JP2002114741A - 新規化合物ｆ−１６０５３ａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】動脈硬化・糖尿病・血栓・炎症・免疫・癌・ア
レルギー・冠状動脈再狭窄などの諸病に対する医薬とし
ての効果が期待できる、スフィンゴ脂質の分解系に作用
する酵素であるスフィンゴシンキナーゼの阻害活性を有
する新規化合物を提供する。 【解決手段】糸状菌の一種であるステレウム・オクラセ
オフラバム ＳＡＮＫ１９４００株の培養物より採取し
た、式Ｉの化合物またはその塩。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、スフィンゴシンキ
ナーゼ阻害活性を有する新規化合物、該化合物生産菌の
培養物より該化合物を採取することを特徴とする該化合
物の製造方法、該化合物の生産菌、該化合物を有効成分
として含有する医薬、該化合物を有効成分として含有す
る抗動脈硬化剤、該化合物を有効成分として含有する抗
糖尿病剤、該化合物を有効成分として含有する抗血栓
剤、該化合物を有効成分として含有する抗炎症剤、該化
合物を有効成分として含有する免疫抑制剤、該化合物を
有効成分として含有する制癌剤、該化合物を有効成分と
して含有する癌転移抑制剤、該化合物を有効成分として
含有する抗アレルギー剤、該化合物を有効成分として含
有する経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）後の再狭窄等の
予防剤若しくは治療剤等に関する。

【０００２】

【従来の技術】スフィンゴ脂質は従来、グリセロリン脂
質及びコレステロールとならぶ細胞膜の主要な構成成分
の一つと考えられてきたが、その代謝産物の生理活性に
ついては最近までほとんど知られていなかった。近年、
セラミドなどのさまざまなスフィンゴ脂質の代謝産物に
アポトーシスの誘導や細胞増殖刺激作用などの生理活性
が知られる様になり、スフィンゴ脂質の代謝酵素が生理
的反応や種々の病態の原因に密接に関連する可能性が示
唆されるようになった（Ｈａｎｎｕｎ，Ｙ．Ａ．ａｎｄ
Ｏｂｅｉｄ，Ｌ．Ｍ．，ＴＩＢＳ，２０，７３（１９
９５）参照）。

【０００３】スフィンゴ脂質の代謝酵素には、細胞膜の
主要な構成成分であるスフィンゴミエリンを中心とし
て、その生合成に働くもの、分解に働くもの、さらにガ
ングリオシドなどの糖脂質の合成、分解に働くものな
ど、さまざまな酵素が知られている。スフィンゴシンキ
ナーゼは、スフィンゴ脂質の分解系に作用する酵素であ
り、スフィンゴシンをリン酸化し、スフィンゴシン−１
−リン酸を生成させる酵素である。該酵素の基質である
スフィンゴシンや生成物であるスフィンゴシン−１−リ
ン酸についても、最近多くの生理活性が報告されるよう
になった。

【０００４】スフィンゴシンについては、プロテインキ
ナーゼＣ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ：以下、
「ＰＫＣ」という。）を阻害することが知られており、
ＰＫＣの活性化剤であるホルボールエステルの作用を多
くの細胞系で打ち消すことが明らかになっている。例え
ば、ホルボールエステルにより引き起こされた血小板凝
集や、好中球の活性化、白血病細胞の分化などがスフィ
ンゴシンにより抑制される（Ｈａｎｎｕｎ，Ｙ．Ａ．ａ
ｎｄ Ｃｏｒｉｎｎｅ，Ｍ．Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１５４，２２３（１９９
３）参照）。

【０００５】また、スフィンゴシンは種々の情報伝達経
路に対して作用することも知られている（Ｈａｎｎｕ
ｎ，Ｙ．Ａ．ａｎｄ Ｃｏｒｉｎｎｅ，Ｍ．Ｌ．，Ｂｉ
ｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１５４，２
２３（１９９３）参照）。これらの情報伝達経路は癌の
進展、免疫、炎症、脂質糖代謝、血液凝固などの反応に
密接に関連することが知られている。

【０００６】さらに、ある種の白血病細胞においては、
網膜芽腫遺伝子産物（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ
ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ）を介する細胞増殖抑制経路
を、スフィンゴシンが活性化することが知られている。
該作用はＰＫＣ阻害作用に依存しておらず、網膜芽腫遺
伝子産物を脱リン酸化して活性化し、細胞を細胞周期の
Ｇ₀／Ｇ₁期に留めることにより、白血病細胞の増殖を抑
制する（Ｈａｎｎｕｎ，Ｙ．Ａ．ａｎｄ Ｃｏｒｉｎｎ
ｅ Ｍ．Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃ
ｔａ，１１５４，２２３（１９９３）参照）。

【０００７】また、平滑筋細胞に対してスフィンゴシン
が細胞増殖作用を示すことが知られており（Ｙａｃｏｂ
ｓ，Ｌ．Ｓ． ａｎｄ Ｋｅｓｔｅｒ，Ｍ．，Ａｍ．
Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６５，Ｃ７４０（１９９３）
参照）、線維芽細胞と同様の作用機作による細胞増殖の
調節が示唆されている。

【０００８】スフィンゴシン−１−リン酸には、線維芽
細胞に対する増殖刺激作用が知られれている。血小板増
殖因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗ
ｔｈｆａｃｔｏｒ：以下「ＰＤＧＦ」という。）や血清
の線維芽細胞増殖刺激作用は、セカンドメッセンジャー
としてのスフィンゴシン−１−リン酸の作用を介したも
のであることが最近明らかになった（Ｏｌｉｖｅｒａ，
Ａ．ａｎｄ Ｓｐｉｅｇｅｌ，Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ，３６
５，５５７（１９９３）：Ｓｐｉｅｇｅｌ，Ｓ．，ｅｔ
ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒ
ｅａｔｍｅｎｔ，３１，３３７（１９９４）参照）。該
作用もＰＫＣの阻害作用には依存していないものと考え
られている。

【０００９】また、スフィンゴシン−１−リン酸は、ヒ
ト血小板中に多く含まれ、トロンビンやコラーゲン刺激
による血小板活性化の際に血小板外に放出され、血小板
の凝集反応をさらに活性化することが最近になって明ら
かとなった（Ｙａｔｏｍｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌ
ｏｏｄ，８６，１９３（１９９５）参照）。

【００１０】さらに、スフィンゴシン−１−リン酸は、
ホスホリパーゼＤの活性化、細胞内カルシウムイオンプ
ールからのカルシウムイオン放出の促進（Ｓｐｉｅｇｅ
ｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，３１，３３７（１９９
４）参照）、血管平滑筋細胞の遊走制御（Ｂｏｒｎｆｅ
ｌｄｔ，Ｋ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉ
ｏｌ．１３０，１９３（１９９５）参照）、癌細胞の細
胞運動とファゴキネシス（ｐｈａｇｏｋｉｎｅｓｉｓ）
の抑制（Ｈａｎｎｕｎ，Ｙ．Ａ．ａｎｄ Ｃｏｒｉｎｎ
ｅ，Ｍ．Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃ
ｔａ，１１５４，２２３（１９９３）参照）、心筋細胞
におけるカリウムイオン電位の上昇作用（Ｂｕｎｅｍａ
ｎｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１５，５
５２７（１９９５）参照）等へ関与していることが知ら
れている。

【００１１】また、最近、細胞形質膜上のスフィンゴシ
ン−１−リン酸に対するレセプターの存在が明らかとな
り、上記のスフィンゴシン−１−リン酸の有する作用の
いくつかは、このレセプターを介して作用することが明
らかになりつつある。さらに該レセプターを介してスフ
ィンゴシン−１−リン酸は、血管新生に関与する可能性
も指摘されている（Ｌｅｅ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７９，１５５２（１９９８）：Ｌｅ
ｅ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９９，３０１
（１９９９）参照）。

【００１２】このように、スフィンゴシン及びスフィン
ゴシン−１−リン酸は様々な生理作用を有しており、細
胞レベルでスフィンゴシン及び／又はスフィンゴシン−
１−リン酸量を調節する物質には、様々な病態において
有用な薬理作用を有することが期待される。

【００１３】例えば、ＰＤＧＦは、血管平滑筋細胞の増
殖と遊走を刺激することを介して血管病変の進展に重要
な役割を果たすと考えられている（Ｒｏｓｓ，Ｒ．，ｅ
ｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８，１００９（１９９
０）参照）が、そのシグナル伝達経路においてスフィン
ゴシン−１−リン酸はカンドメッセンジャーとして働く
と考えられている（Ｏｌｉｖｅｒａ，Ａ．ａｎｄ Ｓｐ
ｉｅｇｅｌ，Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ，３６５，５５７（１９
９３）：Ｓｐｉｅｇｅｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅ
ａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，
３１，３３７（１９９４）参照）。そのシグナル伝達経
路を遮断する物質は、高脂血症における動脈硬化症、糖
尿病性血管障害、経皮的冠動脈形成術（以下「ＰＴＣ
Ａ」という）後の再狭窄等の予防または治療に有用と考
えられる。

【００１４】また、スフィンゴシン−１−リン酸は血小
板活性化作用を有することが報告されている（Ｙａｔｏ
ｍｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，８６，１９３（１９９５）
参照）ことから、その生成を妨げる物質は、心疾患など
血栓形成を原因とする様々な疾患の予防又は治療に有用
と考えられる。

【００１５】さらに、最近、セリンパルミトイルトラン
スフェラーゼに対する微生物由来の阻害剤 ＩＳＰ−１
がスフィンゴシンによく似た構造を持ち、しかも強力な
免疫抑制作用を持つことが報告された（Ｓａｓａｋｉ，
Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４７，４
２０（１９９４）：Ｍｉｙａｋｅ，Ｙ．，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏ
ｍｍ．２１１，３９６（１９９５）参照）。スフィンゴ
シンもセリンパルミトイルトランスフェラーゼのダウン
レギュレーション作用を有すること（Ｈａｎｎｕｎ，
Ｙ．Ａ．ａｎｄ Ｃｏｒｉｎｎｅ，Ｍ．Ｌ．，Ｂｉｏｃ
ｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１５４，２２３
（１９９３）参照）、及び、ＩＳＰ−１の細胞障害性Ｔ
細胞に対するアポトーシス誘導作用をスフィンゴシン又
はスフィンゴシン−１−リン酸がブロックすること（Ｍ
ｉｙａｋｅ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２１１，３９６
（１９９５）参照）から、スフィンゴシンキナーゼの阻
害剤が免疫抑制剤になる可能性も示唆される。

【００１６】また、スフィンゴシン及びスフィンゴシン
−１−リン酸は各種癌細胞に対して、その増殖や遊走に
作用することが報告されている（Ｓｐｉｅｇｅｌ，
Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，３１，３３７（１９９４）
参照）。スフィンゴシンキナーゼの阻害剤が制癌及び／
又は癌転移の阻止に働く可能性も示唆される。

【００１７】さらに、マスト細胞における免疫グロブリ
ンＥのシグナル伝達にスフィンゴシンキナーゼが関与す
ることが明らかになりつつある。最近、マスト細胞上に
あるＩｇＥのＦｃフラグメントに対するレセプターを介
する細胞内カルシウムイオン濃度（［Ｃａ²⁺］）の上昇
に、スフィンゴシンキナーゼの活性化が関与することが
報告された（Ｃｈｏｉ，Ｏ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａ
ｔｕｒｅ，３８０，６３４（１９９６）参照）。スフィ
ンゴシンキナーゼの阻害剤が抗アレルギー作用を発揮す
る可能性も示唆される。

【００１８】以上の通り、スフィンゴシンキナーゼに対
し特異的な阻害活性を有する化合物は、抗動脈硬化剤、
抗糖尿病剤、抗血栓剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、制癌
剤、癌転移抑制剤、抗アレルギー剤、経皮的冠動脈形成
術（ＰＴＣＡ）後の再狭窄等の予防剤又は治療剤として
有望である。

【００１９】また、スフィンゴシンキナーゼにはアイソ
ザイムが存在することが明らかになりつつある。ラット
のスフィンゴシンキナーゼ１が精製され（Ｏｌｉｖｅｒ
ａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２７３，１２５７６（１９９８）参照）、マウスのスフ
ィンゴシンキナーゼ１（Ｋｏｈａｍａ，Ｔ．，ｅｔａ
ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，２３７２２
（１９９８）参照）及びスフィンゴシンキナーゼ２（Ｌ
ｉｕ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２７５，１９５１３（２０００）参照）がクロー
ニングされた。しかし、スフィンゴシン及びスフィンゴ
シン−１−リン酸の関与が確認又は推測されている、上
述の病態とスフィンゴシンキナーゼの各アイソザイムと
の関係はほとんど解明されておらず、該酵素の各アイソ
ザイム選択的阻害剤及び非選択的阻害剤を見出すことが
望まれている。

【００２０】現在、スフィンゴシンキナーゼ阻害剤とし
ては、スフィンゴシンの構造類似物質であるジヒドロス
フィンゴシンやジメチルスフィンゴシン等が知られてい
る（Ｂｏｒｎｆｅｌｄｔ，Ｋ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３０，１９３（１９９
５）：Ｓｐｉｅｇｅｌ，Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａ
ｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，３
１，３３７（１９９４）参照）が、スフィンゴシンキナ
ーゼのアイソザイム選択性については明らかではない。

【００２１】

【発明が解決しようとする課題】発明者らは、スフィン
ゴシンキナーゼに対して特異的な阻害活性を有する新規
化合物を鋭意探索した結果、微生物培養物中に新規化合
物を見出し、該化合物がスフィンゴシンキナーゼ１及び
２に対し阻害活性を有することを確認し、本発明を完成
した。

【００２２】

【課題を解決するための手段】本発明は、（１）下記式
（Ｉ）

【００２３】

【化２】 で表される化合物又はその塩、（２）下記の物理化学的
性状を有する化合物又はその塩： １）性状：淡黄色油状物質 ２）溶解性：酢酸エチル、クロロホルムなどの非極性溶
媒に可溶 ３）分子式：Ｃ₂₃Ｈ₃₄Ｏ₅ ４）分子量：３９０ （高分解能ＦＡＢ−ＭＳ法による観測値はｍ／ｚ ３８
９．２２９９（Ｍ−Ｈ） ^-、計算値は３８９．２２７
０） ５）赤外吸収スペクトル：ν_max（薄膜法、ｃｍ^-1） ３４５０，２９３０，２８６０，１７３０，１１７０，
１１００ ６）¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：（重クロロホルム
中：単位はｐｐｍ：内部標準はテトラメチルシラン） ９．５（１Ｈ，ｓ），６．８（１Ｈ，ｓ），６．４（１
Ｈ，ｓ），５．８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），５．
７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），２．６（１Ｈ，ｔ，
Ｊ＝１３．０Ｈｚ），２．５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．
０，４．０Ｈｚ），２．４（１Ｈ，ｍ），２．３（２
Ｈ，ｔ−ｌｉｋｅ，Ｊ＝７．５，１．５Ｈｚ），２．２
（２Ｈ，ｍ），１．７（４Ｈ，ｍ），１．６（３Ｈ，ｂ
ｒ，ｓ），１．３（８Ｈ，ｍ），１．１（３Ｈ，ｄ，Ｊ
＝６．５Ｈｚ），０．９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈ
ｚ）． ７）¹³Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：（重クロロホルム
中：単位はｐｐｍ：内部標準はテトラメチルシラン） ２０８．７（ｓ），１９４．０（ｄ），１７３．５
（ｓ），１４７．９（ｓ），１３９．９（ｔ），１３
２．８（ｓ），１２５．５（ｄ），８０．５（ｓ），７
１．５（ｄ），５５．７（ｄ），４５．０（ｔ），４
０．７（ｄ），３９．６（ｄ），３４．７（ｔ），３
１．７（ｔ），３０．４（ｔ），２９．２（ｔ），２
９．０（ｔ），２４．８（ｔ），２２．６（ｔ），１
９．５（ｑ），１９．１（ｑ），１４．１（ｑ）． ８）高速液体クロマトグラフィー カラム ：Ｓｅｎｓｈｕ Ｐａｋ ＰＥＧＡＳＩＬ Ｏ
ＤＳ（直径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ：センシュー科
学（株）製） 溶 媒：アセトニトリル：水＝３：１ 流 速：１ｍｌ／分 検 出：ＵＶ ２１０ｎｍ 保持時間：１１．５分、 （３）ステレウム（Ｓｔｅｒｅｕｍ）属に属する、
（１）又は（２）に記載の化合物の生産菌を培養し、該
培養物より（１）又は（２）に記載の化合物を採取する
ことを特徴とする、（１）又は（２）に記載の化合物の
製造方法、（４）ステレウム（Ｓｔｅｒｅｕｍ）属に属
する、（１）又は（２）に記載の化合物の生産菌が、ス
テレウム・オクラセオフラヴァム（Ｓｔｅｒｅｕｍ ｏ
ｃｈｒａｃｅｏｆｌａｖｕｍ） ＳＡＮＫ１９４００
（ＦＥＲＭ ＢＰ−７２４４）株である、（３）記載の
製造方法、（５）（１）又は（２）に記載の化合物を有
効成分として含有する医薬、（６）（１）又は（２）に
記載の化合物を有効成分として含有する抗動脈硬化剤、
（７）（１）又は（２）に記載の化合物を有効成分とし
て含有する抗糖尿病剤、（８）（１）又は（２）に記載
の化合物を有効成分として含有する抗血栓剤、（９）
（１）又は（２）に記載の化合物を有効成分として含有
する抗炎症剤、（１０）（１）又は（２）に記載の化合
物を有効成分として含有する免疫抑制剤、（１１）請求
項１又は２に記載の化合物を有効成分として含有する制
癌剤、（１２）（１）又は（２）に記載の化合物を有効
成分として含有する癌転移抑制剤、（１３）（１）又は
（２）に記載の化合物を有効成分として含有する抗アレ
ルギー剤、（１４）（１）若しくは（２）に記載の化合
物を有効成分として含有する、経皮的冠動脈形成術（Ｐ
ＴＣＡ）後の再狭窄等の予防剤又は治療剤、及び、（１
５）ステレウム・オクラセオフラヴァム（Ｓｔｅｒｅｕ
ｍ ｏｃｈｒａｃｅｏｆｌａｖｕｍ） ＳＡＮＫ１９４
００（ＦＥＲＭ ＢＰ−７２８０）株、に関する。

【００２４】本発明においては、上記（１）又は（２）
記載の化合物をＦ−１６０５３Ａという。

【００２５】Ｆ−１６０５３Ａは種々の異性体を有す
る。本発明においては、これら異性体が全て単一の式で
表される。本発明はこれらの異性体及びこれらの異性体
の混合物をもすべて含むものである。

【００２６】Ｆ−１６０５３Ａは常法に従って塩にする
ことができる。そのような塩は、医薬用途、獣医学用
途、及びそれ以外の用途（例えば、合成中間体等）のい
ずれにも使用することができる。そのような塩として
は、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、
のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム
塩、のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄
塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属
塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミ
ン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミ
ン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレン
ジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、
ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキ
シルアミン塩、Ｎ．Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン
塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノール
アミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラ
ジン塩、テトラメチルアンモニア塩、トリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン
塩；弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、沃化水素酸
塩のようなハロゲン化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、
硫酸塩、燐酸塩等の無機塩類；メタンスルホン酸塩、ト
リフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩の
ような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸
塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホ
ン酸塩、酢酸、りんご酸、フマール酸塩、コハク酸塩、
クエン酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；及
び、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オリニチン
塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ
酸塩等を挙げることができ、好適には薬理学的に許容さ
れる塩、すなわち、ナトリウム塩、塩酸塩である。

【００２７】本発明は、生体内において代謝されてＦ−
１６０５３Ａに変換される化合物、いわゆるプロドラッ
グもすべて含むものである。

【００２８】

【発明の実施の形態】Ｆ−１６０５３Ａを生産する微生
物としては、特に限定されるものではないが、例えば、
ステレウム（Ｓｔｅｒｅｕｍ）属に属する糸状菌等を挙
げることができ、好適にはステレウム・オクラセオフラ
バム（Ｓｔｅｒｅｕｍ ｏｃｈｒａｃｅｏｆｌａｖｕ
ｍ）であり、より好適にはステレウム・オクラセオフラ
バム ＳＡＮＫ１９４００株（以下、単に「ＳＡＮＫ１
９４００株」という。）である。ＳＡＮＫ１９４００株
は、１９９８年８月茨城県つくば市において採集した子
実体の担子胞子より分離された。

【００２９】本菌の培養下での菌学的性状を観察するた
め、以下に示す寒天培地上で培養を行った。ポテトデキ
ストロース寒天（Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａ
ｇａｒ：以下、「ＰＤＡ」という。）培地；ニッスイ
ポテトデキストロース寒天培地（日水製薬（株）製）３
９ｇを蒸留水１Ｌに溶解し、１２１℃にて１５分間滅菌
し、プレートを作製した。

【００３０】ＭＥＡ培地；マルトエキス１２．５ｇ及び
寒天２０ｇを蒸留水１Ｌに溶解し、１２１℃にて１５分
間滅菌し、プレートを作製した。色調の表示は「メチュ
ーン・ハンドブック・オブ・カラー」（Ｋｏｒｎｅｒｕ
ｐ，Ａ． ａｎｄ Ｗａｎｓｃｈｅｒ，Ｊ． Ｈ． ：
“Ｍｅｔｈｕｅｎ ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｃｏｌ
ｏｕｒ（３ｒｄ． ｅｄｉｔｉｏｎ）”，Ｅｒｙｅ Ｍ
ｅｔｈｕｅｎ，Ｌｏｎｄｏｎ，（１９７８））に従っ
た。

【００３１】ＳＡＮＫ１９４００株の培養下での菌学的
性状は次の通りである。

【００３２】ＰＤＡ上での生長は、２３℃、２週間の培
養で７乃至１２ｍｍである。菌そうの縁の部分は立ち上
がり、鋸歯状である。菌そうは羊毛状、白色乃至イエロ
イッシュホワイト（４Ａ２）である。裏面はブラウン
（６Ｅ６）である。ＭＥＡ上での生長は、２３℃、２週
間の培養で１２乃至１４ｍｍである。菌そうの縁の部分
は埋没し全縁である。菌そうは短軟毛状、白色である。
裏面の培地の色は変化しない。気菌糸は幅１．５乃至６
μｍ、薄壁乃至やや厚壁である。においはなし。分生子
はなし。かすがい連結は少なく、隔壁あたり１個又は２
つ以上形成し、幅の広い菌糸だけに観察される。

【００３３】ＳＡＮＫ１９４００株は培地上で子実体を
形成しないので、その同定には子実体が必要である。そ
こで、分離に供試した子実体の乾燥標本の菌学的性状を
観察した。その乾燥標本の菌学的性状は次の通りであ
る。

【００３４】子実体は杯形乃至背着性である。傘は幅
２．７ｍｍ以下で厚さ０．２ｍｍ以下、しばしば横に連
なる。表面は粗剛毛乃至粗長毛、白色である。縁は長縁
毛である。子実層の面は平滑、グレイッシュオレンジ
（５Ｂ３）乃至グレイッシュブラウン（５Ｅ３）であ
る。毛被と肉の間に下皮はない。担子胞子は５．０乃至
７．１μｍ×２．２乃至２．８μｍ、長楕円形乃至円筒
形、平滑、無色、アミロイドである。担子器は２２乃至
３０μｍ×４．５乃至５．５μｍ、細長い棍棒状、４つ
の小柄を有し、基部にかすがい連結はない。骨格シスチ
ジアは幅４．５乃至８．５μｍ、厚壁、先端は円形また
は小さい突起を有する。鋭角シスチジアは１４乃至２８
μｍ×２．５乃至４μｍ、無色、薄壁である。菌糸は二
菌糸型である。原菌糸は幅１．５乃至３μｍ、薄壁乃至
厚壁、隔壁にかすがい連結はない。骨格菌糸は３乃至
５．５μｍ、厚壁、しばしば二次隔壁を有する。アカン
トフィシスや偽アカントフィシスはない。

【００３５】本菌の以上のような菌学的性状は、チャム
リス（Ｃｈａｍｕｒｉｓ，Ｇ． Ｐ．： Ｉｎｆｒａｇ
ｅｎｅｒｉｃ ｔａｘａ ｉｎ Ｓｔｅｒｅｕｍ，ａｎ
ｄｋｅｙｓ ｔｏ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｓ
ｐｅｃｉｅｓ． Ｍｙｃｏｔａｘｏｎ，２２，１０５
（１９８５））やユング（Ｊｕｎｇ，Ｈ． Ｓ．： Ｗ
ｏｏｄ−ｒｏｔｔｉｎｇ Ａｐｈｙｌｌｏｐｈｏｒａｌ
ｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ａｐｐａｌａ
ｃｈｉａｎ ｓｐｒｕｃｅ−ｆｉｒ ｆｏｒｅｓｔ，Ｂ
ｉｂｌ． Ｍｙｃｏｌ．，１１９，１１４（１９８
７））の、ステレウム・オクラセオフラバムの菌学的性
状に関する記載に一致した。よって、ＳＡＮＫ１９４０
０株をステレウム・オクラセオフラバムと同定した。

【００３６】なお、ＳＡＮＫ１９４００株は、ステレウ
ム・オクラセオフラバム ＳＡＮＫ１９４００株とし
て、平成１２年７月２６日付けで日本国茨城県つくば市
東１−１−３の通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７２
４４を付与された。

【００３７】周知の通り、真菌類は自然界において、ま
たは人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、
化学薬品処理等）により、変異を起こしやすく、本発明
のＳＡＮＫ１９４００株も同様である。ＳＡＮＫ１９４
００株はその全ての変異株を包含する。また、これらの
変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組み換え、形質
導入、形質転換等によりえられたものも含有される。即
ち、Ｆ−１６０５３Ａを生産するＳＡＮＫ１９４００
株、それらの変異株およびそれらと明確に区別されない
菌株は全てＳＡＮＫ１９４００株に包含される。

【００３８】Ｆ−１６０５３Ａは、ステレウム属に属す
る該化合物の生産菌を培養し、次いでその培養物から該
化合物を採取することにより得ることができる。

【００３９】Ｆ−１６０５３Ａ生産菌を培養するための
培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、微量金
属、微量栄養因子等の栄養源を適宜含有する培地であれ
ば、合成培地及び天然培地の何れをも使用することがで
きる。

【００４０】炭素源としては、例えば、グルコース、シ
ュークロース、澱粉、グリセリン、水飴、糖蜜、大豆油
等を挙げることができる。培地に含有せしめる炭素源の
量は、１乃至３０重量％である。

【００４１】窒素源としては、例えば、大豆粉、コーン
スチープリカー、生イースト、ジャガイモ、硫酸アンモ
ニウム、硝酸ナトリウム等を挙げることができる。培地
に含有せしめる窒素源の量は、０．１乃至１０重量％で
ある。

【００４２】必要に応じ、炭酸カルシウム、リン酸塩等
の無機塩類、金属、無機及び有機の微量栄養因子等を培
地に添加してもよい。

【００４３】Ｆ−１６０５３Ａ生産菌の培養法として
は、一般に微生物の二次代謝物を生産する方法であれば
特に限定されないが、例えば、液体振とう培養法等を挙
げることができる。

【００４４】Ｆ−１６０５３Ａ生産菌の培養温度は１８
乃至２４℃であり、好適には２３℃である。

【００４５】Ｆ−１６０５３Ａ生産菌を液体振とう培養
したときのＦ−１６０５３Ａの生産は、通常７乃至９日
で最高値に達する。

【００４６】Ｆ−１６０５３Ａは、該化合物生産菌の培
養物、培養ろ液、培養上清及び／又は菌体より採取する
ことができる。培養物に、該培養物と等容の、水と混和
する溶媒を添加し攪拌することにより、Ｆ−１６０５３
Ａが該溶媒中に抽出される。そのような水と混和する溶
媒としては、例えば、アセトン、アセトニトリル、含水
アセトン、含水アセトニトリル等を挙げることができ
る。該抽出物を珪藻土等をろ過操作助剤とするろ過操作
又は遠心分離操作に供することにより、固形分をろ別
し、抽出液を得ることができる。該抽出液を粗画分と
し、Ｆ−１６０５３Ａの物理化学的性状を利用して該化
合物を精製することができる。

【００４７】該抽出液を減圧濃縮乾固に供し、上述の水
と混和する溶媒を留去した後、ｐＨ３程度の酸性条件下
で水と混和しない溶媒で抽出する。そのような水と混和
しない溶媒としては、例えば、ｎ−ブタノール、メチル
エチルケトン、酢酸エチル、クロロホルム、塩化エチレ
ン、塩化メチレン、それら２つ以上の混合溶媒等を挙げ
ることができる。

【００４８】得られた画分から溶媒を留去し、吸着クロ
マトグラフィーに供する。Ｆ−１６０５３Ａを吸着剤に
吸着させた後、Ｆ−１６０５３Ａを溶出して回収する
か、又は、夾雑物を吸着剤に吸着させ、非吸着画分中に
Ｆ−１６０５３Ａを回収することができる。そのような
吸着剤としては、例えば、活性炭、アンバーライトＸＡ
Ｄ−２、アンバーライトＸＡＤ−４（以上、ローム・ア
ンド・ハース社製）、ダイヤイオンＨＰ−１０、ダイヤ
イオンＨＰ−２０、ダイヤイオンＣＨＰ−２０Ｐ、ダイ
ヤイオンＨＰ−５０（以上、三菱化学（株）製）等を挙
げることができる。吸着クロマトグラフィーに使用する
移動層としては、例えば、含水メタノール、含水アセト
ン水、含水ｎ−ブタノール水等を挙げることができる。

【００４９】このようにして得られたＦ−１６０５３Ａ
含有画分を、さらに、シリカゲル、フロリジル、コスモ
シールナ１４０Ｃ１８−ＯＰＮ（カライテスク社製）等
の担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー、セファ
デックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）等の担体を用
いた分配カラムクロマトグラフィー、セファデックスＧ
−２５（ファルマシア社製）等を用いたゲルろ過クロマ
トグラフィー、順相カラム又はＳｅｎｓｈｕ Ｐａｋ
ＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳ（センシュー科学（株）製）等
の逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ｈ
ｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈ
ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：以下、「ＨＰＬＣ」とい
う。）等に供することにより、該化合物を単離すること
ができる。これらの精製手段は、単独で又は２つ以上を
組み合わせて使用することができ、必要に応じて一つの
精製手段を２回以上繰り返してもよい。

【００５０】Ｆ−１６０５３Ａ生産菌の培養、該化合物
の抽出、精製、単離工程における、該化合物の挙動は、
以下に記載する１）又は２）の方法により追跡すること
ができる。１）ＨＰＬＣ分析による方法ＨＰＬＣの分析
条件としては、特に限定されるものではないが、例え
ば、次のような条件を挙げることができる： カラム ：Ｓｅｎｓｈｕ Ｐａｋ ＰＥＧＡＳＩＬ Ｏ
ＤＳ（直径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ：センシュー科
学（株）製） 溶 媒：アセトニトリル：水＝３：１ 流 速：１ｍｌ／分 検 出：ＵＶ ２１０ｎｍ 保持時間：１１．５分。 ２）スフィンゴシンキナーゼ阻害活性測定による方法 スフィンゴシンキナーゼ阻害活性は、例えば、以下に記
載する方法に従って確認することができる（Ｓｃｈｒｏ
ｅｐｆｅｒ，Ｊ． Ｒ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ． Ｃｈｅｍ．，２４５，３０８４（１９７０）参
照）。

【００５１】スフィンゴシンキナーゼの酵素溶液、アデ
ノシン三リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ−３’−ｍｏｎｏ
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ：以下、「ＡＴＰ」という。）、塩
化マグネシウム、エチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｌ
ｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ：以
下、「ＥＤＴＡ」という。）、メルカプトエタノールを
含むリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、被検検体、
及びプロピレングリコールに溶解した標識基質を混合
し、酵素反応を行う。

【００５２】スフィンゴシンキナーゼの供給源として
は、スフィンゴシンキナーゼ活性を有する組織又は細胞
であれば特に限定されず、動物組織、動物細胞等を挙げ
ることができる。この場合、動物種にも特に限定はな
い。

【００５３】動物組織としては、例えば、肝臓、腎臓、
血管組織等が挙げられ、好適にはウイスターイマミチ系
雄性ラット肝臓であり、より好適には該肝臓の細胞質可
溶性画分である。

【００５４】動物細胞としては、初代培養により得られ
る正常細胞及び株化した細胞の双方が使用でき、好適に
はラット胎児胸部大動脈由来平滑筋細胞株Ａ７ｒ５（Ａ
ＴＣＣ株番号：ＣＲＬ−１４４４）である。

【００５５】また、組換え体の酵素も使用することがで
きる。その場合も該組換え体の動物源に限定はないが、
好適にはヒト、マウスである。例えば、マウス由来スフ
ィンゴシンキナーゼ１（Ｋｏｈａｍａ，Ｔ．，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，２３７２２
（１９９８）参照）又はマウス由来スフィンゴシンキナ
ーゼ２（Ｌｉｕ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２７５，１９５１３（２０００）参照）の
ｃＤＮＡ又は構造遺伝子を含む組換えＤＮＡベクターを
導入し該酵素を細胞に発現させ、該細胞の細胞質を回収
することにより、酵素溶液として使用することができ
る。該組換え体を発現させる細胞としては、特に限定さ
れるものではないが、例えば、ヒト胎児腎臓由来細胞で
あるＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１５７
３）等を挙げることができる。また、該組換え体の発現
に用いるベクターとしては、動物細胞にトランスフェク
ションすることができ、且つ該ベクターに挿入された外
来配列によってコードされた蛋白質を発現させることが
できるものであれば特に限定されるものではないが、好
適にはトランスフェクションされた細胞を選抜するのに
適したマーカー遺伝子配列を含むベクターであり、その
ようなベクターとして、例えば、ネオマオシン耐性遺伝
子配列を含むｐＣＲ３．１（インヴィトロジェン社製）
等を挙げることができる。培地にＧ４１８（シグマ社
製）を添加することにより、ネオマイシン耐性遺伝子を
保有する細胞を選抜することができる。

【００５６】スフィンゴシンキナーゼ反応に用いる酵素
は、組織抽出液、細胞破砕液、細胞分画により得られる
画分等の粗酵素標品、及び、精製工程を経ることにより
得られる部分精製標品若しくは均一標品のいずれであっ
てもよい。精製工程としては、通常蛋白質の精製に使用
される方法であれば特に限定されないが、例えば、カル
モジュリンがスフィンゴシンキナーゼと結合する性質
（Ｏｌｉｖｅｒａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１２５７６（１９９８）参
照）を利用したアフィニティ・クロマトグラフィー等を
挙げることができる。

【００５７】標識基質としては、特に限定されるもので
はないが、好適には［３−³Ｈ］−Ｄ−エリスロ−スフ
ィンゴシン（ＮＥＮ社製）である。

【００５８】スフィンゴシンキナーゼ反応の温度は、３
０℃乃至３７℃であり、好適には３７℃である。

【００５９】スフィンゴシンキナーゼ反応の反応時間
は、５分乃至６０分であり、好適には２０分である。

【００６０】スフィンゴシンキナーゼ反応の停止は、濃
アンモニア水の添加により行なうことが好ましい。

【００６１】スフィンゴシンキナーゼ反応終了後、反応
液を脂溶性溶媒を用いて抽出することによりアルカリ性
条件下で水難溶性の基質Ｄ−エリスロ−スフィンゴシン
を有機相に移した後、水相に回収される生成物Ｄ−エリ
スロ−スフィンゴシン−１−リン酸を定量することによ
り、該酵素活性を算出することができる。好適な基質で
ある［３−³Ｈ］−Ｄ−エリスロ−スフィンゴシンを用
いた場合、スフィンゴシンキナーゼ活性は、脂溶性溶媒
で抽出した後の水相に回収される［３−³Ｈ］−Ｄ−エ
リスロ−スフィンゴシン−１−リン酸の放射能及び基質
の比放射能から算出することができる。脂溶性溶媒とし
ては、スフィンゴシンキナーゼ反応生成物が溶解し得る
溶媒であれば特に限定されないが、例えば、クロロホル
ム、クロロホルムとメタノールの混合溶媒等が挙げら
れ、好適にはクロロホルム：メタノール＝２：１（容積
／容積）である。

【００６２】被検体によるスフィンゴシンキナーゼ活性
阻害率（Ａ）は、被検体非存在下におけるスフィンゴシ
ンキナーゼ活性（Ｂ）及び被検体存在下におけるスフィ
ンゴシンキナーゼ活性（Ｃ）から、次に示す式により算
出することができる。 Ａ＝（Ｂ−Ｃ）÷Ｂ また、スフィンゴシンキナーゼの活性測定には、³²Ｐ−
ＡＴＰを用いるオリヴェラらの方法（Ｏｌｉｖｅｒａ，
Ａ． ａｎｄ Ｓｐｉｅｇｅｌ，Ｓ．，Ｎａｔｕｒｅ，
３６５，５５７（１９９３）参照）を適用してもよい。
本発明の化合物を動脈硬化症、糖尿病、血栓症、炎症性
疾患、自己免疫疾患、癌の進展や転移、経皮的冠動脈形
成術（ＰＴＣＡ）後の再狭窄の予防剤又は治療剤として
用いる場合、種々の形態で投与され得るが、疾患の種
類、疾患の程度、患者の年齢、患者の性別度等に応じて
適宜選択することができる。例えば、錠剤、カプセル
剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤は経口投与され、注射剤
は単独で若しくはブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と
混合して静脈内投与されるか、又は単独で筋肉内投与、
皮下投与、皮内投与、腹腔内投与され、坐剤は直腸内投
与される。これらの製剤は、常法に従い、賦形剤、結合
剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁
剤、コーティング剤等、医薬の製剤分野において通常使
用しうる公知の補助剤を用いて製剤化することができ
る。

【００６３】錠剤の形態に成形するには、担体として当
該分野で公知のものを広く使用できる。そのような担体
としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブド
ウ糖、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セ
ルロース、ケイ酸等の賦形剤；水、エタノール、プロパ
ノール、単シロップ、ブドウ糖液、澱粉液、ゼラチン溶
液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセ
ルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の
結合剤；乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラ
ミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポ
リオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリ
ル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱
粉、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、カカオバタ
ー、水素添加油等の崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩
基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリ
ン、澱粉等の保湿剤；澱粉、乳糖、カオリン、ベントナ
イト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステ
アリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコール等の潤沢
剤等を挙げることができる。また、錠剤は必要に応じ通
常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包
錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層
錠等とすることができる。

【００６４】丸剤の形態に成形するには、担体として当
該分野で公知のものを広く使用できる。そのような担体
としては、例えば、ブドウ糖、乳糖、カカオバター、澱
粉、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤；アラビ
アゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結
合剤；ラミナラン寒天等の崩壊剤等を挙げることができ
る。

【００６５】坐剤の形態に成形するには、担体として当
該分野で公知のものを広く使用できる。そのような担体
としては、例えば、ポリエチレングリコール、カカオバ
ター、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、
ゼラチン、半合成グリセリド等を挙げることができる。

【００６６】注射剤として調製される場合には、液剤及
び懸濁剤は殺菌され、且つ血液と等張であることが好ま
しい。これら液剤、乳剤および懸濁剤の形態に成形する
には、希釈剤として当該分野で公知のものを広く使用で
き、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、
エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イ
ソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタ
ン脂肪酸エステル類等を挙げることができる。なお、こ
の場合、血液との等張性を保つのに十分な量の食塩、ブ
ドウ糖、グリセリン等を医薬製剤中に含有せしめてもよ
く、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加
してもよい。

【００６７】また、必要に応じて着色剤、保存剤、香
料、風味剤、甘味剤、他の医薬等を含有せしめてもよ
い。

【００６８】これらの医薬製剤中に含まれるＦ−１６０
５３Ａの量は、特に限定されるものではないが、通常１
乃至７０重量％であり、好適には１乃至３０重量％であ
る。

【００６９】Ｆ−１６０５３Ａの投与量は、症状、年
齢、体重、投与形態、剤形等に依存するが、通常成人に
対して１日あたり、上限５００乃至１０００ｍｇ、下限
が１０乃至５０ｍｇであり、好適な範囲は５０乃至５０
０ｍｇである。

【００７０】Ｆ−１６０５３Ａを有効成分として含有す
る医薬の投与回数は、投与形態、剤形等に依存するが、
数日に１回、１日１回、又は１日数回である。

【００７１】

【実施例】以下に実施例、試験例及び製剤例を挙げ、本
発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限
定されるものではない。 実施例１．Ｆ−１６０５３Ａの製造 １）生産菌の培養 表１に示す組成を有する培養培地８０ｍｌを入れた、５
００ｍｌ容の三角フラスコを１２１℃にて１５分間滅菌
した後、室温まで冷却し、ＳＡＮＫ１９４００株を無菌
的に接種し、２３℃、２１０ｒｐｍの条件下で７日間培
養を行なった。 表１．培養培地の組成 ―――――――――――――――――――――――――――――― マルトース ２０ｇ グルコース １０ｇ ポリペプトン ２ｇ イースト・エキストラクト ０．８ｇ リン酸二水素カリウム ０．５ｇ 硫酸マグネシウム・七水和物 １ｇ 塩化第二鉄・六水和物 ０．０１ｇ 硫酸亜鉛・七水和物 ０．００２ｇ 塩化カルシウム ０．０５５ｇ 消泡剤 ＣＢ−４２２ （日本油脂（株）社製） ０．２ｍｇ イオン交換水で１０００ｍｌとした。 ―――――――――――――――――――――――――――――― ２）化合物の単離 １）で得られた培養物１．２Ｌを遠心分離し、菌体と培
養上清とに分離した。菌体に８０％アセトン水１Ｌを加
え、３時間室温にて抽出した。固形物をろ過した後、ろ
液中のアセトンを減圧留去した。得られた水溶液０．５
ＬをｐＨ３に調整し、酢酸エチル０．５Ｌを加えて３回
抽出した。得られた酢酸エチル画分２Ｌに飽和食塩水１
Ｌを加えて洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて脱
水し、減圧濃縮して褐色油状物質４．３ｇを得た。これ
を少量の４０％アセトニトリル水に溶解し、予め水で平
衡化した５００ｍｌのダイヤイオンＨＰ−２０カラム
（三菱化学（株）製）に付し、２乃至３カラム容量の水
及び４０％アセトニトリル溶液で該カラムを洗浄した
後、５カラム容量の７０％アセトニトリル水で溶出し
た。溶出液中のアセトニトリルを減圧留去した後凍結乾
燥し、黄色油状物質９５０ｍｇを得た。これを少量の３
０％アセトニトリル溶液に溶解し、同じ溶媒で予め平衡
化した１５０ｍｌ容のコスモシール１４０Ｃ１８−ＯＰ
Ｎ（ナカライテスク社製）カラムに付した。該カラムを
２乃至３カラム容量の３０％アセトニトリル水及び６０
％アセトニトリル水で洗浄した後、５カラム容量の７０
％アセトニトリル水で溶出した。溶出液中のアセトニト
リルを減圧留去した後凍結乾燥し、黄色油状物質６１４
ｍｇを得た。このうち２９０ｍｇを少量の８０％アセト
ニトリル水に溶解し、このうち２０ｍｇ相当量を、予め
アセトニトリル：水＝３：１の溶液で平衡化したＨＰＬ
Ｃカラム（Ｓｅｎｓｈｕ Ｐａｋ ＰＥＧＡＳＩＬ Ｏ
ＤＳ：直径２０ｍｍ×長さ２５０ｍｍ：センシュー科学
（株）製）に付し、同じ溶媒で９ｍｌ／ｍｉｎの流速で
展開した。波長２１０ｎｍの吸収を検出し、保持時間約
４０分に溶出されるピーク画分を分取した。このＨＰＬ
Ｃ分画を２０回行い、得られたピーク画分を合併し、ア
セトニトリルを減圧留去した。残った水を凍結乾燥し、
Ｆ−１６０５３Ａを１２０ｍｇ得た。 試験例１．スフィンゴシンキナーゼ阻害活性の測定 １）酵素溶液の調製 マウス由来スフィンゴシンキナーゼ１ｃＤＮＡ（Ｋｏｈ
ａｍａ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２７３，２３７２２（１９９８）参照）及びマウ
ス由来スフィンゴシンキナーゼ２ｃＤＮＡ（Ｌｉｕ，
Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７
５，１９５１３（２０００）参照）を、それぞれ別個
に、発現ベクターｐＣＲ３．１（インヴィトロジェン社
製）へ組込み、リポフェクタミン・プラス（ライフテク
ノロジー社製）を用い、ヒト胎児腎由来のＨＥＫ２９３
細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１５７３）にトランスフ
ェクションした。すなわち、１ウェルあたり６×１０⁵
個のＨＥＫ２９３細胞を、組織培養用ポリリジンコート
６ウェルプレート（上記キットに含まれる。）中で、３
７℃にて２４時間培養した後、１μｇの組換えベクター
をトランスフェクションした。３７℃にて１日間培養し
た後、培地にＧ４１８（シグマ社製）を終濃度１００乃
至４００μｇ／ｍｌとなるよう添加し、さらに２週間培
養することによりネオマイシン耐性細胞を選択的に増殖
させた。得られた細胞を、セルスクレーパーを用いてウ
ェルから剥がし、緩衝液１（２０％グリセロール、１ｍ
Ｍ β―メルカプトエタノール、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１
ｍＭ バナジン酸ナトリウム、１５ｍＭ 弗化ナトリウ
ム、０．５ｍＭ ４−デオキシピリドキシン、１０μｇ
／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌ アプロチニン、
１ｍＭ フェニルメタンスルホン酸、０．１Ｍリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７．４））に懸濁して回収した。５
回の凍結融解を繰り返した後、３，０００×Ｇ、１０分
間遠心分離した。上清を回収し、１０５，０００×Ｇ、
３０分間遠心分離し、得られた上清を酵素溶液とした。 ２）酵素阻害活性の測定 スフィンゴシンキナーゼ阻害活性の測定は、１）で得ら
れたスフィンゴシンキナーゼ１又は２の酵素溶液、及
び、［３−³Ｈ］−Ｄ−エリスロ−スフィンゴシン（Ｎ
ＥＮ社製）を基質として用い、シュレーファーらの方法
（Ｓｃｈｒｏｅｐｆｅｒ，Ｊ． Ｒ． ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４５，３０８４（１９７
０）参照）に従って行なった。

【００７２】１）で調製した、蛋白濃度が０．１乃至
０．５μｇ／ｍｌの酵素溶液１００μｌ、緩衝液２（１
０ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．
１Ｍ リン酸カリウム緩衝液、１ｍＭ バナジン酸ナト
リウム、１５ｍＭ 弗化ナトリウム、０．５ｍＭ デオ
キシピリドキシン、１ｍＭ フェニルメタンスルホン酸
（ｐＨ７．４））１００μｌ、実施例１で得られたＦ−
１６０５３Ａ溶液１０μｌ、及び、プロピレングリコー
ルに溶解した［３−³Ｈ］−Ｄ−エリスロ−スフィンゴ
シン１０μｌを混合し、３７℃にて２０分保温した。濃
アンモニア水５０μｌを加えることにより反応を停止さ
せた。

【００７３】基質であるＤ−エリスロ−スフィンゴシン
はアルカリ性条件下では水難溶性であるのに対し、生成
物であるＤ−エリスロ−スフィンゴシン−１−リン酸は
水可溶性なので、該生成物を回収するために反応終了液
の水溶性成分を回収した。すなわち、反応終了液にクロ
ロホルム：メタノール＝２：１（容積／容積）７５０μ
ｌを加えて該反応液を抽出し、水層を回収した。得られ
た水層を９６穴プレート（ルーマプレート：パッカード
社製）に１ウェルあたり７０μｌ注ぎ、室温にて一晩放
置することにより乾燥させた後、９６穴プレート用液体
シンチレーションカウンター（トップカウント：パッカ
ード社製）を用いて各ウェルの放射能を測定した。各ウ
ェルの放射能及び基質の比放射能より、スフィンゴシン
キナーゼ活性を算出した。

【００７４】Ｆ−１６０５３Ａによるスフィンゴシンキ
ナーゼ活性阻害率（Ａ）は、該化合物非存在下における
スフィンゴシンキナーゼ活性（Ｂ）及び該化合物存在下
におけるスフィンゴシンキナーゼ活性（Ｃ）から、次に
示す式により算出した。 Ａ＝（Ｂ−Ｃ）÷Ｂ このような方法で測定し算出した、マウス由来の組換え
体スフィンゴシンキナーゼ−１及び２の活性に対するＦ
−１６０５３Ａの５０％阻害濃度を表２に示した。 表２．Ｆ−１６０５３Ａのスフィンゴシンキナーゼ阻害活性 ―――――――――――――――――――――――――――――――― アイソザイム ５０％阻害濃度（μｇ／ｍｌ） ―――――――――――――――――――――――――――――――― スフィンゴシンキナーゼ１ ５．１ スフィンゴシンキナーゼ２ １０．９ ―――――――――――――――――――――――――――――――― 表２に示した通り、Ｆ−１６０５３Ａはスフィンゴシン
キナーゼ１及び２に対し、ほぼ同等の阻害活性を示し
た。 製剤例１．カプセル剤 Ｆ−１６０５３Ａ １００ｍｇ 乳糖 １００ｍｇ トウモロコシ澱粉 １４８．８ｍｇ ステアリン酸マグネシウム １．２ｍｇ ――――――――――――――――――――――――――――― 全量 ３５０ｍｇ 上記処方の粉末を混合し、６０メッシュのふるいを通し
た後、得られた粉末をゼラチンカプセルに入れ、カプセ
ル剤とする。

【００７５】

【発明の効果】本発明の提供するＦ−１６０５３Ａは優
れたスフィンゴシンキナーゼ阻害活性を有し、動脈硬化
症、糖尿病、血栓症、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌の
進展又は転移、経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）後の再
狭窄の予防又は治療等に有用である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/10 １０１ Ａ６１Ｐ 9/10 １０１ 29/00 29/00 35/00 35/00 35/04 35/04 37/06 37/06 37/08 37/08 Ｃ０７Ｃ 69/013 Ｃ０７Ｃ 69/013 Ｂ 69/03 69/03 Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｅ Ｃ１２Ｐ 7/64 Ｃ１２Ｐ 7/64 // Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 9/99 (Ｃ１２Ｎ 1/14 (Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｅ Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 7/64 (Ｃ１２Ｐ 7/64 Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 田中 一新 茨城県つくば市御幸が丘33 三共株式会社 内 Ｆターム(参考） 4B064 AD65 BA04 BB09 BB19 BB24 BE07 BE14 BG02 BG08 BH02 BH04 BH05 BJ04 BJ20 CA07 CD02 CD09 CD20 CD22 CE03 CE08 CE10 CE11 DA01 DA13 4B065 AA71X AC14 AC16 BA22 BB03 BB15 BB16 BB23 BB29 BC03 BC26 BD01 BD14 BD15 BD16 BD18 CA12 CA43 CA44 CA46 4C206 AA01 AA02 AA03 AA04 DB06 DB56 KA04 KA19 MA01 NA14 ZA40 ZA45 ZA54 ZB08 ZB11 ZB13 ZB26 ZC20 ZC35 4H006 AA01 AB20 AB22 AB23 AB24 AB27 AB29 BJ30 BN20 BQ10 BR70

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記式（Ｉ） 【化１】 で表される化合物又はその塩。
2. 【請求項２】下記の物理化学的性状を有する化合物又は
   その塩： １）性状：淡黄色油状物質 ２）溶解性：酢酸エチル、クロロホルムなどの非極性溶
   媒に可溶 ３）分子式：Ｃ₂₃Ｈ₃₄Ｏ₅ ４）分子量：３９０（高分解能ＦＡＢ−ＭＳ法による観
   測値はｍ／ｚ ３８９．２２９９（Ｍ−Ｈ） ^-、計算値
   は３８９．２２７０） ５）赤外吸収スペクトル：ν_max（薄膜法、ｃｍ^-1） ３４５０，２９３０，２８６０，１７３０，１１７０，
   １１００ ６）¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：（重クロロホルム
   中：単位はｐｐｍ：内部標準はテトラメチルシラン） ９．５（１Ｈ，ｓ），６．８（１Ｈ，ｓ），６．４（１
   Ｈ，ｓ），５．８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），５．
   ７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），２．６（１Ｈ，ｔ，
   Ｊ＝１３．０Ｈｚ），２．５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．
   ０，４．０Ｈｚ），２．４（１Ｈ，ｍ），２．３（２
   Ｈ，ｔ−ｌｉｋｅ，Ｊ＝７．５，１．５Ｈｚ），２．２
   （２Ｈ，ｍ），１．７（４Ｈ，ｍ），１．６（３Ｈ，ｂ
   ｒ，ｓ），１．３（８Ｈ，ｍ），１．１（３Ｈ，ｄ，Ｊ
   ＝６．５Ｈｚ），０．９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈ
   ｚ）． ７）¹³Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：（重クロロホルム
   中：単位はｐｐｍ：内部標準はテトラメチルシラン） ２０８．７（ｓ），１９４．０（ｄ），１７３．５
   （ｓ），１４７．９（ｓ），１３９．９（ｔ），１３
   ２．８（ｓ），１２５．５（ｄ），８０．５（ｓ），７
   １．５（ｄ），５５．７（ｄ），４５．０（ｔ），４
   ０．７（ｄ），３９．６（ｄ），３４．７（ｔ），３
   １．７（ｔ），３０．４（ｔ），２９．２（ｔ），２
   ９．０（ｔ），２４．８（ｔ），２２．６（ｔ），１
   ９．５（ｑ），１９．１（ｑ），１４．１（ｑ）． ８）高速液体クロマトグラフィー カラム ：Ｓｅｎｓｈｕ Ｐａｋ ＰＥＧＡＳＩＬ Ｏ
   ＤＳ（直径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ：センシュー科
   学（株）製） 溶 媒：アセトニトリル：水＝３：１ 流 速：１ｍｌ／分 検 出：ＵＶ ２１０ｎｍ 保持時間：１１．５分
3. 【請求項３】ステレウム（Ｓｔｅｒｅｕｍ）属に属す
   る、請求項１又は２記載の化合物の生産菌を培養し、該
   培養物より請求項１又は２記載の化合物を採取すること
   を特徴とする、請求項１又は２記載の化合物の製造方
   法。
4. 【請求項４】ステレウム（Ｓｔｅｒｅｕｍ）属に属す
   る、請求項１又は２記載の化合物の生産菌が、ステレウ
   ム・オクラセオフラヴァム（Ｓｔｅｒｅｕｍ ｏｃｈｒ
   ａｃｅｏｆｌａｖｕｍ） ＳＡＮＫ１９４００（ＦＥＲ
   Ｍ ＢＰ−７２４４）株である、請求項３記載の製造方
   法。
5. 【請求項５】請求項１又は２に記載の化合物を有効成分
   として含有する医薬。
6. 【請求項６】請求項１又は２に記載の化合物を有効成分
   として含有する抗動脈硬化剤。
7. 【請求項７】請求項１又は２に記載の化合物を有効成分
   として含有する抗糖尿病剤。
8. 【請求項８】請求項１又は２に記載の化合物を有効成分
   として含有する抗血栓剤。
9. 【請求項９】請求項１又は２に記載の化合物を有効成分
   として含有する抗炎症剤。
10. 【請求項１０】請求項１又は２に記載の化合物を有効成
    分として含有する免疫抑制剤。
11. 【請求項１１】請求項１又は２に記載の化合物を有効成
    分として含有する制癌剤。
12. 【請求項１２】請求項１又は２に記載の化合物を有効成
    分として含有する癌転移抑制剤。
13. 【請求項１３】請求項１又は２に記載の化合物を有効成
    分として含有する抗アレルギー剤。
14. 【請求項１４】請求項１若しくは２に記載の化合物を有
    効成分として含有する、経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣ
    Ａ）後の再狭窄等の予防剤又は治療剤。
15. 【請求項１５】ステレウム・オクラセオフラヴァム（Ｓ
    ｔｅｒｅｕｍ ｏｃｈｒａｃｅｏｆｌａｖｕｍ） ＳＡ
    ＮＫ１９４００（ＦＥＲＭ ＢＰ−７２４４）株。