JP2002176976A - 低粘度媒体を用いた高分解ｄｎａ配列決定法 - Google Patents
低粘度媒体を用いた高分解ｄｎａ配列決定法Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、容易に装填されキャピラリー電気
泳動チューブから除去される低粘度媒体を与えることに
よって、ＤＮＡ配列決定フラグメントの単一塩基分解を
達成するための改良された方法と装置を提供すること。 【解決手段】 ＤＮＡ配列決定の混合物中のＤＮＡフラ
グメントが大きさによって分離される、標的ポリヌクレ
オチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって：こ
の方法は、前記ＤＮＡフラグメントをキャピラリー電気
泳動のための媒体を含む変性水溶液中でのキャピラリー
電気泳動によって分離する工程を、包含し、ここで、少
なくとも約３００塩基長のフラグメントに対して単一塩
基分解が達成される方法が提供される。また、溶液の低
粘性がこの種の溶液のキャピラリーチューブへの迅速な
装填と再装填を可能にする。
泳動チューブから除去される低粘度媒体を与えることに
よって、ＤＮＡ配列決定フラグメントの単一塩基分解を
達成するための改良された方法と装置を提供すること。 【解決手段】 ＤＮＡ配列決定の混合物中のＤＮＡフラ
グメントが大きさによって分離される、標的ポリヌクレ
オチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって：こ
の方法は、前記ＤＮＡフラグメントをキャピラリー電気
泳動のための媒体を含む変性水溶液中でのキャピラリー
電気泳動によって分離する工程を、包含し、ここで、少
なくとも約３００塩基長のフラグメントに対して単一塩
基分解が達成される方法が提供される。また、溶液の低
粘性がこの種の溶液のキャピラリーチューブへの迅速な
装填と再装填を可能にする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】（低粘度媒体を用いた高分解
ＤＮＡ配列決定法発明の技術分野）本発明はキャピラリ
ー電気泳動によるＤＮＡフラグメント混合物中のＤＮＡ
フラグメントの分離に基づくＤＮＡ配列決定に関するも
のである。
ＤＮＡ配列決定法発明の技術分野）本発明はキャピラリ
ー電気泳動によるＤＮＡフラグメント混合物中のＤＮＡ
フラグメントの分離に基づくＤＮＡ配列決定に関するも
のである。
【０００２】
【従来の技術】（参考文献）
【０００３】
【化１】
【０００４】
【化２】 電気泳動はＤＮＡ種、タンパク質、ペプチド、および誘
導化アミノ酸を含む多くの生物分子の分離のために広く
使用されている。迅速で、高分解分離を行うことができ
るひとつの電気泳動技術はキャピラリー電気泳動（Ｃ
Ｅ）である（GrossmanおよびColburn，1992）。一般的
には、ＣＥはその内径が約１０〜２００ミクロン、長さ
が約５〜１００ｃｍまたはそれ以上の溶融シリカキャピ
ラリーチューブを用いる。
導化アミノ酸を含む多くの生物分子の分離のために広く
使用されている。迅速で、高分解分離を行うことができ
るひとつの電気泳動技術はキャピラリー電気泳動（Ｃ
Ｅ）である（GrossmanおよびColburn，1992）。一般的
には、ＣＥはその内径が約１０〜２００ミクロン、長さ
が約５〜１００ｃｍまたはそれ以上の溶融シリカキャピ
ラリーチューブを用いる。
【０００５】多くの注目を集めたＣＥの用途のひとつは
ＤＮＡ配列決定フラグメントの分離と同定であった。こ
のような分離はガラスプレート間の架橋したポリアクリ
ルアミドマトリックスの入念な準備を必要とするスラブ
ゲル形態を予め使用して行われた。さらに最近、このよ
うな分離をＣＥによって行うため、分離は時間を短く
し、試料の大きさを減らし、試料装填を自動化し、そし
て試料ピークの分解能を潜在的に高くする利点を与える
方法が記述されてきた。
ＤＮＡ配列決定フラグメントの分離と同定であった。こ
のような分離はガラスプレート間の架橋したポリアクリ
ルアミドマトリックスの入念な準備を必要とするスラブ
ゲル形態を予め使用して行われた。さらに最近、このよ
うな分離をＣＥによって行うため、分離は時間を短く
し、試料の大きさを減らし、試料装填を自動化し、そし
て試料ピークの分解能を潜在的に高くする利点を与える
方法が記述されてきた。
【０００６】Guttmanら（1990）は３〜６％Ｔおよび５
％Ｃを含む架橋ポリアクリルアミドを用いるＣＥによっ
て１６０塩基のオーダーで含有するポリヌクレオチドの
単一塩基分離を報告した。
％Ｃを含む架橋ポリアクリルアミドを用いるＣＥによっ
て１６０塩基のオーダーで含有するポリヌクレオチドの
単一塩基分離を報告した。
【０００７】Cohenら（1990）はＣＥと架橋ポリアクリ
ルアミドゲル（３％Ｔ、５％Ｃ）を使用して全長で１８
ないし３３０塩基の単一塩基によって長さの異なるＤＮ
Ａ配列決定フラグメントを分離した。Swerdlowら（1990
ａ）はＣＥによって行われるＤＮＡ配列決定フラグメン
トの分離と、同一の架橋ポリアクリルアミドマトリック
ス（６％Ｔ、５％Ｃ）を用いるスラブゲル電気泳動によ
って行われるそれとを比較した。ＣＥによって行われる
分離は従来のスラブゲル形態によって与えられるものよ
りも３倍早く、2.4倍の良い分解能と５倍のよい分離効
率であったといえる。
ルアミドゲル（３％Ｔ、５％Ｃ）を使用して全長で１８
ないし３３０塩基の単一塩基によって長さの異なるＤＮ
Ａ配列決定フラグメントを分離した。Swerdlowら（1990
ａ）はＣＥによって行われるＤＮＡ配列決定フラグメン
トの分離と、同一の架橋ポリアクリルアミドマトリック
ス（６％Ｔ、５％Ｃ）を用いるスラブゲル電気泳動によ
って行われるそれとを比較した。ＣＥによって行われる
分離は従来のスラブゲル形態によって与えられるものよ
りも３倍早く、2.4倍の良い分解能と５倍のよい分離効
率であったといえる。
【０００８】上記のような架橋ポリアクリルアミドマト
リックスはＤＮＡ配列分析に使えることを示したが、一
定の制限があった。ひとつの制限はキャピラリーチュー
ブ中で重合化中にポリアクリルアミドマトリックスに気
泡が形成し、ピーク分解を妥協して処理し重合化に続く
若干のアクリルアミド充填チューブの廃棄を必要とする
ことであった（Swerdlow、1990a，b）。
リックスはＤＮＡ配列分析に使えることを示したが、一
定の制限があった。ひとつの制限はキャピラリーチュー
ブ中で重合化中にポリアクリルアミドマトリックスに気
泡が形成し、ピーク分解を妥協して処理し重合化に続く
若干のアクリルアミド充填チューブの廃棄を必要とする
ことであった（Swerdlow、1990a，b）。
【０００９】他の制限は試料の電気泳動中にキャピラリ
ーチューブの注入端近くに気泡が生成することであった
（Swerdlow，1990b）。
ーチューブの注入端近くに気泡が生成することであった
（Swerdlow，1990b）。
【００１０】第３の制限は高圧にて、チューブからゲル
マトリックスを噴出させる電気浸透が生じることであっ
た。このような噴出を押さえるため、架橋マトリックス
をチューブの内壁に共有結合させた（Kargerら、198
9）。しかしながら、このような共有結合は重合中また
は電気泳動中に収縮によるマトリックスの空隙の形成を
導く（Grossmanら、1992，140〜142頁）。
マトリックスを噴出させる電気浸透が生じることであっ
た。このような噴出を押さえるため、架橋マトリックス
をチューブの内壁に共有結合させた（Kargerら、198
9）。しかしながら、このような共有結合は重合中また
は電気泳動中に収縮によるマトリックスの空隙の形成を
導く（Grossmanら、1992，140〜142頁）。
【００１１】第４の制限は、ＤＮＡ配列分析で、配列決
定鋳型によるキャピラリー入口の汚れであった。入口で
本来固定されている大きい鋳型の蓄積物はその後に装填
された試料により達せられる分解度を制限し、これによ
ってキャピラリーはせいぜい数回使用するように限定さ
れる。
定鋳型によるキャピラリー入口の汚れであった。入口で
本来固定されている大きい鋳型の蓄積物はその後に装填
された試料により達せられる分解度を制限し、これによ
ってキャピラリーはせいぜい数回使用するように限定さ
れる。
【００１２】他の制限は、マトリックスの重合化がキャ
ピラリーチューブで行われるとき、重合化は各チューブ
に対して個別に行う必要があり、一般的にはキャピラリ
ーを電気泳動のために使用する前にかなりの猶予（例え
ば夜通しの重合化）を要することである。
ピラリーチューブで行われるとき、重合化は各チューブ
に対して個別に行う必要があり、一般的にはキャピラリ
ーを電気泳動のために使用する前にかなりの猶予（例え
ば夜通しの重合化）を要することである。
【００１３】線状（非架橋）ポリアクリルアミドマトリ
ックスはまたＤＮＡフラグメントの分離に有用であるこ
とが見出された。Heigerら（1990）は６、９、１２％の
Ｔを含有する線状ポリアクリルアミドマトリックスは長
さが約７５〜１２，０００塩基対の大きさ（非変性条
件）の範囲の制限フラグメントのＣＥによる分離に有用
であり、そしてさらに、一層高い％のＴ（例えば９％
Ｔ）は、変性条件下に、長さが４０〜６０塩基の範囲の
ポリデオキシアデニレートの混合物を分解するのに有用
であることを示した。著者らはポリマーマトリックスの
重合化がキャピラリーチューブ内で行われ、高い粘度が
得られ、粘性の溶液の取り扱いの困難性を最小にするこ
とを示唆した。
ックスはまたＤＮＡフラグメントの分離に有用であるこ
とが見出された。Heigerら（1990）は６、９、１２％の
Ｔを含有する線状ポリアクリルアミドマトリックスは長
さが約７５〜１２，０００塩基対の大きさ（非変性条
件）の範囲の制限フラグメントのＣＥによる分離に有用
であり、そしてさらに、一層高い％のＴ（例えば９％
Ｔ）は、変性条件下に、長さが４０〜６０塩基の範囲の
ポリデオキシアデニレートの混合物を分解するのに有用
であることを示した。著者らはポリマーマトリックスの
重合化がキャピラリーチューブ内で行われ、高い粘度が
得られ、粘性の溶液の取り扱いの困難性を最小にするこ
とを示唆した。
【００１４】Sudorら（1991）は３〜１０％のＴ（全ア
クリルアミドの重量％）と７Ｍの尿素を含有する線状ポ
リアクリルアミド溶液を用いるＤＮＡフラグメントの分
離を報告した。ポリアクリルアミド充填キャピラリーチ
ューブはチューブの外側でポリアクリルアミド溶液を形
成し次に重合化溶液を注射器によりチューブ中に押しだ
して形成されるが、圧力をかけ過ぎて注射器を破損しな
いよう注意する。３、５、および１０％のＴを含む溶液
で行ったＣＥ分離の比較は、１０％Ｔが長さ１０〜３６
塩基のオリゴヌクレオチド試験フラグメント（ポリ−ｄ
ｃ）の最良の分解を与えることを示した。
クリルアミドの重量％）と７Ｍの尿素を含有する線状ポ
リアクリルアミド溶液を用いるＤＮＡフラグメントの分
離を報告した。ポリアクリルアミド充填キャピラリーチ
ューブはチューブの外側でポリアクリルアミド溶液を形
成し次に重合化溶液を注射器によりチューブ中に押しだ
して形成されるが、圧力をかけ過ぎて注射器を破損しな
いよう注意する。３、５、および１０％のＴを含む溶液
で行ったＣＥ分離の比較は、１０％Ｔが長さ１０〜３６
塩基のオリゴヌクレオチド試験フラグメント（ポリ−ｄ
ｃ）の最良の分解を与えることを示した。
【００１５】さらに最近は、Mathies、Huang、および共
同研究者ら（Huangら、1992a、b、c；Mathiesら、199
2）がＣＥによるＤＮＡ配列分析について線状ポリアク
リルアミドマトリックス（７Ｍ尿素を含有する９％Ｔ）
を記載した。マトリックスはキャピラリーに対し３００
〜３５０塩基まで（Huangら、1992ｂ）、およびプライ
マーを越えて５００塩基の高さまで（Huangら、1992a）
配列決定が一般に可能であると言われている。高い粘度
のマトリックスはキャピラリーチューブ中で重合化され
物理的に安定で複数（３または４）の試料注入が可能で
あるといえる。
同研究者ら（Huangら、1992a、b、c；Mathiesら、199
2）がＣＥによるＤＮＡ配列分析について線状ポリアク
リルアミドマトリックス（７Ｍ尿素を含有する９％Ｔ）
を記載した。マトリックスはキャピラリーに対し３００
〜３５０塩基まで（Huangら、1992ｂ）、およびプライ
マーを越えて５００塩基の高さまで（Huangら、1992a）
配列決定が一般に可能であると言われている。高い粘度
のマトリックスはキャピラリーチューブ中で重合化され
物理的に安定で複数（３または４）の試料注入が可能で
あるといえる。
【００１６】理想的には、ＤＮＡ配列決定フラグメント
を分離する際に使用するマトリックスは、（ｉ）長さが
３００塩基、好ましくは、長さが５００塩基、またはそ
れよりも大きいＤＮＡ配列決定フラグメントに対する単
一塩基分解を与え、そして、（ii）キャピラリーチュー
ブの迅速な充填と再充填を可能にするに充分な低い粘度
をもつ。
を分離する際に使用するマトリックスは、（ｉ）長さが
３００塩基、好ましくは、長さが５００塩基、またはそ
れよりも大きいＤＮＡ配列決定フラグメントに対する単
一塩基分解を与え、そして、（ii）キャピラリーチュー
ブの迅速な充填と再充填を可能にするに充分な低い粘度
をもつ。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、容易に装填
されキャピラリー電気泳動チューブから除去される低粘
度媒体を与えることによって、ＤＮＡ配列決定フラグメ
ントの単一塩基分解を達成するための改良された方法と
装置を提供すること。
されキャピラリー電気泳動チューブから除去される低粘
度媒体を与えることによって、ＤＮＡ配列決定フラグメ
ントの単一塩基分解を達成するための改良された方法と
装置を提供すること。
【００１８】
【課題を解決するための手段】本発明において、ＤＮＡ
配列決定の混合物中のＤＮＡフラグメントが大きさによ
って分離される、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド
配列を決定する方法であって：この方法は、前記ＤＮＡ
フラグメントを、キャピラリー電気泳動のための媒体を
含む変性水溶液中でのキャピラリー電気泳動によって分
離する工程であって、ここで該溶液が３０℃で約１０〜
約３００センチポアズの粘度を有する工程、を包含し、
ここで、少なくとも約３００塩基長のフラグメントに対
して単一塩基分解が達成される方法が提供される。
配列決定の混合物中のＤＮＡフラグメントが大きさによ
って分離される、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド
配列を決定する方法であって：この方法は、前記ＤＮＡ
フラグメントを、キャピラリー電気泳動のための媒体を
含む変性水溶液中でのキャピラリー電気泳動によって分
離する工程であって、ここで該溶液が３０℃で約１０〜
約３００センチポアズの粘度を有する工程、を包含し、
ここで、少なくとも約３００塩基長のフラグメントに対
して単一塩基分解が達成される方法が提供される。
【００１９】また、本発明において、ＤＮＡ配列決定の
混合物中のＤＮＡフラグメントが大きさによって分離さ
れる、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定
する方法であって：この方法は、前記ＤＮＡフラグメン
トをキャピラリー電気泳動のための媒体を含む変性水溶
液中でのキャピラリー電気泳動によって分離する工程を
包含し、ここで、少なくとも約３００塩基長のフラグメ
ントに対して単一塩基分解が達成される方法が提供され
る。
混合物中のＤＮＡフラグメントが大きさによって分離さ
れる、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定
する方法であって：この方法は、前記ＤＮＡフラグメン
トをキャピラリー電気泳動のための媒体を含む変性水溶
液中でのキャピラリー電気泳動によって分離する工程を
包含し、ここで、少なくとも約３００塩基長のフラグメ
ントに対して単一塩基分解が達成される方法が提供され
る。
【００２０】
【発明の実施の形態】（発明の概要）本発明は、容易に
装填されキャピラリー電気泳動チューブから除去される
低粘度媒体を与えることによって、ＤＮＡ配列決定フラ
グメントの単一塩基分解を達成するための改良された方
法と装置を提供する。
装填されキャピラリー電気泳動チューブから除去される
低粘度媒体を与えることによって、ＤＮＡ配列決定フラ
グメントの単一塩基分解を達成するための改良された方
法と装置を提供する。
【００２１】ひとつの局面では、本発明は標的ポリヌク
レオチドのヌクレオチド配列を決定する改良された自動
化方法を含み、ＤＮＡ配列決定混合物中のＤＮＡフラグ
メントはキャピラリー電気泳動チューブ中の大きさによ
って分離される。改良点は平均分子量が約２０と約１０
０の間の平均分子量をもつ約４〜約７重量％のポリアク
リルアミド分子からなる変性水溶液中のＤＮＡフラグメ
ントの分離を含む。溶液の粘度はチューブの全域で低い
圧力差、例えば約１００psi以下を印加してキャピラリ
ー電気泳動チューブの充填を可能にする。フラグメント
の分離後、ポリアクリルアミド溶液をチューブから除去
し、チューブの両末端全域で圧力差を加えることによっ
て新しい変性水溶液をチューブ中に導入する。
レオチドのヌクレオチド配列を決定する改良された自動
化方法を含み、ＤＮＡ配列決定混合物中のＤＮＡフラグ
メントはキャピラリー電気泳動チューブ中の大きさによ
って分離される。改良点は平均分子量が約２０と約１０
０の間の平均分子量をもつ約４〜約７重量％のポリアク
リルアミド分子からなる変性水溶液中のＤＮＡフラグメ
ントの分離を含む。溶液の粘度はチューブの全域で低い
圧力差、例えば約１００psi以下を印加してキャピラリ
ー電気泳動チューブの充填を可能にする。フラグメント
の分離後、ポリアクリルアミド溶液をチューブから除去
し、チューブの両末端全域で圧力差を加えることによっ
て新しい変性水溶液をチューブ中に導入する。
【００２２】他の局面では、本発明は標的のポリヌクレ
オチドのヌクレオチド配列を決定する改良された方法を
含み、ＤＮＡ配列決定混合物中のＤＮＡフラグメントを
大きさによって分離する。この改良は約４〜約７重量％
の線状ポリアクリルアミド分子からなる変性水溶液中で
のキャピラリー電気泳動によるＤＮＡフラグメントの分
離を含む。
オチドのヌクレオチド配列を決定する改良された方法を
含み、ＤＮＡ配列決定混合物中のＤＮＡフラグメントを
大きさによって分離する。この改良は約４〜約７重量％
の線状ポリアクリルアミド分子からなる変性水溶液中で
のキャピラリー電気泳動によるＤＮＡフラグメントの分
離を含む。
【００２３】好ましくは、線状ポリアクリルアミド分子
は約２０と約１００の間の、さらに好ましくは約５５の
平均分子量をもつ。
は約２０と約１００の間の、さらに好ましくは約５５の
平均分子量をもつ。
【００２４】本方法はさらに小さい選択された範囲につ
いて、例えば長さが約３０ないし約１００または２００
塩基の範囲でのフラグメントについての単一塩基分解を
達成するために使用できるが、本発明に使用するための
分離媒体（ポリマー溶液）は長さが少なくとも約３００
塩基、好ましくは少なくとも５００塩基のフラグメント
のための単一塩基分解を達成するために有効である。
いて、例えば長さが約３０ないし約１００または２００
塩基の範囲でのフラグメントについての単一塩基分解を
達成するために使用できるが、本発明に使用するための
分離媒体（ポリマー溶液）は長さが少なくとも約３００
塩基、好ましくは少なくとも５００塩基のフラグメント
のための単一塩基分解を達成するために有効である。
【００２５】これらおよび他の本発明の目的および特徴
は次の本発明の詳細な説明を添付図面と共に読み取ると
き一層完全に明らかになるであろう。
は次の本発明の詳細な説明を添付図面と共に読み取ると
き一層完全に明らかになるであろう。
【００２６】（定義）「アクリルアミド」および「アク
リルアミド単量体」は構造式ＮＨ2Ｃ（＝Ｏ）ＣＲ1＝Ｃ
Ｒ2Ｒ3をもち、式中のＲ1は水素、Ｒ2とＲ3は水素また
はメチル基であることができる。
リルアミド単量体」は構造式ＮＨ2Ｃ（＝Ｏ）ＣＲ1＝Ｃ
Ｒ2Ｒ3をもち、式中のＲ1は水素、Ｒ2とＲ3は水素また
はメチル基であることができる。
【００２７】「ポリマー」は鎖を形成するように一緒に
共有結合した一層小さい単量体サブユニットからなる大
きい分子を伝統的な意味で使用している。
共有結合した一層小さい単量体サブユニットからなる大
きい分子を伝統的な意味で使用している。
【００２８】「線状ポリアクリルアミド」または「線状
ポリアクリルアミドポリマー」は架橋剤が存在しないで
アクリルアミド単量体から形成されたポリマーをさす。
ポリアクリルアミドポリマー」は架橋剤が存在しないで
アクリルアミド単量体から形成されたポリマーをさす。
【００２９】「架橋ポリアクリルアミド」は３次元の共
有結合架橋ゲルを生成するように架橋剤（例えば、ビス
アクリルアミド）の存在でアクリルアミド単量体から形
成されたポリマーをさす。
有結合架橋ゲルを生成するように架橋剤（例えば、ビス
アクリルアミド）の存在でアクリルアミド単量体から形
成されたポリマーをさす。
【００３０】「変性水溶液」は２次元構造が大部分また
は完全に欠けている単一鎖状態でポリヌクレオチドを維
持するために有効な濃度で変性剤（例えば尿素）を含有
する水溶液をさす。
は完全に欠けている単一鎖状態でポリヌクレオチドを維
持するために有効な濃度で変性剤（例えば尿素）を含有
する水溶液をさす。
【００３１】「ポリマー溶液」の語は本発明の線状ポリ
アクリルアミド分子、すなわち約２０と約１００Ｋｄａ
の間の平均分子量をもつ分子を含む任意の溶液をさす。
このポリマー溶液は前章で定義したような変性剤を含む
ことができる。
アクリルアミド分子、すなわち約２０と約１００Ｋｄａ
の間の平均分子量をもつ分子を含む任意の溶液をさす。
このポリマー溶液は前章で定義したような変性剤を含む
ことができる。
【００３２】「平均分子量」は多数の分子量をもつポリ
マー種から作られた試料母集団の数平均分子量（Ｍｎ）
をさす。この数は次式で定義される： Ｍｎ＝（Σｎi×ＭＷi）／Σｎi 式中のｎiは種ｉの分子数を示し、ＭＷiは種ｉの分子量
である。
マー種から作られた試料母集団の数平均分子量（Ｍｎ）
をさす。この数は次式で定義される： Ｍｎ＝（Σｎi×ＭＷi）／Σｎi 式中のｎiは種ｉの分子数を示し、ＭＷiは種ｉの分子量
である。
【００３３】「電気泳動移動度」は選択された分子種に
ついて単位電界強度につき誘導される定常状態速度をさ
す。電気泳動移動度はチューブ内の特定地点を通過する
ための分子種に要求される時間で、あるいは選択された
時間でのチューブ長に沿った参照地点からの分子種の距
離で判定できる。「相対的電気泳動移動度」は他の分子
種のそれと比較した分子種の電気泳動移動度をさす。
ついて単位電界強度につき誘導される定常状態速度をさ
す。電気泳動移動度はチューブ内の特定地点を通過する
ための分子種に要求される時間で、あるいは選択された
時間でのチューブ長に沿った参照地点からの分子種の距
離で判定できる。「相対的電気泳動移動度」は他の分子
種のそれと比較した分子種の電気泳動移動度をさす。
【００３４】「ＤＮＡ配列決定フラグメント」の語は選
択されたＤＮＡ標的配列について配列情報を得るために
生成したＤＮＡポリヌクレオチドをさす。このようなフ
ラグメントは酵素により、例えばサンガージデオキシ方
法によって、または化学的に、例えばマキサムおよびギ
ルバートのアプローチによって生成することができる。
さらに、フラグメントは単一配列決定反応（例えば、ジ
デオキシシチジントリフォスフェートの存在で行われる
ジデオキシ配列決定反応）から、または１以上の配列決
定反応から（例えば、各フラグメントの３’末端塩基を
同定するために適している標識５’プライマーを含む４
種のジデオキシ配列決定反応から）始めることができ
る。
択されたＤＮＡ標的配列について配列情報を得るために
生成したＤＮＡポリヌクレオチドをさす。このようなフ
ラグメントは酵素により、例えばサンガージデオキシ方
法によって、または化学的に、例えばマキサムおよびギ
ルバートのアプローチによって生成することができる。
さらに、フラグメントは単一配列決定反応（例えば、ジ
デオキシシチジントリフォスフェートの存在で行われる
ジデオキシ配列決定反応）から、または１以上の配列決
定反応から（例えば、各フラグメントの３’末端塩基を
同定するために適している標識５’プライマーを含む４
種のジデオキシ配列決定反応から）始めることができ
る。
【００３５】（発明の詳細な説明）本発明は、ポリヌク
レオチド、そして特に、ＤＮＡ配列決定フラグメントを
分離するための篩分け媒体（ポリマー溶液）に有用な約
２０〜約１００の平均分子量をもつ線状ポリアクリルア
ミド製剤を提供する。電気泳動用に、ポリマー溶液は約
４〜約７重量％の濃度にて、溶液のｐＨを制御するため
の選択された緩衝液と変性剤と共に、線状ポリアクリル
アミドを含む。
レオチド、そして特に、ＤＮＡ配列決定フラグメントを
分離するための篩分け媒体（ポリマー溶液）に有用な約
２０〜約１００の平均分子量をもつ線状ポリアクリルア
ミド製剤を提供する。電気泳動用に、ポリマー溶液は約
４〜約７重量％の濃度にて、溶液のｐＨを制御するため
の選択された緩衝液と変性剤と共に、線状ポリアクリル
アミドを含む。
【００３６】本発明のポリマー溶液はチューブの両端を
横切る小さい圧力差を加えてキャピラリーチューブに導
入することができる。ポリヌクレオチド試料はキャピラ
リーチューブの一端に導入されて電場はチューブの端部
を浸した電極貯槽を横切って印加される。ポリヌクレオ
チドフラグメントは電場を通って移動するので、ポリマ
ー溶液によって安定させた篩分けマトリックスを通る特
異な移動によって長さに基づき分別される。
横切る小さい圧力差を加えてキャピラリーチューブに導
入することができる。ポリヌクレオチド試料はキャピラ
リーチューブの一端に導入されて電場はチューブの端部
を浸した電極貯槽を横切って印加される。ポリヌクレオ
チドフラグメントは電場を通って移動するので、ポリマ
ー溶液によって安定させた篩分けマトリックスを通る特
異な移動によって長さに基づき分別される。
【００３７】本発明のポリマー溶液は特に標的ポリヌク
レオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）分子中の隣接するヌク
レオチド配列を決定するのに有用であるが、溶液の他の
用途は２またはそれ以上の配列間の差（例えば、突然変
異体）の検出、合成オリゴヌクレオチドの純度の評価、
および制限フラグメントの分解とサイジングを含む。
レオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）分子中の隣接するヌク
レオチド配列を決定するのに有用であるが、溶液の他の
用途は２またはそれ以上の配列間の差（例えば、突然変
異体）の検出、合成オリゴヌクレオチドの純度の評価、
および制限フラグメントの分解とサイジングを含む。
【００３８】（Ｉ．キャピラリー電気泳動装置）図１
は、本発明の方法を行うために適したキャピラリー電気
泳動システム２０（アプライド バイオシステムズ、フ
ォスターシティ ＣＡ）の簡略化された概略図である。
このシステムは好ましくは約１０〜２００cm、一般には
約１００cm以下の長さ、および好ましくは約１０〜２０
０μm（ミクロン）、一般には約５０μmの内径（i．
d.）を有するキャピラリーチューブ２２を含む。図に示
した例では、チューブを水平位置に支持し下方に曲げら
れた末端領域をもつ。このキャピラリーチューブは電気
泳動中に電気浸透を制御でき（例えば、電気浸透が約２
×１０-5ｃｍ2／秒−Ｖ以下であるように）、これは試
料と最小に影響し合うかあるいは全く影響しない。ひと
つの好ましいキャピラリーチューブは内径が５０μｍの
（ポリミクロテクノロジーズ、フェニックス、ＡＺから
入手できる）溶融シリカチューブであり、その内側表面
は以下のセクションII．Ｂで詳述するように化学的にコ
ーティングされている。
は、本発明の方法を行うために適したキャピラリー電気
泳動システム２０（アプライド バイオシステムズ、フ
ォスターシティ ＣＡ）の簡略化された概略図である。
このシステムは好ましくは約１０〜２００cm、一般には
約１００cm以下の長さ、および好ましくは約１０〜２０
０μm（ミクロン）、一般には約５０μmの内径（i．
d.）を有するキャピラリーチューブ２２を含む。図に示
した例では、チューブを水平位置に支持し下方に曲げら
れた末端領域をもつ。このキャピラリーチューブは電気
泳動中に電気浸透を制御でき（例えば、電気浸透が約２
×１０-5ｃｍ2／秒−Ｖ以下であるように）、これは試
料と最小に影響し合うかあるいは全く影響しない。ひと
つの好ましいキャピラリーチューブは内径が５０μｍの
（ポリミクロテクノロジーズ、フェニックス、ＡＺから
入手できる）溶融シリカチューブであり、その内側表面
は以下のセクションII．Ｂで詳述するように化学的にコ
ーティングされている。
【００３９】さらに一般に、キャピラリーチューブは、
好ましくは２００μｍまたはそれ以下の内径をもつ、ポ
リマー溶液のカラムを支持することができるチューブま
たは導管のいずれかであることができる。例えば、チュ
ーブはガラススライド等に形成された導管の形にするこ
とができる。
好ましくは２００μｍまたはそれ以下の内径をもつ、ポ
リマー溶液のカラムを支持することができるチューブま
たは導管のいずれかであることができる。例えば、チュ
ーブはガラススライド等に形成された導管の形にするこ
とができる。
【００４０】システム２０の陰極貯槽２６はさらに次の
セクションに述べる電気泳動ポリマー溶液２８を含む。
２２ａで示されるチューブの陰極端を貯槽２６内に密封
し、図に示されるように、電気泳動中に、ポリマー溶液
中に浸漬する。貯槽２６の第２のチューブ３０は細かく
制御した空気圧システム（図には示していない）に連結
し、例えばポリマー溶液を正の圧力によりチューブに装
填するため、ポリマー溶液より上のヘッドスペースで圧
力を制御するために使用することができる。加圧システ
ムは約１００−３００psiまたはそれ以下のキャピラリ
ーチューブの末端を横切る圧力差を発生させることがで
きる。
セクションに述べる電気泳動ポリマー溶液２８を含む。
２２ａで示されるチューブの陰極端を貯槽２６内に密封
し、図に示されるように、電気泳動中に、ポリマー溶液
中に浸漬する。貯槽２６の第２のチューブ３０は細かく
制御した空気圧システム（図には示していない）に連結
し、例えばポリマー溶液を正の圧力によりチューブに装
填するため、ポリマー溶液より上のヘッドスペースで圧
力を制御するために使用することができる。加圧システ
ムは約１００−３００psiまたはそれ以下のキャピラリ
ーチューブの末端を横切る圧力差を発生させることがで
きる。
【００４１】追加として、空気圧システムはキャピラリ
ーチューブを通って溶液を引き出すための真空システム
を含むことができる。
ーチューブを通って溶液を引き出すための真空システム
を含むことができる。
【００４２】システム２０の試料貯槽３１はチューブの
陰極端に装填される試料混合物を含む。好ましくは、試
料は一本鎮形態で試料のポリヌクレオチドを維持する変
性溶液に溶解した。例えば配列決定反応からの乾燥ＤＮ
Ａ試料は１容量の５ｍＭ水性ＥＤＴＡ、および１２容量
のフォルムアミドの混合物に溶解し、試料装填前に２分
間９０℃で加熱する。試料と陰極貯槽はチューブの陰極
端を貯槽流体に浸漬することができる位置に配置するた
め、カルーセル等で運ぶことができる。ここには示して
いないが、カルーセルは、例えば、電気泳動工程の間の
クリーニングおよびフラッシングのための溶液、または
異なるポリマー溶液を含む追加の貯槽を運ぶことができ
る。
陰極端に装填される試料混合物を含む。好ましくは、試
料は一本鎮形態で試料のポリヌクレオチドを維持する変
性溶液に溶解した。例えば配列決定反応からの乾燥ＤＮ
Ａ試料は１容量の５ｍＭ水性ＥＤＴＡ、および１２容量
のフォルムアミドの混合物に溶解し、試料装填前に２分
間９０℃で加熱する。試料と陰極貯槽はチューブの陰極
端を貯槽流体に浸漬することができる位置に配置するた
め、カルーセル等で運ぶことができる。ここには示して
いないが、カルーセルは、例えば、電気泳動工程の間の
クリーニングおよびフラッシングのための溶液、または
異なるポリマー溶液を含む追加の貯槽を運ぶことができ
る。
【００４３】２２ｂで示されるチューブの反対側の陽極
端を、陽極貯槽３４に含まれる陽極電解質溶液３２に浸
す。貯槽２６のチューブ３０に類似の貯槽３４の第２の
チューブ３６は、例えば、貯槽２６のチューブ３０のよ
うに、ポリマー溶液をチューブに装填するため、溶液３
２の上の圧力を制御することを含ませることができる。
代表的には、電解質溶液２８と３２の組成はキャピラリ
ーチューブ中のポリマー溶液と同一である。
端を、陽極貯槽３４に含まれる陽極電解質溶液３２に浸
す。貯槽２６のチューブ３０に類似の貯槽３４の第２の
チューブ３６は、例えば、貯槽２６のチューブ３０のよ
うに、ポリマー溶液をチューブに装填するため、溶液３
２の上の圧力を制御することを含ませることができる。
代表的には、電解質溶液２８と３２の組成はキャピラリ
ーチューブ中のポリマー溶液と同一である。
【００４４】試料装填と続く電気泳動による試料分離の
ため、充填したキャピラリーチューブと電極貯槽は好ま
しくはチューブを通る正味の液体流が少ししかまたはな
いように配置する。これは同じ高さに電極貯槽溶液の表
面を保ち、あるいは２つの溶液の上の大気圧を制御して
行うことができる。
ため、充填したキャピラリーチューブと電極貯槽は好ま
しくはチューブを通る正味の液体流が少ししかまたはな
いように配置する。これは同じ高さに電極貯槽溶液の表
面を保ち、あるいは２つの溶液の上の大気圧を制御して
行うことができる。
【００４５】システムの高電圧供給器４０は図に示され
るように陰極および陽極の貯槽に連結し、２つの貯槽間
に選択された電位を印加する。電圧供給リード線は、そ
れぞれ、陰極および陽極貯槽のプラチナ電極４１と４２
に連結される。電圧供給は、好ましくは６kVと２０kVの
電圧設定で、電極を横切って定電圧（ＤＣ）を印加する
ように設計することができる。
るように陰極および陽極の貯槽に連結し、２つの貯槽間
に選択された電位を印加する。電圧供給リード線は、そ
れぞれ、陰極および陽極貯槽のプラチナ電極４１と４２
に連結される。電圧供給は、好ましくは６kVと２０kVの
電圧設定で、電極を横切って定電圧（ＤＣ）を印加する
ように設計することができる。
【００４６】システム中の検出器４４はチューブの陽極
端付近に配置され、チューブ内の光学検出ゾーン４５を
通って移動する試料ピークをモニターする。一般的に
は、キャピラリーチュービングは小さい窓を作るように
外部のポリイミドコーティング（ポリイミド被覆キャピ
ラリーの場合には）の小さい領域を除くように処理され
た。検出器はＵＶまたは可視吸収光検出のために、およ
び／または例えば蛍光放射検出またはラジオアイソトー
プ検出のために設計される。
端付近に配置され、チューブ内の光学検出ゾーン４５を
通って移動する試料ピークをモニターする。一般的に
は、キャピラリーチュービングは小さい窓を作るように
外部のポリイミドコーティング（ポリイミド被覆キャピ
ラリーの場合には）の小さい領域を除くように処理され
た。検出器はＵＶまたは可視吸収光検出のために、およ
び／または例えば蛍光放射検出またはラジオアイソトー
プ検出のために設計される。
【００４７】好ましくは、蛍光放射検出は、試料分子と
会合した蛍光種によって、約２４０〜６００nmに調整で
きる１またはそれ以上の選択された励起波長で行われ
る。一般的には、検出器は励起源としてアルゴンレーザ
ーを用いる。好ましくは、共焦の光学配置を使用する
（例えば、Huangら、1992）。電気泳動ピークを記録す
るため、検出器を積分器／プロッター４６に連結し、磁
気媒体等のデーター貯蔵のためのコンピューターの形を
とることができる。
会合した蛍光種によって、約２４０〜６００nmに調整で
きる１またはそれ以上の選択された励起波長で行われ
る。一般的には、検出器は励起源としてアルゴンレーザ
ーを用いる。好ましくは、共焦の光学配置を使用する
（例えば、Huangら、1992）。電気泳動ピークを記録す
るため、検出器を積分器／プロッター４６に連結し、磁
気媒体等のデーター貯蔵のためのコンピューターの形を
とることができる。
【００４８】ラジオアイソトープ検出は3Ｈまたは14Ｃ
のための改良されたＨＰＬＣアイソトープ検出器を使用
して行うことができる（ラジオマチック インストルメ
ンツアンド ケミカル社、メリデン、ＣＴ）。32Ｐ標識
ピークの検出のため、半導体またはシンチレーションに
基づくラジオアイソトープ検出器装置を使用することが
できる（Pentonyら、1989a、b）。ガンマ線検出のため
に配列した検出器も使用できる（例えば、Altariaら、1
990）。
のための改良されたＨＰＬＣアイソトープ検出器を使用
して行うことができる（ラジオマチック インストルメ
ンツアンド ケミカル社、メリデン、ＣＴ）。32Ｐ標識
ピークの検出のため、半導体またはシンチレーションに
基づくラジオアイソトープ検出器装置を使用することが
できる（Pentonyら、1989a、b）。ガンマ線検出のため
に配列した検出器も使用できる（例えば、Altariaら、1
990）。
【００４９】操作において、キャピラリーチューブは適
当な溶液貯槽の上のヘッドスペースに正圧を印加してチ
ューブを通る適当なすすぎ溶液をフラッシングして完全
に洗浄する。あるいは、キャピラリーを注射器によって
手で洗浄できる。本発明の実施において、ポリマー含有
電解質溶液それ自身を使用して試料操作間のシステムを
フラッシングする。ポリマー電解質溶液とは異なる洗浄
溶液を使用する場合、次にチューブを数容量のポリマー
溶液でフラシングする。
当な溶液貯槽の上のヘッドスペースに正圧を印加してチ
ューブを通る適当なすすぎ溶液をフラッシングして完全
に洗浄する。あるいは、キャピラリーを注射器によって
手で洗浄できる。本発明の実施において、ポリマー含有
電解質溶液それ自身を使用して試料操作間のシステムを
フラッシングする。ポリマー電解質溶液とは異なる洗浄
溶液を使用する場合、次にチューブを数容量のポリマー
溶液でフラシングする。
【００５０】次に試料は、一般的には動電学的な注入に
よって、チューブの陰極端に装填する。チューブの陰極
端を試料溶液中におき、短い高電圧パルスをチューブの
両端を横切って印加する（例えば、６kVを５秒間）。次
にチューブ端を陰極貯槽２６の溶液に戻し、所望の数の
フラグメントピークが検出ゾーンを通過するまで分離電
圧（例えば、１２kV）を印加する。
よって、チューブの陰極端に装填する。チューブの陰極
端を試料溶液中におき、短い高電圧パルスをチューブの
両端を横切って印加する（例えば、６kVを５秒間）。次
にチューブ端を陰極貯槽２６の溶液に戻し、所望の数の
フラグメントピークが検出ゾーンを通過するまで分離電
圧（例えば、１２kV）を印加する。
【００５１】多数の試料の自動化電気泳動のために、装
置はチューブ内の試料の移動を同時にモニターするため
のキャピラリーチューブと適当な検出手段の配列を含む
ように適合させることができる。このような配置によっ
て、同じ試料または多くの異なる試料をこのような配列
を用いて同時に分析することができる。
置はチューブ内の試料の移動を同時にモニターするため
のキャピラリーチューブと適当な検出手段の配列を含む
ように適合させることができる。このような配置によっ
て、同じ試料または多くの異なる試料をこのような配列
を用いて同時に分析することができる。
【００５２】（ＩＩ．線状ポリアクリルアミド組成物）
上記のように、本発明は選択された濃度の線状ポリアク
リルアミド分子を選択された分子量の範囲で含む低粘度
溶液を使用してキャピラリー電気泳動中の大きいＤＮＡ
配列決定フラグメントの単一塩基分解を与えるという発
見に基づく。本発明のポリマー溶液は粘度が、ＤＮＡ配
列決定フラグメントの高分解分離のために予め使用した
線状ポリアクリルアミド媒体よりもかなり低い。
上記のように、本発明は選択された濃度の線状ポリアク
リルアミド分子を選択された分子量の範囲で含む低粘度
溶液を使用してキャピラリー電気泳動中の大きいＤＮＡ
配列決定フラグメントの単一塩基分解を与えるという発
見に基づく。本発明のポリマー溶液は粘度が、ＤＮＡ配
列決定フラグメントの高分解分離のために予め使用した
線状ポリアクリルアミド媒体よりもかなり低い。
【００５３】（ＩＩ．Ａ 線状ポリアクリルアミドの調
製）本発明の線状ポリアクリルアミドの分子は平均分子
量が約２０と約１００の間によって特徴づけられる。
製）本発明の線状ポリアクリルアミドの分子は平均分子
量が約２０と約１００の間によって特徴づけられる。
【００５４】ポリマー母集団の平均分子量は多くのファ
クターによって調整することができる。ひとつのアプロ
ーチでは、重合化の条件が最終のポリマー母集団のＭＷ
を変えるために変えられる。平均分子量は（１）反応温
度を高くする、（２）ラジカル開始剤とアクリルアミド
単量体の比を増加する、または（３）鎖移動試薬の量を
増加することによって減らすことができる。使用できる
移動試薬は低級アルキルアルコールを含み、好ましくは
イソプロパノールを用いる。
クターによって調整することができる。ひとつのアプロ
ーチでは、重合化の条件が最終のポリマー母集団のＭＷ
を変えるために変えられる。平均分子量は（１）反応温
度を高くする、（２）ラジカル開始剤とアクリルアミド
単量体の比を増加する、または（３）鎖移動試薬の量を
増加することによって減らすことができる。使用できる
移動試薬は低級アルキルアルコールを含み、好ましくは
イソプロパノールを用いる。
【００５５】実施例１は本発明による線状ポリアクリル
アミド製剤を調製するための方法を記載する。この方法
では、水（２２２ml）中のイソプロパノール（６．５５
ml）の混合物を３５℃で１０分間撹拌し、その間ヘリウ
ムで脱気する。次にアクリルアミド（２５ｇ）を加えて
完全に溶解させる。アクリルアミドが溶解した後、約
０．０５％（それぞれＴＭＥＤおよびＡＰＳに対する
ｗ：ｖおよびｖ：ｖ）の最終濃度まで、ＴＭＥＤ（Ｎ，
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン）およ
びＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）を添加して重合を開始
し、そして９０分間激しく撹拌しながら重合を続ける。
アミド製剤を調製するための方法を記載する。この方法
では、水（２２２ml）中のイソプロパノール（６．５５
ml）の混合物を３５℃で１０分間撹拌し、その間ヘリウ
ムで脱気する。次にアクリルアミド（２５ｇ）を加えて
完全に溶解させる。アクリルアミドが溶解した後、約
０．０５％（それぞれＴＭＥＤおよびＡＰＳに対する
ｗ：ｖおよびｖ：ｖ）の最終濃度まで、ＴＭＥＤ（Ｎ，
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン）およ
びＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）を添加して重合を開始
し、そして９０分間激しく撹拌しながら重合を続ける。
【００５６】好ましくは、ポリマー溶液は数日間にわた
って緩衝液の複数の変化に対して１２〜１４のＭＷカッ
トオフ透析管で透析し低分子量の反応物を除去する。透
析に続いて、ポリマー溶液を凍結乾燥し、約４０％の収
率で乾燥ポリマーを得る。
って緩衝液の複数の変化に対して１２〜１４のＭＷカッ
トオフ透析管で透析し低分子量の反応物を除去する。透
析に続いて、ポリマー溶液を凍結乾燥し、約４０％の収
率で乾燥ポリマーを得る。
【００５７】ポリマーの平均ＭＷを調整するための第２
の方法はポリマーを異なるＭＷフラクションに分別して
単離と精製を行う。ポリマーの水溶液を大きさに依存す
るクロマトグラフィー分離（例えばゲル浸透クロマトグ
ラフィー）またはメタノールのような水混合性溶媒を用
いる分別沈澱によって分別する。
の方法はポリマーを異なるＭＷフラクションに分別して
単離と精製を行う。ポリマーの水溶液を大きさに依存す
るクロマトグラフィー分離（例えばゲル浸透クロマトグ
ラフィー）またはメタノールのような水混合性溶媒を用
いる分別沈澱によって分別する。
【００５８】都合のよいことには、このようにして得ら
れたポリマーの分子量分布は上で定義したような数平均
分子量として示される。平均分子量は当該分野でよく知
られている方法（例えば、Hiemenz、1986、42〜49頁参
照）に従ってゲル浸透クロマトグラフィーを用いて決定
される。簡単には、既知の分子量組成のいくらかのポリ
アクリルアミド標準品の保持時間は分子量と溶出時間の
相関関係を算定する標準曲線を確立するように決定され
る。標準曲線を使用して溶出時間に基づいた試料の平均
分子量を決定する。例示的な分子量の決定は実施例２に
与えられる。
れたポリマーの分子量分布は上で定義したような数平均
分子量として示される。平均分子量は当該分野でよく知
られている方法（例えば、Hiemenz、1986、42〜49頁参
照）に従ってゲル浸透クロマトグラフィーを用いて決定
される。簡単には、既知の分子量組成のいくらかのポリ
アクリルアミド標準品の保持時間は分子量と溶出時間の
相関関係を算定する標準曲線を確立するように決定され
る。標準曲線を使用して溶出時間に基づいた試料の平均
分子量を決定する。例示的な分子量の決定は実施例２に
与えられる。
【００５９】（ＩＩ．Ｂ ポリマー溶液）単一鎖ポリヌ
クレオチドを分離するため、ポリマー溶液は大きくまた
は全体的に二次構造が全くない単一鎖状態でポリヌクレ
オチドを維持するために有効な濃度で変性剤を含む。一
般的に、７〜８Ｍの濃度での尿素が使用される。一般
に、本発明でのＤＮＡフラグメントを分離するために用
いられるポリマー溶液は３０℃で測定するとき、約１０
〜約３００センチポアズの粘度をもつ。
クレオチドを分離するため、ポリマー溶液は大きくまた
は全体的に二次構造が全くない単一鎖状態でポリヌクレ
オチドを維持するために有効な濃度で変性剤を含む。一
般的に、７〜８Ｍの濃度での尿素が使用される。一般
に、本発明でのＤＮＡフラグメントを分離するために用
いられるポリマー溶液は３０℃で測定するとき、約１０
〜約３００センチポアズの粘度をもつ。
【００６０】また溶液は約４〜９の間の選択された値で
溶液のｐＨを維持するための緩衝液を含む。使用した任
意所定の緩衝液種に対して、最大の試料ピーク分解のた
めの最適濃度が存在する。バンド幅を広げるには低すぎ
る濃度（低いイオン強度）または高すぎる濃度（高いイ
オン強度）にて発生させることができる。一般に、双極
性イオン緩衝液は分解を改善しバックグラウンドＵＶ吸
収の変動を減らす。
溶液のｐＨを維持するための緩衝液を含む。使用した任
意所定の緩衝液種に対して、最大の試料ピーク分解のた
めの最適濃度が存在する。バンド幅を広げるには低すぎ
る濃度（低いイオン強度）または高すぎる濃度（高いイ
オン強度）にて発生させることができる。一般に、双極
性イオン緩衝液は分解を改善しバックグラウンドＵＶ吸
収の変動を減らす。
【００６１】単一鎖ポリヌクレオチドの高分解を達成す
るため、本発明のポリマーは約４〜約７重量％の濃度で
ポリマー溶液中に存在する。
るため、本発明のポリマーは約４〜約７重量％の濃度で
ポリマー溶液中に存在する。
【００６２】本発明の重要な局面によれば、本発明のポ
リマー溶液は容易に流れ、キャピラリーチューブの容易
に迅速な充填と再充填を行うことができる。好ましく
は、約１００psi以下、好ましくは５０psi以下のチュー
ブを横切る圧力差を用いて、５０cm×内径５０μｍのキ
ャピラリーチューブを３０分以内に充填することができ
るように粘度は充分に低くする（３０℃で測定して、約
１０ないし約３００センチポアズ）。あるいは、注射器
を使用して軽く圧力を加えて、実施例４のポリマー溶液
を６０秒以下でこのようなキャピラリーに装填すること
ができる。迅速な充填の特徴は特にＤＮＡ配列分析用の
自動化キャピラリー電気泳動法に敏感に反応することで
ある。
リマー溶液は容易に流れ、キャピラリーチューブの容易
に迅速な充填と再充填を行うことができる。好ましく
は、約１００psi以下、好ましくは５０psi以下のチュー
ブを横切る圧力差を用いて、５０cm×内径５０μｍのキ
ャピラリーチューブを３０分以内に充填することができ
るように粘度は充分に低くする（３０℃で測定して、約
１０ないし約３００センチポアズ）。あるいは、注射器
を使用して軽く圧力を加えて、実施例４のポリマー溶液
を６０秒以下でこのようなキャピラリーに装填すること
ができる。迅速な充填の特徴は特にＤＮＡ配列分析用の
自動化キャピラリー電気泳動法に敏感に反応することで
ある。
【００６３】以下の表１は１０ないし３００センチポア
ズのポリマー粘度（η）での上記キャピラリーチューブ
のための計算した充填時間を示す。
ズのポリマー粘度（η）での上記キャピラリーチューブ
のための計算した充填時間を示す。
【００６４】
【表１】 （ＩＩ．Ｃ キャピラリーチューブの調製と充填）本発
明に使用するキャピラリーチューブは電気泳動中に電気
浸透を抑えることができ、試料とは最小限の相互作用が
あるかまたは全くないタイプのものである（例えば、電
気浸透が約２×１０-5ｃｍ／秒−Ｖ以下である）。好ま
しいキャピラリーチューブは内径が約２００ミクロン以
下、好ましくは約１００ミクロン以下のものであり、２
５ミクロン以下の寸法も考えられるが、さらに好ましく
は約２５〜５０ミクロンの範囲内である。
明に使用するキャピラリーチューブは電気泳動中に電気
浸透を抑えることができ、試料とは最小限の相互作用が
あるかまたは全くないタイプのものである（例えば、電
気浸透が約２×１０-5ｃｍ／秒−Ｖ以下である）。好ま
しいキャピラリーチューブは内径が約２００ミクロン以
下、好ましくは約１００ミクロン以下のものであり、２
５ミクロン以下の寸法も考えられるが、さらに好ましく
は約２５〜５０ミクロンの範囲内である。
【００６５】一般的に、チューブは構造上の剛性を与え
るように外部ポリイミドコーティングをもつ溶融シリカ
からなる。電気浸透はチューブの内側シリカ表面に沿っ
て負の電荷をマスキングして抑えることができる。この
ようなマスキングは、当該分野で知られているアプロー
チを用い、内側表面に共有結合または非共有結合してい
る化学コーティングを適用して行われる。Cobbら（199
0）の方法に基づく適当な共有コーティングを調製する
ための方法の詳細は実施例３に提供される。選択したコ
ーティングは、少なくとも１日の複数の操作（例えば、
約８時間にわたって行われる連続５操作にわたる）に対
し、使用した分離条件下に安定でなければならず、好ま
しくは長さが３００塩基で、好ましくは長さが５００塩
基まで、またはそれ以上のフラグメントのための単一塩
基分解を与える。
るように外部ポリイミドコーティングをもつ溶融シリカ
からなる。電気浸透はチューブの内側シリカ表面に沿っ
て負の電荷をマスキングして抑えることができる。この
ようなマスキングは、当該分野で知られているアプロー
チを用い、内側表面に共有結合または非共有結合してい
る化学コーティングを適用して行われる。Cobbら（199
0）の方法に基づく適当な共有コーティングを調製する
ための方法の詳細は実施例３に提供される。選択したコ
ーティングは、少なくとも１日の複数の操作（例えば、
約８時間にわたって行われる連続５操作にわたる）に対
し、使用した分離条件下に安定でなければならず、好ま
しくは長さが３００塩基で、好ましくは長さが５００塩
基まで、またはそれ以上のフラグメントのための単一塩
基分解を与える。
【００６６】実施例３に記載されるコーティング方法で
は、溶融シリカキャピラリーチューブを１．０ＭのＮａ
ＯＨで洗い流し次に３工程方法を用いてコーティングす
る。第１の工程では、内壁のシリカ表面は塩化チオニル
を用いて塩素化される。塩素化に先だって、チューブは
約８０カラム容量の乾燥蒸留テトラヒドロフラン（ＴＨ
Ｆ）を用いて洗い流して、内壁表面を乾燥する。残りの
ＴＨＦを（例えば、ヘリウムによって）除去した後、少
量のジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）を含む塩化チオ
ニル溶液をチューブに通過させてシリカ表面を塩素化す
る。反応は互いにチューブの両端を結合しチューブをオ
ーブン中で５５℃にてインキュベートすることにより一
晩中続けられる。
は、溶融シリカキャピラリーチューブを１．０ＭのＮａ
ＯＨで洗い流し次に３工程方法を用いてコーティングす
る。第１の工程では、内壁のシリカ表面は塩化チオニル
を用いて塩素化される。塩素化に先だって、チューブは
約８０カラム容量の乾燥蒸留テトラヒドロフラン（ＴＨ
Ｆ）を用いて洗い流して、内壁表面を乾燥する。残りの
ＴＨＦを（例えば、ヘリウムによって）除去した後、少
量のジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）を含む塩化チオ
ニル溶液をチューブに通過させてシリカ表面を塩素化す
る。反応は互いにチューブの両端を結合しチューブをオ
ーブン中で５５℃にてインキュベートすることにより一
晩中続けられる。
【００６７】第２の工程では、チューブは乾燥蒸留ＴＨ
Ｆをカラムの数倍容量用いて洗い流して塩化チオニル溶
液を除去し、次に、ＴＨＦ中のビニルマグネシウムブロ
ミド（グリニヤ試薬）の１Ｍ溶液を用いて（〜１００倍
のカラム容量を約５時間）洗い流す。チューブを間欠的
にヒートガンを用いて加熱し反応を容易にする。５時間
洗い流す工程の後、チューブの両端を再び相互に連結し
て終夜７０℃にて加熱する。
Ｆをカラムの数倍容量用いて洗い流して塩化チオニル溶
液を除去し、次に、ＴＨＦ中のビニルマグネシウムブロ
ミド（グリニヤ試薬）の１Ｍ溶液を用いて（〜１００倍
のカラム容量を約５時間）洗い流す。チューブを間欠的
にヒートガンを用いて加熱し反応を容易にする。５時間
洗い流す工程の後、チューブの両端を再び相互に連結し
て終夜７０℃にて加熱する。
【００６８】第３の工程では、表面ビニル基をアクリル
アミドと反応させる。まずキャピラリーをＴＨＦ（グリ
ニヤ試薬を除くため）、メタノール水で逐次洗い流して
条件を整える。次にチューブを３０分間新しく調製した
３％（ｗ：ｖ）アクリルアミド単量体、０．１％（ｖ：
ｖ）ＴＭＥＤ、および０．１％（ｗ：ｖ）ＡＰＳを含む
重合化水溶液で洗い流す。この工程に続いて、チューブ
を水で洗い流してヘリウム流で乾燥させる。乾燥したコ
ーティングチューブを使用するまで−２０℃で貯蔵する
ことができる。
アミドと反応させる。まずキャピラリーをＴＨＦ（グリ
ニヤ試薬を除くため）、メタノール水で逐次洗い流して
条件を整える。次にチューブを３０分間新しく調製した
３％（ｗ：ｖ）アクリルアミド単量体、０．１％（ｖ：
ｖ）ＴＭＥＤ、および０．１％（ｗ：ｖ）ＡＰＳを含む
重合化水溶液で洗い流す。この工程に続いて、チューブ
を水で洗い流してヘリウム流で乾燥させる。乾燥したコ
ーティングチューブを使用するまで−２０℃で貯蔵する
ことができる。
【００６９】ポリマー溶液の試料分離用キャピラリーチ
ューブへの装填は注射器により、あるいはキャピラリー
チューブの一端を浸す貯槽溶液上のヘッドスペースに正
の圧力をかけて、手軽に行われる。注射器による装填の
ために、キャピラリーチューブの一端は注射器に連結
し、ポリマー溶液を注射器のプランジャに軽く圧力をか
けてチューブに装填する。５０cm×内径５０μｍのキャ
ピラリーチューブを注射器により６０秒以内に充填で
き、チューブ内に気泡をトラップすることがない。
ューブへの装填は注射器により、あるいはキャピラリー
チューブの一端を浸す貯槽溶液上のヘッドスペースに正
の圧力をかけて、手軽に行われる。注射器による装填の
ために、キャピラリーチューブの一端は注射器に連結
し、ポリマー溶液を注射器のプランジャに軽く圧力をか
けてチューブに装填する。５０cm×内径５０μｍのキャ
ピラリーチューブを注射器により６０秒以内に充填で
き、チューブ内に気泡をトラップすることがない。
【００７０】好ましくは、自動化ＣＥ装置に使用するた
め、貯槽溶液上のヘッドスペースでチューブに正の圧力
をかけてポリマー溶液を装填または再装填する。このア
プローチではキャピラリーチューブの一端（例えば陽極
端）を貯槽に含まれるポリマー溶液に（例えば上記セク
ションＩのようなＣＥ装置の陽極貯槽中で）浸す。貯槽
溶液上のヘッドスペースはキャピラリーチューブの一端
を貯槽溶液に通過させるように採用した適当なシーリン
グ手段によって外側の大気から密閉される。さらにシー
リング手段は制御できる気体圧力源（例えば適当な制御
手段をもつ圧搾気体シリンダー）に貯槽のヘッドスペー
スを接近させる。正の圧力を陽極溶液上のヘッドスペー
スに加えて、チューブ端を横切る圧力差を生じさせ、陽
極貯槽溶液をチューブに移動させる。上記のように、本
発明に使用される低粘度溶液は低圧、例えば１００psi
またはそれ以下でキャピラリーチューブに迅速に導かれ
る。圧力差は、溶液がチューブの陰極端に出るまで、陰
極端が陰極溶液に浸される時間保持される。
め、貯槽溶液上のヘッドスペースでチューブに正の圧力
をかけてポリマー溶液を装填または再装填する。このア
プローチではキャピラリーチューブの一端（例えば陽極
端）を貯槽に含まれるポリマー溶液に（例えば上記セク
ションＩのようなＣＥ装置の陽極貯槽中で）浸す。貯槽
溶液上のヘッドスペースはキャピラリーチューブの一端
を貯槽溶液に通過させるように採用した適当なシーリン
グ手段によって外側の大気から密閉される。さらにシー
リング手段は制御できる気体圧力源（例えば適当な制御
手段をもつ圧搾気体シリンダー）に貯槽のヘッドスペー
スを接近させる。正の圧力を陽極溶液上のヘッドスペー
スに加えて、チューブ端を横切る圧力差を生じさせ、陽
極貯槽溶液をチューブに移動させる。上記のように、本
発明に使用される低粘度溶液は低圧、例えば１００psi
またはそれ以下でキャピラリーチューブに迅速に導かれ
る。圧力差は、溶液がチューブの陰極端に出るまで、陰
極端が陰極溶液に浸される時間保持される。
【００７１】先に述べたように、充填したキャピラリー
チューブと電極貯槽は好ましくはチューブを通る正味の
液体流が殆どないかまたはないように配置される。これ
は同じ高さに電極貯槽溶液表面を保持し、または２つの
溶液上の大気圧を制御して行うことができる。
チューブと電極貯槽は好ましくはチューブを通る正味の
液体流が殆どないかまたはないように配置される。これ
は同じ高さに電極貯槽溶液表面を保持し、または２つの
溶液上の大気圧を制御して行うことができる。
【００７２】（ＩＩＩ．電気泳動法）電気泳動により分
離されるポリヌクレオチド試料は標準法によって調製さ
れる。一般的には試料は１またはそれ以上の配列決定反
応から誘導されるＤＮＡ配列決定フラグメントの混合物
である。ＤＮＡ配列決定のための２つの最初の技術は化
学法（例えば、MaxamとGilbert、1970）と酵素法（例え
ば、Sangerら、1977）である。両者の技術のためのルー
チンプロトコルは広く入手可能である（例えばAusube
l；Sambrook、1989）。アプローチにおいてこれらの技
術は異なるが、両者は限定された５’末端塩基部位で始
まり選択された塩基または選択された塩基の組み合せで
ランダムに終わるポリヌクレオチド（配列決定フラグメ
ント）の母集団を生成する。（ＤＮＡのためのこの４つ
の標準ヌクレオチド塩基はデオキシアデニレート、デオ
キシシチジレート、デオキシグアニレート、およびチミ
ジレートであり、それぞれＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴとして
略記される）。一般的にはフラグメントは、高められた
検出のためにレポーター標識（「レポーター」または
「標識」と交互に呼ばれる）を含み、１またはそれ以上
の異なる選択された末端塩基で終わる他のフラグメント
から選択された塩基で終わるフラグメントを区別するた
めに適する。いずれかまたは両方の目的のために適して
いる任意の標識を使用することができ、蛍光標識が好適
である。例えば、フラグメントを蛍光またはラジオ標識
５’プライマーを使用して、蛍光標識ジデオキシ末端ヌ
クレオチド（例えば、Bergotら、1991）を使用して、ま
たは放射化ヌクレオチド（例えは、 35Ｓ標識ｄＡＴＰ）
を使用して標識を付けることができる。
離されるポリヌクレオチド試料は標準法によって調製さ
れる。一般的には試料は１またはそれ以上の配列決定反
応から誘導されるＤＮＡ配列決定フラグメントの混合物
である。ＤＮＡ配列決定のための２つの最初の技術は化
学法（例えば、MaxamとGilbert、1970）と酵素法（例え
ば、Sangerら、1977）である。両者の技術のためのルー
チンプロトコルは広く入手可能である（例えばAusube
l；Sambrook、1989）。アプローチにおいてこれらの技
術は異なるが、両者は限定された５’末端塩基部位で始
まり選択された塩基または選択された塩基の組み合せで
ランダムに終わるポリヌクレオチド（配列決定フラグメ
ント）の母集団を生成する。（ＤＮＡのためのこの４つ
の標準ヌクレオチド塩基はデオキシアデニレート、デオ
キシシチジレート、デオキシグアニレート、およびチミ
ジレートであり、それぞれＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴとして
略記される）。一般的にはフラグメントは、高められた
検出のためにレポーター標識（「レポーター」または
「標識」と交互に呼ばれる）を含み、１またはそれ以上
の異なる選択された末端塩基で終わる他のフラグメント
から選択された塩基で終わるフラグメントを区別するた
めに適する。いずれかまたは両方の目的のために適して
いる任意の標識を使用することができ、蛍光標識が好適
である。例えば、フラグメントを蛍光またはラジオ標識
５’プライマーを使用して、蛍光標識ジデオキシ末端ヌ
クレオチド（例えば、Bergotら、1991）を使用して、ま
たは放射化ヌクレオチド（例えは、 35Ｓ標識ｄＡＴＰ）
を使用して標識を付けることができる。
【００７３】通常は、Sangerらのジデオキシ（酵素）法
を使用する。この方法ではＤＮＡ鋳型は簡単な溶液の加
熱（例えば、６０℃で１０分間）、続いて２０〜３０分
間、４〜２０℃までのゆっくりした冷却によって溶液中
で５’プライマーオリゴヌクレオチドにアニールする。
好ましくは、プライマーは、プライマー中で５’末端塩
基に共有結合する蛍光標識を含む。使用できる適当な蛍
光染料および標識を付す方法は、ここに参考文献として
組み込まれる米国特許4,855,525に記載されている。次
に、鋳型−プライマー溶液は（ｉ）４つの標準ヌクレオ
チド塩基の選択された濃度、（ii）選択された末端塩基
のジデオキシ形態の選択された濃度、および（iii）Ｄ
ＮＡポリメラーゼの存在で、インキュベートされる。ポ
リメラーゼ触媒反応は選択された時間行われ、次に適当
な手段によって（例えば冷エタノール中で反応を静める
ことによって）停止させる。望ましい場合には、１また
はそれ以上の標準塩基を選択されたヌクレオチド類似
体：例えば、ピーク圧縮を避けるため、ｄＧＴＰの代わ
りにｃ７ｄＧＴＰと置換することができる。ＤＮＡポリ
メラーゼのこの働きは、（標識を付けた）５’プライマ
ー配列で開始し、選択された末端塩基のジデオキシ形態
でそれらの３’末端で終端し、配列において鋳型ＤＮＡ
に相補的である標識を付けたＤＮＡフラグメントを生成
するために効果的である。
を使用する。この方法ではＤＮＡ鋳型は簡単な溶液の加
熱（例えば、６０℃で１０分間）、続いて２０〜３０分
間、４〜２０℃までのゆっくりした冷却によって溶液中
で５’プライマーオリゴヌクレオチドにアニールする。
好ましくは、プライマーは、プライマー中で５’末端塩
基に共有結合する蛍光標識を含む。使用できる適当な蛍
光染料および標識を付す方法は、ここに参考文献として
組み込まれる米国特許4,855,525に記載されている。次
に、鋳型−プライマー溶液は（ｉ）４つの標準ヌクレオ
チド塩基の選択された濃度、（ii）選択された末端塩基
のジデオキシ形態の選択された濃度、および（iii）Ｄ
ＮＡポリメラーゼの存在で、インキュベートされる。ポ
リメラーゼ触媒反応は選択された時間行われ、次に適当
な手段によって（例えば冷エタノール中で反応を静める
ことによって）停止させる。望ましい場合には、１また
はそれ以上の標準塩基を選択されたヌクレオチド類似
体：例えば、ピーク圧縮を避けるため、ｄＧＴＰの代わ
りにｃ７ｄＧＴＰと置換することができる。ＤＮＡポリ
メラーゼのこの働きは、（標識を付けた）５’プライマ
ー配列で開始し、選択された末端塩基のジデオキシ形態
でそれらの３’末端で終端し、配列において鋳型ＤＮＡ
に相補的である標識を付けたＤＮＡフラグメントを生成
するために効果的である。
【００７４】隣接する塩基の配列を決定する場合、４つ
の別々の配列決定反応を、各標識塩基に対して１つに行
うことが好ましい。さらに、また各反応に対して、異な
る標識を使用し、各配列決定反応に生成したフラグメン
トを他の３つの反応に生成したフラグメントから区別で
きるようにすることが好ましい。この目的にあったスペ
クトルで分解できる蛍光染料の種類は記載されており
（例えば米国特許4,855,525；Smithら、1985）、これに
よって４つの配列決定反応からのフラグメントを同じレ
ーン（移動路）で電気泳動により分離することができ
る。４種のスペクトルで分解できる蛍光染料（ＦＡＭ、
ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、およびＲＯＸと呼ぶ）で各々標識
を付された４種の「ユニバーサル」Ｍ１３ ５’−プラ
イマーをアプライド バイオシステムズから市販品とし
て入手できる。
の別々の配列決定反応を、各標識塩基に対して１つに行
うことが好ましい。さらに、また各反応に対して、異な
る標識を使用し、各配列決定反応に生成したフラグメン
トを他の３つの反応に生成したフラグメントから区別で
きるようにすることが好ましい。この目的にあったスペ
クトルで分解できる蛍光染料の種類は記載されており
（例えば米国特許4,855,525；Smithら、1985）、これに
よって４つの配列決定反応からのフラグメントを同じレ
ーン（移動路）で電気泳動により分離することができ
る。４種のスペクトルで分解できる蛍光染料（ＦＡＭ、
ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、およびＲＯＸと呼ぶ）で各々標識
を付された４種の「ユニバーサル」Ｍ１３ ５’−プラ
イマーをアプライド バイオシステムズから市販品とし
て入手できる。
【００７５】各配列決定反応で生成したＤＮＡ配列決定
フラグメントは通常遠心分離によって冷エタノール溶液
から単離される。ペレットを冷７０％エタノールで洗浄
した後、得られたペレットを簡単に、例えば３分間真空
遠心によって乾燥し、次に電気泳動分析の準備をする。
あるいは、試料は暗室で−２０℃にて貯蔵する場合、数
ヶ月間この乾燥した形態で安定である。
フラグメントは通常遠心分離によって冷エタノール溶液
から単離される。ペレットを冷７０％エタノールで洗浄
した後、得られたペレットを簡単に、例えば３分間真空
遠心によって乾燥し、次に電気泳動分析の準備をする。
あるいは、試料は暗室で−２０℃にて貯蔵する場合、数
ヶ月間この乾燥した形態で安定である。
【００７６】キャピラリーチューブに装填する前に、乾
燥したＤＮＡフラグメント試料を変性溶液中に再懸濁し
て簡単に加熱しＤＮＡフラグメント全部を一本鎖形態に
変換する。例えば、変性溶液は１容量の５mMの水性ＥＤ
ＴＡ、および１２容量のフォルムアミドの混合物からな
ることができる。変性溶液中で懸濁した後、試料を９０
℃にて２分間加熱し、次に、ポリマー溶液充填キャピラ
リーチューブの陰極端に、一般に上述のような動電学的
な注入によって、装填する。１以上の反応からのフラグ
メントをキャピラリーチューブに装填する場合、反応か
らのフラグメントは好ましくは装填前に混合する。
燥したＤＮＡフラグメント試料を変性溶液中に再懸濁し
て簡単に加熱しＤＮＡフラグメント全部を一本鎖形態に
変換する。例えば、変性溶液は１容量の５mMの水性ＥＤ
ＴＡ、および１２容量のフォルムアミドの混合物からな
ることができる。変性溶液中で懸濁した後、試料を９０
℃にて２分間加熱し、次に、ポリマー溶液充填キャピラ
リーチューブの陰極端に、一般に上述のような動電学的
な注入によって、装填する。１以上の反応からのフラグ
メントをキャピラリーチューブに装填する場合、反応か
らのフラグメントは好ましくは装填前に混合する。
【００７７】図２Ａ〜２Ｅは、実施例４に述べたように
生成させたＣ（３’末端）にて終端する配列決定フラグ
メントの混合物を用いて得られた電気泳動図の時間区分
を示す。これらの図では、蛍光強度（任意の単位で）は
検出器を過ぎる溶出時間の関数としてプロットされる。
ｍ１３ｍｐ１８（＋）鎖の既知の配列から決定された各
フラグメントの長さは、各ピークの頂部に示される。フ
ラグメントの溶出時間の間隔はシチジレート残基の既知
の配列位置と密接に相関関係があった。
生成させたＣ（３’末端）にて終端する配列決定フラグ
メントの混合物を用いて得られた電気泳動図の時間区分
を示す。これらの図では、蛍光強度（任意の単位で）は
検出器を過ぎる溶出時間の関数としてプロットされる。
ｍ１３ｍｐ１８（＋）鎖の既知の配列から決定された各
フラグメントの長さは、各ピークの頂部に示される。フ
ラグメントの溶出時間の間隔はシチジレート残基の既知
の配列位置と密接に相関関係があった。
【００７８】図２Ａは長さが約２０ないし５０塩基の範
囲のフラグメントの分離を示す。図に示されるように、
単一塩基による長さが異なるピークはほぼベースライン
で分解された。図２Ｂは長さが約２２０ないし２６０塩
基の範囲のフラグメントの分離を示す。また、単一塩基
分解が達成された。図２Ｃは長さが約３５０ないし３７
１塩基の範囲のフラグメントの分離を示す。図から分か
るように、長さが３００塩基よりも大きいフラグメント
はよく分解されている。図２Ｄと２Ｅは約４０５ないし
４５２塩基（図２Ｄ）および約５００ないし５２５塩基
（図２Ｅ）の大きさの範囲のフラグメントの分離を各々
示す。これらの図は、長さが４００塩基まで、５００塩
基まで、またはそれ以上のフラグメントが本方法で分解
されることを示す。
囲のフラグメントの分離を示す。図に示されるように、
単一塩基による長さが異なるピークはほぼベースライン
で分解された。図２Ｂは長さが約２２０ないし２６０塩
基の範囲のフラグメントの分離を示す。また、単一塩基
分解が達成された。図２Ｃは長さが約３５０ないし３７
１塩基の範囲のフラグメントの分離を示す。図から分か
るように、長さが３００塩基よりも大きいフラグメント
はよく分解されている。図２Ｄと２Ｅは約４０５ないし
４５２塩基（図２Ｄ）および約５００ないし５２５塩基
（図２Ｅ）の大きさの範囲のフラグメントの分離を各々
示す。これらの図は、長さが４００塩基まで、５００塩
基まで、またはそれ以上のフラグメントが本方法で分解
されることを示す。
【００７９】実施例４からのＤＮＡ配列決定試料の電気
泳動分離もまた従来のスラブゲル形態を用いて行った
（アプライド バイオシステムズ モデル３７０Ａ Ｄ
ＮＡ配列決定システム、アプライド バイオシステム
ズ、ＣＡ）。４％Ｔおよび５％Ｃを含有する架橋マトリ
ックスを使用した。得られた電気泳動図は前記キャピラ
リー電気泳動分析で得られたものと比較できるピーク分
解を示した。さらに重要なことは、相対的ピーク強度は
本質的にキャピラリー電気泳動によって見出されたもの
と同じであり、図２Ａ〜２Ｅの変化するピーク高はＤＮ
Ａ試料（すなわち、試料中の各フラグメントの実際の分
量）に帰するものであり、分離方法の欠点に帰するもの
でないことを示した。
泳動分離もまた従来のスラブゲル形態を用いて行った
（アプライド バイオシステムズ モデル３７０Ａ Ｄ
ＮＡ配列決定システム、アプライド バイオシステム
ズ、ＣＡ）。４％Ｔおよび５％Ｃを含有する架橋マトリ
ックスを使用した。得られた電気泳動図は前記キャピラ
リー電気泳動分析で得られたものと比較できるピーク分
解を示した。さらに重要なことは、相対的ピーク強度は
本質的にキャピラリー電気泳動によって見出されたもの
と同じであり、図２Ａ〜２Ｅの変化するピーク高はＤＮ
Ａ試料（すなわち、試料中の各フラグメントの実際の分
量）に帰するものであり、分離方法の欠点に帰するもの
でないことを示した。
【００８０】所望の数の配列決定フラグメントの移動度
を記録した後、電気泳動を中止し、キャピラリーチュー
ブ中のポリマー溶液を置き換えることができる。例え
ば、陽極貯槽溶液の上のヘッドスペースに正の加圧を用
いてキャピラリーチューブを通る数カラム容量の新しい
ポリマー溶液を押し流すことができる。キャピラリーの
他端は処分用の廃物収集器に向けられる。次に新しく充
填したキャピラリーチューブを用意して他の試料を分離
する。
を記録した後、電気泳動を中止し、キャピラリーチュー
ブ中のポリマー溶液を置き換えることができる。例え
ば、陽極貯槽溶液の上のヘッドスペースに正の加圧を用
いてキャピラリーチューブを通る数カラム容量の新しい
ポリマー溶液を押し流すことができる。キャピラリーの
他端は処分用の廃物収集器に向けられる。次に新しく充
填したキャピラリーチューブを用意して他の試料を分離
する。
【００８１】（ＩＶ．用途）本発明のポリマー組成物と
方法は特に選択されたポリヌクレオチド標的配列につい
て配列情報を得るために有用である。ひとつの局面で
は、ヌクレオチドの隣接する範囲の配列の認識を望むこ
とができ、その場合には配列決定フラグメントは上記セ
クションIIIで述べたように４種の配列決定反応で調製
される。４つの反応からのフラグメントを同じ移動路
（同じキャピラリーチューブ）で分離する場合、各反応
からのフラグメントは他の３つの反応からのフラグメン
トと区別できるように標識を付けられる。４つのスペク
トルにより分解できる標識を用いることが望ましいが他
の標識付けする図式、例えば２つの識別できる標識を用
いる二元図（Huangら、1992b）を用いることができる。
Huangらのアプローチでは、４つの配列決定反応は次の
４つの標識の組み合せを用いて識別され、ＡとＢは、標
識Ａのみ、標識Ｂのみ、ＡとＢの両方、ＡでもＢでもな
い、と使用される２つの標識を示す。他の選択肢とし
て、４種の大きさで使用される単一標識を使用する（Pe
ntoneyら、1992）。
方法は特に選択されたポリヌクレオチド標的配列につい
て配列情報を得るために有用である。ひとつの局面で
は、ヌクレオチドの隣接する範囲の配列の認識を望むこ
とができ、その場合には配列決定フラグメントは上記セ
クションIIIで述べたように４種の配列決定反応で調製
される。４つの反応からのフラグメントを同じ移動路
（同じキャピラリーチューブ）で分離する場合、各反応
からのフラグメントは他の３つの反応からのフラグメン
トと区別できるように標識を付けられる。４つのスペク
トルにより分解できる標識を用いることが望ましいが他
の標識付けする図式、例えば２つの識別できる標識を用
いる二元図（Huangら、1992b）を用いることができる。
Huangらのアプローチでは、４つの配列決定反応は次の
４つの標識の組み合せを用いて識別され、ＡとＢは、標
識Ａのみ、標識Ｂのみ、ＡとＢの両方、ＡでもＢでもな
い、と使用される２つの標識を示す。他の選択肢とし
て、４種の大きさで使用される単一標識を使用する（Pe
ntoneyら、1992）。
【００８２】他の局面では、本発明の方法は２種の試料
からの２つの標的配列領域が同一であるかどうかを決定
するために使用できる。ここでは、期待される配列は既
に知られており、少なくともひとつの配列決定反応は、
識別できる標識を含む配列決定プライマーを用いて各標
的配列で行われる。末端塩基は２つの反応の各々が等し
いように選択される。各反応からの配列決定フラグメン
トは共にキャピラリーチューブに装填され、得られた電
気泳動図（必要により各標識によって生じる移動差に対
して補正される）は２つの標的配列を示す溶出プロフィ
ルが同じかどうか決定するために点検される。標的配列
における単一部位変化が生じることが知られ、そして選
択された末端塩基が突然変異の基本特性であることが選
択される場合、本方法はこのような突然変異が存在する
かどうか迅速な評価を与える。
からの２つの標的配列領域が同一であるかどうかを決定
するために使用できる。ここでは、期待される配列は既
に知られており、少なくともひとつの配列決定反応は、
識別できる標識を含む配列決定プライマーを用いて各標
的配列で行われる。末端塩基は２つの反応の各々が等し
いように選択される。各反応からの配列決定フラグメン
トは共にキャピラリーチューブに装填され、得られた電
気泳動図（必要により各標識によって生じる移動差に対
して補正される）は２つの標的配列を示す溶出プロフィ
ルが同じかどうか決定するために点検される。標的配列
における単一部位変化が生じることが知られ、そして選
択された末端塩基が突然変異の基本特性であることが選
択される場合、本方法はこのような突然変異が存在する
かどうか迅速な評価を与える。
【００８３】また本発明の方法を使用して標的配列の配
列「サイン」を決定することができ、選択された塩基タ
イプ（例えばシチジレート）に属する塩基間の相対的間
隔は標的配列を同定する特徴（定性的または限定的）と
して記録される。好ましくは、相対的間隔は既知の長さ
の標準フラグメント混合物の存在で決定され、電気泳動
の移動度のラン対ランの変化性を補正することができ
る。
列「サイン」を決定することができ、選択された塩基タ
イプ（例えばシチジレート）に属する塩基間の相対的間
隔は標的配列を同定する特徴（定性的または限定的）と
して記録される。好ましくは、相対的間隔は既知の長さ
の標準フラグメント混合物の存在で決定され、電気泳動
の移動度のラン対ランの変化性を補正することができ
る。
【００８４】上記の用途は説明のために厳密に示してい
るが、本発明の精神と範囲内で多くの変化が可能であ
る。
るが、本発明の精神と範囲内で多くの変化が可能であ
る。
【００８５】上述から、本発明の目的にいかに合致して
いるかを高く評価できる。本発明のポリマー溶液は長さ
が約３０ないし約５００塩基の範囲またはそれ以上のＤ
ＮＡフラグメントの単一塩基分解を提供することができ
る。低粘度の溶液はチューブ内の溶液を容易に置換し試
料混合物の分離を行うことができ、これによって前のラ
ンからの試料のビルドアップやゴーストピークの問題を
回避できる。さらに、複数の試料分離のためのキャピラ
リーチューブの使用はキャピラリーの消耗を減らし、複
数の試料分析の自動化も能率化される。
いるかを高く評価できる。本発明のポリマー溶液は長さ
が約３０ないし約５００塩基の範囲またはそれ以上のＤ
ＮＡフラグメントの単一塩基分解を提供することができ
る。低粘度の溶液はチューブ内の溶液を容易に置換し試
料混合物の分離を行うことができ、これによって前のラ
ンからの試料のビルドアップやゴーストピークの問題を
回避できる。さらに、複数の試料分離のためのキャピラ
リーチューブの使用はキャピラリーの消耗を減らし、複
数の試料分析の自動化も能率化される。
【００８６】
【実施例】以下、本発明の実施例を示すが、本発明を限
定するものではない。
定するものではない。
【００８７】（材料と方法）化学品はアルドリッチケミ
カル社（ミルウォーキー、ＷＩ）から、また比較できる
品質の市販品から入手した。
カル社（ミルウォーキー、ＷＩ）から、また比較できる
品質の市販品から入手した。
【００８８】（実施例１） （線形ポリアクリルアミドの調製）次の方法に対し、Ｔ
ＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジ
アミン、１０％ｖ：ｖ水溶液）のストック水溶液とＡＰ
Ｓ（過硫酸アンモニウム、１０％ｗ：ｖ水溶液）のスト
ック水溶液を調製した。
ＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジ
アミン、１０％ｖ：ｖ水溶液）のストック水溶液とＡＰ
Ｓ（過硫酸アンモニウム、１０％ｗ：ｖ水溶液）のスト
ック水溶液を調製した。
【００８９】水浴中３５℃に保持された５００mlエルレ
ンマイヤーフラスコに、２２２mlの水と６．５５mlのイ
ソプロパノールを添加した。溶液を約１０分間撹拌しな
がらヘリウムを溶液中に泡立たせた。次にアクリルアミ
ド（２５ｇ）を添加した（〜１．５Ｍ最終濃度）。アク
リルアミドが完全に溶解したとき、ＴＭＥＤとＡＰＳの
上記各ストック溶液１．２５mlを添加し、激しく撹拌し
ながら９０分間重合化を行って、蜂蜜状の濃度をもつ溶
液を生成した。
ンマイヤーフラスコに、２２２mlの水と６．５５mlのイ
ソプロパノールを添加した。溶液を約１０分間撹拌しな
がらヘリウムを溶液中に泡立たせた。次にアクリルアミ
ド（２５ｇ）を添加した（〜１．５Ｍ最終濃度）。アク
リルアミドが完全に溶解したとき、ＴＭＥＤとＡＰＳの
上記各ストック溶液１．２５mlを添加し、激しく撹拌し
ながら９０分間重合化を行って、蜂蜜状の濃度をもつ溶
液を生成した。
【００９０】ポリマー溶液を１２〜１４のカットオフ透
析膜（スペクトラ／ポア＃２、スペクトラム メディカ
ル インダストリーズ、ロサンジェルス、ＣＡ）を用い
て４℃にて３日間にわたって水（各３．５リットル）の
５変化に対して透析した。透析に続いて、ポリマー溶液
を凍結乾燥し９．５８ｇの乾燥ポリマーを生成した。
析膜（スペクトラ／ポア＃２、スペクトラム メディカ
ル インダストリーズ、ロサンジェルス、ＣＡ）を用い
て４℃にて３日間にわたって水（各３．５リットル）の
５変化に対して透析した。透析に続いて、ポリマー溶液
を凍結乾燥し９．５８ｇの乾燥ポリマーを生成した。
【００９１】（実施例２） （分子量の決定）実施例１からのポリマー物質の分子量
はゲル浸透クロマトグラフィーによって決定した。連続
して連結した２個のウォーターズ ウルトラヒドロゲル
リニアーカラム、およびピークの検出のためのウォー
ターズ Ｒ４０１ ディフェレンシャル リフラクトメ
ーターを備えたウォーターズ ５９０ ソルベント デ
リバリ システム（ミルフォード、ＭＡ）を用いて、試
料と標準物を実験した。他の条件：注入した試料、８０
μlの〜４mg／mlストック液；流速、０．６ml／分；移
動相、１００mMのリン酸カリウム、ｐＨ７．０。 分子
量決定に使用した４つの非イオン性線形ポリアクリルア
ミド標準物（ポリサイエンシーズ インコーポレイテッ
ド、ワーリントン、ＰＡ）の性質をを表２に示す：
はゲル浸透クロマトグラフィーによって決定した。連続
して連結した２個のウォーターズ ウルトラヒドロゲル
リニアーカラム、およびピークの検出のためのウォー
ターズ Ｒ４０１ ディフェレンシャル リフラクトメ
ーターを備えたウォーターズ ５９０ ソルベント デ
リバリ システム（ミルフォード、ＭＡ）を用いて、試
料と標準物を実験した。他の条件：注入した試料、８０
μlの〜４mg／mlストック液；流速、０．６ml／分；移
動相、１００mMのリン酸カリウム、ｐＨ７．０。 分子
量決定に使用した４つの非イオン性線形ポリアクリルア
ミド標準物（ポリサイエンシーズ インコーポレイテッ
ド、ワーリントン、ＰＡ）の性質をを表２に示す：
【００９２】
【表２】 これらの標準物の溶出時間と既知の平均分子量から、較
正曲線を確定した。この較正曲線に基づいて、実施例１
からのポリマー試料を５５の数平均分子量をもつように
決定した。
正曲線を確定した。この較正曲線に基づいて、実施例１
からのポリマー試料を５５の数平均分子量をもつように
決定した。
【００９３】（実施例３） （被覆したキャピラリーチューブの調製）次の寸法をも
つ溶融したシリカキャピラリーチュービング（ＴＳＰ
０５０３７５、Ｐａｒｔ ＃ ２００００１７）はポリ
ミクロ テクノロジーズ、ツクソン、ＡＺからのもので
あった：長さ＝２０ｍ、内径＝５０μｍ、外径＝３６１
μｍ、外側ポリイミド層の厚さ＝１６μｍ。このチュー
ブから、５メートルセグメントを除去し、一連の平均に
間隔をおいた８個の２ｍｍウィンドウをチュービング中
に熱ワイヤでポリイミドコーティングを焼き取って形成
させた。ウインドウは約５５ｃｍの間隔を置いており８
または９本のキャピラリーチューブはそれぞれ入口から
４０cmで出口から１５cmのウインドウを含み、５メート
ルセグメントから調製できた。
つ溶融したシリカキャピラリーチュービング（ＴＳＰ
０５０３７５、Ｐａｒｔ ＃ ２００００１７）はポリ
ミクロ テクノロジーズ、ツクソン、ＡＺからのもので
あった：長さ＝２０ｍ、内径＝５０μｍ、外径＝３６１
μｍ、外側ポリイミド層の厚さ＝１６μｍ。このチュー
ブから、５メートルセグメントを除去し、一連の平均に
間隔をおいた８個の２ｍｍウィンドウをチュービング中
に熱ワイヤでポリイミドコーティングを焼き取って形成
させた。ウインドウは約５５ｃｍの間隔を置いており８
または９本のキャピラリーチューブはそれぞれ入口から
４０cmで出口から１５cmのウインドウを含み、５メート
ルセグメントから調製できた。
【００９４】下記のコーティング処置の前にチュービン
グは注射器により手動でＮａＯＨの１．０Ｍ溶液で洗い
流し、次にシリンジポンプ（モデル３５１、オリオンリ
サーチ、ケンブリッジ、ＭＡ）を用いて水で自動的に洗
い流した。
グは注射器により手動でＮａＯＨの１．０Ｍ溶液で洗い
流し、次にシリンジポンプ（モデル３５１、オリオンリ
サーチ、ケンブリッジ、ＭＡ）を用いて水で自動的に洗
い流した。
【００９５】キャピラリーチューブの内壁はCobbら（19
90）の方法の改良を用いて３段階で化学的にコーティン
グした。
90）の方法の改良を用いて３段階で化学的にコーティン
グした。
【００９６】第１段階では、内壁のシリカ表面は塩化チ
オニル（ＳＯＣｌ2）を用いて活性化した。塩素化の前
に、チューブを４時間周期で上記シリンジポンプを用
い、蒸留した乾燥テトラヒドロンフラン（ＴＨＦ）で洗
い流し内壁表面を乾燥させた。２mlの気密注射器を用い
流速を「０．４」、そして寸法を「５」にセットした。
チューブを通過したＴＨＦの全容量は約８００μｌであ
った（約〜８０カラム容量）。次に残りのＴＨＦをヘリ
ウム流を用いて手動で追い出し、上記ＴＨＦに関する限
りは、ジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ、１０μｌ）と
ＳＯＣｌ2（２ml）の混合物をシリンジポンプによって
チューブを通過させた。（〜４時間、〜８００μｌ）。
次にチューブの両端部を気密なプラスチックスリーブと
連結し、５５℃にて一晩オーブン中でインキュベートし
た。
オニル（ＳＯＣｌ2）を用いて活性化した。塩素化の前
に、チューブを４時間周期で上記シリンジポンプを用
い、蒸留した乾燥テトラヒドロンフラン（ＴＨＦ）で洗
い流し内壁表面を乾燥させた。２mlの気密注射器を用い
流速を「０．４」、そして寸法を「５」にセットした。
チューブを通過したＴＨＦの全容量は約８００μｌであ
った（約〜８０カラム容量）。次に残りのＴＨＦをヘリ
ウム流を用いて手動で追い出し、上記ＴＨＦに関する限
りは、ジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ、１０μｌ）と
ＳＯＣｌ2（２ml）の混合物をシリンジポンプによって
チューブを通過させた。（〜４時間、〜８００μｌ）。
次にチューブの両端部を気密なプラスチックスリーブと
連結し、５５℃にて一晩オーブン中でインキュベートし
た。
【００９７】第２の段階ではチューブの塩化物活性化内
壁をビニル臭化マグネシウム（「グリニヤ試薬」）と反
応させた。まず塩化物活性化チューブを蒸留した乾燥Ｔ
ＨＦ（１時間、〜３００μｌ）でシリンジポンプによっ
て洗い流しＳＯＣｌ2溶液を除去し、次にグリニヤ試薬
のＴＨＦ中の１Ｍ溶液で洗い流した（シリンジポンプ、
２ml注射器、〜１ml、５時間）。反応を容易にするよう
チューブをヒートガンで断続的に加熱した。５時間の洗
浄期間後、チューブの両端部を再び気密なプラスチック
スリーブで連結し、まだグリニヤ試薬を含んでいるキャ
ピラリーチューブを一晩７０℃にてインキュベートし
た。
壁をビニル臭化マグネシウム（「グリニヤ試薬」）と反
応させた。まず塩化物活性化チューブを蒸留した乾燥Ｔ
ＨＦ（１時間、〜３００μｌ）でシリンジポンプによっ
て洗い流しＳＯＣｌ2溶液を除去し、次にグリニヤ試薬
のＴＨＦ中の１Ｍ溶液で洗い流した（シリンジポンプ、
２ml注射器、〜１ml、５時間）。反応を容易にするよう
チューブをヒートガンで断続的に加熱した。５時間の洗
浄期間後、チューブの両端部を再び気密なプラスチック
スリーブで連結し、まだグリニヤ試薬を含んでいるキャ
ピラリーチューブを一晩７０℃にてインキュベートし
た。
【００９８】第３の段階では、ビニール被覆内壁をアク
リルアミドと反応させてアクリルアミドコーティングを
与えた。まずキャピラリーをシリンジポンプによってＴ
ＨＦで洗い流してグリニヤ溶液を除き（１ml注射器、〜
２００μｌ、２０分間）、メタノール（〜１５０μ
ｌ）、次に水（〜２００μｌ）で洗い流した。次にチュ
ーブを３００μｌの１０％ｗ：ｖアクリルアミド水溶
液、７００μｌの水、１μｌのＴＭＥＤ、および１０μ
ｌの１０％（ｗ：ｖ）ＡＰＳ水溶液を含む新しく調製し
た重合化溶液（１ml）で３０分間洗い流した。次にチュ
ーブを水（１００μｌ）で洗い流し、１．５時間ヘリウ
ム流で乾燥し、使用するまで−２０℃のフリーザーに貯
蔵した。
リルアミドと反応させてアクリルアミドコーティングを
与えた。まずキャピラリーをシリンジポンプによってＴ
ＨＦで洗い流してグリニヤ溶液を除き（１ml注射器、〜
２００μｌ、２０分間）、メタノール（〜１５０μ
ｌ）、次に水（〜２００μｌ）で洗い流した。次にチュ
ーブを３００μｌの１０％ｗ：ｖアクリルアミド水溶
液、７００μｌの水、１μｌのＴＭＥＤ、および１０μ
ｌの１０％（ｗ：ｖ）ＡＰＳ水溶液を含む新しく調製し
た重合化溶液（１ml）で３０分間洗い流した。次にチュ
ーブを水（１００μｌ）で洗い流し、１．５時間ヘリウ
ム流で乾燥し、使用するまで−２０℃のフリーザーに貯
蔵した。
【００９９】（実施例４） （ＤＮＡポリヌクレオチドの配列分析）キャピラリー電
気泳動装置は、高電圧供給器（ガンマハイボルテージリ
サーチ社、オーマンドビーチ、ＦＬ）およびデータ収集
のためのモデル６００データアナリシスシステム（アプ
ライド バイオシステムズ社、フォスターシティー、Ｃ
Ａ）を備えた。実施例３で調製したキャピラリーチュー
ブ（５０μｍの内径、５５cmの長さ、検出器に対し４０
cm）を配置し、陽極貯槽を電気的に接地した陰極貯槽に
連結した。
気泳動装置は、高電圧供給器（ガンマハイボルテージリ
サーチ社、オーマンドビーチ、ＦＬ）およびデータ収集
のためのモデル６００データアナリシスシステム（アプ
ライド バイオシステムズ社、フォスターシティー、Ｃ
Ａ）を備えた。実施例３で調製したキャピラリーチュー
ブ（５０μｍの内径、５５cmの長さ、検出器に対し４０
cm）を配置し、陽極貯槽を電気的に接地した陰極貯槽に
連結した。
【０１００】標識を付けたポリヌクレオチドの検出は、
実施例３と同様に、陰極端から４０cmのキャピラリーチ
ューブの表面に形成された長さ２mmのウインドウ付近に
位置した蛍光検出器を用いて行った。アルゴンイオンレ
ーザーからの励起光（モデル２２１−４０ＭＬＡ、シオ
ニクス、サン ノゼ、ＣＡ）は０．５の光密度の中性密
度フィルター（＃ＦＮＧ ０８５、メルスグリオット、
アービン、ＣＡ）を通過して６４ｍｍの焦点距離長
（ｆ．１．）の直径７ｍｍの正レンズおよび８５ｍｍの
ｆ．１．の直径５ｍｍの負レンズからなる一組の集束光
学部に入り、キャピラリーチューブに１００μｍのレー
ザースポットの大きさの入射光線となった。蛍光放出線
は直角に１２ｍｍのｆ．１．の１４ｍｍの直径の非球面
コレクタレンズによって収集され、５３０ｎｍのＲＤＦ
バンドパスフィルター（オメガオプチカル社、ブラット
ルボロ、ＶＴ）を通過した。フィルターを通過後、放出
光は１７ｍｍの１０ｍｍ直径の非球面ファブリレンズに
よって随伴された４８ｍｍ ｆ．１．の１９ｍｍ直径の
非球面ファブリレンズからなるファブリセットを通過し
た。次に光電子増倍管（＃Ｒ９８−２１、ハママツ、サ
ン ノゼ、ＣＡ）に像を造った。検出用レンズはすべて
アプライド バイオシステムズ、フォスターシティー、
ＣＡによって製造されたものであった。
実施例３と同様に、陰極端から４０cmのキャピラリーチ
ューブの表面に形成された長さ２mmのウインドウ付近に
位置した蛍光検出器を用いて行った。アルゴンイオンレ
ーザーからの励起光（モデル２２１−４０ＭＬＡ、シオ
ニクス、サン ノゼ、ＣＡ）は０．５の光密度の中性密
度フィルター（＃ＦＮＧ ０８５、メルスグリオット、
アービン、ＣＡ）を通過して６４ｍｍの焦点距離長
（ｆ．１．）の直径７ｍｍの正レンズおよび８５ｍｍの
ｆ．１．の直径５ｍｍの負レンズからなる一組の集束光
学部に入り、キャピラリーチューブに１００μｍのレー
ザースポットの大きさの入射光線となった。蛍光放出線
は直角に１２ｍｍのｆ．１．の１４ｍｍの直径の非球面
コレクタレンズによって収集され、５３０ｎｍのＲＤＦ
バンドパスフィルター（オメガオプチカル社、ブラット
ルボロ、ＶＴ）を通過した。フィルターを通過後、放出
光は１７ｍｍの１０ｍｍ直径の非球面ファブリレンズに
よって随伴された４８ｍｍ ｆ．１．の１９ｍｍ直径の
非球面ファブリレンズからなるファブリセットを通過し
た。次に光電子増倍管（＃Ｒ９８−２１、ハママツ、サ
ン ノゼ、ＣＡ）に像を造った。検出用レンズはすべて
アプライド バイオシステムズ、フォスターシティー、
ＣＡによって製造されたものであった。
【０１０１】Ｃにて終端するフラグメントの単一色配列
決定「はしご」は、アプライド バイオシステムズ、フ
ォスターシティー、ＣＡからの配列決定キットと添付の
配列決定使用説明書を用いて（パーツ番号４０１１１
９、Ｔａｑ ＤｉｐｒｉｍｅｒＣｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｉｎｇ ｋｉｔ）ジデオキシ配列決定法によって調
製した。Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ鋳型（ｍ１３ｍｐ１８
（＋）鎖、０．１ｐモル）を蛍光染料プライマー（ＦＡ
ＭＭ１３（−２１）プライマー）に対してアニールし、
３’末端塩基として与えられたジデオキシシチジン（ｄ
ｄＣＴＰ）と共に、Ｔａｑポリメラーゼを用いてプライ
マー伸長を行った。得られた反応混合物を暗室で−２０
℃にて乾燥したエタノール沈澱物として貯蔵した。
決定「はしご」は、アプライド バイオシステムズ、フ
ォスターシティー、ＣＡからの配列決定キットと添付の
配列決定使用説明書を用いて（パーツ番号４０１１１
９、Ｔａｑ ＤｉｐｒｉｍｅｒＣｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｉｎｇ ｋｉｔ）ジデオキシ配列決定法によって調
製した。Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ鋳型（ｍ１３ｍｐ１８
（＋）鎖、０．１ｐモル）を蛍光染料プライマー（ＦＡ
ＭＭ１３（−２１）プライマー）に対してアニールし、
３’末端塩基として与えられたジデオキシシチジン（ｄ
ｄＣＴＰ）と共に、Ｔａｑポリメラーゼを用いてプライ
マー伸長を行った。得られた反応混合物を暗室で−２０
℃にて乾燥したエタノール沈澱物として貯蔵した。
【０１０２】ＤＮＡ配列決定フラグメントを分解するた
めのポリマー溶液を次のように調製した。２．４ｇの尿
素と実施例１からの０．３１ｇの乾燥した線状ポリアク
リルアミド試料に、５．６ｇのトリス（シグマケミカル
社）、４０mlのメタノール、および２２０mlの水からな
りリン酸でｐＨ８．０に調整してなる３．５mlの緩衝液
（トリスフォスフェート緩衝液）を添加した。混合物を
約３時間撹拌し次に０．４５μｍの孔径のシリンジフィ
ルターによって濾過した。溶液の粘度は、３７℃で測定
したとき、１８０センチポアズであった。
めのポリマー溶液を次のように調製した。２．４ｇの尿
素と実施例１からの０．３１ｇの乾燥した線状ポリアク
リルアミド試料に、５．６ｇのトリス（シグマケミカル
社）、４０mlのメタノール、および２２０mlの水からな
りリン酸でｐＨ８．０に調整してなる３．５mlの緩衝液
（トリスフォスフェート緩衝液）を添加した。混合物を
約３時間撹拌し次に０．４５μｍの孔径のシリンジフィ
ルターによって濾過した。溶液の粘度は、３７℃で測定
したとき、１８０センチポアズであった。
【０１０３】ポリマー溶液をシリンジを介して手動によ
りキャピラリーチューブに装填した。シリンジプランジ
ャに軽く圧をかけて６０秒以内にポリマー溶液を充分に
充填した。充填したキャピラリーチューブ内には気泡は
認められなかった。チューブを充填すると、キャピラリ
ーチューブ内に装填した同じポリマー溶液を含む各陽極
と陰極の貯槽溶液にチューブの末端を浸漬した。
りキャピラリーチューブに装填した。シリンジプランジ
ャに軽く圧をかけて６０秒以内にポリマー溶液を充分に
充填した。充填したキャピラリーチューブ内には気泡は
認められなかった。チューブを充填すると、キャピラリ
ーチューブ内に装填した同じポリマー溶液を含む各陽極
と陰極の貯槽溶液にチューブの末端を浸漬した。
【０１０４】充填したキャピラリーチューブ内に試料を
装填する直前に、上記からの乾燥した配列決定反応混合
物を、５ｍＭの水性ＥＤＴＡ（０．５μｌ）とフォルム
アミド（６μｌ）の混合物に再懸濁させた。懸濁物を９
０℃で２分間加熱し、次に氷浴に移した。試料をキャピ
ラリーチューブに装填するため、チューブの陰極端をま
ず簡単に水の圧搾容器で洗浄して、チューブ端の外側か
らポリマー溶液の小滴を除去した。次に陰極電極とキャ
ピラリーチューブの陰極端を試料溶液に置き、６ｋｖの
電圧を５秒間印加した。試料フラグメントの分離は、陰
極貯槽へ電極とチューブ端を戻し、１２ｋｖの運転電圧
を印加して開始された。試料を用いて得られた電気泳動
図の部分図を図２Ａ〜２Ｅに示す。
装填する直前に、上記からの乾燥した配列決定反応混合
物を、５ｍＭの水性ＥＤＴＡ（０．５μｌ）とフォルム
アミド（６μｌ）の混合物に再懸濁させた。懸濁物を９
０℃で２分間加熱し、次に氷浴に移した。試料をキャピ
ラリーチューブに装填するため、チューブの陰極端をま
ず簡単に水の圧搾容器で洗浄して、チューブ端の外側か
らポリマー溶液の小滴を除去した。次に陰極電極とキャ
ピラリーチューブの陰極端を試料溶液に置き、６ｋｖの
電圧を５秒間印加した。試料フラグメントの分離は、陰
極貯槽へ電極とチューブ端を戻し、１２ｋｖの運転電圧
を印加して開始された。試料を用いて得られた電気泳動
図の部分図を図２Ａ〜２Ｅに示す。
【０１０５】本発明は特定の方法と具体例を参照して記
載したが、本発明の精神と範囲から離れずに種々の改良
や改変を行うことができることは高く評価されるであろ
う。
載したが、本発明の精神と範囲から離れずに種々の改良
や改変を行うことができることは高く評価されるであろ
う。
【０１０６】
【発明の効果】キャピラリーチューブ内で一本鎖ＤＮＡ
配列決定フラグメントの混合物を電気泳動により分離す
ることによって、長さが３００塩基以上のＤＮＡ標的配
列を決定する際に使用するＤＮＡ配列決定方法が提供さ
れる。
配列決定フラグメントの混合物を電気泳動により分離す
ることによって、長さが３００塩基以上のＤＮＡ標的配
列を決定する際に使用するＤＮＡ配列決定方法が提供さ
れる。
【０１０７】溶液の低粘性がこの種の溶液のキャピラリ
ーチューブへの迅速な装填と再装填を可能にする。
ーチューブへの迅速な装填と再装填を可能にする。
【図１】図１は本発明によるキャピラリー電気泳動装置
の概略図を示す。
の概略図を示す。
【図２ＡＢ】図２Ａ〜２ＢはＤＮＡ配列決定フラグメン
トの混合物を用いる本発明の方法によって得られた電気
泳動の選択された時間部分の電気泳動図を示す。このフ
ラグメントはサンガー法により生成し、シチジンのジデ
オキシ形態をもち３’末端で終端した。
トの混合物を用いる本発明の方法によって得られた電気
泳動の選択された時間部分の電気泳動図を示す。このフ
ラグメントはサンガー法により生成し、シチジンのジデ
オキシ形態をもち３’末端で終端した。
【図２ＣＤ】図２Ｃ〜２ＤはＤＮＡ配列決定フラグメン
トの混合物を用いる本発明の方法によって得られた電気
泳動の選択された時間部分の電気泳動図を示す。このフ
ラグメントはサンガー法により生成し、シチジンのジデ
オキシ形態をもち３’末端で終端した。
トの混合物を用いる本発明の方法によって得られた電気
泳動の選択された時間部分の電気泳動図を示す。このフ
ラグメントはサンガー法により生成し、シチジンのジデ
オキシ形態をもち３’末端で終端した。
【図２Ｅ】図２ＥはＤＮＡ配列決定フラグメントの混合
物を用いる本発明の方法によって得られた電気泳動の選
択された時間部分の電気泳動図を示す。このフラグメン
トはサンガー法により生成し、シチジンのジデオキシ形
態をもち３’末端で終端した。
物を用いる本発明の方法によって得られた電気泳動の選
択された時間部分の電気泳動図を示す。このフラグメン
トはサンガー法により生成し、シチジンのジデオキシ形
態をもち３’末端で終端した。
Claims (2)
- 【請求項１】 ＤＮＡ配列決定の混合物中のＤＮＡフラ
グメントが大きさによって分離される、標的ポリヌクレ
オチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって：該
方法は、前記ＤＮＡフラグメントを、キャピラリー電気
泳動のための媒体を含む変性水溶液中でのキャピラリー
電気泳動によって分離する工程であって、ここで該溶液
が３０℃で約１０〜約３００センチポアズの粘度を有す
る工程、を包含し、 ここで、少なくとも約３００塩基長のフラグメントに対
して単一塩基分解が達成される、方法。 - 【請求項２】 ＤＮＡ配列決定の混合物中のＤＮＡフラ
グメントが大きさによって分離される、標的ポリヌクレ
オチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって：該
方法は、前記ＤＮＡフラグメントをキャピラリー電気泳
動のための媒体を含む変性水溶液中でのキャピラリー電
気泳動によって分離する工程を、包含し、 ここで、少なくとも約３００塩基長のフラグメントに対
して単一塩基分解が達成される、方法。
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