JP2002191388A - Ｄ−アラビトールの製造方法及びその実施に用いる新規微生物 - Google Patents
Ｄ−アラビトールの製造方法及びその実施に用いる新規微生物Info
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- JP2002191388A JP2002191388A JP2000401267A JP2000401267A JP2002191388A JP 2002191388 A JP2002191388 A JP 2002191388A JP 2000401267 A JP2000401267 A JP 2000401267A JP 2000401267 A JP2000401267 A JP 2000401267A JP 2002191388 A JP2002191388 A JP 2002191388A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 資化可能な炭素源を原料とした微生物による
Ｄ−アラビトールの生成反応において、グリセロールや
エリスリトールなどの多価アルコール類を生産すること
が無く、高い選択性を有し、なおかつ、原料消費量に対
して高収率でＤ−アラビトールを製造する方法を提供す
る。 【解決手段】 カンジダ・パラプシロシスに属し、資化
可能な炭素源からＤ−アラビトールを選択的に生産する
能力を有する新規微生物であるカンジダ・パラプシロシ
スＦＥＲＭ Ｐ−１８００６を用いてＤ−アラビトール
を製造する。
Ｄ−アラビトールの生成反応において、グリセロールや
エリスリトールなどの多価アルコール類を生産すること
が無く、高い選択性を有し、なおかつ、原料消費量に対
して高収率でＤ−アラビトールを製造する方法を提供す
る。 【解決手段】 カンジダ・パラプシロシスに属し、資化
可能な炭素源からＤ−アラビトールを選択的に生産する
能力を有する新規微生物であるカンジダ・パラプシロシ
スＦＥＲＭ Ｐ−１８００６を用いてＤ−アラビトール
を製造する。
Description
【０００１】
【０００２】本発明は、Ｄ−アラビトールの製造方法及
びその方法を実施するために用いる新規微生物に関し、
詳細には、甘味料として有用であるだけでなく、キシロ
ースやキシリトールの原料としても有用であるＤ−アラ
ビトールについて、選択的且つ高収率で製造することを
可能とするカンジダ・パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ
ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）に属する新規微生物、及
びそれを実施するために用いた資化可能な炭素源からの
Ｄ−アラビトールの製造方法に関する。
びその方法を実施するために用いる新規微生物に関し、
詳細には、甘味料として有用であるだけでなく、キシロ
ースやキシリトールの原料としても有用であるＤ−アラ
ビトールについて、選択的且つ高収率で製造することを
可能とするカンジダ・パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ
ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）に属する新規微生物、及
びそれを実施するために用いた資化可能な炭素源からの
Ｄ−アラビトールの製造方法に関する。
【０００３】
【０００４】従来、微生物を用いたＤ−アラビトールの
生産には様々な方法が検討されていたが、何れも選択性
や収率に問題が有り、これらの要望を同時に満たすこと
は困難であった。
生産には様々な方法が検討されていたが、何れも選択性
や収率に問題が有り、これらの要望を同時に満たすこと
は困難であった。
【０００５】例えば、カンジダ（キヤンジダ）属、サッ
カロミセス属、ピヒヤ属、デバリオミセス属に属する微
生物を利用した、発酵法によるＤ−アラビトールの生成
は既に知られているが、Ｄ−アラビトール以外にグリセ
ロール、エリスリトールなどの多価アルコール類がかな
りの割合で同時に生成するという欠点があり、また、原
料消費量に対するＤ−アラビトールの生成収率において
も満足できるものではなかった。
カロミセス属、ピヒヤ属、デバリオミセス属に属する微
生物を利用した、発酵法によるＤ−アラビトールの生成
は既に知られているが、Ｄ−アラビトール以外にグリセ
ロール、エリスリトールなどの多価アルコール類がかな
りの割合で同時に生成するという欠点があり、また、原
料消費量に対するＤ−アラビトールの生成収率において
も満足できるものではなかった。
【０００６】さらに、特開昭５４−１４５２８４号公報
では、カンジダ・トルロプシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｏ
ｒｕｒｏｐｓｉｓ）に属する微生物を採用することによ
り、グリセロール、エリスリトールなどの多価アルコー
ル類を生成しない製造方法を紹介しているが、原料消費
量に対するＤ−アラビトールの生成収率は十分なものと
は言えなかった。
では、カンジダ・トルロプシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｏ
ｒｕｒｏｐｓｉｓ）に属する微生物を採用することによ
り、グリセロール、エリスリトールなどの多価アルコー
ル類を生成しない製造方法を紹介しているが、原料消費
量に対するＤ−アラビトールの生成収率は十分なものと
は言えなかった。
【０００７】
【０００８】本発明が解決しようとする課題は、資化可
能な炭素源を原料とした微生物によるＤ−アラビトール
の生成反応において、グリセロールやエリスリトールな
どの多価アルコール類を生産することが無く、高い選択
性を有し、なおかつ、原料消費量に対するＤ−アラビト
ールへの生成収率が高い、Ｄ−アラビトールの製造方
法、及びＤ−アラビトールの生産能力を有する新規微生
物を提供することにある。
能な炭素源を原料とした微生物によるＤ−アラビトール
の生成反応において、グリセロールやエリスリトールな
どの多価アルコール類を生産することが無く、高い選択
性を有し、なおかつ、原料消費量に対するＤ−アラビト
ールへの生成収率が高い、Ｄ−アラビトールの製造方
法、及びＤ−アラビトールの生産能力を有する新規微生
物を提供することにある。
【０００９】
【００１０】本発明者らの鋭意研究の結果、カンジダ・
パラプシロシスに属し、山梨県の菓子工場の敷地内から
発見された新規微生物であるカンジダ・パラプシロシス
Ｎｏ．１２３（工業技術院生命工学工業技術研究所特許
微生物寄託センターに平成１２年８月２９日付けでＦＥ
ＲＭ Ｐ−１８００６として寄託されている。）が、Ｄ
−アラビトールの製造において高選択性と高収率が望め
る菌体であることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。
パラプシロシスに属し、山梨県の菓子工場の敷地内から
発見された新規微生物であるカンジダ・パラプシロシス
Ｎｏ．１２３（工業技術院生命工学工業技術研究所特許
微生物寄託センターに平成１２年８月２９日付けでＦＥ
ＲＭ Ｐ−１８００６として寄託されている。）が、Ｄ
−アラビトールの製造において高選択性と高収率が望め
る菌体であることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。
【００１１】すなわち、本発明の課題を解決するための
手段は、次のとおりである。
手段は、次のとおりである。
【００１２】第１に、カンジダ・パラプシロシスに属
し、資化可能な炭素源からＤ−アラビトールを選択的に
生産する能力を有する新規微生物であるカンジダ・パラ
プシロシスＦＥＲＭ Ｐ−１８００６を用いた、Ｄ−ア
ラビトールの製造方法。第２に、Ｄ−アラビトールの製
造にあたり、培地中のｐＨを１．０〜６．０、好ましく
は１．１〜５．０、更に好ましくは１．２〜４．０とす
ることを特徴とする、上記第１に記載のＤ−アラビトー
ルの製造方法。第３に、受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１８
００６として寄託されている、カンジダ・パラプシロシ
スに属する新規微生物。
し、資化可能な炭素源からＤ−アラビトールを選択的に
生産する能力を有する新規微生物であるカンジダ・パラ
プシロシスＦＥＲＭ Ｐ−１８００６を用いた、Ｄ−ア
ラビトールの製造方法。第２に、Ｄ−アラビトールの製
造にあたり、培地中のｐＨを１．０〜６．０、好ましく
は１．１〜５．０、更に好ましくは１．２〜４．０とす
ることを特徴とする、上記第１に記載のＤ−アラビトー
ルの製造方法。第３に、受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１８
００６として寄託されている、カンジダ・パラプシロシ
スに属する新規微生物。
【００１３】以下、この新菌株の菌学的性質を説明す
る。
る。
【００１４】なお、以下の説明、発明の実施の形態、各
実施例、比較例において使用する培地の成分構成は、次
のとおりである。
実施例、比較例において使用する培地の成分構成は、次
のとおりである。
【００１５】
【表１】
【００１６】カンジダ・パラプシロシスＮｏ．１２３
（ＦＥＲＭ Ｐ−１８００６）の菌学的性質
（ＦＥＲＭ Ｐ−１８００６）の菌学的性質
【００１７】（１）生育状態 栄養細胞の大きさ：５．４×４．９μｍ（注１） 栄養細胞の形：楕円形、卵形（注１） 栄養細胞の増殖法：多極出芽（注１） 菌糸体：偽菌糸を形成した（注２） コロニーの様子：なめらか、クリーム状 Ｄ．Ｂ．Ｂ染色：呈色せず（子嚢菌と判定） 胞子の形成：形成せず（注３）
【００１８】（注１）カンジダ・パラプシロシスＮｏ．
１２３の保存菌体をプレート状のＹＭ培地に１白金耳接
種し、２５℃で２日間、菌体の前培養を行った。培養後
の菌体を、Ｍａｌｔ ｅｘｔｒａｃｔ液体培地に１白金
耳接種し２５℃、１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎで振盪
培養し、サンプリングした菌体を光学顕微鏡を用いて測
定した。 （注２）注１と同様の方法で菌体を前培養した後、Ｃｏ
ｒｎ ｍｅａｌ ａｇａｒプレートに１白金耳接種し２
５℃で培養し、２日ごとに顕微鏡観察した。 （注３）注１と同様の方法で菌体を前培養した後、Ｆｏ
ｗｅｌｌ’ｓ ａｃｅｔａｔｅプレートとＭａＣｌａｒ
ｙ’ｓ ａｃｅｔａｔｅプレートにそれぞれ１白金耳ず
つ接種し２５℃で１８日間培養し、顕微鏡で観察した。
１２３の保存菌体をプレート状のＹＭ培地に１白金耳接
種し、２５℃で２日間、菌体の前培養を行った。培養後
の菌体を、Ｍａｌｔ ｅｘｔｒａｃｔ液体培地に１白金
耳接種し２５℃、１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎで振盪
培養し、サンプリングした菌体を光学顕微鏡を用いて測
定した。 （注２）注１と同様の方法で菌体を前培養した後、Ｃｏ
ｒｎ ｍｅａｌ ａｇａｒプレートに１白金耳接種し２
５℃で培養し、２日ごとに顕微鏡観察した。 （注３）注１と同様の方法で菌体を前培養した後、Ｆｏ
ｗｅｌｌ’ｓ ａｃｅｔａｔｅプレートとＭａＣｌａｒ
ｙ’ｓ ａｃｅｔａｔｅプレートにそれぞれ１白金耳ず
つ接種し２５℃で１８日間培養し、顕微鏡で観察した。
【００１９】（２）生理的性質 酸素要求性：好気的 生育温度：２０〜３７℃ 最適生育温度：２５℃ ビタミンの要求性：Ｂｉｏｔｉｎ ｆｒｅｅ、ビタミ
ン９種（Ｂｉｏｔｉｎ、Ｃａ−Ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔ
ｅ、Ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ、Ｉｎｏｓｉｔｏｌ、Ｎｉａ
ｃｉｎ、ｐ−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ、Ｐ
ｒｙｄｏｘｉｎｅ、Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ、Ｔｈｉａｍ
ｉｎ）ｆｒｅｅで生育なし
ン９種（Ｂｉｏｔｉｎ、Ｃａ−Ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔ
ｅ、Ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ、Ｉｎｏｓｉｔｏｌ、Ｎｉａ
ｃｉｎ、ｐ−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ、Ｐ
ｒｙｄｏｘｉｎｅ、Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ、Ｔｈｉａｍ
ｉｎ）ｆｒｅｅで生育なし
【００２０】（３）炭素源の発酵性 発酵性試験用培地の調製 発酵性試験用基本培地を、Ｄｕｒｈａｍ管を逆さに入れ
た試験管に４．０ｍｌ分注し、次いで発酵性評価を行う
炭素源を溶解した１０％（ｗ／ｖ） 炭素源溶液（ただ
し、Ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｔａｒｃｈ 、Ｉｎｕｌｉｎは
５％で実施）を１．０ｍｌ、ＢＴＢ溶液０．３ｍｌを無
菌的に添加したものを調製した。なお、発酵性評価を行
う炭素源がＳｏｌｕｂｌｅ ｓｔａｒｃｈ、Ｉｎｕｌｉ
ｎ、Ｒａｆｆｉｎｏｓｅの場合、発酵性試験用基本培地
の添加量を３．０ｍｌ、炭素源溶液の添加量を２．０ｍ
ｌとして調製した。 培養 カンジダ・パラプシロシスＮｏ．１２３の保存菌体をＹ
Ｍ液体培地に１白金耳摂取し、ＯＤ６６０≒１．０（分
光光度計による６６０ｎｍでの濁度の測定値）となるま
で振盪培養（２５℃、１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉ
ｎ．）した。振盪培養後、遠心集菌を行い、滅菌蒸留水
で２回洗浄を行った後、滅菌蒸留水でＯＤ６６０≒０．
１の菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液０．１ｍｌ
を上記発酵性試験用培地に接種し、２５℃、静置培養を
行い、Ｄｕｒｈａｍ管内の気体の蓄積の様子を観察し
た。炭素源の発酵性は表２に記載の基準に従って評価し
た。各種炭素源の発酵性の結果は表３に記載した。
た試験管に４．０ｍｌ分注し、次いで発酵性評価を行う
炭素源を溶解した１０％（ｗ／ｖ） 炭素源溶液（ただ
し、Ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｔａｒｃｈ 、Ｉｎｕｌｉｎは
５％で実施）を１．０ｍｌ、ＢＴＢ溶液０．３ｍｌを無
菌的に添加したものを調製した。なお、発酵性評価を行
う炭素源がＳｏｌｕｂｌｅ ｓｔａｒｃｈ、Ｉｎｕｌｉ
ｎ、Ｒａｆｆｉｎｏｓｅの場合、発酵性試験用基本培地
の添加量を３．０ｍｌ、炭素源溶液の添加量を２．０ｍ
ｌとして調製した。 培養 カンジダ・パラプシロシスＮｏ．１２３の保存菌体をＹ
Ｍ液体培地に１白金耳摂取し、ＯＤ６６０≒１．０（分
光光度計による６６０ｎｍでの濁度の測定値）となるま
で振盪培養（２５℃、１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉ
ｎ．）した。振盪培養後、遠心集菌を行い、滅菌蒸留水
で２回洗浄を行った後、滅菌蒸留水でＯＤ６６０≒０．
１の菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液０．１ｍｌ
を上記発酵性試験用培地に接種し、２５℃、静置培養を
行い、Ｄｕｒｈａｍ管内の気体の蓄積の様子を観察し
た。炭素源の発酵性は表２に記載の基準に従って評価し
た。各種炭素源の発酵性の結果は表３に記載した。
【００２１】
【表２】
【００２２】
【表３】
【００２３】（４）炭素源の資化性 資化性試験用培地の調製 Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｏｇｅｎ ｂａｓｅ（Ｄｉｆｃｏ社
製）水溶液（１３．４ｇ／１００ｍｌ）と、１０％（ｗ
／ｖ）炭素源水溶液を調製し、それぞれの水溶液２５０
μｌと滅菌蒸留水４．５ｍｌを、滅菌済みの試験管に無
菌的に分注し、これを炭素源資化性試験用培地とした。
なお、炭素源を含まない培地として、Ｙｅａｓｔ Ｎｉ
ｔｏｇｅｎ ｂａｓｅ水溶液（１３．４ｇ／１００ｍ
ｌ）２５０μｌと滅菌蒸留水４．７５ｍｌからなる培地
も調製した。 培養 カンジダ・パラプシロシスＮｏ．１２３の保存菌体をＧ
ＰＹ液体培地に１白金耳接種し、ＯＤ６６０≒１．０と
なるまで振盪培養（２５℃、１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍ
ｉｎ．）した。滅菌蒸留水による遠心洗浄を２回行った
後、３〜６ｍｌの滅菌蒸留水を用いて菌体懸濁液を調製
した。この菌体懸濁液を炭素源資化性試験用培地がＯＤ
６６０≒０．０１となるように接種し、振盪培養（２５
℃、１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎ．）を行った。 評価 振盪培養中の生育の様子について、１日目、３日目、７
日目、１４日目、２１日目に肉眼比濁用黒線（３／４ｍ
ｍ幅の黒線を引いた白い紙）を用いて、肉眼比濁用黒線
の前に試験管（７ｍｌ／１８×１８０ｍｍ）を置き、そ
の線の見え方を表４の基準で評価した。２１日間の培養
終了時に菌の生育が観測されなかった培地については、
培養液のＯＤ６６０の値を測定した。炭素源資化性につ
いては、菌体の生育状況と培地の濁度を総合した表５の
基準に基づいた評価で判定し、その結果を表６にまとめ
た。
製）水溶液（１３．４ｇ／１００ｍｌ）と、１０％（ｗ
／ｖ）炭素源水溶液を調製し、それぞれの水溶液２５０
μｌと滅菌蒸留水４．５ｍｌを、滅菌済みの試験管に無
菌的に分注し、これを炭素源資化性試験用培地とした。
なお、炭素源を含まない培地として、Ｙｅａｓｔ Ｎｉ
ｔｏｇｅｎ ｂａｓｅ水溶液（１３．４ｇ／１００ｍ
ｌ）２５０μｌと滅菌蒸留水４．７５ｍｌからなる培地
も調製した。 培養 カンジダ・パラプシロシスＮｏ．１２３の保存菌体をＧ
ＰＹ液体培地に１白金耳接種し、ＯＤ６６０≒１．０と
なるまで振盪培養（２５℃、１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍ
ｉｎ．）した。滅菌蒸留水による遠心洗浄を２回行った
後、３〜６ｍｌの滅菌蒸留水を用いて菌体懸濁液を調製
した。この菌体懸濁液を炭素源資化性試験用培地がＯＤ
６６０≒０．０１となるように接種し、振盪培養（２５
℃、１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎ．）を行った。 評価 振盪培養中の生育の様子について、１日目、３日目、７
日目、１４日目、２１日目に肉眼比濁用黒線（３／４ｍ
ｍ幅の黒線を引いた白い紙）を用いて、肉眼比濁用黒線
の前に試験管（７ｍｌ／１８×１８０ｍｍ）を置き、そ
の線の見え方を表４の基準で評価した。２１日間の培養
終了時に菌の生育が観測されなかった培地については、
培養液のＯＤ６６０の値を測定した。炭素源資化性につ
いては、菌体の生育状況と培地の濁度を総合した表５の
基準に基づいた評価で判定し、その結果を表６にまとめ
た。
【００２４】
【表４】
【００２５】
【表５】
【００２６】
【表６】
【００２７】（６）窒素源の資化性 資化性試験用培地の調製 Ｙｅａｓｔ Ｃａｒｂｏｎ ｂａｓｅ（Ｄｉｆｃｏ社
製）水溶液（２３．４ｇ／１００ｍｌ）と、窒素源水溶
液を調製し、それぞれの水溶液２５０μｌと滅菌蒸留水
４．５ｍｌを、滅菌済みの試験管に無菌的に分注し、こ
れを窒素源資化性試験用培地とした。窒素源水溶液の濃
度は、Ｎｉｔｒａｔｅ（硝酸カリウム）が０．７８ｇ／
５０ｍｌ、Ｎｉｔｒｉｔｅ（亜硝酸ナトリウム）が０．
２６ｇ／５０ｍｌ、Ｃａｄａｖｅｒｉｎｅが０．６８ｇ
／５０ｍｌ、Ｌ−ｌｙｓｉｎｅが０．５６ｇ／５０ｍ
ｌ、その他の窒素源については３．５ｇ／５０ｍｌであ
る。なお、窒素源を含まない培地として、Ｙｅａｓｔ
Ｃａｒｂｏｎ ｂａｓｅ水溶液（２３．４ｇ／１００ｍ
ｌ）２５０μｌと滅菌蒸留水４．７５ｍｌからなる培地
を調製し、ブランクとして評価した。 培養 炭素源資化性試験と同様に行った。 評価 炭素源資化性試験と同様の評価方法を用いて資化性を判
定し、結果を表７にまとめた。
製）水溶液（２３．４ｇ／１００ｍｌ）と、窒素源水溶
液を調製し、それぞれの水溶液２５０μｌと滅菌蒸留水
４．５ｍｌを、滅菌済みの試験管に無菌的に分注し、こ
れを窒素源資化性試験用培地とした。窒素源水溶液の濃
度は、Ｎｉｔｒａｔｅ（硝酸カリウム）が０．７８ｇ／
５０ｍｌ、Ｎｉｔｒｉｔｅ（亜硝酸ナトリウム）が０．
２６ｇ／５０ｍｌ、Ｃａｄａｖｅｒｉｎｅが０．６８ｇ
／５０ｍｌ、Ｌ−ｌｙｓｉｎｅが０．５６ｇ／５０ｍ
ｌ、その他の窒素源については３．５ｇ／５０ｍｌであ
る。なお、窒素源を含まない培地として、Ｙｅａｓｔ
Ｃａｒｂｏｎ ｂａｓｅ水溶液（２３．４ｇ／１００ｍ
ｌ）２５０μｌと滅菌蒸留水４．７５ｍｌからなる培地
を調製し、ブランクとして評価した。 培養 炭素源資化性試験と同様に行った。 評価 炭素源資化性試験と同様の評価方法を用いて資化性を判
定し、結果を表７にまとめた。
【００２８】
【表７】
【００２９】
【００３０】本発明を実施するために使用する微生物と
しては、資化可能な炭素源からＤ−アラビトールを選択
的かつ高収率に生産する能力を有するものであればよ
く、具体的にはカンジダ・パラプシロシスに属する、新
規微生物であるカンジダ・パラプシロシスＮｏ．１２３
（工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託セ
ンターにＦＥＲＭ Ｐ−１８００６として寄託されてい
る。）を採用でき、また、その変異株を包含する。変異
株は、親株から、たとえば紫外線、Ｘ線、γ線などの照
射、または適当な変異剤による処理などの慣行法によっ
て得ることができる。カンジダ・パラプシロシスに属す
る菌体の培養方法は、液体培地を用いて好気的条件下で
攪拌培養することにより実施されることが望ましい。
しては、資化可能な炭素源からＤ−アラビトールを選択
的かつ高収率に生産する能力を有するものであればよ
く、具体的にはカンジダ・パラプシロシスに属する、新
規微生物であるカンジダ・パラプシロシスＮｏ．１２３
（工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託セ
ンターにＦＥＲＭ Ｐ−１８００６として寄託されてい
る。）を採用でき、また、その変異株を包含する。変異
株は、親株から、たとえば紫外線、Ｘ線、γ線などの照
射、または適当な変異剤による処理などの慣行法によっ
て得ることができる。カンジダ・パラプシロシスに属す
る菌体の培養方法は、液体培地を用いて好気的条件下で
攪拌培養することにより実施されることが望ましい。
【００３１】液体培地の主炭素源としてはグルコース、
フルクトース、スクロース、糖蜜または、これらの混合
物など、各種糖質の使用が可能である。なお、これら糖
質の培地中における量的割合としては、Ｄ−アラビトー
ルの生成を妨げない範囲であれば自由に選択できる。液
体培地に添加される糖類の濃度条件は、５〜４０％（ｗ
／ｖ）、好ましくは１０〜３０％（ｗ／ｖ）、更に好ま
しくは１５〜２０％（ｗ／ｖ）である。液体培地中の炭
素源となる糖類の濃度が４０％（ｗ／ｖ）を超えると、
浸透圧が高くなり、微生物によるアラビトールの生成能
力が低下するため好ましくない。また、液体培地に添加
される糖類の濃度が５％（ｗ／ｖ）を下回った場合、液
体培地中に含まれる炭素源の絶対量が少なくなり、Ｄ−
アラビトールの製造が効率的に行われなくなるため好ま
しくない。
フルクトース、スクロース、糖蜜または、これらの混合
物など、各種糖質の使用が可能である。なお、これら糖
質の培地中における量的割合としては、Ｄ−アラビトー
ルの生成を妨げない範囲であれば自由に選択できる。液
体培地に添加される糖類の濃度条件は、５〜４０％（ｗ
／ｖ）、好ましくは１０〜３０％（ｗ／ｖ）、更に好ま
しくは１５〜２０％（ｗ／ｖ）である。液体培地中の炭
素源となる糖類の濃度が４０％（ｗ／ｖ）を超えると、
浸透圧が高くなり、微生物によるアラビトールの生成能
力が低下するため好ましくない。また、液体培地に添加
される糖類の濃度が５％（ｗ／ｖ）を下回った場合、液
体培地中に含まれる炭素源の絶対量が少なくなり、Ｄ−
アラビトールの製造が効率的に行われなくなるため好ま
しくない。
【００３２】液体培地に使用される窒素源としては、微
生物が利用可能な窒素化合物であればよく、例えば酵母
エキスなどが使用できる。また、液体培地には必要に応
じて、リン酸カリウム、硫酸アンモニウムなどの種々の
無機塩類を添加することもできる。Ｄ−アラビトールの
生成は、液体培地に菌体を直接接種するか、または別に
種培養液を調製しそれを液体培地に接種しても良い。種
培養液は、Ｄ−アラビトールの生成に用いられる培地と
同組成の液体培地に直接菌体を接種し、２５℃で１〜２
日間程度培養することで得ることができる。
生物が利用可能な窒素化合物であればよく、例えば酵母
エキスなどが使用できる。また、液体培地には必要に応
じて、リン酸カリウム、硫酸アンモニウムなどの種々の
無機塩類を添加することもできる。Ｄ−アラビトールの
生成は、液体培地に菌体を直接接種するか、または別に
種培養液を調製しそれを液体培地に接種しても良い。種
培養液は、Ｄ−アラビトールの生成に用いられる培地と
同組成の液体培地に直接菌体を接種し、２５℃で１〜２
日間程度培養することで得ることができる。
【００３３】培養温度は微生物が発育し得る範囲内で適
宜設定されるが、通常１０〜４０℃、好ましくは２０〜
３０℃、更に好ましくは２５℃前後である。培地温度が
４０℃を超えたり１０℃を下回ると、微生物の活性が急
激に低下し、Ｄ−アラビトールの生成量が低下するため
好ましくない。Ｄ−アラビトールの生成に用いられる培
地のｐＨは、１．０〜６．０、好ましくは１．１〜５．
０、更に好ましくは１．２〜４．０である。ｐＨが７．
０を超えると、Ｄ−アラビトールの生成量が著しく低下
するため好ましくない。本発明における培養期間は、培
地の種類及び主炭素源である糖質の濃度により異なるた
め、各種条件に応じて適宜変更すべきであるが、培地中
の炭素源が最大限に消費された時点か、もしくは培養液
中のＤ−アラビトール生成量が最大となった時点で終了
させることが望ましく、通常３〜１０日程度である。培
養の進捗度は、ガスクロマトグラフィーや高速液体クロ
マトグラフィーなどの方法を用い、培養液中のＤ−アラ
ビトールを定量することで、容易に測定が可能である。
また、培養の進行度、培養液調製、各種溶液の添加量な
どの目安として、それぞれの溶液の濁度（Ｏｐｔｉｃａ
ｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ：ＯＤ）を用いることも可能であ
る。濁度は分光光度計によって特定波長の散乱光を測定
することで、求めることができる。
宜設定されるが、通常１０〜４０℃、好ましくは２０〜
３０℃、更に好ましくは２５℃前後である。培地温度が
４０℃を超えたり１０℃を下回ると、微生物の活性が急
激に低下し、Ｄ−アラビトールの生成量が低下するため
好ましくない。Ｄ−アラビトールの生成に用いられる培
地のｐＨは、１．０〜６．０、好ましくは１．１〜５．
０、更に好ましくは１．２〜４．０である。ｐＨが７．
０を超えると、Ｄ−アラビトールの生成量が著しく低下
するため好ましくない。本発明における培養期間は、培
地の種類及び主炭素源である糖質の濃度により異なるた
め、各種条件に応じて適宜変更すべきであるが、培地中
の炭素源が最大限に消費された時点か、もしくは培養液
中のＤ−アラビトール生成量が最大となった時点で終了
させることが望ましく、通常３〜１０日程度である。培
養の進捗度は、ガスクロマトグラフィーや高速液体クロ
マトグラフィーなどの方法を用い、培養液中のＤ−アラ
ビトールを定量することで、容易に測定が可能である。
また、培養の進行度、培養液調製、各種溶液の添加量な
どの目安として、それぞれの溶液の濁度（Ｏｐｔｉｃａ
ｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ：ＯＤ）を用いることも可能であ
る。濁度は分光光度計によって特定波長の散乱光を測定
することで、求めることができる。
【００３４】本発明では、グリセロールやエリスリトー
ルといった副生成物を生じること無く、選択的にＤ−ア
ラビトールを生成することが可能であった。その結果、
使用した炭素源消費量当たりのＤ−アラビトール生成収
率（Ｄ−アラビトール生産量／炭素源消費量）は、３０
％以上、好ましくは４０％以上であり、最大で５０％を
超えるものであった。
ルといった副生成物を生じること無く、選択的にＤ−ア
ラビトールを生成することが可能であった。その結果、
使用した炭素源消費量当たりのＤ−アラビトール生成収
率（Ｄ−アラビトール生産量／炭素源消費量）は、３０
％以上、好ましくは４０％以上であり、最大で５０％を
超えるものであった。
【００３５】このようにして得られた培養液中のＤ−ア
ラビトールは、常法によって培養液中から単離、精製す
ることが可能であり、ろ過、遠心分離、イオン交換さら
には、吸着クロマトグラフィー、結晶化など公知の手段
を適宜組み合わせることで実施できる。例えば、培養液
から遠心分離によって菌体を除去し、次いで活性炭処理
により着色物質などを除き、さらにイオン交換樹脂によ
り脱イオンし、生成した培養液を濃縮乾固する。これに
熱エタノール等の有機溶媒を加えてＤ−アラビトールを
抽出し、抽出液をそのまま室温または冷却下に放置する
と白色のＤ−アラビトール結晶が晶析する。このように
して得たＤ−アラビトール結晶をエタノールなどの有機
溶媒を用いて再結晶を行うことにより、純粋なＤ−アラ
ビトール結晶を得ることができる。以下に、実施例及び
比較例を示して本発明を詳細に説明するが、本発明の範
囲は以下の例に制限されるものではない。
ラビトールは、常法によって培養液中から単離、精製す
ることが可能であり、ろ過、遠心分離、イオン交換さら
には、吸着クロマトグラフィー、結晶化など公知の手段
を適宜組み合わせることで実施できる。例えば、培養液
から遠心分離によって菌体を除去し、次いで活性炭処理
により着色物質などを除き、さらにイオン交換樹脂によ
り脱イオンし、生成した培養液を濃縮乾固する。これに
熱エタノール等の有機溶媒を加えてＤ−アラビトールを
抽出し、抽出液をそのまま室温または冷却下に放置する
と白色のＤ−アラビトール結晶が晶析する。このように
して得たＤ−アラビトール結晶をエタノールなどの有機
溶媒を用いて再結晶を行うことにより、純粋なＤ−アラ
ビトール結晶を得ることができる。以下に、実施例及び
比較例を示して本発明を詳細に説明するが、本発明の範
囲は以下の例に制限されるものではない。
【００３６】なお、以下の実施例、比較例で使用する液
体培地の成分組成は、次のとおりである。
体培地の成分組成は、次のとおりである。
【００３７】
【表８】
【００３８】
【実施例１】
【００３９】カンジダ・パラプシロシスＮｏ．１２３
（ＦＥＲＭ Ｐ−１８００６）の保存菌体を、０．２Ｎ
のＮａＯＨでｐＨ５．５に調整した５％グルコース液体
培地（７ｍｌ／１８ｍｍ×１８０ｍｍ試験管）に１白金
耳接種し、２５℃、１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎで振
盪培養を行い、液体培地の濁度が分光光度計（ＨＩＴＡ
ＣＨＩ ｍｏｄｅｌ １０１ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅ
ｒ）による測定でＯＤ６６０≒１．０になるまで振盪培
養を行い、前々培養液を得た。この前々培養液を、ＹＭ
液体培地の濁度がＯＤ６６０≒０．０１となるまで接種
させ、その中の１００ｍｌを５００ｍｌ容振盪フラスコ
に分注し、４８時間振盪培養し前培養液を得た。この前
培養液を滅菌済み遠沈管（５００ｍｌ容ポリアロマ製）
に全量入れ、冷凍遠心機（ＨＩＴＡＣＨＩ・２０ＰＲ−
５２Ｄ）を用いて遠心分離（４５００ｒｐｍ、２０ｍｉ
ｎ、４℃）を行い、上清を廃棄し菌体を回収した。回収
した菌体に、１２Ｍ−ＨＣｌでｐＨ１．８に調整した１
５％グルコース液体培地を添加、懸濁させて、液体培地
がＯＤ６６０≒１００になるように調製した。菌体を添
加した上記液体培地１００ｍｌをメスシリンダーに計り
とり、５００ｍｌ容振盪フラスコに分注し、これを２５
℃、１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎで振盪培養を行っ
た。振盪培養１２０時間目でこの培養液のＨＰＬＣ分析
を行ったところ、培養液中のＤ−アラビトールの生産量
は７０．７４ｇ／Ｌ（収率５０．７％＝Ｄ−アラビトー
ル生産量／グルコース消費量）であった。
（ＦＥＲＭ Ｐ−１８００６）の保存菌体を、０．２Ｎ
のＮａＯＨでｐＨ５．５に調整した５％グルコース液体
培地（７ｍｌ／１８ｍｍ×１８０ｍｍ試験管）に１白金
耳接種し、２５℃、１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎで振
盪培養を行い、液体培地の濁度が分光光度計（ＨＩＴＡ
ＣＨＩ ｍｏｄｅｌ １０１ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅ
ｒ）による測定でＯＤ６６０≒１．０になるまで振盪培
養を行い、前々培養液を得た。この前々培養液を、ＹＭ
液体培地の濁度がＯＤ６６０≒０．０１となるまで接種
させ、その中の１００ｍｌを５００ｍｌ容振盪フラスコ
に分注し、４８時間振盪培養し前培養液を得た。この前
培養液を滅菌済み遠沈管（５００ｍｌ容ポリアロマ製）
に全量入れ、冷凍遠心機（ＨＩＴＡＣＨＩ・２０ＰＲ−
５２Ｄ）を用いて遠心分離（４５００ｒｐｍ、２０ｍｉ
ｎ、４℃）を行い、上清を廃棄し菌体を回収した。回収
した菌体に、１２Ｍ−ＨＣｌでｐＨ１．８に調整した１
５％グルコース液体培地を添加、懸濁させて、液体培地
がＯＤ６６０≒１００になるように調製した。菌体を添
加した上記液体培地１００ｍｌをメスシリンダーに計り
とり、５００ｍｌ容振盪フラスコに分注し、これを２５
℃、１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎで振盪培養を行っ
た。振盪培養１２０時間目でこの培養液のＨＰＬＣ分析
を行ったところ、培養液中のＤ−アラビトールの生産量
は７０．７４ｇ／Ｌ（収率５０．７％＝Ｄ−アラビトー
ル生産量／グルコース消費量）であった。
【００４０】
【実施例２】
【００４１】カンジダ・パラプシロシスＮｏ．１２３
（ＦＥＲＭ Ｐ−１８００６）の保存菌体を、０．２Ｎ
のＮａＯＨでｐＨ５．５に調整した５％グルコース液体
培地（８ｍｌ／１８ｍｍ×１８０ｍｍ試験管）に１白金
耳接種し、２５℃、１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎで振
盪培養を行った。振盪培養は液体培地の濁度がＯＤ６６
０≒１．０になるまで行い、これを前培養液とした。前
培養終了後、前培養液を滅菌済み綿栓付き試験管に全量
入れ、遠心機を用いて遠心分離を行い、菌体を回収し
た。その後滅菌水を加えて懸濁した後、再び遠心分離を
行い菌体を回収する操作を２回行い、菌体洗浄を行っ
た。集菌洗浄後、０．１ＮのＮａＯＨでｐＨを４．８に
調整した１５％フルクトース液体培地に対して、ＯＤ６
６０≒０．０１となるように洗浄済みの菌体を接種し、
滅菌済み綿栓付き５００ｍｌ容振盪フラスコに１００ｍ
ｌ分注した。この溶液を２５℃、１２０ｓｔｒｏｋｅｓ
／ｍｉｎで１０日間振盪培養した。振盪培養２４０時間
目でこの培養液中に含まれるＤ−アラビトールは、７
６．４０ｇ／Ｌ（収率５０．９％＝Ｄ−アラビトール生
産量／フルクトース消費量）であった。
（ＦＥＲＭ Ｐ−１８００６）の保存菌体を、０．２Ｎ
のＮａＯＨでｐＨ５．５に調整した５％グルコース液体
培地（８ｍｌ／１８ｍｍ×１８０ｍｍ試験管）に１白金
耳接種し、２５℃、１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎで振
盪培養を行った。振盪培養は液体培地の濁度がＯＤ６６
０≒１．０になるまで行い、これを前培養液とした。前
培養終了後、前培養液を滅菌済み綿栓付き試験管に全量
入れ、遠心機を用いて遠心分離を行い、菌体を回収し
た。その後滅菌水を加えて懸濁した後、再び遠心分離を
行い菌体を回収する操作を２回行い、菌体洗浄を行っ
た。集菌洗浄後、０．１ＮのＮａＯＨでｐＨを４．８に
調整した１５％フルクトース液体培地に対して、ＯＤ６
６０≒０．０１となるように洗浄済みの菌体を接種し、
滅菌済み綿栓付き５００ｍｌ容振盪フラスコに１００ｍ
ｌ分注した。この溶液を２５℃、１２０ｓｔｒｏｋｅｓ
／ｍｉｎで１０日間振盪培養した。振盪培養２４０時間
目でこの培養液中に含まれるＤ−アラビトールは、７
６．４０ｇ／Ｌ（収率５０．９％＝Ｄ−アラビトール生
産量／フルクトース消費量）であった。
【００４２】
【００４３】カンジダ・オレオフィラＮｏ．１６１の保
存菌体を、実施例２と同様の方法で前培養及び前培養し
た菌体の集菌洗浄を行った。集菌洗浄後、０．１ＮのＮ
ａＯＨでｐＨを５．５に調整した１５％グルコース液体
培地に対して、ＯＤ６６０≒０．０１となるように洗浄
済みの菌体を接種し、２５℃、１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／
ｍｉｎで１０日間振盪培養した。Ｄ−アラビトール生産
量は、３１．１４ｇ／Ｌ（収率２０．８％＝Ｄ−アラビ
トール生産量／グルコース消費量）であり、リビトール
２．４５ｇ／Ｌ（収率１．６％）も同時に生成した。ま
た、この菌体は培養時に高い発泡性を有した。
存菌体を、実施例２と同様の方法で前培養及び前培養し
た菌体の集菌洗浄を行った。集菌洗浄後、０．１ＮのＮ
ａＯＨでｐＨを５．５に調整した１５％グルコース液体
培地に対して、ＯＤ６６０≒０．０１となるように洗浄
済みの菌体を接種し、２５℃、１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／
ｍｉｎで１０日間振盪培養した。Ｄ−アラビトール生産
量は、３１．１４ｇ／Ｌ（収率２０．８％＝Ｄ−アラビ
トール生産量／グルコース消費量）であり、リビトール
２．４５ｇ／Ｌ（収率１．６％）も同時に生成した。ま
た、この菌体は培養時に高い発泡性を有した。
【００４４】各実施例及び比較例の培養結果を、表９に
示す。
示す。
【００４５】
【表９】
【００４６】
【００４７】本発明によれば、資化可能な炭素源を原料
とした微生物によるＤ−アラビトールの生成反応におい
て、グリセロールやエリスリトールなどの多価アルコー
ル類を生産することが無く、高い選択性を有し、なおか
つ、原料からＤ−アラビトールへの生成収率が高いＤ−
アラビトールの製造方法を提供できる。
とした微生物によるＤ−アラビトールの生成反応におい
て、グリセロールやエリスリトールなどの多価アルコー
ル類を生産することが無く、高い選択性を有し、なおか
つ、原料からＤ−アラビトールへの生成収率が高いＤ−
アラビトールの製造方法を提供できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:72） Ｃ１２Ｒ 1:72） (72)発明者 小島 貴士 岐阜県羽島郡川島町松倉町500−１ (72)発明者 近藤 敏弘 茨城県つくば市桜町一丁目13−13アクシス 桜105 (72)発明者 尾藤 幸枝 東京都あきる野市野辺666−21 Ｆターム(参考） 4B064 AC05 CA06 CC07 DA10 4B065 AA73X AC14 AC20 BC02 CA07 CA41
Claims (3)
- 【請求項１】 カンジダ・パラプシロシスに属し、資化
可能な炭素源からＤ−アラビトールを選択的に生産する
能力を有する新規微生物であるカンジダ・パラプシロシ
スＦＥＲＭ Ｐ−１８００６を用いた、Ｄ−アラビトー
ルの製造方法。 - 【請求項２】 Ｄ−アラビトールの製造にあたり、培地
中のｐＨを１．０〜６．０とすることを特徴とする、請
求項１に記載のＤ−アラビトールの製造方法。 - 【請求項３】 受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１８００６と
して寄託されている、カンジダ・パラプシロシスに属す
る新規微生物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000401267A JP4616940B2 (ja) | 2000-12-28 | 2000-12-28 | Ｄ−アラビトールの製造方法及びその実施に用いる新規微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000401267A JP4616940B2 (ja) | 2000-12-28 | 2000-12-28 | Ｄ−アラビトールの製造方法及びその実施に用いる新規微生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002191388A true JP2002191388A (ja) | 2002-07-09 |
| JP4616940B2 JP4616940B2 (ja) | 2011-01-19 |
Family
ID=18865730
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000401267A Expired - Fee Related JP4616940B2 (ja) | 2000-12-28 | 2000-12-28 | Ｄ−アラビトールの製造方法及びその実施に用いる新規微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4616940B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113444750A (zh) * | 2021-08-19 | 2021-09-28 | 河北工程大学 | 一种恒流弱电场胁迫下海水非灭菌高渗发酵甘油生产d-阿拉伯糖醇的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4891276A (ja) * | 1972-03-08 | 1973-11-28 | ||
| JPS536231B2 (ja) * | 1973-11-05 | 1978-03-06 | ||
| JPS54145284A (en) * | 1978-01-24 | 1979-11-13 | Hoffmann La Roche | Production of ddalabinose |
-
2000
- 2000-12-28 JP JP2000401267A patent/JP4616940B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4891276A (ja) * | 1972-03-08 | 1973-11-28 | ||
| JPS536231B2 (ja) * | 1973-11-05 | 1978-03-06 | ||
| JPS54145284A (en) * | 1978-01-24 | 1979-11-13 | Hoffmann La Roche | Production of ddalabinose |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113444750A (zh) * | 2021-08-19 | 2021-09-28 | 河北工程大学 | 一种恒流弱电场胁迫下海水非灭菌高渗发酵甘油生产d-阿拉伯糖醇的方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4616940B2 (ja) | 2011-01-19 |
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