JP2002072096A

JP2002072096A - 超解像顕微鏡

Info

Publication number: JP2002072096A
Application number: JP2000259889A
Authority: JP
Inventors: Yoshinori Iketaki; 慶記池滝; Takashige Omatsu; 尾松　　孝茂; Masaaki Fujii; 正明藤井; Tomoo Suzuki; 智雄鈴木
Original assignee: Nippon Roper Co Ltd; Japan Science and Technology Corp; Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; Olympus Corp; Nippon Roper Co Ltd
Priority date: 2000-08-29
Filing date: 2000-08-29
Publication date: 2002-03-12
Anticipated expiration: 2020-08-29
Also published as: JP4659952B2

Abstract

(57)【要約】【課題】イレース光として利用できる波長帯域を広く
するとともに、光源の簡便さに優れた、新しい超解像顕
微鏡を提供する。【解決手段】試料分子が基底状態から第一電子励起状
態へ励起するときの吸収帯の最長端波長λ_1(max)より短
い波長λ₁を有するポンプ光の光源と、第一電子励起状
態の試料分子が蛍光を発光するときの蛍光発光帯の最長
端波長λ_2(max)より長い波長λ₂を有するとともに、第
一電子励起状態の試料分子の蛍光寿命より短いパルス幅
を有するパルスイレース光の光源と、ポンプ光およびパ
ルスイレース光の照射領域を一部分重ね合わせる重ね手
段とを備え、重ね手段を介してポンプ光およびパルスイ
レース光を試料に照射することにより、第一電子励起状
態の試料分子が基底状態へ脱励起する際の発光の領域を
一部分抑制する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この出願の発明は、超解像顕
微鏡に関するものである。さらに詳しくは、この出願の
発明は、超解像性を実現した新しい超解像顕微鏡に関す
るものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、レーザー技術や電子画像技術をは
じめとする周辺技術の進歩にともない、様々なタイプの
高性能かつ多機能な顕微鏡が開発されてきている。本願
発明の発明者も、その一つとして、複数波長の光を試料
に照明することによって発生する二重共鳴吸収過程を用
いて、得られる画像のコントラスト制御および試料の化
学分析を可能とする顕微鏡（以下、二重共鳴吸収顕微鏡
と呼ぶ）をすでに提案している（特願平６−３２９１６
５参照）。

【０００３】この二重共鳴吸収顕微鏡では、二重共鳴吸
収過程を用いて特定の分子を選択し、特定の光学遷移に
起因する吸収および蛍光を観測することができる。その
原理を説明すると、まず、基底状態（Ｓ₀状態：図１）
の試料分子（つまり、試料を構成する分子）が持つ価電
子軌道の電子を、レーザー光などの共鳴波長λ₁光によ
り第一電子励起状態へ励起させ（Ｓ₁状態：図２）、続
いて共鳴波長λ₂光により第二電子励起状態またはさら
に高位の励起状態へ励起させる（Ｓ₂状態：図３）。分
子は、この励起状態から蛍光あるいは燐光を発光したり
して基底状態に戻る（図４）。そして、図２に示した吸
収や図４に示した蛍光や燐光の発光を用いて吸収像や発
光像を観察する。

【０００４】Ｓ₁状態への励起過程においては、単位体
積内のＳ₁状態の分子数は照射する光の強度が増加する
にしたがって増加する。線吸収係数は、分子一個当たり
の吸収断面積と単位体積当たりの分子数の積で与えられ
るので、Ｓ₂状態への励起過程においては続いて照射す
る共鳴波長λ₂に対する線吸収係数は最初に照射した共
鳴波長λ₁の光の強度に依存する。すなわち、共鳴波長
λ₂（以下、波長λ₂と略称）に対する線吸収係数は共鳴
波長λ₁（以下、波長λ₁と略称）の光の強度で制御でき
る。このことは、波長λ₁および波長λ₂の２波長の光で
試料を照射し、波長λ₂による透過像を撮影すれば、透
過像のコントラストを波長λ₁の光で完全に制御できる
ことを示している。また、Ｓ₂状態からの蛍光または燐
光による脱励起過程が可能である場合には、その発光強
度はＳ₁状態にある分子数に比例する。したがって、蛍
光顕微鏡として利用する場合にも画像コントラストの制
御が可能となる。

【０００５】また、この二重共鳴吸収顕微鏡は、コント
ラストの制御のみならず、化学分析も可能にする。図１
に示される最外穀価電子軌道は個々の分子に固有なエネ
ルギー準位をもつので、波長λ₁は分子によって異な
る。同時に波長λ₂も分子固有のものとなる。単一波長
で照明・観察を行う従来の顕微鏡においても、ある程度
は特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察することが
可能ではあるが、一般にはいくつかの分子の吸収帯の波
長領域は重複するため、試料の化学組成の正確な同定ま
では不可能である。これに対し、二重共鳴吸収顕微鏡で
は波長λ₁および波長λ₂の２波長により吸収あるいは発
光する分子を限定するので、従来技術よりも正確な試料
の化学組成の同定が可能となる。また、価電子を励起す
る場合、分子軸に対して特定の電場ベクトルを持つ光の
みが強く吸収されるので、波長λ₁および波長λ₂の偏光
方向を決めて、吸収像または蛍光像を撮影すれば、同じ
分子でも配向方向の同定をも行うことができる。

【０００６】本願発明の発明者はさらに、回折限界を越
える高い空間分解能の二重共鳴吸収顕微鏡をも提案して
いる（特願平８−３０２２３２参照）。二重共鳴吸収過
程については、図５に例示したようにＳ₂状態からの蛍
光が極めて弱くなるある種の分子が存在する。このよう
な光学的性質を持つ分子に対しては、以下のような極め
て興味深い現象が起きる。図６は、図５と同じく二重共
鳴吸収過程の概念図であるが、横紬にＸ軸を設けて空間
的距離の広がりを表現しており、波長λ₁光および波長
λ₂光が照射されている空間領域Ａ₁（＝蛍光抑制領域）
と、波長λ₁光のみが照射されて波長λ₂光が照射されて
いない空間領域Ａ₀（＝蛍光領域）について示してい
る。空間領域Ａ₀では波長λ₁光による励起によってＳ₁
状態の分子が多数生成される。このとき空間領域Ａ₀か
らは波長λ₃で発光する蛍光が見られる。しかし空間領
域Ａ₁では、波長λ₂光が照射されるので、Ｓ₁状態の分
子が即座に高位のＳ₂状態へと励起され、Ｓ₁状態の分子
は存在しなくなる。このため空間領域Ａ₁においては、
波長λ₃の蛍光は全く発生せず、しかもＳ₂状態からの蛍
光はもともとないので、完全に蛍光自体が抑制されるこ
ととなる。すなわち蛍光が発生するのは空間領域Ａ₀の
みとなる。このような現象の発生が数種類の分子におい
て確認されている。

【０００７】したがって、従来の走査型レーザー顕微鏡
などでは、レーザー光を集光して観察試料上に形成され
るマイクロビームのサイズが集光レンズの開口数と波長
による回折限界で決まるので、それ以上の空間分解能が
原理的に期待できないにの対し、図６で示した現象によ
れば波長λ₁光と波長λ₂光を空間的に一部分重ね合わせ
ることで、波長λ₂光の照射で蛍光領域が抑制されるた
め、たとえば波長λ₁光の照射領域に着目すると、蛍光
領域は集光レンズの開口数と波長とで決まるビームのサ
イズよりも狭くなっており、実質的に空間分解能の向上
が図られている。本願発明者による二重共鳴吸収顕微鏡
（特願平８−３０２２３２参照）は、この原理を用い
て、回折限界を越える超解像顕微鏡を実現しているので
ある。

【０００８】そして本願発明の発明者は、この二重共鳴
吸収顕微鏡の超解像性をさらに高めるべく、その機能を
十分に活かすための試料の調整や波長λ₁光・波長λ₂光
の試料への照射タイミングなどをもすでに提案している
（特願平９−２５５４４４）。より具体的には、試料を
染色分子により染色する。この染色分子として、基底状
態を含め少なくとも３つの量子状態（Ｓ₀状態，Ｓ₁状
態，Ｓ₂状態・・・）を有し、且つＳ₁状態を除く高位の
量子状態から基底状態へ脱励起するときの遷移において
蛍光による緩和過程よりも熱緩和過程が支配的である各
種分子（以下、蛍光ラベラー分子と呼ぶ）を用いるので
ある。このような蛍光ラベラー分子と生化学的な染色技
術を施した生体分子とを化学結合させてなる試料に、波
長λ₁光を照射して蛍光ラベラー分子をＳ₁状態に励起さ
せ、続いて即座に波長λ₂光を照射して蛍光ラベラー分
子をより高位の量子準位に励起させることで、Ｓ₁状態
からの蛍光を効果的に抑制できるようになる。この際
に、上述したような空間的な蛍光領域の人為的な抑制を
行うことにより、空間分解能のさらなる向上が実現され
る。

【０００９】上記の蛍光ラベラー分子の光学的性質は、
以下のように量子化学的な見地から説明できる。一般
に、分子はそれを構成する各原子のσまたはπ結合によ
って結ばれている。言い換えると、分子の分子軌道はσ
分子軌道またはπ分子軌道をもっていて、これらの分子
軌道に存在する電子が各原子を結合する重要な役割を担
っている。そのなかでも、σ分子軌道の電子は、各原子
を強く結合し、分子の骨格である分子内の原子間距離を
決める。これに対して、π分子軌道の電子は、各原子の
結合にほとんど寄与しないで、むしろ分子全体に極めて
弱い力で束縛される。

【００１０】多くの場合、σ分子軌道にいる電子を光で
励起させると、分子の原子間隔が大きく変化し、分子の
解離を含む大きな構造変化が起こる。その結果として、
原子の運動エネルギーや構造変化するために光が分子に
与えたエネルギーのほとんどが熱エネルギーに形を変え
る。したがって、励起エネルギーは蛍光という光の形態
で消費されない。また、分子の構造変化は極めて高速に
おこるので（たとえばピコ秒より短い）、その過程で仮
に蛍光が起きても極めて蛍光寿命が短い。しかしそれに
対して、π分子軌道の電子が励起しても、分子の構造自
体はほとんど変化せず、高位の量子的な離散準位に長時
間とどまり、ナノ秒のオーダーで蛍光を放出して脱励起
する性質を持つ。

【００１１】量子化学によれば、分子がπ分子軌道を持
つことと、二重結合を持つこととは同等であり、用いる
蛍光ラベラー分子には、二重結合を豊富に持つ分子を選
定することが必要条件となる。そして、二重結合を持つ
分子でもベンゼンやビラジンなどの６員環分子において
は、Ｓ₂状態からの蛍光が極めて弱いことが確かめられ
ている（例えば、M..Fujii et.al., Chem. Phys. Lett.
171 (1990) 341）。したがって、ベンゼンやビラジン
などの６員環分子を含む分子を蛍光ラベラー分子として
選定すればＳ₁状態からの蛍光寿命が長くなり、しかも
光照射によりＳ₁状態からＳ₂状態に励起させることで分
子からの蛍光を容易に抑制でき、上述の二重共鳴吸収顕
微鏡の超解像性を効果的に利用することができるように
なる。

【００１２】すなわち、これらの蛍光ラベラー分子によ
り試料を染色して観察を行えば、高空間分解能の蛍光像
を取得することができるだけでなく、その蛍光ラベラー
分子の側鎖の化学基を調整することにより生体試料の特
定の化学組織のみを選択的に染色でき、試料の詳細な化
学組成までも分析可能となる。

【００１３】一般に、二重共鳴吸収過程は二つの光の波
長や偏光状態等が特定の条件を満たす場合のみに起こる
ので、これを用いることで非常に詳細な分子の構造を知
ることが可能となる。すなわち、光の偏光方向と分子の
配向方向とは強い相関関係があり、二波長光それぞれの
偏光方向と分子の配向方向とが特定の角度をなすとき二
重共鳴吸収過程が強く起こる。したがって、二波長光を
試料に照射して、各光の偏光方向を回転することによ
り、蛍光の消失の程度が変化するので、その様子から観
察しようとする組織の空間配向の情報も得られる。さら
に、二つの波長の光を調整させることでもこのことが可
能である。

【００１４】他方、波長λ₁光と波長λ₂光の照射タイミ
ングを適当なものに調整することにより（特願平９−２
５５４４４参照）、蛍光像のＳ／Ｎを改善し、且つ蛍光
抑制をさらに効果的に起こすことも可能となっている。

【００１５】また、本願発明の発明者により、波長λ₁
光と波長λ₂光の照射タイミングのさらなる工夫によ
り、Ｓ／Ｎおよび蛍光抑制のさらなる向上を実現するこ
とも提案されている（特願平１０―９７９２４参照）。

【００１６】ところで、前述した波長λ₁光の照射領域
の一部分への波長λ₂光の照射領域の重ね合わせは、波
長λ₂光を中空ビーム化して、つまり中央部（軸近傍領
域）がゼロ強度であり、且つ軸対象な強度分布を有する
中空ビーム光にして、波長λ₁光の一部分と空間的に重
ね合わせ、試料上に集光することで実現できる。図７
は、この重合せおよびそれによる蛍光抑制を例示した概
念図である。波長λ₂光は、たとえば図８にも例示した
ような位相板により中空ビーム化されており、この中空
ビーム化された波長λ₂光と波長λ₁光の重ね合わせによ
り、波長λ₂光の強度がゼロとなる光軸近傍の領域以外
では蛍光は抑制され、波長λ₁光の広がりよりも狭い領
域に存在する蛍光ラベラー分子（または試料分子）の蛍
光のみが観察される。その結果、超解像性が発現する。

【００１７】図８に例示した位相板は、波長λ₂光にそ
の光軸を中心対象としてπだけ位相差を与えるものであ
る。この位相板に波長λ₂光を通すことで、波長λ₂光の
光軸近傍領域（光軸を含む）の位相が反転するため、そ
の光軸近傍領域の電場強度はゼロとなり、蛍光抑制によ
る超解像性の発現に理想的な中空ビーム形状をもつ波長
λ₂光が得られるのである。

【００１８】中空ビーム化を実現する位相板としては、
図８に示したものの他にも、たとえば図９に例示したよ
うに光軸を中心として連続的に波長λ₂光に２πの位相
差を与えるものを用いることができる。

【００１９】

【発明が解決しようとする課題】さて、以上のように本
願発明の発明者によってこれまで提案されてきた二重共
鳴吸収顕微鏡は、その超解像性と分析能力において際立
った有用性と技術的優位性を示しているものの、未だに
以下に示すような改良すべき点が残されているのが実情
である。なお、従来の二重共鳴吸収顕微鏡については、
試料分子（＝試料を構成する分子）をＳ₀状態からＳ₁状
態へ励起させる波長λ₁光をポンプ光、Ｓ₁状態の分子を
Ｓ₂状態へ励起させる波長λ₂光をイレース光と呼ぶこと
とする。また、超解像性の実現をより効果的なものとす
べく、蛍光ラベラー分子を用いて試料を染色する場合に
は、試料分子とはこの蛍光ラベラー分子のこととなる。

【００２０】まず第一に、従来の二重共鳴吸収顕微鏡で
は、蛍光を抑制するためにイレース光を用いることが前
提であるが、イレース光はＳ₁状態からＳ₂状態へ共鳴吸
収する波長λ₂を有することが必要となるため、利用で
きる波長帯域が狭く限定されてしまっていた。

【００２１】第二に、蛍光ラベラー分子を用いる場合、
使用する蛍光ラベラー分子に応じて波長帯域も変化する
ため、蛍光ラベラー分子を変える度に光源のレーザーシ
ステムにも手を加える必要があった。この点を改善する
ためにオプティカルパラメトリックレーザーを用いるこ
とも考えられるが、高価で大規模な光源システムとなる
のであまり好ましくない。また、光源システムの調整に
は高度な技術が必要となり、電子顕微鏡のように専任オ
ペレータを要する事態も発生し得る。

【００２２】そこで、この出願の発明は、以上のとおり
の事情に鑑みてなされたものであり、イレース光として
利用できる波長帯域を広くするとともに、光源の簡便さ
に優れた、新しい超解像顕微鏡を提供することを課題と
している。

【００２３】

【課題を解決する手段】この出願の発明は、上記の課題
を解決するものとして、試料分子が基底状態から第一電
子励起状態へ励起するときの吸収帯の最長端波長λ
_1(max)より短い波長λ₁を有するポンプ光の光源と、第
一電子励起状態の試料分子が蛍光を発光するときの蛍光
発光帯の最長端波長λ_2(max)より長い波長λ₂を有する
とともに、第一電子励起状態の試料分子の蛍光寿命より
短いパルス幅を有するパルスイレース光の光源と、ポン
プ光およびパルスイレース光の照射領域を一部分重ね合
わせる重ね手段とを備え、重ね手段を介してポンプ光お
よびパルスイレース光を試料に照射することにより、第
一電子励起状態の試料分子が基底状態へ脱励起する際の
発光の領域を一部分抑制することを特徴とする超解像顕
微鏡（請求項１）を提供する。

【００２４】また、この出願の発明は、上記の超解像顕
微鏡において、パルスイレース光のパルス幅が、１psec
以上であり、且つ第一電子励起状態の試料分子の蛍光寿
命より短いこと（請求項２）や、パルスイレース光の波
長λ₂が、第一電子励起状態の試料分子が蛍光を発光す
るときの蛍光発光帯の最長端波長λ_2(max)より長いこと
に加え、試料分子が第一電子励起状態の特定の振動準位
・回転準位から当該振動準位・回転準位よりも高い第一
電子励起状態の振動準位・回転準位へ遷移するときの共
鳴波長であること（請求項３）や、その場合におけるパ
ルスイレース光の波長λ₂の具体的数値が１μｍ以上で
あること（請求項４）や、試料分子からの蛍光発光期間
内に２発以上のパルスイレース光が試料へ照射されるこ
と（請求項５）や、パルスイレース光のフォトンフラッ
クスＩ_eraseが、後述の数７の条件式を満たすこと（請
求項６）や、その場合におけるパルスイレース光のフォ
トンフラックスＩ_eraseの具体的数値範囲が１０²⁷photo
n/cm²/sec以上１０³⁰photon/cm²/sec以下であること
（請求項７）や、ポンプ光がパルスポンプ光であり、そ
のパルス幅が第一電子励起状態の試料分子の蛍光寿命よ
り短いこと（請求項８）や、パルスポンプ光の照射開始
時あるいは照射終了時から試料分子の蛍光発光終了時ま
での間に２発以上のパルスイレース光が試料へ照射され
ること（請求項９）（請求項１０）や、試料分子の蛍光
発光終了時から次のパルスポンプ光のパルス開始時まで
の間にイレース光が試料へ照射されないこと（請求項１
１）や、パルスポンプ光のパルス幅とパルスイレース光
のパルス幅が同じであること（請求項１２）をその態様
として提供し、さらに、試料分子からの発光を検出する
発光検出器としてシリコンを用いた半導体検出器を備え
ていること（請求項１３）をもその態様として提供す
る。

【００２５】

【発明の実施の形態】以下に、この出願の発明の超解像
顕微鏡の原理について説明する。

【００２６】図１０は、分子一般のエネルギー準位を例
示したものである。まず、分子には、それを構成する電
子の分子軌道を変えることによって高いエネルギーを持
つ準位へ量子遷移を行う電子遷移が存在する。その各々
の量子状態は、電子状態、特に、励起したものは電子励
起状態と呼ばれる。光が吸収される際には、主にこの電
子状態間の電子遷移が起こる。

【００２７】その一方で、構成する電子の分子軌道は変
化しないものの、構成する原子核の核間距離が量子的に
位置を変化する振動遷移も存在する。この場合の量子状
態は振動準位と呼ばれる。さらには、分子に空間的に移
動の自由度があるときは、量子的な回転運動を行う回転
遷移が存在する。この場合の量子状態は回転準位と呼ば
れる。そして、これら振動準位と回転準位はカップリン
グして、様々な組み合わせの量子準位を形成する。

【００２８】一般に、異なる電子状態間の光遷移（つま
り、光吸収による電子遷移）と比較すると、同じ電子状
態における異なる振動準位・回転準位間の光遷移（つま
り、光吸収による振動遷移・回転遷移）の確率は低いも
のの、図１０に例示したように電子状態間を埋めるよう
に広くその状態が分布する特徴がある。

【００２９】電子状態間の光遷移に伴う光の吸収断面積
は１０^-16〜１０^-17ｃｍ²の値を持つのに対し、振動準
位・回転準位間では１０^-17〜１０^-19ｃｍ²と２桁程度
小さい値を持つ。したがって、分子の振動準位・回転準
位間の光遷移を起こすためには、電子遷移を利用した場
合と比較して２桁以上高い光子フラックスを持つ光で分
子を励起する必要がある。

【００３０】また、同じ電子状態に属するエネルギー的
に高い振動準位・回転準位の脱励起過程には次のような
性質がある。たとえば図１１に例示したように、Ｓ₁状
態（＝第一電子励起状態）にある分子は、蛍光を発して
Ｓ₀状態（＝基底状態）へ緩和する（蛍光過程）。とこ
ろが、Ｓ₀状態に属する高位の振動準位・回転準位にあ
る分子は、蛍光を発することなく、主に熱で緩和してＳ
₀状態の最低エネルギー状態へ落ち着く（熱緩和過
程）。また、仮にＳ₁状態の高位の振動準位・回転準位
へ励起した場合でも、Ｓ₁状態の最低振動準位・回転準
位へ熱緩和により脱励起し、その後、蛍光を発してＳ₀
状態の振動準位・回転準位へ緩和する（いわゆるＫａｓ
ｈａの法則）。また、このような２段階の過程を経ず、
ある一定の確率で直接Ｓ₀状態の振動準位・回転準位へ
熱緩和する場合もあり、この場合では分子は一切蛍光を
発しない。

【００３１】したがって、この直接熱緩和による振動準
位・回転準位の脱励起過程を用いることで分子の蛍光抑
制が可能となるのである。この出願の発明の超解像顕微
鏡はこの原理を利用している。

【００３２】まず、ポンプ光により試料分子をＳ₀状態
からＳ₁状態の最低振動準位・回転準位（以下、Ｓ₁ ⁰状
態）へ励起させる。次いで、イレース光によりＳ₁状態
のＳ₁ ⁰状態から同じＳ₁状態の高位の振動準位・回転準
位（以下、Ｓ₁'状態）へ励起させる。この出願の発明に
おいては、従来の二重共鳴吸収顕微鏡の場合とは異な
り、Ｓ₀→Ｓ₁ ⁰励起のための照射光をポンプ光とし、Ｓ₁
⁰→Ｓ₁'励起のための照射光をイレース光とする。前述
したように、一般にＳ₁ ⁰→Ｓ₁'励起に要する光エネルギ
ーは電子遷移のそれと比較すると遥かに小さく、イレー
ス光の波長λ₂は近赤外領域に近づく場合がある。

【００３３】また、Ｓ₁'状態の分子は数ピコ秒という極
めて短時間で熱緩和してしまう。仮に、１ピコ秒よりパ
ルス幅の短いレーザー光で試料分子をＳ₁ ⁰状態からＳ₁'
状態へ励起した場合、Ｓ₁'状態の試料分子は数ピコ秒の
間に確率ａでＳ₁ ⁰状態へ熱緩和し、この状態より蛍光収
率φで蛍光を発する。一方、１−ａの確率でＳ₁'状態の
試料分子は直接Ｓ₀状態へ蛍光を発することなく熱緩和
する。

【００３４】ここで、Ｓ₁'状態にある試料分子に対し、
波長λ₂のピコ秒パルスレーザーによりＮ発のパルスを
照射する場合を考える。但し、Ｎ発のパルスはＳ₁ ⁰状態
の蛍光寿命τより短い期間に発振が終了しているものと
する。この場合、図１２に例示したように、試料分子は
Ｓ₁ ⁰状態とＳ₁'状態との間を何回も往復することにな
る。その間に、Ｓ₁ ⁰状態の試料分子は、蛍光を発する前
に直接、つまり蛍光を発することなくＳ₀状態へ熱緩和
する。その結果として、試料分子そのものからの蛍光を
抑制できる。

【００３５】１分子が蛍光を発光する確率Ｆは、上記の
各変数を用いて定量的に求めると、下記の数２で与えら
れる。

【００３６】

【数２】

【００３７】一般にＳ₁ ⁰状態へ熱緩和する確率ａはゼロ
であり得ないため、Ｎをある程度大きくすれば、蛍光確
率Ｆを小さくすることができる。その結果、試料分子の
蛍光抑制が可能となるのである。

【００３８】またあるいは、試料分子の蛍光寿命より短
いイレース光を複数発照射しても同等の効果を実現でき
る。イレース光の照射時間をＴ、Ｓ₁'状態の励起寿命を
τ（Ｓ₁'）とすると、試料分子は、照射時間の間にＴ／
τ（Ｓ₁'）回、Ｓ₁'状態とＳ ₁ ⁰状態との間の遷移・緩和
を繰り返す。一般に、τ（Ｓ₁'）は数ｐｓｅｃであり、
Ｓ₁ ⁰状態の蛍光寿命τは短くても数１００ｐｓｅｃであ
るので、試料分子が蛍光を発する前にＳ₁'状態とＳ₁ ⁰状
態との間で遷移・緩和する回数は１００回以上にもな
る。たとえば、イレース光の照射時間ＴをＳ₁ ⁰状態の蛍
光寿命τに設定し、仮にａが０．９５であっても蛍光確
率Ｆは１００分の１以下に抑制される。これは、超解像
性の発現には十分な値である。

【００３９】ここで、Ｓ₁ ⁰状態からＳ₁'状態への光遷移
に伴う吸収断面積をσ_vとし、イレース光のフォトンフ
ラックスをＩ_eraseとすると、簡単レート方程式により
Ｓ₁'状態へ励起される確率αが次式で与えられる（たと
えばY.Iketaki et.al Opt.Eng.35(8) 2418, 1996参
照）。

【００４０】

【数３】

【００４１】蛍光抑制を有効に発現させるには、少なく
とも、イレース光の１パルスの照射で確率αが０．５以
上のＳ₁ ⁰→Ｓ₁'励起を起こす必要がある。このため、イ
レース光は、次式のような不等式を満たす必要がある。

【００４２】

【数４】

【００４３】また、その一方で、イレース光のフォトン
フラックスがあまりにも強すぎると、非共鳴型の２光子
吸収過程が起こり、Ｓ₀状態の試料分子がＳ₁状態へ励起
してしまい、逆に蛍光を抑制するのではなく促進させて
しまう。したがって、イレース光のフォトンフラックス
の上限も次式で決まる。

【００４４】

【数５】

【００４５】ここで、βは非共鳴型の２光子吸収過程で
試料分子がＳ₁状態に励起する確率であり、σ_2pは非共
鳴型の２光子吸収過程の吸収断面積である。この確率β
を少なくとも２分の１以下にしないと、イレース光で蛍
光抑制する確率よりもＳ₀状態をＳ₁状態へ励起する確率
の方が大きくなってしまう恐れがあるので、数５の条件
を、

【００４６】

【数６】

【００４７】とする必要がある。

【００４８】そして、数４および数６より、Ｉ_eraseの
最適条件は次式となる。

【００４９】

【数７】

【００５０】したがって、数７のもとで、Ｓ₁'状態を経
由した蛍光抑制効果を用いれば、幅広い波長帯域のイレ
ース光によって超解像を実現することができるようにな
る。

【００５１】以上より、この出願の発明の超解像顕微鏡
では、まず、ポンプ光の波長λ₁を試料分子がＳ₀状態か
らＳ₁状態へ励起するときの吸収帯の最長端波長λ
_1(max)より短い波長とし、イレース光の波長λ₂をＳ₁状
態の試料分子が蛍光を発光するときの蛍光発光帯の最長
端波長λ_2(max)より長い波長、好ましくは試料分子がＳ
₁状態の特定の振動準位・回転準位（たとえばＳ₁ ⁰）か
ら当該振動準位・回転準位よりも高いＳ₁状態の振動準
位・回転準位（たとえばＳ₁'）へ遷移するときの共鳴波
長とし、且つ、イレース光をパルス光とするとともにそ
のパルス幅をＳ₁状態の試料分子の蛍光寿命より短くす
ることで、試料分子が蛍光を発光することなく直接Ｓ₀
状態へ熱緩和するようになる。これにより、ポンプ光お
よびイレース光を互いの照射領域を一部分重ね合せるよ
うに試料へ照射する、たとえばイレース光を前述の図８
や図９に例示した位相板などにより中空ビーム化してポ
ンプ光の照射領域に対して一部分重ね合せるように試料
へ照射すると、重ね合わさった領域、つまり蛍光抑制領
域では蛍光が抑制されることとなり、超解像性が実現さ
れる。Ｓ₁状態の試料分子の蛍光発光帯の最長端波長λ
_2(max)より長い波長λ₂というイレース光の波長帯域
は、従来の二重共鳴吸収顕微鏡におけるイレース光より
も極めて広く、オプティカルパラメトリックレーザーな
どの複雑な光源システムを用いることなく、簡単な構成
の光源システムで超解像顕微鏡を実現でき、蛍光ラベラ
ー分子で試料を染色した場合でも複数の蛍光ラベラー分
子に対応することができるのである。

【００５２】なお、好ましくは、パルスイレース光のパ
ルス幅は１ｐｓｅｃ以上で、且つＳ ₁状態の試料分子の
蛍光寿命より短いものとし、波長λ₂は１μｍ以上、よ
り好ましくは１μｍ以上２．５μｍ以下とする。

【００５３】また、蛍光確率Ｆをより小さくして蛍光抑
制をさらに効果的に発現すべく、パルスイレース光は、
試料分子からの蛍光発光期間内に２発以上、好ましくは
なるべく多数、試料へ照射されることが望ましい。

【００５４】さらにまた、パルスイレース光のフォトン
フラックスＩ_eraseは、上述のとおり、数７の条件を満
たすことが望ましく、具体的数値としては、たとえば１
０²⁷photon/cm²/sec以上１０³⁰photon/cm²/sec以下が好
ましい。

【００５５】ポンプ光については、イレース光と同様
に、Ｓ₁状態の試料分子の蛍光寿命より短いパルス幅を
有するパルス光とし、この場合において、より効果的な
蛍光抑制を実現すべく、たとえば、パルスポンプ光の照
射開始時あるいは照射終了時から試料分子の蛍光発光終
了時までの間に２発以上のパルスイレース光が試料へ照
射されることや、試料分子の蛍光発光終了時から次のパ
ルスポンプ光のパルス開始時までの間はイレース光が試
料へ照射されないことや、パルスポンプ光のパルス幅と
パルスイレース光のパルス幅が同じであることが好まし
い態様である。

【００５６】なお、以上のこの出願の発明の超解像顕微
鏡では、蛍光抑制領域以外の領域、つまり観察領域にお
ける試料分子からの発光を検出する発光検出器として、
たとえばシリコンを用いた半導体検出器を備えることが
できる。

【００５７】この出願の発明は、以上のとおりの特徴を
有するものであるが、以下に、添付した図面に沿って実
施例を示し、さらに詳しくこの発明の実施の形態につい
て説明する。

【００５８】

【実施例】［実施例１］図１３は、この出願の発明の超
解像顕微鏡の一実施例を示したものである。

【００５９】この図１３に例示した超解像顕微鏡では、
光源として、半導体レーザー励起の固体パルスレーザー
であるＮｄ：ＹＡＧレーザー（１）を用いている。この
Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（１）は、基本波で１０６４ｎ
ｍ、２倍波で５３２ｎｍのサブナノ秒レーザーパルスを
最大数１０ｋＨｚの高繰返しで発振する。また、そのパ
ルス幅は５００ｐｓｅｃとする。この種のレーザーは、
メンテナンスフリーであり、しかもサイズが全てのユニ
ットを含め数１０ｃｍのボリュームに収まってしまうの
で、光源設備を極めて扱いが容易で、小型なものとする
ことができる。本実施例における超解像顕微鏡は、Ｎ
ｄ：ＹＡＧレーザー（１）の２倍波をパルスポンプ光、
基本波をパルスイレース光として用いた超解像レーザー
走査型蛍光顕微鏡を構成している。

【００６０】ここで、試料（１２）を蛍光ラベラー分子
としてのローダミン−６Ｇで染色する場合を想定する。

【００６１】下記の表１は、ローダミン−６Ｇの各エネ
ルギー準位間で遷移が起こるときのおおよその吸収断面
積を示している。

【００６２】

【表１】

【００６３】また、下記の表２は、本実施例におけるＮ
ｄ：ＹＡＧレーザー（１）の仕様を示している。

【００６４】

【表２】

【００６５】ここで、前記数７を用いて、表２の仕様の
Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（１）を用いた場合のパルスイレ
ース光のフォトンフラックスＩ_eraseの最適値を計算す
ると、１．４×１０²⁷photon/cm²/sec ＜ I_erase＜
３．７×１０²⁹photon/cm²/secとなる。

【００６６】たとえば、イレース光の開口数ＮＡが１の
レンズでレーザービームを集光した場合、そのスポット
サイズｓは、以下のレイリーの式で計算するとほぼ１３
００ｎｍになる。

【００６７】

【数８】

【００６８】また、得られたｓとＩ_eraseの最上限値
３．７×１０²⁹photon/cm²/secを用いてパルスエネルギ
ーの最大値を求めると、約０．５μJ/pulseである。

【００６９】ローダミン−６Ｇをはじめとする各種の蛍
光ラベラー分子を用いた場合、各吸収断面積は多少変動
するが、Ｉ_eraseは１０²⁷photon/cm²/sec以上１０³⁰pho
ton/cm²/sec以下のオーダー値にある。したがって、本
実施例のような小型の半導体レーザー励起の固体パルス
レーザーであるＮｄ：ＹＡＧレーザー（１）によって、
様々な蛍光ラベラー分子に対して最適なパルスイレース
光を発生させることができるのである。

【００７０】さて、図１３の超解像顕微鏡の動作につい
てさらに説明する。まず、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（１）
の基本波１０６４ｎｍをビームスプリッター（２）で分
岐し、分岐した一つはＫＤＰ結晶（４）を介して２倍の
５３２ｎｍに変換する。これをパルスポンプ光として用
いる。他方はそのままパルスイレース光として用いる。

【００７１】パルスイレース光は、ミラー（３）を介し
て遅延光学系（５）へ入射される。この遅延光学系
（５）は、平行移動可能な折り返しプリズム（５１）を
有しており、プリズム（５１）の位置を移動調整するこ
とで光路長を変化させることができる。よって、パルス
イレース光を遅延光学系（５）に通すことにより、パル
スポンプ光に対して任意の光路差を持たすことが可能と
なり、パルスイレース光とパルスポンプ光が観察試料面
に到達する時刻を同時にしたり、ずらしたりすることが
可能となる。

【００７２】遅延光学系（５）を通過したパルスイレー
ス光は、前述の図８や図９に例示したような位相板
（６）を介して中空ビーム化された後、ミラー（７）で
偏向され、ダイクロイックミラー（８）によりパルスポ
ンプ光と同軸上にビーム調整される。

【００７３】そして、コンバインされたパルスポンプ光
とパルスイレース光は、リレーレンズ（９）およびハー
フミラー（１０）を介して観察光学系の光軸上に誘導さ
れ、対物レンズ（１１）により試料走査ステージ（１
３）上の試料（１２）に集光される。

【００７４】試料（１２）から発せられた蛍光は、ハー
フミラー（１０）およびハーフミラー（１４）を通過し
て、結像レンズ（１５）によりＣＣＤカメラ（１６）の
撮像面上に結像される。これにより蛍光像が目視可能と
なる。

【００７５】その一方で、ハーフミラー（１４）に入射
した蛍光は一部反射されてレンズ（１７）へ入射し、さ
らに空間フィルターであるピンホール（１８）上に結像
される。ピンホール（１８）を通過した蛍光は、レンズ
（１９）により透過型回折格子（２０）を通過してＩＣ
ＣＤカメラ（２１）の撮像面上に結像される。ＩＣＣＤ
カメラ（２１）とは、光−電子変換膜と２次元光電子像
倍管からなるカメラシステムである。蛍光は、一度、透
過型回折格子（２０）を通過するので蛍光スペクトルの
形としてＩＣＣＤカメラ（２０）で撮影される。

【００７６】そして、試料（１２）を試料走査ステージ
（１３）で２次元走査しながら、蛍光信号を計測し、各
点におけるデータをコンピュータのメモリーに格納し、
ＣＲＴ上で画像表示を行えば、目的とする試料（１２）
の構造を画像化できる。このとき、集光したレーザービ
ームよりも遥かに微少な領域の蛍光信号をセレクトする
ことによって、計測法としてのポテンシャルを極めて高
いものとすることができる。

【００７７】また、試料走査ステージ（１３）としてた
とえばピエゾ駆動型のものを用いることで、位置移動分
解能は１０ｎｍという極めて高い値を実現することがで
き、この超解像顕微鏡の空間分解能に十分見合った性能
の試料走査ステージ（１３）とすることができる。

【００７８】また、ピンホール（１８）を顕微鏡光学系
の共焦点位置に設置することで、試料（１２）の３次元
観察も可能となる。すなわち、ピンホール（１８）はレ
ーザー光の焦点位置から発する蛍光のみを通過させるこ
とができるので、試料走査ステージ（１３）を光軸方向
に移動して、試料走査ステージ（１３）をレーザービー
ムに対して２次元走査することにより、光学深さ方向の
断層像が得られる。

【００７９】このような超解像顕微鏡において、パルス
ポンプ光およびパルスイレース光の照射タイミングなら
びに蛍光信号入力時のゲートタイミングについて説明す
る。図１４は、そのタイミングの一例を示したものであ
る。

【００８０】本実施例においては、パルスポンプ光もパ
ルスイレース光も同一のＮｄ：ＹＡＧレーザー（１）か
ら発生され、どちらも５００ｐｓｅｃのパルス幅を有し
ている。それに対し、たとえば蛍光ラベラー分子として
のローダミン−６Ｇの蛍光寿命はその６倍の３ｎｓｅｃ
である。この場合、たとえば図１４に例示したように、
まず、パルスポンプ光を試料（１２）へ照射し、その照
射終了直後に、つまりそのパルス終了時にイレース光を
試料（１２）へ照射する。そして、パルスポンプ光とパ
ルスイレース光の照射が完全に終了する直後から信号入
力ゲートを２ｎｓｅｃ開放し、丁度ローダミン−６Ｇの
発光が終了する時刻に信号入力ゲートを閉じる。これに
より、観察領域では、パルスポンプ光とパルスイレース
光が重なり合っていないので、パルスポンプ光の照射終
了後からローダミン−６Ｇの蛍光寿命である３ｎｓｅｃ
の間、ローダミン−６Ｇは発光する。蛍光抑制領域で
は、他方、パルスポンプ光とパルスイレース光が重なり
合っているので、パルスイレース光の照射終了時には、
蛍光が抑制されて観察されない。

【００８１】以上のようなタイミングでレーザー光の照
射と信号の取込みを設定すれば、検出器へパルスポンプ
光およびパルスイレース光の散乱光が混入せず、バック
グラウンドノイズを低減できるだけなく、ポンプ光およ
びイレース光のパルス幅がローダミン−６Ｇの蛍光寿命
よりも十分に短いので、蛍光寿命の７０％にもおよび時
間帯域の蛍光を有効に取得できる。その結果、非常に良
いＳ／Ｎで信号検出が可能となる。そして、本実施例に
おいて用いたレーザーのパルス幅は５００ｎｓｅｃであ
るが、ローダミン−６ＧがＳ₁ ⁰状態とＳ₁'状態との間の
遷移・緩和を１００回以上繰り返すので、前記数２によ
り十分に良好な蛍光抑制が可能となり、超解像性が良好
に発現する。

【００８２】なお、パルスポンプ光とパルスイレース光
の照射のタイミングは、遅延光学系（５）でパルスイレ
ース光の光路長を高精度に調整できるため、検出器から
の出力信号をオシロスコープ等でモニターすることで最
低化が図れる。たとえば、光速を考えると、１００ｐｓ
ｅｃは約３ｃｍの光路長に対応するので、その値に従っ
てマイクロステージなどに搭載した遅延光学系（５）の
プリズム（５１）を位置調整する。

【００８３】［実施例２］ここでは、この出願の発明の
超解像顕微鏡の特徴を十分に引き出すパルスイレース光
の波長領域についてさらに説明する。

【００８４】この発明における蛍光抑制効果は、前述し
たように広い波長領域のパルスイレース光で発現する
が、特に約１μｍ以上の長波長領域で顕著なものとな
る。たとえば、尾崎幸洋・河田聡編「近赤外分光法」
日本分光学会測定法シリーズ３２学会出版センター
（１９９６）には、各有機分子の近赤外領域の吸収スペ
クトルが示されている。それらが示すように、約１μｍ
以上約２．５μｍ以下の長波長領域で様々な吸収線が観
測されている。これは、様々な分子の化学基とその倍音
が似たような波長領域に現れるからである。したがっ
て、１μｍ以上、好ましくは１μｍ以上２．５μｍ以下
の波長領域にパルスイレースの波長λ₂を同調させるこ
とにより、吸収断面積が比較的大きいので、非共鳴多光
子吸収過程を起こすような強いフォトンフラックスでパ
ルスイレース光を照射することなく、Ｓ ₁ ⁰状態からＳ₁'
状態への遷移を起こすことができる。その結果、前述し
たような比較的低いフォトンフラックスのパルスイレー
ス光で有効な蛍光抑制を実現できるのである。

【００８５】また、同文献から明らかなように、代表的
な基本的な化学基の振動・回転吸収帯は波長１μｍ以上
に集中しており、このことから、大部分の蛍光ラベラー
分子に対して、１μｍ以上、あるいは１μｍ以上２．５
μｍ以下の波長帯域のパルスイレース光による蛍光抑制
が実現できるのがわかる。

【００８６】さらには、この波長帯域が優れている点と
して、生体試料にほとんどダメージを与えないことが挙
げられる。これは、高分解能で生きたまま生体試料を観
察できるというライフサイエンスにおいて特に有用であ
る。近赤外領域では、非共鳴多光子吸収過程が起こらな
い限り、試料の損傷は起きないのである。

【００８７】またさらに、この波長帯域では、シリコン
を用いた半導体光検出器の検出効率も最大となるため、
ＣＣＤ等の汎用で利用しやすい固体素子を用いて検出器
を構成できる。

【００８８】そして、この波長帯域が実用性の点からさ
らに魅力的なのは、この波長帯域で発振する小型固体レ
ーザーが数多く存在するということである。特に、実用
的なＹＧＡ結晶を基本とするレーザー媒質が多く、たと
えば、ポピュラーなＮｄ：ＹＧＡ以外にも、Ｔｍ：ＹＡ
Ｇ、Ｈｏ：ＹＡＧ、Ｅｒ：ＹＡＧがあり、丁度１μｍ以
上３μｍ以下の波長帯域で極めて強い発振線を有する。
この他にもＨｄ：ＹＬＦｗはじめとするガラスレーザ
ー、Ｔｉサファイアレーザーが利用できる。これらは極
めて安定で信頼性の高いものであるため、前述の実施例
１のように基本波をイレース光とし、その高調波をポン
プ光とすることで、非常に簡単な光源系を構成できる。

【００８９】［実施例３］図１５は、この出願の発明の
超解像顕微鏡の別の一実施例を示したものである。

【００９０】この図１５に例示した超解像顕微鏡では、
図１３におけるダイクロイックミラー（８）がパルス遅
延光学回路（２２）に換えられ、図１３の超解像顕微鏡
とはパルスポンプ光とパルスイレース光の融合法式が異
なるものとなっている。そして、パルスポンプ光の照射
開始時あるいは照射終了時から試料分子の蛍光発光終了
時までの間にパルスイレース光を複数回間欠的に試料
（１２）に照射するようになっている。

【００９１】より具体的には、まず、本実施例における
Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（１）は、そのレーザー共振器内
に過飽和の色素セルを有し、本来はレーザーパルス幅が
ナノ秒であるところを３０ｐｓｅｃまで圧縮できる。

【００９２】図１３の場合と同様に、このＮｄ：ＹＡＧ
レーザー（１）からの基本波（１０６４ｎｍ）はビーム
スプリッター（２）で分岐され、その一方はＫＤＰ結晶
（４）により２倍波（５３２ｎｍ）とされてパルスポン
プ光として用いられ、他方はそのままパルスイレース光
として用いられる。

【００９３】パルスイレース光は、ハーフミラー
（３）、遅延光学系（５）、位相板（６）、およびミラ
ー（７）を介してパルス遅延光学回路（２２）に入る。
パルスポンプ光は、パルス遅延光学回路（２２）の出力
段でパルスイレース光とコンバインされる。コンバイン
された両光は、リレーレンズ（９）およびハーフミラー
（１０）を介して観察光学系へと誘導される。

【００９４】パルス遅延光学回路（２２）は、具体的に
は、たとえば図１６に例示したように、一つのハーフミ
ラー（２２１）と、このハーフミラー（２２１）を光路
上に含むループ光路を形成するプリズム（２２２）とで
構成されるループ光学系であり、その出力段にはダイク
ロイックミラー（２２３）が設けられている。このパル
ス遅延光学回路（２２）に入射したパルスイレース光
は、まず、ハーフミラー（２２１）により透過光１と反
射光１とに分離される。透過光１はそのままダイクロイ
ックミラー（２２３）へ出力され、反射光１は各プリズ
ム（２２２）で光路が変更されてハーフミラー（２２
１）へ戻り、透過光２と反射光２とに分離される。反射
光２は透過光１と同じ光路を通過し、透過光２は各プリ
ズム（２２２）を介して同じループ光路を通過してハー
フミラー（２２１）へ戻り、再び透過光と反射光に分離
される。このようにしてハーフミラー（２２１）および
プリズム（２２２）による透過光および反射光の分離・
ループが繰り返される。したがって、パルスイレース光
をこのパルス遅延光学回路（２２）に入射させること
で、ループ光路の分だけ遅延したパルスが次々と発生す
る。

【００９５】図１７は、パルス遅延光学回路（２２）を
出力したパルスイレース光とパルスポンプ光のタイミン
グチャートの一例を示したものである。この図１７に例
示したように、パルスイレース光の１番目のパルスｎ１
が一番強い強度を持ち、それ以後のパルスｎ２，ｎ３，
ｎ４・・・は指数関数的にその強度が低下する。本実施
例では、パルス幅３０ｐｓｅｃのパルス列がパルス遅延
光学回路（２２）から次々と出力される。したがって、
このような間欠的なパルスによりＳ₁ ⁰状態にある試料分
子あるいは蛍光ラベラー分子を次々とＳ₁'状態へ励起さ
せ、効果的に蛍光を抑制することができる。

【００９６】なお、光は大気中において１ｎｓｅｃで約
３０ｃｍ進むので、パルス遅延光学回路（２２）のルー
プ長を調整することで、パルス列のパルス間隔を任意に
調整できる。たとえば、ループ長を３ｃｍに設定すれ
ば、パルス間隔は１００ｐｓｅｃとすることができる。
このような光源系の簡単な構成・操作によっても、様々
な試料分子あるいは蛍光ラベラー分子に対する蛍光抑制
効果を実現できる。もちろん、この発明は以上の例に限
定されるものではなく、細部については様々な態様が可
能である。

【００９７】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願の
発明によって、イレース光として利用できる波長帯域を
広くするとともに、光源の簡便さに優れた、新しい超解
像顕微鏡が提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】基底状態の試料分子の電子配置を例示した図で
ある。

【図２】Ｓ₁状態に励起された試料分子の電子配置を例
示した図である。

【図３】Ｓ₂状態に励起された試料分子の電子配置を例
示した図である。

【図４】脱励起した試料分子の電子配置を例示した図で
ある。

【図５】二重共鳴吸収過程を例示した概念図である。

【図６】二重共鳴吸収過程を空間的に例示した概念図で
ある。

【図７】ポンプ光およびイレース光の一部重合せおよび
それによる蛍光抑制を例示した概念図である。

【図８】イレース光の中空ビーム化のための位相板の一
例を示した図である。

【図９】イレース光の中空ビーム化のための位相板の別
の一例を示した図である。

【図１０】分子一般のエネルギー準位を例示した図であ
る。

【図１１】分子の脱励起過程を例示した図である。

【図１２】この出願の発明の超解像顕微鏡が利用する蛍
光抑制原理を説明するための図である。

【図１３】この出願の発明の超解像顕微鏡の一実施例を
示した概略構成図である。

【図１４】パルスポンプ光およびパルスイレース光の照
射タイミングならびに蛍光信号入力時のゲートタイミン
グの一例を示した図である。

【図１５】この出願の発明の超解像顕微鏡の別の一実施
例を示した概略構成図である。

【図１６】パルス遅延光学回路の一例を示した概略構成
図である。

【図１７】パルスポンプ光およびパルスイレース光の照
射タイミングの一例を示した図である。

【符号の説明】

１Ｎｄ：ＹＡＧレーザー２ビームスプリッター３ハーフミラー４ＫＤＰ結晶５遅延光学系５１プリズム６位相板７ミラー８ダイクロイックミラー９リレーレンズ１０ハーフミラー１１対物レンズ１２試料１３試料走査ステージ１４ハーフミラー１５結像レンズ１６ＣＣＤカメラ１７レンズ１８ピンホール１９レンズ２０透過型回折格子２１ＩＣＣＤカメラ２２パルス遅延光学回路２２１ハーフミラー２２２プリズム２２３ダイクロイックミラー

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者尾松孝茂神奈川県横浜市戸塚区平戸５−10−９ (72)発明者藤井正明愛知県岡崎市竜美南２−３−１６号棟 303号 (72)発明者鈴木智雄千葉県千葉市花見川区幕張本郷６−11−13 ニューバイオレット101 Ｆターム(参考） 2G043 AA06 BA16 DA02 DA05 EA01 FA02 GA02 GA07 GB19 HA02 HA09 HA15 JA04 KA01 KA02 KA08 KA09 LA03 MA01 MA04 MA16 2H052 AA08 AA09 AC04 AC13 AC30 AC34 AD18 AF02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料分子が基底状態から第一電子励起状
態へ励起するときの吸収帯の最長端波長λ_1(max)より短
い波長λ₁を有するポンプ光の光源と、第一電子励起状
態の試料分子が蛍光を発光するときの蛍光発光帯の最長
端波長λ_2(ma _x)より長い波長λ₂を有するとともに、第
一電子励起状態の試料分子の蛍光寿命より短いパルス幅
を有するパルスイレース光の光源と、ポンプ光およびパ
ルスイレース光の照射領域を一部分重ね合わせる重ね手
段とを備え、重ね手段を介してポンプ光およびパルスイ
レース光を試料に照射することにより、第一電子励起状
態の試料分子が基底状態へ脱励起する際の発光の領域を
一部分抑制することを特徴とする超解像顕微鏡。
【請求項２】パルスイレース光のパルス幅が、１psec
以上であり、且つ第一電子励起状態の試料分子の蛍光寿
命より短い請求項１の超解像顕微鏡。
【請求項３】パルスイレース光の波長λ₂が、第一電
子励起状態の試料分子が蛍光を発光するときの蛍光発光
帯の最長端波長λ_2(max)より長く、且つ、試料分子が第
一電子励起状態の特定の振動準位・回転準位から当該振
動準位・回転準位よりも高い第一電子励起状態の振動準
位・回転準位へ遷移するときの共鳴波長である請求項１
または２の超解像顕微鏡。
【請求項４】パルスイレース光の波長λ₂が１μｍ以
上である請求項３の超解像顕微鏡。
【請求項５】試料分子からの蛍光発光期間内に２発以
上のパルスイレース光が試料へ照射される請求項１ない
し４のいずれかの超解像顕微鏡。
【請求項６】パルスイレース光のフォトンフラックス
Ｉ_eraseが、【数１】の条件式を満たす請求項１ないし５のいずれかの超解像
顕微鏡。
【請求項７】パルスイレース光のフォトンフラックス
Ｉ_eraseが１０²⁷photon/cm²/sec以上１０³⁰photon/cm²/
sec以下である請求項６の超解像顕微鏡。
【請求項８】ポンプ光がパルスポンプ光であり、その
パルス幅が第一電子励起状態の試料分子の蛍光寿命より
短い請求項１ないし７のいずれかの超解像顕微鏡。
【請求項９】パルスポンプ光の照射開始時から試料分
子の蛍光発光終了時までの間に２発以上のパルスイレー
ス光が試料へ照射される請求項８の超解像顕微鏡。
【請求項１０】パルスポンプ光の照射終了時から試料
分子の蛍光発光終了時までの間に２発以上のパルスイレ
ース光が試料へ照射される請求項８または９の超解像顕
微鏡。
【請求項１１】試料分子の蛍光発光終了時から次のパ
ルスポンプ光のパルス開始時までの間にイレース光が試
料へ照射されない請求項８ないし１０のいずれかの超解
像顕微鏡。
【請求項１２】パルスポンプ光のパルス幅とパルスイ
レース光のパルス幅が同じである請求項８ないし１１の
いずれかの超解像顕微鏡。
【請求項１３】試料分子からの発光を検出する発光検
出器としてシリコンを用いた半導体検出器を備えている
請求項１ないし１２のいずれかの超解像顕微鏡。