JPH11508443A

JPH11508443A - プライマーウオーキング循環配列決定

Info

Publication number: JPH11508443A
Application number: JP9504240A
Authority: JP
Inventors: リーヴ，マイケル・アラン; ロビンソン，フィリップ・スティーヴン; ボール，スチュアート
Original assignee: アマーシャム・ライフ・サイエンス
Priority date: 1995-06-28
Filing date: 1996-06-26
Publication date: 1999-07-27
Also published as: US6376183B1; WO1997001645A1; EP0837950A1; CA2224396A1; US6043059A

Abstract

(57)【要約】本発明は、核酸のプライマーウオーキング配列決定方法を提供するが、その際、予め合成された１セットのウオーキングプライマーを用い、該プライマーはアニーリング温度を上昇させ、および／または配列の複雑性を増加させずにアニーリング特性を改良する。

Description

【発明の詳細な説明】プライマーウオーキング循環配列決定序論：プライマーウオーキング（walking）配列決定において、プライマー／鋳型複合体はポリメラーゼにより伸長合成されて、鎖が停止することによりネステッドセットの断片を生じ、電気泳動および検出（放射性または蛍光）の後に配列が読まれる。次に、第１プライマーから得られた配列の末端付近の配列情報を用いて、第２プライマーを合成する。次に、この第２の（ウオーキング）プライマーを用いて同じ鋳型の配列を決定する。プライマーウオーキング配列決定は、別法である「ショットガン」アプローチに比して、重複配列情報を生じることが少ないので、より効果的である。本技術の欠点：プライマーウオーキングの主な欠点は、各配列決定ラウンドの後のウオーキングプライマーの再合成である。研究（Studier）（J Kieleczawa et al，Science 258，p1787（1992））およびその他（T Azhikina et al，PNAS，90，p11460，（1993））は、予め合成されたセットから構築された変調プライマーを用いて各配列決定ラウンドの後にデノボのプライマー合成を回避する、洗練された計画を提案した。これらのウオーキングプライマー計画の何れもが、しかしながら、循環配列決定（cycle sequencing）に適合しない。循環配列決定は、循環配列決定に用いられるポリメラーゼ酵素に最適な温度に近いアニーリング温度を有するプライマーを必要とする。18から24の間の残基数のプライマーが一般的に循環配列決定に用いられる。プライマーの長さが増加すれば、与えられた数の連続して（contiguous）オーバーラップするフレーム内で完全な対合（perfect match）を得るための一定の確率（probability）を得るために必要なあらゆる予め合成されたウオーキングプライマーセットのサイズも増加する。18から24の間の残基数のプライマーに関しては、必要な予め合成されたウオーキングプライマーセットのサイズにより、プライマーウオーキングが実行不可能な問題となる。本発明の利点：本発明により、循環配列決定のための扱いやすいサイズセットの予め合成されたウオーキングプライマーの使用が可能になる。本発明：本発明は、核酸標的のプライマーウオーキング配列決定方法を提供するが、該方法は一連の配列決定反応を実施することを含み、各々はプライマーを標的にハイブリダイズさせてプライマーの鎖伸長合成／鎖停止を作用させるが、その際、各々の配列決定反応に関して、アニーリング温度を上昇させ、および／または、それらの配列の複雑性を増大させることなくアニーリング特性を改良させる、予め合成された１セットのウオーキングプライマーから選択されたプライマーを使用する。本発明はｙオリゴヌクレオチドライブラリーも提供するが、ｙは２から20000 として定義されて、各オリゴヌクレオチドはｎ個のヌクレオチド類似体残基Ｎおよびｘ個のヌクレオチド残基Ｘからなるが、但し、ｉ）ｎは８または９と定義され、 ii）ｘは３−５と定義され、 iii）各ヌクレオチド類似体残基Ｘは、２以上のＡ，Ｃ，ＧおよびＴと塩基対合することが可能であるか、またはＡ，Ｃ，Ｇ，Ｔよりも強い塩基相互作用を形成すると定義され、 iv）オリゴヌクレオチド内のヌクレオチド残基Ｎおよびヌクレオチド類似体残基Ｘの順番は、無作為であるかまたはオリゴヌクレオチド鎖の５’末端が残基Ｘである。本明細書において、ＤＮＡ配列は、ひとつだけ隣の残基から翻訳される各フレームを伴う、一連の連続してオーバーラップする同一サイズのフレームとして考えられる。以下の例は、本明細書において用いられる用語を定義する。各々のフレームはｎ残基の長さであり、例えば、配列内において、TTACGACTは８残基のフレームであり、即ち、ｎ＝８であり、例えば、配列内において、TACGACTは７残基のフレームであり、即ち、ｎ＝７である。ウオーキングプライマーを選択するのに適切なｉのそのようなフレームが存在し、例えば、配列内において、およびTTACGACTは８残基の３フレームであり、即ち、ｉ＝３、ｎ＝８であり、例えば、配列内において、およびTACGACTは７残基の４フレームであり、即ち、ｉ＝４、ｎ＝７である。ｎ残基の各フレームに関しては、可能な配列の数は、４ⁿ として与えられる。５から９の間のｎに関する４ⁿの値を以下に与える。ｎ４ⁿ ５１，０２４６４，０９６７１６，３８４８６５，５３６９２６２，１４４したがって、無作為配列ＤＮＡにおいては、平均１kbごとに与えられた５マーの配列が約１度生じ、与えられた６マーの配列は平均して４kbごとに約１度生じ、与えられた７マーの配列は平均して16kbごとに約１度生じ、与えられた８マーの配列は平均して65kbごとに約１度生じ、そして与えられた９マーの配列は平均して262kbごとに約１度生じる。即ち、与えられた５マーは、約１kb未満の鋳型内において唯一の位置において完全な対合を形成すると予測するはずである。約１kbより大きな鋳型に関しては、５マーは鋳型内の複数の位置において完全な対合を形成すると予測されるはずである。鋳型内の複数位置における完全対合のそのような形成は、５マーを、配列決定のためのウオーキングプライマーとして無益なものとする。与えられた６マーは、約４kb未満の鋳型内において唯一の位置において完全な対合を形成すると予測するはずである。約４kbより大きな鋳型に関しては、６マーは鋳型内の複数の位置において完全な対合を形成すると予測されるはずである。鋳型内の複数位置における完全対合のそのような形成は、６マーを、配列決定のためのウオーキングプライマーとして無益なものとする。与えられた７マーは、約16kb未満の鋳型内において唯一の位置において完全な対合を形成すると予測するはずである。約16kbより大きな鋳型に関しては、７マーは鋳型内の複数の位置において完全な対合を形成すると予測されるはずである。鋳型内の複数位置における完全対合のそのような形成は、７マーを、配列決定のためのウオーキングプライマーとして無益なものとする。与えられた８マーは、約65kb未満の鋳型内において唯一の位置において完全な対合を形成すると予測するはずである。約65kbより大きな鋳型に関しては、８マーは鋳型内の複数の位置において完全な対合を形成すると予測されるはずである。鋳型内の複数位置における完全対合のそのような形成は、８マーを、配列決定のためのウオーキングプライマーとして無益なものとする。与えられた９マーは、約262kb未満の鋳型内において唯一の位置において完全な対合を形成すると予測するはずである。約262kbより大きな鋳型に関しては、９マーは鋳型内の複数の位置において完全な対合を形成すると予測されるはずである。鋳型内の複数位置における完全対合のそのような形成は、９マーを、配列決定のためのウオーキングプライマーとして無益なものとする。配列決定鋳型および鋳型のサイズは変更可能であり、当業者には明らかである。以下のガイドラインは、例示のためにのみ与えられる。プラスミド鋳型は２kbから15kbの範囲であってよく、Ｍ１３鋳型は８kbから15kbの範囲であってよく、ラムダ鋳型は45kbから55kbの範囲であってよく、コスミッド鋳型は45kbから55kbの範囲であってよい。バクテリアの人工染色体鋳型は50kbから150kbの範囲であってよい。酵母の人工染色体鋳型は100kbから1,000kbの範囲であってよい。即ち、プライマーおよびＭ１３鋳型内において唯一の部位において完全対合を生じさせるためには、７残基またはそれ以上のプライマーが必要とされる。ラムダおよびコスミッド鋳型内において唯一の部位において完全対合を生じさせるためには、８残基またはそれ以上のプライマーが必要とされる。バクテリアの人工染色体鋳型内において唯一の部位において完全対合を生じさせるためには、９残基またはそれ以上のプライマーが必要とされる。酵母の人工染色体鋳型内において唯一の部位において完全対合を生じさせるためには、10残基またはそれ以上のプライマーが必要とされる。予め合成された１セットのウオーキングプライマーを用いたプライマーウオーキング配列決定に関して、上記予め合成されたセット内のプライマーと、前のプライマーから読まれた配列の末端近くのｎ残基のｉの連続してオーバーラップするフレーム内の配列の一つとの間で完全な対合を見いだす確率を計算することが可能である。Ｓはウオーキングプライマーセットを含むｎ残基長のプライマーの数とする。単一フレームのｎ残基長に関して、フレーム配列とウオーキングプライマーのセット中のプライマーのｎ残基長の間に完全対合が存在する確率は、Ｓ／４ⁿ により与えられる。単一フレームのｎ残基長に関して、フレーム配列とウオーキングプライマーのセット中のプライマーのｎ残基長の間に完全対合が存在しない確率は、１−（Ｓ／４ⁿ）により与えられる。ｉの連続オーバーラップフレームｎ残基長に関して、あらゆるフレーム配列とウオーキングプライマーのセット中のプライマーのｎ残基長の間に完全対合が存在しない確率は、１−（Ｓ／４ⁿ）ⁱにより与えられる。即ち、 logＰ＝ｉ log（１−（Ｓ／４ⁿ））ｉ＝logＰ／log（１−（Ｓ／４ⁿ））Ｓ＝４ⁿ（１−（Ｐ）^1/i）Ｓ／４ⁿ＝（１＝（Ｐ）^1/i）である。以下の表の値は、示された連続オーバーラップフレーム（ｉ）の数の範囲で完全対合の示されたパーセンテージ確率を与えるのに必要なウオーキングプライマーセットの函数（fraction）を与える。Ｓ／４ⁿ＝示された連続オーバーラップフレーム（ｉ）の数の範囲で完全対合の示されたパーセンテージ確率（Ｐ）を与えるのに必要な５マーの数は、以下に与えられる：示された連続オーバーラップフレーム（ｉ）の数の範囲で完全対合の示されたパーセンテージ確率（Ｐ）を与えるのに必要な６マーの数は、以下に与えられる：示された連続オーバーラップフレーム（ｉ）の数の範囲で完全対合の示されたパーセンテージ確率（Ｐ）を与えるのに必要な７マーの数は、以下に与えられる：示された連続オーバーラップフレーム（ｉ）の数の範囲で完全対合の示されたパーセンテージ確率（Ｐ）を与えるのに必要な８マーの数は、以下に与えられる：示された連続オーバーラップフレーム（ｉ）の数の範囲で完全対合の示されたパーセンテージ確率（Ｐ）を与えるのに必要な９マーの数は、以下に与えられる：以下の実施例は、長さｎ残基の完全なセットの予め合成されたウオーキングプライマーの函数のみが、予め合成されたウオーキングプライマーの一つとｎ残基のｉの連続オーバーラップフレームの一つの間で完全対合を見いだす極めて高い確率を有するために使用されるのに必要であることを明確に示すが、ｉはサイクルあたりに読まれる配列の平均の長さより小さい（約400−500塩基）。この実施例に関して、サイズＳの予め合成されたウオーキングプライマー１セットのための完全対合の示されたパーセンテージ確率（Ｐ）を与えるのに必要な８マーの連続オーバーラップフレーム（ｎ＝８）の数（ｉ）を、以下の表に与える：即ち、例えば、1,500の８マーの予め合成された１セットは、該８マーと99の連続オーバーラップフレーム８残基長の一つの間の完全対合を見いだす90％のチャンスを与えるはずである。同じ1,500の８マーの予め合成された１セットは、該８マーと198の連続オーバーラップフレーム８残基長の一つの間の完全対合を見いだす99％のチャンスを与えるはずである。同じ1,500の８マーの予め合成された１セットは、該８マーと297の連続オーバーラップフレーム８残基長の一つの間の完全対合を見いだす99.9％のチャンスを与えるはずである。上記例において、そのような予め合成された１セットのウオーキングプライマーは、各配列決定ラウンド後に８マーの予め合成されたウオーキングプライマーを選択する極めて高い確率を与えるはずである。1,500の８マーの１セットは、合成のために扱いやすい量であり、プライミングの各ラウンドのためには入手しやすい。そのような８マーのプライマーは、ラムダおよびコスミッド鋳型までを包含するサイズのすべての鋳型内の唯一の部位において完全対合を生じさせることも予測されるはずである。そのような単一の８マーのプライマーは、しかしながら、循環配列決定には不適切なはずである。上記のとおり、循環配列決定は、循環配列決定に使用されるポリメラーゼ酵素に最適な温度に近いアニーリング温度を有するプライマーを必要とする。一般には、18から24残基長の間のプライマーが循環配列決定に使用される。本発明は、以下の方法において必要とされるウオーキングプライマー１セットのサイズを増加させることなしに、（上記の種類の）予め合成された１セットのウオーキングプライマーのアニーリング温度を上昇させること（あるいは、より一般にはアニーリング特性を改良すること）をあてにする。ａ．４つのＤＮＡ塩基（Ａ，Ｃ，ＧおよびＴ）各々と塩基対合可能なプライマーに残基を付加する。例は、ｉ）イノシン（優先度Ｃ＞Ａ＞Ｇ〜Ｔにて全４塩基と対合する）である。 ii）５−ニトロインドール：（全４塩基と対合できるが、主として都合よくスタッキング相互作用を安定化させる）。 iii）５−ニトロ−ピロール：（全４塩基と対合するが、主として都合よくスタッキング相互作用を安定化させる）。 iv）Ｋ（２−アミノ−６−メトキシアミノプリン）：（ピリミジンと対合する）。ｖ）Ｐ（６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｃ］［１，２］オキサジン−７−ワン］：（プリンと対合する）。 vi）当業者には明らかな使用可能なその他。Ｂ．通常のＡ，Ｃ，ＧおよびＴ塩基より強い塩基対合相互作用を形成するプライマー中にて塩基を用いる。例は、ｉ）２−アミノアデニン（Ａの代わりに使用できる）。 ii）５−メチルシトシン（Ｃの代わりに使用できる）。 iii）当業者には明らかな使用可能なその他。上記の塩基はまとめて縮重塩基と呼んでよい。そのような縮重塩基の数は、本発明が関係する予め合成された１セットのウオーキングプライマーにおいて、好ましくは１から20である。これらの縮重塩基は各々のオリゴヌクレオチドウオーキングプライマーの長さに従って、分散されるか、または、５’末端または３’ 末端または中間に集中させてよい。良好な結果は、オリゴヌクレオチドの５’末端に集中された３、４または５の縮重塩基の使用により得られた。実施例１以下のオリゴヌクレオチドを合成した：５’ＧＴＣＡＣＧＡＣ３’ （ＡＭ１）５’ＸＸＸＧＴＣＡＣＧＡＣ３’ （ＡＭ２）（式中、Ｘは５−ニトロインドール残基を示す）。 25pmolのこれら各プライマーをCsCl精製されたM13mp8鋳型に加えて、ビストラＤＮＡシステムズＤＮＡラブステーション625（アマーシャムインターナショナルplc.）上において、ラブステーションサーモシークエナーゼ（商標名）蛍光染料ターミネーター循環配列決定キット（RPN2435，アマーシャムインターナショナルplc.）、ラブステーションFMP（商標名）蛍光染料ターミネーター沈殿キット（RPN2433，アマーシャムインターナショナルplc.）および１−32染料ターミネーター循環配列決定ｖ2.0方法を用いて循環配列決定した。該方法は、循環配列決定アニーリング温度を40℃に下げ、２秒間／℃ランピング（ramping）により60℃にて４分間伸長させることにより、この例を校正した（edited）。次に、サンプルを電気泳動して、アプライドバイオシステムズ373A蛍光配列決定機上で分析した。結果は、プライマーＡＭ２の５’末端に添加された５−ニトロインドール残基により、シグナル強度並びに配列の質の両方の点における顕著な改良を明確に示した。シグナル強度は、ＡＭ１におけるよりもＡＭ２の方が８倍高かった。解読可能な配列はＡＭ２については460−500塩基であるのに対して、ＡＭ１については340−380であった。実施例２一般式５’Ｘ₁Ｘ₂… Ｘ_mＧＴＣＡＣＧＡＣ３’ （式中、Ｘｍ５−ニトロインドール１，２，３，４，５５−ニトロインダゾール３，４，５３−ニトロピロール３ベンズイミダゾール１−６）のオリゴヌクレオチドを合成した。５−ニトロインドール残基を含むオリゴヌクレオチドは全て、実施例１に記載された試験においてＡＭ１よりも良好であったが、ｍが３または４の場合、限界に近い最上であった。５−ニトロインダゾール残基を含むオリゴヌクレオチドの性能はＡＭ２に匹敵した。３−ニトロピロール残基を含むオリゴヌクレオチドの性能はＡＭ１よりも良好であった（シグナルは２倍強かった）。これらの結果を基にすると、８または９の正常塩基および３、４または５の上記された特別の縮重塩基を含む予め合成されたオリゴヌクレオチドライブラリーは、本明細書に記載されたプライマーウオーキング配列決定方法において使用された場合に、改良された結果を与えることが予測されうる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年７月２５日【補正内容】条約第３４条に基づく補正書の翻訳文１．一連の配列決定反応を実施することを含むが、各々はプライマーを標的にハイブリダイズさせてプライマーの鎖伸長合成／鎖停止を作用させ、その際、各々の配列決定反応に関して、予め合成された１セットのウオーキングプライマーから選択されたプライマーを使用するが、但し、各々のウオーキングプライマーはヌクレオチド残基並びに少なくとも一つのヌクレオチド類似体残基の鎖からなり、それにより、アニーリング温度を上昇させ、および／または、その配列の複雑性を増大させることなくアニーリング特性を改良させる、核酸標的のプライマーウオーキング配列決定方法。２．核酸標的が循環配列決定される、請求項１記載の方法。３．蛍光染料ターミネーター標識を配列検出に用いる、請求項１または２記載の方法。４．放射性-ddNTP標識を配列検出に用いる、請求項１または２記載の方法。５．ウオーキングプライマーが鋳型の鎖上の任意の４塩基と対合可能な塩基を含む、請求項１ないし４の何れか１項記載の方法。６．ウオーキングプライマーがそれらの５’末端において連続塩基を含むが、但し、該連続塩基は鋳型の鎖上の任意の４塩基と対合可能である、請求項５項記載の方法。７．ウオーキングプライマーがそれらの配列を通して分散させた塩基を含むが、但し、該分散塩基は鋳型の鎖上の任意の４塩基と対合可能である、請求項５項記載の方法。８．鋳型の鎖上の任意の４塩基と対合可能である塩基がイノシンである、請求項６または７項記載の方法。９．鋳型の鎖上の任意の４塩基と対合可能である塩基が５−ニトロインドールである、請求項６または７項記載の方法。 10．鋳型の鎖上の任意の４塩基と対合可能である塩基が３−ニトロピロールである、請求項６または７項記載の方法。 11．鋳型の鎖上の任意の４塩基と対合可能である塩基がＫ（２−アミノ−６− メトキシアミノプリン）およびＰ（６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｃ］［1，２］オキサジン−７−ワン］の混合物である、請求項６または７項記載の方法。 12．鋳型の鎖上の任意の４塩基と対合可能である塩基が請求項８ないし11に記載の任意の塩基の組み合わせである、請求項６または７項記載の方法。 13．ｙが２から20000として定義されて、各オリゴヌクレオチドはｎ個のヌクレオチド類似体残基Ｎおよびｘ個のヌクレオチド残基Ｘからなるが、但し、ｉ）ｎは８または９と定義され、 ii）ｘは３−５と定義され、 iii）各ヌクレオチド類似体残基Ｘは、２以上のＡ，Ｃ，ＧおよびＴと塩基対合することが可能であるか、またはＡ，Ｃ，Ｇ，Ｔよりも強い塩基相互作用を形成すると定義され、 iv）オリゴヌクレオチド内のヌクレオチド残基Ｎおよびヌクレオチド類似体残基Ｘの順番は、無作為であるかまたはオリゴヌクレオチド鎖の５’末端が残基Ｘである、ｙオリゴヌクレオチドライブラリー。 14．ポリメラーゼ酵素、ヌクレオチド３リン酸、鎖停止ヌクレオチド３リン酸類似体、反応バッファー、並びに予め合成された１セットのウオーキングプライマーを含み、但し、各々のウオーキングプライマーはヌクレオチド残基並びに少なくとも一つのヌクレオチド類似体残基の鎖からなり、それにより、アニーリング温度が上昇し、および／または、その配列の複雑性を増大させることなくアニーリング特性が改良される、配列決定キット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ロビンソン，フィリップ・スティーヴンイギリス国エイチピー22・４キュービー, バッキンガムシャー，エールズベリー，ウィングレイヴ，ミル・クローズ，サーストン・ハウス（番地なし) (72)発明者ボール，スチュアートイギリス国エルイー11・３ジェイエイ，レスターシャー，ラクボロー，ホルト・ドライブ 34

Claims

【特許請求の範囲】１．一連の配列決定反応を実施することを含むが、各々はプライマーを標的にハイブリダイズさせてプライマーの鎖伸長合成／鎖停止を作用させ、その際、各々の配列決定反応に関して、アニーリング温度を上昇させ、および／またはそれらの配列の複雑性を増大させることなくアニーリング特性を改良させる、予め合成された１セットのウオーキングプライマーから選択されたプライマーを使用する、核酸標的のプライマーウオーキング配列決定方法。２．核酸標的が循環配列決定される、請求項１記載の方法。３．蛍光染料ターミネーター標識を配列検出に用いる、請求項１または２記載の方法。４．放射性-ddNTP標識を配列検出に用いる、請求項１または２記載の方法。５．ウオーキングプライマーが鋳型の鎖上の任意の４塩基と対合可能な塩基を含む、請求項１ないし４の何れか１項記載の方法。６．ウオーキングプライマーがそれらの５’末端において連続塩基を含むが、但し、該連続塩基は鋳型の鎖上の任意の４塩基と対合可能である、請求項５項記載の方法。７．ウオーキングプライマーがそれらの配列を通して分散させた塩基を含むが、但し、該分散塩基は鋳型の鎖上の任意の４塩基と対合可能である、請求項５項記載の方法。８．鋳型の鎖上の任意の４塩基と対合可能である塩基がイノシンである、請求項６または７項記載の方法。９．鋳型の鎖上の任意の４塩基と対合可能である塩基が５−ニトロインドールである、請求項６または７項記載の方法。 10．鋳型の鎖上の任意の４塩基と対合可能である塩基が３−ニトロピロールである、請求項６または７項記載の方法。 11．鋳型の鎖上の任意の４塩基と対合可能である塩基がＫ（２−アミノ−６− メトキシアミノプリン）およびＰ（６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｃ］［１，２］オキサジン−７−ワン］の混合物である、請求項６または７項記載の方法。 12．鋳型の鎖上の任意の４塩基と対合可能である塩基が請求項８ないし11に記載の任意の塩基の組み合わせである、請求項６または７項記載の方法。 13．ｙが２から20000として定義されて、各オリゴヌクレオチドはｎ個のヌクレオチド類似体残基Ｎおよびｘ個のヌクレオチド残基Ｘからなるが、但し、ｉ）ｎは８または９と定義され、 ii）ｘは３−５と定義され、 iii）各ヌクレオチド類似体残基Ｘは、２以上のＡ，Ｃ，ＧおよびＴと塩基対合することが可能であるか、またはＡ，Ｃ，Ｇ，Ｔよりも強い塩基相互作用を形成すると定義され、 iv）オリゴヌクレオチド内のヌクレオチド残基Ｎおよびヌクレオチド類似体残基Ｘの順番は、無作為であるかまたはオリゴヌクレオチド鎖の５’末端が残基Ｘである、ｙオリゴヌクレオチドライブラリー。 14．ポリメラーゼ酵素、ヌクレオチド３リン酸、鎖停止ヌクレオチド３リン酸類似体、反応バッファー、並びにアニーリング温度を上昇させ、および／またはそれらの配列の複雑性を増加させずにアニーリング特性ガ改良されるような予め合成された１セットのウオーキングプライマーを含む、配列決定キット。 15．予め合成された１セットのウオーキングプライマーとして請求項13記載のオリゴヌクレオチドライブラリーを用いる、請求項14記載の配列決定キット。