JP2002153294A5

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Info

Publication number: JP2002153294A5
Application number: JP2000354995A
Authority: JP
Filing date: 2000-11-21
Publication date: 2007-12-20

Description

【００１８】
【実験２】
＜グルクロン酸生成酵素＞
【実験２−１】
＜グルクロン酸生成酵素生産菌のスクリーニング＞
財団法人発酵研究所（以下、『ＩＦＯ』と言う。）及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（以下、『ＡＴＣＣ』と言う。）等から入手した各種カビをポテトデキストロース寒天スラント培地でそれぞれ２７℃で７日間培養した後、下記組成の液体培地に個別にそれらの一白金耳を植菌し、２７℃で５日間培養した。又、上記各種酵母をポテトデキストロース寒天スラント培地でそれぞれ２７℃で４日間培養した後、酸化トレハロース含有液体培地に個別にそれらの一白金耳を植菌し、２７℃で２日間振盪培養した。前記液体培地としては、蒸留水１Ｌ当たり、実験１で得た酸化トレハロース２．３ｇ、グルコース６ｇ、マルトエキス６ｇ、酵母エキスＳ１．２ｇ、及びポリペプトン３ｇを溶解含有する水溶液を滅菌処理したものを用いた。更に、上記各種細菌をポテトデキストロース寒天スラント培地でそれぞれ２７℃で２〜３日間培養した後、下記組成の酸化トレハロース含有液体培地に個別にそれらの一白金耳を植菌し、２７℃で２〜３日間培養した。前記液体培地としては、脱イオン水１Ｌ当たり、実験１で得た酸化トレハロース１０ｇ、硝酸アンモニウム２ｇ、酵母エキス０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、リン酸ナトリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム０．５ｇ、硫酸鉄０．０１ｇ、塩化マンガン０．０１ｇ、及び塩化カルシウム０．０１ｇを溶解し滅菌処理したものを用いた。培養液中のグルクロン酸生成の有無は、下記ＴＬＣにより調べた。更に、前記したカビ、酵母、細菌の培養後の各培養液０．５ｍｌを、実験１で得た酸化トレハロース２％（ｗ／ｗ）含有溶液（ｐＨ５．０又はｐＨ７．０）０．５ｍｌに加え、４０℃で２４時間保ち、酸化トレハロース（酸化トレハロースのナトリウム塩）からのグルクロン酸（グルクロン酸ナトリウム）の生成の有無を下記ＴＬＣにより調べた。即ち、ＴＬＣは、薄層としてメルク社製の『シリカゲルＦ２５４』を、展開溶媒は、酢酸エチル：ピリジン：酢酸：水（＝５：５：１：３（体積比））を用いて一回展開した。展開後、発色剤として、硫酸−メタノール溶液を薄層に噴霧し、１０５℃で５分間加熱して発色させた。その結果、アルスロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ、ＩＦＯ１２１３７）及びバチラス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍａｃｅｒａｎｓ、ＩＦＯ３４９０）の培養液中にはグルクロン酸の生成を認めた。又、アルスロバクター・アトロシアネアス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒａｔｒｏｃｙａｎｅｕｓ、ＩＦＯ１２９５６）、アルスロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ、ＦＥＲＭＢＰ−４３１６）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ、ＡＴＣＣ１０８６４）、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉ、ＩＦＯ３１０９３）、及びトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａｖｉｒｉｄｅ、ＨＬＩＴ５０３４）の培養液を用いて行った酵素反応液中にはグルクロン酸（グルクロン酸ナトリウム）が生成していた。その結果を表１に示す。表１中、「＋」はグルクロン酸を生成したことを、「−」はグルクロン酸を生成しなかったことを示す。尚、酸化トレハロースのナトリウム塩を酸化トレハロースのカルシウム塩又はカリウム塩などの塩類、又は酸化トレハロースに置き代えた以外は前記と同様にして、表１の微生物及びそれら微生物の培養液を用いて試験したところ、表１と同様、グルクロン酸又はその塩類が生成した。

【００３１】
【実施例Ａ−２】
＜酸化トレハロース類からのグルクロン酸類及びＤ−グルクロノラクトンの調製＞
ＩＦＯから入手したアルスロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ、ＩＦＯ１２１３７）をポテトデキストロース寒天スラント培地を用いて２７℃で２日間培養した後、下記組成の酸化トレハロース含有液体培地１Ｌにその一白金耳を植菌し、２７℃で４日間振盪培養した。前記液体培地としては、蒸留水１Ｌに、前記実施例Ａ−１（１）で調製した酸化トレハロースのナトリウム塩を１０ｇ、硝酸アンモニウム２ｇ、酵母エキス０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、リン酸ナトリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム０．５ｇ、硫酸鉄０．０１ｇ、塩化マンガン０．０１ｇ、及び塩化カルシウム０．０１ｇを溶解含有させた水溶液を滅菌処理したものを用いた。培養終了後、酸化トレハロースのナトリウム塩は培養液からはその殆どが消失し、培養液にはグルクロン酸ナトリウムが生成していた。本培養液中の不溶物を活性炭で脱塩・濾過し、予め１Ｎ塩酸で処理したイオン交換樹脂（『ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（Ｈ形）』、三菱化成工業株式会社製）を充填したカラムを用いて脱塩した。本溶液をＨＰＬＣで分析したところ、本溶液は、純度約９２％（ｗ／ｗ）のグルクロン酸を１，４８５ｍｇ含有し、実施例Ａ−１（１）で用いた原料のトレハロース重量に対して約４８％の収率で得た。このグルクロン酸を減圧濃縮することにより、グルクロン酸をＤ−グルクロノラクトンに変換させつつＤ−グルクロノラクトンを結晶化し、最終的に１，３９２ｍｇのＤ−グルクロノラクトン白色結晶を得た。本結晶のＤ−グルクロノラクトンの純度は約９１．２％（ｗ／ｗ）で、酸化トレハロース重量に対して約４５％の収率で得た。尚、グルクロン酸を減圧濃縮して脱水するに際し、その脱水の程度を加減することにより、グルクロン酸及びＤ−グルクロノラクトン含有率の異なる各種組成物を得ることもできる。