４上段チャー
ト）。このパルスレーザの発光が終了した点２７に同期
して、遅延回路１２が遅延時間τｄを生じる（図４中段
チャート）。更に、この遅延時間τｄ後の点２８と同期
してタイミング発生部１３は積算時間τｉを発生する
（図４下段チャート）。この積算時間τｉの期間だけ、
ＣＣＤカメラ９は、目的とする画像を取得する。

【００２６】また、このとき、発光時間ｔ、遅延時間τ
ｄおよび積算時間τｉは以下の条件を満たす。即ち； ｔ＜τｄ＜τｉ である。一般的に、パルスレーザの発光時間ｔナノ秒は
１〜５ナノ秒(ｎｓｅｃ)であり、一方、遅延蛍光物質の
蛍光寿命は１μ秒から５００μ秒(μｓｅｃ)である。従
って、遅延時間τｄは１μ秒から１００μ秒であり、積
算時間は１０μ秒から５００μ秒の範囲にある。また、
図４に示す夫々の間隔、即ち、パルスレーザの発光間隔
（即ち、パルスの幅）、２の遅延時間の間隔、および２
の積算時間の間隔は、 ｔｌ＞τｄｌ＞τｉｌ の関係にある。上述の通りの本発明の好ましい形態のよ
うに、ＣＣＤカメラを使用して蛍光画像を取得する場合
には、ビデオレートの限界を考慮して、ｔｌが３０Ｈｚ
以下となることが望ましい。しかしながら、本発明はこ
れに限られるものではなく、使用する遅延蛍光物質や測
定する試料等の特性に応じて、各々の条件を変更するこ
とが可能である。

【００２７】［画像取得］次に図３および１を用いて、
画像取得について説明する。ＣＣＤカメラ９は、前記積
算時間τｉの間だけ画像を取得する。このとき、試料か
ら生じた蛍光は、対物レンズ２３を通過し、所望のフィ
ルター２２、結像レンズ２１および中間変倍レンズ２０
を経て、ＣＣＤカメラ９に到達する（図３）。ＣＣＤカ
メラ９は、取得した蛍光を積算し、積算されたデータは
演算・表示部１４に送達され（図１）、結果として表示
部に表示される。

【００２８】［遅延蛍光物質］本発明の装置と合わせて
使用することが可能な遅延蛍光物質は、一般的に使用さ
れる何れの遅延蛍光物質を使用することが可能である。
例えば、アミノ基またはリン酸基と反応する官能基、お
よびランタノイドイオンと錯体を形成する官能基を分子
内に併せ持つ物質が含まれる。

【００２９】［応用］好ましい本発明の形態について説
明したが、本発明はこれらの例に限られるものではな
く、種々の変更を行うことが可能である。例えば、上述
の例では、ＣＣＤカメラを使用して、試料から得られた
蛍光を積算しイメージングすることによりデータを画像
として得る例を示したが、画像としてデータを得る代わ
りに、試料をスキャニングすることにより蛍光強度を得
ることも可能である。また、得られた蛍光強度を、フォ
トマルチプライヤー等の光電変換部により電圧信号に変
換してもよい。また、パルスレーザの周波数、および該
パルス幅を変更することによってスキャニングに適切な
条件を設定することも可能である。

【００３０】

【発明の効果】本発明の時間分解蛍光測定装置を用いる
ことにより、コヒレンシーに起因するスペックルノイズ
を最小限に抑えることが可能であり、それにより散乱ノ
イズのない遅延蛍光画像を取得することが可能である。
その結果、本装置は、高感度且つ高精度な蛍光分析手段
を提供することが可能である。特に、本発明の装置が提
供されたことにより、初めて、時間分解蛍光測定をＤＮ
ＡチップおよびＤＮＡマイクロアレイ等に利用すること
が可能になった。これにより、目的とする蛍光強度を選
択的に測定することが可能となり、従来に比較して、Ｄ
ＮＡチップおよびＤＮＡマイクロアレイ等を高感度且つ
高精度で解析を行うことが可能になった。即ち、細胞を
含む測定系における自家蛍光の影響を最小限に抑制し、
選択的に標的ＤＮＡからの蛍光を検出することが可能と
なる。また、試験におけるアーチファクトを最小限に抑
えることも可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の時間分解蛍光測定装置の好ましい例を
示す図。

【図２】本発明の装置に使用される光学系の好ましい例
を示す図。

【図３】本発明の装置に使用される光ファイバーバンド
ルの好ましい例を示す図。

【図４】パルスレーザ発光、遅延および画像取得のタイ
ミングを示すチャートを示す図。

【符号の説明】 １．パルスレーザ ２．コリメータレンズ ３．ラ
イトガイド用光ファイバー ４．光ファイバーバンド
ル ５．ライトガイド用光ファイバー ６．リレー
レンズ ７．試薬観察用ランプ ８．光源切り替え
部 ９．ＣＣＤカメラ １０．光学ユニット １
１．試料 １２．遅延回路 １３．タイミング発生
部 １４．演算・表示部 １７．光源切り替えミラ
ー １８．ダイクロイックミラー １９．リレーレ
ンズ ２０．中間変倍レンズ ２１．結像レンズ ２２．フィルター ２３．対物
レンズ ２４．収束部 ２５．接続部 ２６．バンドル ２７．パルスレー
ザ発光終了点 ２８．遅延時間終了点

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA16 EA01 FA03 GA06 GA07 GA08 GB18 GB19 GB21 HA01 HA05 HA09 HA12 JA02 KA02 KA03 KA08 KA09 LA02 LA03 MA04 NA01 NA05

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 時間分解蛍光検出装置であって、 励起光束を所定タイミングで断続的に照射する励起光断
   続出射部と、 前記励起光断続出射部から照射された励起光束のための
   光路と、 前記光路上に設けられた前記励起光束の位相を解消する
   ための位相解消部と、 前記励起光束による励起により生じる蛍光を取得するた
   めの光学系と、および前記励起光断続出射部と前記光学
   系の両者に接続して配置され、前記励起光断続出射部に
   よる励起光束の出射タイミングおよび照射時間と、前記
   光学系による蛍光の取得タイミングとを制御するための
   制御部と、を具備する時間分解蛍光検出装置。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の時間分解蛍光検出装置
   であって、 前記光学系は、前記蛍光を蛍光強度画像として測定し、
   これを電気信号とする光電変換部を具備することを特徴
   とする時間分解蛍光検出装置。
3. 【請求項３】 請求項１または２の何れか１項に記載の
   時間分解蛍光検出装置であって、位相解消部が光ファイ
   バーバンドルであることを特徴とする時間分析蛍光検出
   装置。