JP2002153282A - トランスケトラーゼ活性を有するタンパク質、それをコードするｄｎａ、それを含む組換えｄｎａ、形質転換体及びそれを用いたシキミ酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】微生物を用いる効率的なシキミ酸の製造方法の
提供。 【解決手段】 トランスケトラーゼ活性を有するタンパ
ク質、該タンパク質をコードするＣｉｔｒｏｂａｃｔｅ
ｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ由来のＤＮＡ、それを含む組換え
ＤＮＡ、それによりを形質転換した微生物を用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】シキミ酸などの芳香族生合成
経路の化合物及び該経路を経て生合成されるキナ酸など
の化合物の生合成系においてＤ−リボース５リン酸及び
Ｄ−キシロース５リン酸からＤ−グリセロアルデヒド３
リン酸に変換する酵素がトランスケトラーゼである。本
発明は該酵素をコードするＤＮＡとそのＤＮＡを含む組
換えＤＮＡ並びに形質転換体に関するものであり、シキ
ミ酸の微生物による生産能を向上させるために有効な技
術である。シキミ酸は不斉炭素を３個もつ光学活性体で
あり、具体的には医薬原料などに利用される。

【０００２】

【従来の技術】従来シキミ酸は植物からの抽出、キナ酸
あるいは糖類を原料とした合成（ケミカルレビュー（Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ）６５，４３５（１９６
５））、大腸菌を用いて発酵で生成させる方法（ジャー
ナルオブバイオケミカルケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）１９１，３１５（１９５１））、特開２０００−７
６９６７等が知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】植物からの抽出法は植
物中のシキミ酸含量が低く、精製が困難である。キナ酸
あるいは糖類を原料とした合成法は原料価格が高いこ
と、さらに合成ステップも長い問題がある。さらに大腸
菌を用いた発酵による生産法は、シキミ酸の蓄積濃度が
低い問題があり、工業的、経済的にも問題点が多い。本
発明は微生物を用いたシキミ酸の製造において高い蓄積
濃度でシキミ酸を得ることを課題とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため、大腸菌以外にシキミ酸を生産する潜在
能力を持つ微生物を探索し、シトロバクター属に属する
微生物の変異株がシキミ酸を菌体外に分泌することを見
出した（特願平１０−１８７４６４）。さらに一連のシ
キミ酸生合成反応の中から、トランスケトラーゼが律速
反応であると推定し、該酵素をコードするＤＮＡを単離
し、このシトロバクター属に属する微生物に形質転換し
たところ、トランスケトラーゼ活性が上昇し、シキミ酸
の生産能力が上昇することを見出した。

【０００５】すなわち本発明は 「配列番号１に示すアミノ配列または配列番号１におい
て１もしくはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは
付加されたアミノ酸配列からなり、かつトランスケトラ
ーゼ活性を有するタンパク質。」 「上記トランスケトラーゼ活性を有するタンパク質をコ
ードするＤＮＡ。」 「上記トランスケトラーゼ活性を有するタンパク質をコ
ードするＤＮＡと自立複製可能なベクターを含む組換え
ＤＮＡ。」 「上記組換えＤＮＡを宿主に導入してなる形質転換
体。」 「上記形質転換体を培養することを特徴とするシキミ酸
の製造方法。」である。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明は、配列番号１に示すアミ
ノ配列または配列番号１において１もしくはそれ以上の
アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつトランスケトラーゼ活性を有するタンパ
ク質に関する。ここで、トランスケトラーゼ活性の測定
法としては、池田・岡本・勝亦らの方法（アプライド・
マイクロバイオロジカル・バイオテクノロジー（Ａｐｐ
ｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、５０、３７５−３７８（１９９
８））があげられる。

【０００７】トランスケトラーゼ活性を有するタンパク
質は、シトロバクター属に属する微生物に由来するもの
が好ましく、さらに好ましくはシトロバクター属フロイ
ンディー種に属する微生物に由来するものである。配列
番号１に示すアミノ酸配列を持つものが特に好ましい。

【０００８】本発明で用いられるシキミ酸分泌株に特に
制限はないが、シキミ酸は芳香族アミノ酸の代謝中間体
であるために、本発明で用いる微生物は芳香族アミノ酸
の生合成能力の高いものが望ましい。このようなシキミ
酸分泌微生物としては、例えば本発明で用いたシトロバ
クター・フロインディー ＨＳＫ１０（ＦＥＲＭ ＢＰ
−６７１２）株をあげることができる。

【０００９】トランスケトラーゼ活性を有するタンパク
質をコードする遺伝子（以下、トランスケトラーゼ遺伝
子）をクローニングするための染色体ＤＮＡの精製方法
は特に制限はなく、目的細胞に応じた方法が採用され
る。例えば、シトロバクター・フロインディーの染色体
ＤＮＡの精製方法は大腸菌と同様の方法が使用できる。
具体的にはマーマーの方法（生化学実験講座２、４６−
４７、１９７５、東京同人社）があげられる。

【００１０】トランスケトラーゼ遺伝子の単離方法に特
に制限はない。大腸菌トランスケトラーゼ遺伝子の塩基
配列を元にしたＰＣＲ法、大腸菌トランスケトラーゼ遺
伝子をプローブとしたコロニーハイブリダイゼイション
法、大腸菌トランスケトラーゼ欠損株を用いたショット
ガンクローニング法などを用いることが可能である。

【００１１】より具体的には、例えば上記シトロバクタ
ー・フロインディーをトランスケトラーゼ遺伝子の分離
源とする場合、シトロバクター・フロインディーは大腸
菌の近縁であり遺伝子間の相同性が高く、ＰＣＲ法を用
いることが可能と考えられる。このような場合、大腸菌
トランスケトラーゼ遺伝子の塩基配列を元にＰＣＲ用プ
ライマーを設計し、シトロバクター・フロインディーの
染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う。増幅されたＤ
ＮＡ断片は抽出・精製後、適当な大腸菌用ベクター中に
クローニングする。

【００１２】クローニングした増幅配列は常法により塩
基配列の解析を行う。

【００１３】次に、クローニングしたトランスケトラー
ゼ遺伝子を適当な発現用ベクターに組み込み、宿主細胞
を形質転換する。

【００１４】発現用ベクターは宿主細胞中で安定に維持
されるものであれば良く、自立複製可能なものであれば
いずれでも良いが、シトロバクター属フロインディー種
に属する微生物の染色体ＤＮＡに組み込むことが可能な
ベクターであることがこのましい。

【００１５】クローニングしたトランスケトラーゼ遺伝
子を適当なプロモーター配列の下流の適当な位置に連結
する。この際用いられるプロモーターは、宿主細胞中で
機能するものであれば特に制限はない。本発明中のシト
ロバクター・フロインディーの例では、大腸菌のｌａｃ
プロモーターを用いているが、これに限定されるもので
はない。

【００１６】作製したベクターは適当な手段により宿主
細胞中に導入する。導入方法に特に制限はなく、例えば
シトロバクター・フロインディーを形質転換する場合、
塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法などを用
いることが可能である。

【００１７】形質転換体はベクターに組み込まれている
選択マーカーに応じて適宜選択される。通常は薬剤耐
性、栄養要求性などによって選択される。例えばシトロ
バクター・フロインディーにおいて、カナマイシン、ク
ロラムフェニコールなどの薬剤に対する耐性で選択する
ことが可能である。

【００１８】得られた形質転換体が上記ベクターにより
トランスケトラーゼ遺伝子を導入されたかどうかは、例
えばＰＣＲ法などによって確認する。

【００１９】また、宿主細胞中で導入した発現ベクター
によりトランスケトラーゼ遺伝子が発現していること
は、ノーザンブロッティング法、トランスケトラーゼ酵
素の活性測定などで確認する。例えばトランスケトラー
ゼ酵素の活性測定法としては、池田・岡本・勝亦らの方
法（アプライド・マイクロバイオロジカル・バイオテク
ノロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、５０、３７５
−３７８（１９９８））があげられる。

【００２０】本発明の発酵法における培養方法について
説明する。シキミ酸生産用の培地は、炭素源、窒素源、
無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量成分を
含有する通常の培地が使用できる。

【００２１】炭素源としては、グルコース、フラクトー
ス、でんぷんおよびセルロースの加水分解物、糖蜜など
の糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸のごとき有機
酸、メタノール、エタノール、グリセロールのごときア
ルコール類などを1〜15％、窒素源として、酢酸アンモ
ニウムのごとき有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アン
モニウム、のごとき無機アンモニウム塩、アンモニアガ
ス、アンモニア水、尿素等を0.1〜4.0％、有機微量成分
としては、ビオチン等の被要求性物質が0.000001％〜0.
1％、また必要に応じて、コーンスティープリカー、ペ
プトン、酵母エキス等0〜5％をそれぞれ適当に含有する
培地が好ましく用いられる。これらの他に、リン酸カリ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、塩化ナトリ
ウム、等が微量成分として添加されるのが好ましい。ま
た好ましくは消泡剤なども添加し、培養条件の安定化を
はかる。

【００２２】培養は通常、好気条件で行う。培養の間、
培地のpH3〜8に、温度は20〜40℃に調節し、24〜144時
間振とうまたは通気撹拌培養すれば好ましい結果が得ら
れる。

【００２３】培養液あるいは反応液からシキミ酸を単離
採取するには公知の方法で可能である。例えば、菌体を
遠心分離などで除去した後、カチオンおよびアニオン交
換樹脂でイオン性の物質を除き、ヘプタノールなどの有
機溶媒で抽出した後濃縮すれば結晶を取得することがで
きる。

【００２４】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づいて詳細の説明
するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。

【００２５】実施例１ トランスケトラーゼ遺伝子断片
の増幅 シトロバクター・フロインディーＨＳＫ１０株よりマー
マーの方法により染色体ＤＮＡを抽出・精製した。

【００２６】公知である大腸菌トランスケトラーゼ遺伝
子の塩基配列（ＩＤナンバーかＡＣナンバー）を元にし
て、ＰＣＲプライマーを作製した（プライマーＡ、プラ
イマーＢ）。 これらのプライマーは大腸菌トランスケ
トラーゼ遺伝子のオープン・リーディング・フレームの
それぞれ５’末端部分及び３’末端部分に相当する配列
若しくはそれと相補的な配列である。また、プライマー
Ａの５’末端にはＸｈｏＩ切断配列、プライマーＢの
５’末端にはＥｃｏＴ２２Ｉ切断配列が付加してある。
さらにそれぞれの５’末端に適当な３塩基を付加してい
る。

【００２７】次に、これらのプライマーを用いて、シト
ロバクター・フロインディーＨＳＫ１０株の染色体ＤＮ
Ａを鋳型として、ＰＣＲを行った。

【００２８】ＰＣＲの結果、約２０００ｂｐの増幅断片
が確認されたが、これは大腸菌トランスケトラーゼ遺伝
子から推定される大きさとほぼ等しかった。増幅された
ＤＮＡ断片はアガロース電気泳動より精製した。

【００２９】実施例２ トランスケトラーゼ遺伝子のク
ローニングと発現ベクターの作製 実施例１で得られたトランスケトラーゼ遺伝子断片をベ
クターｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）のＨｉｎｃＩＩ切断
部位に挿入し、発現ベクターｐＳＴＫＣ２６を作製し
た。

【００３０】実施例３ 塩基配列の決定 ｐＳＴＫＣ２６中のトランスケトラーゼ遺伝子の塩基配
列はＤＮＡシークエンサー（Ｍｏｄｅｌ ３７３，Ｓ、
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い
て決定した。その結果得られたＤＮＡの塩基配列及び塩
基配列から推定されるアミノ酸配列を配列表１、及び配
列表２に示した。

【００３１】実施例４ シトロバクター・フロインディ
ーへの発現ベクターの導入 実施例２で作製した発現ベクターｐＳＴＫＣ２６をシト
ロバクター・フロインディーＨＳＫ１０株に導入した。
ベクターの導入方法は塩化カルシウム法を用いた。

【００３２】形質転換操作後、培養液をカナマイシン５
０ｕｇ／ｍｌを含む平板培地に塗布後、３０℃で培養
し、カナマイシン耐性株を得た。

【００３３】得られて形質転換体は、発現ベクターｐＳ
ＴＫＣ２６によってトランスケトラーゼ遺伝子が細胞中
に導入されていることを、ＰＣＲを用いて確認した。

【００３４】実施例５ トランスケトラーゼ活性の測定 シトロバクター・フロインディーＨＳＫ１０株、大腸菌
ＪＭ１０９株、及びそれぞれの菌株に上記ｐＳＴＫＣ２
６を導入した株は、それぞれＩＰＴＧによる誘導（培養
開始後４時間、０．２ｇ／ｌ）を行った後、細胞内トラ
ンスケトラーゼ活性を池田・岡本・勝亦らの方法に従っ
て測定した。

【００３５】その結果を表１に示した。これらの結果か
ら、発現ベクターｐＳＴＫＣ２６を持つ菌株ではトラン
スケトラーゼ活性が有意に上昇していることが確認され
た。

【００３６】

【表１】

【００３７】実施例６ シキミ酸の生産 シトロバクター・フロインディーＨＳＫ１０株（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−６７１２）及びｐＳＴＫＣ２６を導入した株
のシキミ酸生産能を測定した。

【００３８】これらの菌株をそれぞれ表２に示した培地
で３０℃、４８時間振盪し、前培養した。次に同じ培地
５０ｍｌを含む５００ｍｌ容三角フラスコに１％植菌
し、３０℃、１８０ｒｐｍ、振幅３０ｃｍの条件下で７
２時間振盪培養を行った。

【００３９】

【表２】

【００４０】培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを遠心
分離にて除去し、濾液中のシキミ酸濃度をＨＰＬＣ法
（カラム：島津ＳＣＲ−１０１Ｈ、移動相：０．１Ｍ
リン酸、流量１ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２５４ｎｍ）
で定量した。その結果を表３に示した。

【００４１】

【表３】

【００４２】この結果から、トランスケトラーゼ遺伝子
を導入した株はより高濃度のシキミ酸を培地中に蓄積す
ることが分かった。

【００４３】

【発明の効果】本発明のトランスケトラーゼ活性を有す
るタンパク質をコードするＤＮＡを組み込むことでシキ
ミ酸の蓄積濃度が向上した菌株が取得でき、そのような
形質転換体を用い、既存の方法と比較してより経済的な
シキミ酸の生産が可能となる。

【００４４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110>東レ株式会社 <120>トランスケトラーゼ活性を有するタンパク質、それをコードするＤＮＡ、 それを含む組換えＤＮＡ、形質転換体及びそれを用いたシキミ酸の製造方法 <130>51E15290 <160>2 <210>1 <211>663 <212>PRT <213>Citrobacter freundii <400>1 Met Ser Ser Arg Lys Glu Leu Ala Asn Ala Ile Arg Ala Leu Ser 1 5 10 15 Met Asp Ala Val Gln Lys Ala Lys Ser Gly His Pro Gly Ala Pro 20 25 30 Met Gly Met Ala Asp Ile Ala Glu Val Leu Trp Arg Asp Phe Leu 35 40 45 Asn His Asn Pro Thr Asn Pro Ser Trp Ala Asp Arg Asp Arg Phe 50 55 60 Val Leu Ser Asn Gly His Gly Ser Met Leu Ile Tyr Ser Leu Leu 65 70 75 His Leu Thr Gly Tyr Asp Leu Pro Met Ser Glu Leu Gln Asn Phe 80 85 90 Arg Gln Leu His Ser Lys Thr Pro Gly His Pro Glu Val Gly Tyr 95 100 105 Thr Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Gly Pro Leu Gly Gln Gly Ile 110 115 120 Ala Asn Ala Val Gly Met Ala Ile Ala Glu Lys Thr Leu Ala Ala 125 130 135 Gln Phe Asn Arg Pro Gly His Asp Ile Val Asp His Phe Thr Tyr 140 145 150 Ala Phe Met Gly Asp Gly Cys Met Met Glu Gly Ile Ser His Glu 155 160 165 Val Cys Ser Leu Ala Gly Thr Leu Lys Leu Gly Lys Leu Val Ala 170 175 180 Phe Tyr Asp Asp Asn Gly Ile Ser Ile Asp Gly His Val Glu Gly 185 190 195 Trp Phe Thr Asp Asp Thr Ala Lys Arg Phe Glu Ala Tyr Gly Trp 200 205 210 His Val Ile Arg Gly Val Asp Gly His Asp Ala Asp Ala Ile Lys 215 220 225 Arg Ala Val Glu Glu Ala Arg Ala Val Thr Asp Lys Pro Ser Leu 230 235 240 Leu Met Cys Lys Thr Ile Ile Gly Phe Gly Ser Pro Asn Lys Ala 245 250 255 Gly Thr His Asp Ser His Gly Ala Pro Leu Gly Asp Ala Glu Ile 260 265 270 Ala Leu Thr Arg Glu Gln Leu Gly Trp Lys Tyr Ala Pro Phe Glu 275 280 285 Ile Pro Ser Glu Ile Tyr Ala Gln Trp Asp Ala Lys Glu Ala Gly 290 295 300 Gln Ala Lys Glu Ala Ala Trp Asn Glu Lys Phe Ala Ala Tyr Ala 305 310 315 Lys Ala Phe Pro Gln Glu Ala Ala Glu Phe Thr Arg Arg Met Lys 320 325 330 Gly Glu Met Pro Ser Asp Phe Asp Ala Lys Ala Asn Glu Phe Ile 335 340 345 Ala Lys Leu Gln Ala Asn Pro Ala Lys Ile Ala Ser Arg Lys Ala 350 355 360 Ser Gln Asn Ala Ile Glu Ala Phe Gly Pro Leu Leu Pro Glu Phe 365 370 375 Leu Gly Gly Ser Ala Asp Leu Ala Pro Ser Asn Leu Thr Leu Trp 380 385 390 Ser Gly Ser Lys Ala Ile Asn Glu Asp Thr Ala Gly Asn Tyr Ile 395 400 405 His Tyr Gly Val Arg Glu Phe Gly Met Thr Ala Ile Ala Asn Gly 410 415 420 Ile Ser Leu His Gly Gly Phe Leu Pro Tyr Thr Ser Thr Phe Leu 425 430 435 Met Phe Val Glu Tyr Ala Arg Asn Ala Val Arg Met Ala Ala Leu 440 445 450 Met Lys Gln Arg Gln Val Met Val Tyr Thr His Asp Ser Ile Gly 455 460 465 Leu Gly Glu Asp Gly Pro Thr His Gln Pro Val Glu Gln Val Ala 470 475 480 Ser Leu Arg Val Thr Pro Asn Met Ser Thr Trp Arg Pro Cys Asp 485 490 495 Gln Val Glu Ser Ala Val Ala Trp Lys Tyr Gly Val Glu Arg Gln 500 505 510 Asp Gly Pro Thr Ala Leu Ile Leu Ser Arg Gln Asn Leu Ala Gln 515 520 525 Gln Glu Arg Thr Ala Glu Gln Leu Ala Asn Ile Ala Arg Gly Gly 530 535 540 Tyr Val Leu Lys Asp Cys Ala Gly Gln Pro Glu Leu Ile Phe Ile 545 550 555 Ala Thr Gly Ser Glu Val Glu Leu Ala Val Ala Ala Trp Asp Lys 560 565 570 Leu Thr Ala Glu Gly Val Lys Ala Arg Val Val Ser Met Pro Ser 575 580 585 Thr Asp Ala Phe Asp Lys Gln Asp Ala Ala Tyr Arg Glu Ser Val 590 595 600 Leu Pro Lys Ala Val Ser Ala Arg Val Ala Ile Glu Ala Gly Ile 605 610 615 Ala Asp Tyr Trp Phe Lys Tyr Val Gly Leu Asn Gly Ala Ile Val 620 625 630 Gly Met Thr Thr Phe Gly Glu Ser Ala Pro Ala Glu Leu Leu Phe 635 640 645 Glu Glu Phe Gly Phe Thr Val Asp Asn Val Val Ala Lys Ala Lys 650 655 660 Glu Leu Leu <210>2 <211>1992 <212>DNA <213>Citrobacter freundii <400>2 atg tcc tca cgt aaa gag ctt gcc aat gct att cgt gcg ctg agc 45 atg gac gca gta cag aaa gcc aaa tcc ggt cac ccg ggt gcc ccg 90 atg ggt atg gct gac att gcc gaa gtc ctg tgg cgt gat ttc ctg 135 aac cac aac ccg act aac ccg tcc tgg gct gac cgt gac cgt ttc 180 gta ctg tct aac ggc cac ggt tca atg ctg att tac agc ctg ctg 225 cac ctc acc ggc tat gat ctg ccg atg tcc gag ctg cag aac ttc 270 cgt cag ctg cac tcc aaa acg ccg ggt cac ccg gaa gtg ggt tac 315 acc gcg ggt gtt gaa acc acg acc ggt cct ttg ggt cag ggc att 360 gcg aat gca gtg ggt atg gct atc gct gaa aaa acg ctg gcg gcg 405 cag ttt aac cgt 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/10 (Ｃ１２Ｐ 7/42 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 7/42 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｆターム(参考） 4B024 AA05 BA10 BA80 CA03 DA05 EA04 GA11 4B050 CC01 CC03 DD02 LL02 LL05 4B064 AD42 CA02 CA19 CC24 DA10 4B065 AA01X AA01Y AB01 AC14 BA02 CA10 CA29 CA41 CA44

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号１に示すアミノ配列または配列番
   号１において１もしくはそれ以上のアミノ酸が欠失、置
   換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつトラ
   ンスケトラーゼ活性を有するタンパク質。
2. 【請求項２】シトロバクター属に属する微生物に由来す
   る請求項１記載のトランスケトラーゼ活性を有するタン
   パク質。
3. 【請求項３】シトロバクター属フロインディー種に属す
   る微生物に由来する請求項２記載のトランスケトラーゼ
   活性を有するタンパク質。
4. 【請求項４】請求項１〜３のいずれか１項記載のトラン
   スケトラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮ
   Ａ。
5. 【請求項５】配列番号２に示す塩基配列、または配列番
   号２に示す塩基配列の１つまたは２つ以上を他の塩基で
   置換した請求項４記載のトランスケトラーゼ活性を有す
   るタンパク質をコードするＤＮＡ。
6. 【請求項６】請求項４または５に記載のトランスケトラ
   ーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡと自立
   複製可能なベクターを含む組換えＤＮＡ。
7. 【請求項７】自立複製可能なベクターが、シトロバクタ
   ー属フロインディー種に属する微生物の染色体ＤＮＡに
   組み込むことが可能なベクターである請求項６記載の組
   換えＤＮＡ。
8. 【請求項８】請求項６または７に記載の組換えＤＮＡを
   宿主に導入してなる形質転換体。
9. 【請求項９】宿主がシトロバクター属に属する微生物で
   あることを特徴とする請求項８記載の形質転換体。
10. 【請求項１０】宿主がシトロバクター属フロインディー
    種に属する微生物であることを特徴とする請求項９記載
    の形質転換体。
11. 【請求項１１】請求項８〜１０のいずれか１項記載の形
    質転換体を培養することを特徴とするシキミ酸の製造方
    法。