JP2002171987A - アルカリセルラーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 高アルカリ性領域に最適反応pHを有し、かつ
セロビオースによって酵素活性が阻害されることのない
アルカリセルラーゼをコードする遺伝子の提供、これを
用いた大量かつ単一のアルカリセルラーゼの製造法の提
供。 【解決手段】 バチルス属細菌由来の特定のアミノ酸配
列又は該アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする
アルカリセルラーゼ遺伝子、バチルス属細菌由来の上記
とは異った特定の塩基配列又は該塩基配列の１若しくは
数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を
有するアルカリセルラーゼ遺伝子、当該遺伝子を含む組
換えベクター、当該組換えベクターを含む形質転換体、
並びに当該形質転換体を培養するアルカリセルラーゼの
製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、洗浄剤用、バイオ
マス用、繊維処理用の酵素として有用なアルカリセルラ
ーゼをコードする遺伝子及びこれを用いた当該アルカリ
セルラーゼの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】セルラーゼは、セルロースのβ-1,4グル
コシド結合を加水分解する酵素の総称であり、アミラー
ゼ、プロテアーゼ、リパーゼと共に加水分解酵素の代表
的存在である。セルラーゼの基質となるセルロースは、
植物細胞壁の主成分として年間1000億トン以上も生産さ
れるバイオマスであり、衣料、紙、建築材料等に有効利
用されると共に、分解によって燃料物質やより高付加価
値の代謝物質へと変換が可能である。そのためセルロー
スを分解する酵素であるセルラーゼや、その反応産物の
有効利用に関する研究が広く行われている。これらの研
究の対象となるセルラーゼは、一般的に中酸性に最適反
応pHを有し、結晶性セルロースを良好に分解できる真菌
類や嫌気性細菌由来の酵素が中心となっている。

【０００３】一方、好アルカリ性バチルス属細菌由来の
アルカリセルラーゼが見出され、その工業的利用が可能
となったことにより、従来困難とされていたセルラーゼ
の衣料用重質洗剤への応用が可能となり、アルカリセル
ラーゼが衣料用洗剤へ配合されるに至った。これ以降、
真菌類由来のセルラーゼ配合洗剤も上市されるようにな
り、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼと並び、洗剤
用酵素としての地位が確立されている。

【０００４】しかし、従来の洗剤用セルラーゼは最適反
応pHが８〜９付近のものが多く、衣料用重質洗剤のpHで
あるpH10以上では有効に作用しない場合が多く見受けら
れる。また、反応生成物の一つであるセロビオースによ
って酵素活性が阻害されるということもセルラーゼの一
般的な特徴の一つであり〔例えば、Creuzetら, Biochim
ie, 65, 149-156(1983)〕、セロビオースが高濃度に蓄
積した場合には、セルロースのバイオマス利用や繊維の
精練の上での障害となり得る。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】そこで本発明は、洗浄
剤用、バイオマス用、繊維処理用の酵素として有用な、
高アルカリ性領域に最適反応pHを有し、かつセロビオー
スによって酵素活性が阻害されることのないアルカリセ
ルラーゼをコードする遺伝子を提供すること、及びその
遺伝子を用いて大量かつ単一のアルカリセルラーゼを製
造する方法を確立することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、自然界か
らセルラーゼ生産菌のスクリーニングを行い、上記性質
を有するアルカリセルラーゼを生産する微生物を見出し
た。そして、当該微生物から当該酵素をコードする遺伝
子をクローン化し、これを用いてアルカリセルラーゼを
製造することに成功した。

【０００７】すなわち本発明は、配列番号１に示すアミ
ノ酸配列又は該アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ
酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコー
ドするアルカリセルラーゼ遺伝子、並びに配列番号２に
示す塩基配列又は該塩基配列の１若しくは数個の塩基が
欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するアルカ
リセルラーゼ遺伝子を提供するものである。

【０００８】さらに本発明は、上記のアルカリセルラー
ゼ遺伝子を含む組換えベクター、当該組換えベクターを
含む形質転換体、並びに当該形質転換体を培養するアル
カリセルラーゼの製造法を提供するものである。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明のアルカリセルラーゼ遺伝
子は、配列番号１に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配
列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列をコードするものであればよい
が、配列番号２で示される塩基配列又は該塩基配列の１
若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配
列を有するものが好ましい。

【００１０】本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子は、例
えばBacillus sp. KSM-N252株等からクローン化するこ
とができる。Bacillus sp. KSM-N252株は、本発明者ら
が見出した菌株であり、最適反応pHをpH10付近に有し、
その反応生成物であるセロビオースによって阻害され
ず、むしろセロビオースにより活性化されるという特徴
を有する分子量約50kDa（SDS電気泳動法）のアルカリセ
ルラーゼ（以下、N252セルラーゼと表記する）を生産す
る微生物である。この菌株は、下記の菌学的性質を有す
る。

【００１１】（Bacillus sp. KSM-N252株の菌学的性
質） Ａ．形態学的性質 （ａ）細胞の形及び大きさ：桿菌（0.4〜0.6×3.2〜9.6
μｍ） （ｂ）多形性：無し （ｃ）運動性：有り （ｄ）胞子の形、大きさ、位置、膨潤の有無：楕円形、
0.6〜1.0×0.8〜1.4μｍ、準端位、膨潤有り （ｅ）グラム染色：不定、但し炭酸ナトリウム0.1重量
％を含むクリスタルバイオレット（CVT）寒天培地には
生育しない。 （ｆ）抗酸性：陰性

【００１２】Ｂ．培養学的性質 （ａ）一般細菌用液体培地（pH5.7）：生育せず （ｂ）一般細菌用液体培地（pH6.8）：生育せず （ｃ）一般細菌用寒天培地（pH6.5）：生育せず （ｄ）一般細菌用寒天培地（pH8.5）：生育する

【００１３】Ｃ．生理学的性質 （ａ）硝酸塩の還元：陽性 （ｂ）脱窒反応：陰性 （ｃ）VPテスト：陰性 （ｄ）インドールの生成：陰性 （ｅ）硫化水素の生成：陰性 （ｆ）デンプンの加水分解：陽性 （ｇ）カゼインの加水分解：陰性 （ｈ）ゼラチンの液化：陽性 （ｉ）クエン酸の利用：陽性 （ｊ）カタラーゼ：陽性 （ｋ）オキシダーゼ：陽性 （ｌ）生育の温度範囲：11〜44℃ （ｍ）生育のpH範囲：pH7.6〜10.5 （ｎ）生育における酸素の影響：嫌気条件下で生育す
る。 （ｏ）グルコースからのガス産生：陰性 （ｐ）塩化ナトリウム耐性：７重量％塩化ナトリウム存
在下で生育する。 （ｑ）馬尿酸の加水分解：陰性 （ｒ）4-メチルウンベリフェリル-β-D-グルクロニド
（MUG）の加水分解：陰性 （ｓ）糖の利用性：グルコース、アラビノース、キシロ
ース、マンニトール、ガラクトース、シュークロース、
マンノース、マルトース、ラクトース、トレハロース、
フラクトース、メリビオース、リボース、サリシン等を
炭素源として生育が認められる。グリセロール、ラムノ
ース、イノシトール、ソルビトールを炭素源として利用
できない。

【００１４】上記Bacillus sp. KSM-N252株は、新規な
バチルス属細菌と判断され、工業技術院生命工学工業技
術研究所にFERM P-17474として寄託されている。当該微
生物からアルカリセルラーゼ遺伝子のクローニングを行
う方法としては、既知の手段、例えばショットガン法、
PCR法を用いることができる。

【００１５】また、本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子
を含む組換えベクターを作製するには、宿主菌体内で複
製維持が可能であり、該酵素を安定に発現させることが
でき、該遺伝子を安定に保持できるベクターに、本発明
のアルカリセルラーゼ遺伝子を組込めばよい。かかるベ
クターとしては、大腸菌を宿主とする場合、pUC18、pBR
322、pHY300PLK等が挙げられ、枯草菌を宿主にする場
合、pUB110、pHSP64（Sumitomoら, Biosci. Biotechno
l. Biocem., 59, 2172-2175, 1995）、pHY300PLK等が挙
げられる。

【００１６】かくして得られた組換えベクターを用いて
宿主菌を形質転換する方法としては、プロトプラスト
法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等
を用いることができる。宿主菌としては、Bacillus属
（枯草菌）等のグラム陽性菌、Escherichia coli（大腸
菌）等のグラム陰性菌、Streptomyces属（放線菌）等の
細菌、Saccharomyces属（酵母）、Aspergillus属（カ
ビ）等の真菌が挙げられる。

【００１７】得られた形質転換体を、宿主菌又は形質転
換体が資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等
を含む培地を用いて適当な条件下で培養すれば、培養液
中に高アルカリ性領域に最適反応pHを有しセロビオース
により阻害されないアルカリセルラーゼが産生される。
かくして得られた培養液から、一般的な方法によって酵
素の採取、精製を行い、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化等
により必要な酵素形態とすることができる。

【００１８】

【実施例】酵素活性は以下のようにして測定した。 〈酵素活性測定法〉試験管に、0.1mLの0.5Ｍグリシン−
水酸化ナトリウム緩衝液（pH10.0）、0.4mLの2.5重量％
カルボキシメチルセルロース（A01MC；日本製紙社
製）、0.4mLの脱イオン水、及び0.1mLの適当に希釈した
酵素液（希釈は10mMトリス塩酸緩衝液、pH7.5で行っ
た）を加え、20分間反応させた後、１mLのジニトロサリ
チル酸試薬（0.5重量％ジニトロサリチル酸、30重量％
ロッシェル塩、1.6重量％水酸化ナトリウム水溶液）を
添加し、沸水中で５分間還元糖の発色を行った。氷水中
で急冷し、４mLの脱イオン水を加え535nmにおける吸光
度を測定し還元糖の生成量を求めた。なお、ブランクは
酵素液を加えずに処理した反応液にジニトロサリチル酸
試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させたも
のを用意した。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下
において１分間に１μmolのグルコース相当の還元糖を
生成する量とした。

【００１９】実施例１ アルカリセルラーゼ生産菌のス
クリーニング 日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したものを80℃、30分間
熱処理し、『2.0重量％カルボキシメチルセルロース（A
10MC；日本製紙社製）、1.0重量％肉エキス（オキソイ
ド社製）、1.0重量％バクトペプトン（ディフコ社
製）、1.0重量％塩化ナトリウム、0.1重量％リン酸二水
素カリウム、0.5重量％炭酸ナトリウム（別滅菌）、0.0
05重量％トリパンブルー（別滅菌）』の組成を有する寒
天平板培地に塗布した。

【００２０】30℃の培養器で３日間静置培養し、生育し
た菌の周辺にカルボキシメチルセルロースの分解に伴う
溶解斑が検出されたものについて選抜し、シングルコロ
ニー化を繰り返した。これらの菌株を、2.0重量％ポリ
ペプトンＳ（日本製薬社製）、1.0重量％魚肉エキス
（和光純薬社製）、0.15重量％リン酸水素二カリウム、
0.1重量％酵母エキス（ディフコ社製）、0.07重量％硫
酸マグネシウム七水塩、0.1重量％カルボキシメチルセ
ルロース及び0.5重量％炭酸ナトリウム（別滅菌）から
成る液体培地を用いて30℃、３日間振盪培養を行った。
アルカリセルラーゼを生産している菌株を選択し、とり
わけ高アルカリ性域で強力な活性を示したセルラーゼ生
産菌としてBacillus sp. KSM-N252株を取得した。

【００２１】実施例２ Bacillus sp. KSM-N252株ゲノ
ムDNAの調製Bacillus sp. KSM-N252株の培養は、2.0重量％ポリペプ
トンＳ、0.1重量％カルボキシメチルセルロ-ス（A10M
C；日本製紙社製）、0.1重量％酵母エキス、1.0重量％
魚肉エキス、0.15重量％リン酸水素二カリウム、0.07重
量％硫酸マグネシウム七水塩、0.5重量％グルタミン酸
ナトリウム（別滅菌）及び0.5重量％炭酸ナトリウム
（別滅菌）から成る培地を用い、30℃、40時間振盪して
行った。得られた培養液約40mLから遠心分離（12000×
ｇ、15分間、５℃）により菌体を回収し、この菌体から
斉藤・三浦の方法によりゲノムDNAを調製した。

【００２２】実施例３ N252セルラーゼ遺伝子のクロー
ニング 実施例２で調製したBacillus sp. KSM-N252株ゲノムDNA
約２μgを、制限酵素Sau3A（ベーリンガーマンハイム社
製）にて、37℃、10分間反応させ部分消化し、70℃、10
分間恒温して反応を停止させた。このうち５μLを、制
限酵素BamH I（ベーリンガーマンハイム社製）にて消化
後、脱リン酸化したpUC18（宝酒造社製）50ngと混合し
て８μLとし、Ligation High（東洋紡社製）４μLを加
えて16℃、30分間恒温してDNA連結反応を行った。反応
液でE. coli HB101株を形質転換し、形質転換体を100μ
g/mLアンピシリンを含むLB寒天培地に塗沫した。加熱溶
解し約50℃に冷却した0.5重量％カルボキシメチルセル
ロース（関東化学社製）、1.0重量％塩化ナトリウム、
0.8重量％寒天及び0.2重量％リゾチーム（シグマ社製）
から成る軟寒天を、生育したコロニーの上から重層し固
化した。37℃で90分間恒温した後、0.4重量％コンゴー
レッド溶液を寒天培地が完全に覆われるまで注ぎ、10分
間静置した。コンゴーレッド溶液を除去し、１重量％塩
化ナトリウム溶液にて洗浄してセルラーゼ生産に伴って
形成されるハローを検出した。ハローを形成した形質転
換体よりFlexiPrep kit（アマシャム・ファルマシア・
バイオテク社製）を用いてプラスミドDNAを抽出し、pUC
18のマルチクローニングサイト近傍に相補的なプライマ
ー１（配列番号３；アンチセンスプライマー）及びプラ
イマー２（配列番号４；センスプライマー）を合成し、
塩基配列を377DNAシーケンサー（PE アプライド・バイ
オシステムズ社製）にて決定した。その結果、Bacillus
sp. N252株の培養上清から精製したアルカリセルラー
ゼのアミノ末端をコードする塩基配列が見出され、目的
とするN252セルラーゼ遺伝子を取得できたことが確認さ
れた。更にプライマー３〜11（配列番号５；N252セルラ
ーゼ遺伝子の上流発現領域に基づくセンスプライマー，
配列番号６；N252セルラーゼ遺伝子の塩基番号523〜547
に基づくセンスプライマー，配列番号７；N252セルラー
ゼ遺伝子の塩基番号854〜877に基づくセンスプライマ
ー，配列番号８；N252セルラーゼ遺伝子の塩基番号1141
〜1164に基づくセンスプライマー，配列番号９；N252セ
ルラーゼ遺伝子の塩基番号224〜247に基づくセンスプラ
イマー，配列番号10；N252セルラーゼ遺伝子の塩基番号
860〜883に基づくアンチセンスプライマー，配列番号1
1；N252セルラーゼ遺伝子の下流発現領域に基づくアン
チセンスプライマー，配列番号12；N252セルラーゼ遺伝
子の塩基番号1282〜1305に基づくアンチセンスプライマ
ー，配列番号13；N252セルラーゼ遺伝子の塩基番号443
〜473に基づくアンチセンスプライマー）を合成して全
塩基配列を決定し（配列番号２）、アミノ酸配列を推定
した（配列番号１）。

【００２３】配列番号１に示すN252セルラーゼのアミノ
酸配列と従来公知のセルラーゼのアミノ酸配列との相同
性を比較すると、最も高い相同性を示した酵素は、Baci
llussp. N-4株の生産するNK-1セルラーゼ（Fukumotoら,
J. Bacteriol. 168, 479-485, 1986）であり、その相
同性は、75.6％であった。次に高い相同性を示した酵素
は、Bacillus sp.株由来のセルラーゼ（特表平11-50390
2号公報）であり、その相同性は72.0％であった。これ
らは、いずれもアルカリセルラーゼではあるが、本発明
の遺伝子からコードされるN252セルラーゼと完全に一致
するものではなかった。これ以外の酵素とN252セルラー
ゼとの相同性はすべて、上記の相同性よりも低く、N252
セルラーゼが新規なアルカリセルラーゼであることを示
唆している。なお、相同性の検索は、GENENTYX-CDバイ
オデータソフトウェア（ソフトウェア開発社製，ver.3
6）を用いたマキシマムマッチング法にて行った。

【００２４】実施例４ 形質転換枯草菌によるN252セル
ラーゼの生産 N252セルラーゼの生産性を高める目的で、Bacillus sp.
KSM-64株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（Sumitomo
ら, Biosci. Biotechnol. Biochem., 56, 827,1992）の
上流発現領域とN252セルラーゼ遺伝子をリコンビナント
PCRにより連結した。即ち、Bacillus sp. KSM-64株由来
のアルカリセルラーゼ遺伝子の上流発現領域〔プライマ
ー12（配列番号14；センスプライマー）及びプライマー
13（配列番号15；アンチセンスプライマー）を使用〕及
びN252セルラーゼ遺伝子断片〔プライマー14（配列番号
16；Bacillus sp. KSM-64株由来のアルカリセルラーゼ
遺伝子の上流発現領域とN252セルラーゼ遺伝子の塩基番
号88〜107に基づくセンスプライマー）及びプライマー1
5（配列番号17；N252セルラーゼ遺伝子の下流発現領域
に基づくアンチセンスプライマー）を使用〕をそれぞれ
PCR（94℃30秒、55℃30秒、72℃２分を１サイクルとし
て30サイクル）にて増幅した。得られた遺伝子断片を精
製し、プライマー12（配列番号14）及びプライマー15
（配列番号17）を用いてリコンビナントPCR（94℃30
秒、55℃１分、72℃１分を１サイクルとして30サイク
ル）によりキメラ遺伝子の増幅を行った。取得したキメ
ラ遺伝子を精製し、制限酵素Bgl II及びHind IIIで処理
後、予め同じ制限酵素で処理しておいたプラスミドpHY3
00PLK（ヤクルト本社製）に連結した。得られた組換え
プラスミドをプロトプラスト法により枯草菌ISW1214株
に導入し、形質転換株を3.0重量％ポリペプトンＳ、3.0
重量％マルトース、0.5重量％魚肉エキス、0.1重量％リ
ン酸二水素カリウム、0.02重量％硫酸マグネシウム七水
塩及びテトラサイクリン（7.5μg/mL）から成る培地に
て30℃、72時間振盪培養した。遠心分離により得られた
培養上清中のセルラーゼ活性は約39000U/Lであり、SDS
電気泳動を行って検出された主要なタンパク質バンドの
分子量は、アミノ酸配列から推定される分子量（51.2kD
a）とほぼ一致した。但し、一部分解によって生じたと
考えられる約35kDaのセルラーゼ活性を示すタンパク質
バンドも検出された。

【００２５】実施例５ 組換えN252セルラーゼの精製 実施例４で得られた形質転換株の培養上清約200mLにPMS
F、EDTAをそれぞれ１mM、５mMとなるよう添加し、氷水
中で１時間静置した。さらに１mM PMSF、５mM EDTAを含
む脱イオン水1000mLを加え、予め10mMリン酸緩衝液（pH
6.0）にて平衡化しておいたDEAEトヨパール650Cカラム
（3.0×18cm；東ソー社製）に添着した。約1.2Ｌの平衡
化緩衝液を用いて非吸着タンパク質を洗浄溶出させた
後、０から0.4Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配法により吸着
タンパク質を溶出させた。0.2Ｍの塩化ナトリウム濃度
付近に溶出されたセルラーゼ活性を示す画分を集め（37
5mL）、限外濾過（PM10メンブレン；アミコン社製）に
より濃縮し、SDS電気泳動を行ったところ、分子量約50k
Daの均一なタンパク質バンドが検出された。以上の精製
操作により本酵素は約４倍に濃縮され、活性収率は3.5
％であった。

【００２６】参考例 組換えN252セルラーゼの酵素学的
性質 (1) 最適反応pH クエン酸緩衝液（pH４〜６）、リン酸緩衝液（pH６〜
８）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH８〜12）
の各緩衝液（100mM）を用いて最適反応pHを調べた結
果、組換えN252セルラーゼはpH10のグリシン−水酸化ナ
トリウム緩衝液中で最も高い反応速度を示した。また、
pH６〜11.5の間で最大活性の50％以上の活性を有してい
た（図１）。

【００２７】(2) セロビオースの影響 50mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH10）、1.0
重量％カルボキシメチルセルロース（A10MC；日本製紙
社製）及び50〜100mMセロビオースから成る反応液をオ
ストワルド粘度計（No.3）に入れ、30℃で10分間恒温し
た後、組換えN252セルラーゼを添加し全量を10mLとし
た。５〜30分後に粘度を測定した結果、本酵素は高濃度
のセロビオース存在下において全く阻害されることがな
く、むしろ酵素活性が促進されていた。

【００２８】(3) 以上のように組換えN252セルラーゼ
は、分子量、Ｎ−末アミノ酸配列、最適反応pHが野生株
からの酵素と一致し、さらに100mMセロビオース存在下
においてその活性が阻害されず、むしろ活性化傾向を示
すという特徴も確認されたことから、Bacillus sp. KSM
-N252株由来のアルカリセルラーゼと同一の酵素である
ことが明らかとなった。

【００２９】

【発明の効果】本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子を用
いることにより、衣料用等の洗浄剤用、バイオマス用、
繊維処理用の酵素として有用な、高アルカリ性領域に最
適反応pHを有し、かつセロビオースに阻害されないアル
カリセルラーゼを大量に生産することができる。

【００３０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KAO CORPORATION <120> Gene for Alkaline Cellulase <130> <160> 17 <210> 1 <211> 492 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 1 Met Lys Ser Arg Lys Lys Ile Ile Pro Ile Cys Met Ala Leu Ile Leu 5 10 15 Thr Leu Ala Leu Leu Met Thr Gly Asn Pro Val Ser Ala Asp Asn Ser 20 25 30 Val Val Gly Gln Asn Gly Gln Leu Ser Ile Ser Gly Ser Gln Leu Val 35 40 45 Asn Gln Asn Gly Glu Pro Val Gln Leu Lys Gly Met Ser Ser His Gly 50 55 60 Leu Gln Trp Tyr Pro Gln Phe Val Asn Tyr Asp Ser Ile Lys Trp Leu 65 70 75 80 Arg Asp Asp Trp Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr Thr Ser 85 90 95 Ser Gly Gly Tyr Ile Gln Asp Arg Ser Val Lys Asp Lys Val Ile Glu 100 105 110 Ser Ile Glu Val Ala Ile Asp Leu Gly Ile Tyr Val Ile Ile Asp Trp 115 120 125 His Ile Leu Ser Asp Gly Asp Pro Asn Ile Tyr Lys Glu Glu Ala Lys 130 135 140 Glu Phe Phe Ala Asp Ile Ser Ala Arg Tyr Gly His Tyr Pro Asn Ile 145 150 155 160 Ile Tyr Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Asn Val Asn Trp Asn Asn 165 170 175 His Ile Lys Pro Tyr Ala Glu Glu Val Ile Pro Val Ile Arg Ala Asn 180 185 190 Asp Pro Asn Asn Ile Ile Ile Val Gly Thr Gly Thr Trp Ser Gln Asp 195 200 205 Val His Asp Ala Ala Asn Asn Pro Leu Ala Asp Pro Asn Val Met Tyr 210 215 220 Ala Phe His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln Met Leu Arg Asp Arg 225 230 235 240 Val Asp Tyr Ala Leu Ser Gln Gly Ala Ala Ile Phe Val Ser Glu Trp 245 250 255 Gly Thr Ser Ala Ala Thr Gly Asp Gly Gly Val Phe Leu Asn Glu Ala 260 265 270 Gln Val Trp Leu Asp Trp Met Asp Glu Arg Asn Leu Ser Trp Ala Asn 275 280 285 Trp Ser Leu Thr His Lys Ala Glu Ser Ser Ala Ala Leu Met Pro Gly 290 295 300 Ala Asn Pro Arg Gly Asn Trp Thr Ala Ala Glu Leu Ser Pro Ser Gly 305 310 315 320 Ala Phe Val Arg Glu Ala Ile Arg Ser Ser Ser Pro Pro Ser Gln Pro 325 330 335 Pro Ser Glu Pro Glu Pro Pro Ser Glu Pro Glu Pro Pro Ser Glu Pro 340 345 350 Glu Pro Pro Ser Asp Pro Gly Thr Tyr Pro Ala Trp Ser Ser Ser Gln 355 360 365 Val Tyr Thr Gly Gly Glu Ile Val Thr Tyr Asp Gly Gln Leu Trp Arg 370 375 380 Ala Gln Trp Trp Thr Gln Gly Gln Ala Pro Gly Gln Gln Trp Gly Pro 385 390 395 400 Trp Glu Pro Leu Gly Ser Ser Leu Pro Pro Ser Glu Pro Glu Pro Pro 405 410 415 Thr Glu Pro Glu Pro Pro Ser Glu Pro Glu Pro Pro Ser Glu Pro Glu 420 425 430 Pro Glu Pro Pro Ser Glu Pro Glu Pro Pro Ser Asp Pro Gly Thr Tyr 435 440 445 Pro Ala Trp Ser Ala Ser Gln Ile Tyr Thr Gly Gly Glu Ile Val Ser 450 455 460 Tyr Ser Gly Gln Leu Trp Arg Ala Lys Trp Trp Thr Gln Asn Gln Thr 465 470 475 480 Pro Gly Asp Gln Tyr Gly Pro Trp Glu Leu Val Asn 485 490 <210> 2 <211> 1479 <212> DNA <213> Bacillus sp. <400> 2 atg aaa agc aga aaa aaa ata ata cca att tgt atg gcg ctt ata ctc 48 Met Lys Ser Arg Lys Lys Ile Ile Pro Ile Cys Met Ala Leu Ile Leu 5 10 15 acg tta gct ttg ctc atg act ggg aac ccg gta tca gcg gat aat tcg 96 Thr Leu Ala Leu Leu Met Thr Gly Asn Pro Val Ser Ala Asp Asn Ser 20 25 30 gta gtt ggc caa aat ggg cag tta agc att agt gga agt caa tta gtt 144 Val Val Gly Gln Asn Gly Gln Leu Ser Ile Ser Gly Ser Gln Leu Val 35 40 45 aat caa aat ggt gaa cct gtt caa tta aaa ggg atg agt tct cac ggc 192 Asn Gln Asn Gly Glu Pro Val Gln Leu Lys Gly Met Ser Ser His Gly 50 55 60 ttg cag tgg tac cca cag ttt gtt aac tat gat tct att aaa tgg tta 240 Leu Gln Trp Tyr Pro Gln Phe Val Asn Tyr Asp Ser Ile Lys Trp Leu 65 70 75 80 cga gac gat tgg gga att act gtt ttc cga gca gct atg tat acc tca 288 Arg Asp Asp Trp Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr Thr Ser 85 90 95 tct ggt gga tat att caa gat cgt tca gta aaa gat aaa gta atc gaa 336 Ser Gly Gly Tyr Ile Gln Asp Arg Ser Val Lys Asp Lys Val Ile Glu 100 105 110 tcg att gaa gta gcc att gac ttg ggc att tat gta atc atc gat tgg 384 Ser Ile Glu Val Ala Ile Asp Leu Gly Ile Tyr Val Ile Ile Asp Trp 115 120 125 cat att tta tct gat ggc gat cct aac att tac aaa gag gaa gcc aaa 432 His Ile Leu Ser Asp Gly Asp Pro Asn Ile Tyr Lys Glu Glu Ala Lys 130 135 140 gaa ttt ttt gct gat att tca gca aga tat ggg cat tac cca aat att 480 Glu Phe Phe Ala Asp Ile Ser Ala Arg Tyr Gly His Tyr Pro Asn Ile 145 150 155 160 ata tat gag att gca aat gaa cca aat ggt aat gta aat tgg aac aat 528 Ile Tyr Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Asn Val Asn Trp Asn Asn 165 170 175 cat atc aag ccg tac gct gaa gag gta att cca gtt att cgt gcg aat 576 His Ile Lys Pro Tyr Ala Glu Glu Val Ile Pro Val Ile Arg Ala Asn 180 185 190 gat ccg aat aat att atc att gtc ggt act ggt aca tgg agt caa gat 624 Asp Pro Asn Asn Ile Ile Ile Val Gly Thr Gly Thr Trp Ser Gln Asp 195 200 205 gtt cac gat gct gcg aat aat cct tta gca gat cct aat gtg atg tat 672 Val His Asp Ala Ala Asn Asn Pro Leu Ala Asp Pro Asn Val Met Tyr 210 215 220 gct ttc cat ttc tat gca ggt acg cat ggt caa atg tta cgt gac cga 720 Ala Phe His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln Met Leu Arg Asp Arg 225 230 235 240 gtc gac tat gca tta agc caa ggt gcg gcc att ttt gtt agt gag tgg 768 Val Asp Tyr Ala Leu Ser Gln Gly Ala Ala Ile Phe Val Ser Glu Trp 245 250 255 gga aca agc gcc gct aca ggt gat ggc gga gtg ttc tta aat gaa gct 816 Gly Thr Ser Ala Ala Thr Gly Asp Gly Gly Val Phe Leu Asn Glu Ala 260 265 270 caa gtc tgg ctt gat tgg atg gat gag cgt aac tta agt tgg gcc aat 864 Gln Val Trp Leu Asp Trp Met Asp Glu Arg Asn Leu Ser Trp Ala Asn 275 280 285 tgg tct tta act cat aag gct gag tct tct gct gca tta atg cca gga 912 Trp Ser Leu Thr His Lys Ala Glu Ser Ser Ala Ala Leu Met Pro Gly 290 295 300 gct aac cca aga gga aac tgg act gca gct gaa cta tca cca tct ggt 960 Ala Asn Pro Arg Gly Asn Trp Thr Ala Ala Glu Leu Ser Pro Ser Gly 305 310 315 320 gca ttt gta aga gaa gcc att cgt agt tca tca cca ccg tca caa cca 1008 Ala Phe Val Arg Glu Ala Ile Arg Ser Ser Ser Pro Pro Ser Gln Pro 325 330 335 ccg agc gag cca gag cca cca agt gaa cca gag cca cca agt gaa cca 1056 Pro Ser Glu Pro Glu Pro Pro Ser Glu Pro Glu Pro Pro Ser Glu Pro 340 345 350 gaa cca cca agc gac cct gga aca tac cca gct tgg agt tca agc caa 1104 Glu Pro Pro Ser Asp Pro Gly Thr Tyr Pro Ala Trp Ser Ser Ser Gln 355 360 365 gtc tat acc ggt gga gaa att gta act tat gat ggt caa tta tgg aga 1152 Val Tyr Thr Gly Gly Glu Ile Val Thr Tyr Asp Gly Gln Leu Trp Arg 370 375 380 gca cag tgg tgg aca caa ggt caa gca ccg gga caa caa tgg gga cca 1200 Ala Gln Trp Trp Thr Gln Gly Gln Ala Pro Gly Gln Gln Trp Gly Pro 385 390 395 400 tgg gaa cca tta ggg tct tca ctt cca cca agc gaa cca gag ccg cca 1248 Trp Glu Pro Leu Gly Ser Ser Leu Pro Pro Ser Glu Pro Glu Pro Pro 405 410 415 act gaa cca gaa cca ccg agc gaa cca gag cca cca tct gag ccg gaa 1296 Thr Glu Pro Glu Pro Pro Ser Glu Pro Glu Pro Pro Ser Glu Pro Glu 420 425 430 cca gaa cca cca agt gag cca gag cca cca agt gac cct gga aca tat 1344 Pro Glu Pro Pro Ser Glu Pro Glu Pro Pro Ser Asp Pro Gly Thr Tyr 435 440 445 cca gcc tgg agt gca agt caa ata tat acg ggt ggt gaa att gtt tct 1392 Pro Ala Trp Ser Ala Ser Gln Ile Tyr Thr Gly Gly Glu Ile Val Ser 450 455 460 tac agt ggt cag tta tgg aga gca aaa tgg tgg acg caa aat caa aca 1440 Tyr Ser Gly Gln Leu Trp Arg Ala Lys Trp Trp Thr Gln Asn Gln Thr 465 470 475 480 cct ggg gat caa tat ggt cca tgg gag tta gtt aac taa 1479 Pro Gly Asp Gln Tyr Gly Pro Trp Glu Leu Val Asn *** 485 490 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer based on the proper sequence of pUC18 <400> 3 caggaaacag ctatgac 17 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer based on the proper sequence of pUC18 <400> 4 agtcacgacg ttgta 15 <210> 5 <211> 25 <212> <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer based on the proper sequence in the upstream region o f N252 cellulase gene <400> 5 ataacgctta cttatgttct gggag 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer based on nucleotide number 523 to 547 of N252 cellula se gene <400> 6 aacaatcata tcaagccgta cgctg 25 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer based on nucleotide number 854 to 877 of N252 cellula se gene <400> 7 gttgggccaa ttggtcttta actc 24 <210> 8 <211> 24 <212> <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer based on nucleotide number 1141 to 1164 of N252 cellu lase gene <400> 8 caattatgga gagcacagtg gtgg 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer based on nucleotide number 224 to 247 of N252 cellula se gene <400> 9 attctattaa atggttacga gacg 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer based on nucleotide number 860 to 883 of N252 cel lulase gene <400> 10 ccttatgagt taaagaccaa ttgg 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer based on the proper sequence in the downstream re gion of N252 cellulase gene <400> 11 aaacttccgg gtcaaatagt cctg 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer based on nucleotide number 1282 to 1305 of N252 c ellulase gene <400> 12 tggttctggt tccggctcag atgg 24 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer based on nucleotide number 443 to 473 of N252 cel lulase gene <400> 13 gggtaatgcc catatcttgc tgaaatatca g 31 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer based on the proper sequence in the upstream region o f KSM64 cellulase gene (Biosci. Biotechnol. Biochem., 56, 827, 1992) <400> 14 ttccagatct acttaccatt ttagagtcaa aag 33 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer based on the proper sequence in the upstream regi on of KSM64 cellulase gene (Biosci. Biotechnol. Biochem., 56, 827, 1992) <400> 15 ggcttgtgct ggtcgaccca actgc 25 <210> 16 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer based on the proper sequence in the upstream region o f KSM64 cellulase gene plus nucleotide number 88 to 107 of N252 cellulas e gene <400> 16 gttgggtcga ccagcacaag ccgataattc ggttgttggc caaaatgggc ag 52 <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer based on the proper sequence in the downstream re gion of N252 cellulase gene <400> 17 ctattaagct tcggtatttc aggaatcaaa taagg 35

【図面の簡単な説明】

【図１】組換えN252セルラーゼの最適反応pHを示す図で
ある。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１２年１２月８日（２０００．１２．
８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/42 (Ｃ１２Ｎ 1/21 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/42 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 9/42 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 小林 徹 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA12 CA04 DA07 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 4B050 CC01 DD02 FF11E LL04 4B065 AA15X AA15Y AB01 BA22 CA31 CA57

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に示すアミノ酸配列又は該ア
   ミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若
   しくは付加されたアミノ酸配列をコードするアルカリセ
   ルラーゼ遺伝子。
2. 【請求項２】 配列番号２に示す塩基配列又は該塩基配
   列の１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加さ
   れた塩基配列を有するアルカリセルラーゼ遺伝子。
3. 【請求項３】 請求項１又は２記載の遺伝子を含む組換
   えベクター。
4. 【請求項４】 請求項３記載の組換えベクターを含む形
   質転換体。
5. 【請求項５】 宿主が微生物である請求項４記載の形質
   転換体。
6. 【請求項６】 請求項４又は５記載の形質転換体を培養
   するアルカリセルラーゼの製造法。