JP2002010775A

JP2002010775A - Ｄｎａサンプル作成用反応装置

Info

Publication number: JP2002010775A
Application number: JP2001099080A
Authority: JP
Inventors: Ryoji Nemoto; 亮二根本; Hidemi Yoshida; 秀美吉田; Hisashi Hagiwara; 久萩原
Original assignee: Hitachi Electronics Engineering Co Ltd
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2000-04-27
Filing date: 2001-03-30
Publication date: 2002-01-15

Abstract

(57)【要約】【課題】ＰＣＲ産物の生成から、該産物の精製、シー
ケンス反応及び該シーケンス反応生成物の精製まで一貫
して自動的に行うことができるＤＮＡサンプル作成用反
応装置を提供する。【解決手段】複数本の中空状導電性ノズルと、該ノズ
ルに連接された中空状シリンジと、該シリンジの中空部
に挿入されたピストンを有し、該ピストンの上部には昇
降可能なピストンヘッドが固着されており、前記導電性
ノズルの中間部は両側に開閉可能なシャッターを有する
筐体内に収容されており、前記シャッターのうちの一方
のシャッターに隣接して冷却機構が配設されており、前
記筐体内側の導電性ノズルの中間部が、導体により電源
と接続されていることを特徴とするＤＮＡサンプル作成
用反応装置。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はＤＮＡ塩基配列決定
装置で分析するためのＤＮＡサンプルを作成するための
反応装置に関する。更に詳細には、本発明は蛍光標識さ
れたＤＮＡサンプルを、熱サイクリングによる増幅、特
に、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）による増幅反応
を利用して作成するために反応装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】特定のＤＮＡ領域を挟んだ２種類のプラ
イマーとＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡ合成反応を繰り返
すことにより、その特定領域を数十万倍に増幅する方法
としてポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）が１９８５年
に米国のＣｅｔｕｓ社により開発された。

【０００３】この方法は、その後、耐熱性酵素Ｔａｑポ
リメラーゼを利用した方法に改良されたことで、効率の
良いＰＣＲ法として確立され、現在に至っている。更
に、１９８７年には、米国のＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
社とＣｅｔｕｓ社が共同開発したＰＣＲ法の自動化装置
が開発、販売され、利用が飛躍的に拡大した。

【０００４】ＰＣＲ法の原理は、例えば、実験医学，Ｖ
ｏｌ．７，Ｎｏ．２，１４頁〜１８頁（１９８９）に詳
細に説明されている。このＰＣＲ法は基本的に、プラ
イマーが結合された２本鎖ＤＮＡを熱変性により１本鎖
に変性し、プライマーをアニーリングし、Ｔａｑポ
リメラーゼにより伸長させることからなる一連のサイク
ルからなり、このサイクルを数十回繰り返すことにより
所望のＤＮＡ断片を増幅させることからなる。

【０００５】従来のＰＣＲ自動化装置では、ポリメラー
ゼ連鎖反応をプラスチック製のエッペンドルフチューブ
のような小型試験管内で行っていた。このため、従来の
装置では、エッペンドルフチューブを温度調節可能なチ
ャンバ内に収容し、このチャンバ内の温度を変化させる
ことにより、エッペンドルフチューブ内の反応混合物の
温度を、熱変性、アニーリング伸長にそれぞれ必
要な温度に周期的に変化させる。例えば、熱変性の場
合は約９４℃、アニーリングの場合は約５５℃、伸
長の場合は約７２℃にされる。

【０００６】しかし、従来の自動化装置では、ＰＣＲ産
物を生成するだけであり、この産物の精製、シーケンス
反応（すなわち、ＰＣＲ産物によりＤＮＡ塩基配列決定
装置で測定可能なサンプルの生成）及びシーケンス反応
生成物の精製は別の装置又は手作業によらなければ実施
することができなかった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、ＰＣＲ産物の生成から、該産物の精製、シーケンス
反応及び該シーケンス反応生成物の精製まで一貫して自
動的に行うことができるＤＮＡサンプル作成用反応装置
を提供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】前記課題は、複数本の中
空状導電性ノズルと、該ノズルに連接された中空状シリ
ンジと、該シリンジの中空部に挿入されたピストンを有
し、該ピストンの上部には昇降可能なピストンヘッドが
固着されており、前記導電性ノズルの中間部は両側に開
閉可能なシャッターを有する筐体内に収容されており、
前記シャッターのうちの一方のシャッターに隣接して冷
却機構が配設されており、前記筐体内側の導電性ノズル
の中間部が、導体により電源と接続されていることを特
徴とするＤＮＡサンプル作成用反応装置により解決され
る。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、図面を参照しながら本発明
のＤＮＡサンプル作成用反応装置について具体的に説明
する。図１は、本発明のＤＮＡサンプル作成用反応装置
の構成の一例を示す概要斜視図である。反応装置１６
は、先端に導電性（例えば、ステンレス製）のノズル１
６０１を有する。ノズルの本数は例えば、９６本であ
る。これ以外の本数のノズルを具備することもできる。
ノズル１６０１の中間部は密閉可能な筐体１６０３内に
収容されている。この筐体１６０３の一方の端部には開
閉可能なシャッタ１６０４を有する空冷ファン１６０５
が配設され、他端には開閉可能なシャッタ１６０７が配
設されている。ノズル１６０１は上下二枚の導電性基板
１６０９に接続されている。導電性基板１６０９は例え
ば、銅製又はステンレス製基板である。上下二枚の導電
性基板１６０９により画成された領域がノズル１６０１
の加熱区画である。筐体１６０３の両端は開口したまま
でもよい。この場合、シャッタ１６０４及び１６０７を
配設する必要はなく、筐体の一方の開口端部に隣接して
空冷ファン１６０５を配設する。

【００１０】この導電性基板１６０９には、電源（図示
されていない）から延びる導体ケーブル１６１１が接続
されている。従って、電源（図示されていない）をＯＮ
にすると、導電性基板１６０９から各導電性ノズルに電
流が流れ、ジュール熱によりノズル１６０１を加熱する
ことができる。逆に、電源（図示されていない）をＯＦ
Ｆにすると、ノズル１６０１の加熱が止むので、空冷フ
ァン１６０５のシャッター１６０４を開放し、更にシャ
ッター１６０７を開放して、空冷ファン１６０５を駆動
させることにより、ノズル１６０１を冷却することがで
きる。導電性基板１６０９の間に配設されている板１６
１３は、ファン１６０５の空気の流れを整え、ノズル１
６０１を短時間のうちに効果的に冷却するための整流板
である。図３では、整流板１６１３は２枚しか配設され
ていないが、３枚以上配設することもできる。整流板１
６１３は例えば、セラミック、銅、プラスチック又はス
テンレスなどから形成することができる。

【００１１】ノズル１６０１はシリンジ１６１５に連接
されている。シリンジ１６１５の内部にはピストン１６
１７が挿入されており、このピストン１６１７の上部に
は上下方向に昇降可能なピストンヘッド１６１９が固着
されている。ピストンヘッド１６１９は独立の昇降機構
（図示されていない）に支持されている。ピストンヘッ
ド１６１９の昇降機構は、ステッピングモータ式、水圧
式、油圧式、ボールスクリュー式など公知慣用の機構を
使用できる。

【００１２】シリンジ１６１５は上下２枚の固定板１６
２１に固定されている。また、この固定板１６２１の一
端は、取付板１６２３に固着されている。取付板１６２
３は後述の分注ヘッド移動機構１４内の昇降機構（図示
されていない）に取着され、反応装置１６全体の昇降動
作を確保する。反応装置１６全体の昇降は、分注ヘッド
移動機構１４内の別の独立した昇降機構（図示されてい
ない）に取着され、反応装置１６の昇降動作を確保す
る。

【００１３】図２は、ノズル１６０１、シリンジ１６１
５、ピストン１６１７及びヘッド１６１９の一体的な部
分拡大断面図である。ノズル１６０１は前記のようにス
テンレスなどの導電性金属部材から形成されているが、
ステンレス以外の導電性部材（例えば、銅、アルミニウ
ム、金、白金など）も使用できる。ノズル１６０１の内
面及び外面にはテフロンコーティングを施すことが好ま
しい。ノズル１６０１は例えば、外径１．２７ｍｍ、内
径０．８ｍｍ、全体長さ１００ｍｍとすることができ
る。この仕様で、ノズル１６０１の内容積は約６０μｌ
となり、ＰＣＲ法及びシーケンス法で必要な反応容量要
件を満たすことができる。ＰＣＲ法及びシーケンス法に
関する反応は全て、このノズル１６０１の内部で行われ
る。従って、ノズル１６０１は、ＰＣＲ法及びシーケン
ス法に関する反応のための反応容器として機能する。

【００１４】固定板１６２１の材質は特に限定されない
が、電気的絶縁性と耐熱性を有する材質（例えば、セラ
ミック又はプラスチック）から形成されていることが好
ましい。しかし、金属製であることもできる。同様に、
シリンジ１６１５の材質も特に限定されないが、電気的
絶縁性と耐熱性を有する材質（例えば、ガラス又はプラ
スチック）から形成されていることが好ましい。しか
し、金属製であることもできる。ピストン１６１７の材
質としては、ガラス又はプラスチックなどを好適に使用
できる。別法として、シリンジ１６１５とノズル１６０
１は同一の金属素材（例えば、ステンレス）により一体
的に形成することもできる。

【００１５】図３は、ノズル１６０１の加熱及び冷却方
式を示す模式的概要図である。ノズル１６０１の加熱区
画、すなわち、導電性基板１６０９間の間隔は４６ｍｍ
である。９６本のノズル１６０１を直列配線する。すな
わち、上下２枚の導電性基板１６０９で各ノズルを接続
する。印加電圧はＤＣ３５．４Ｖ（最大４３Ｖ）、電流
は８．２Ａ（最大１０Ａ）である。加熱時間は計算値で
５秒間（５０℃上昇時間）である。これらの値は使用す
るノズルが外径１．２７ｍｍ、内径０．８ｍｍであり、
材質がＳＵＳ３０４であり、加熱範囲が４６ｍｍの条件
下によるものであり、これら以外のノズルを使用する場
合には、電圧値、電流値及び加熱時間はそれぞれ異な
る。各条件下における適正な電圧値、電流値及び加熱時
間は実験を繰り返すことにより当業者により容易に決定
することができる。適正な温度制御を確保するため、加
熱範囲の適当な箇所に熱電対（図示されていない）など
の温度センサを配設することが好ましい。前記のよう
に、ノズル加熱時にはシャッター１６０４及び１６０７
は閉じられ、ノズル加熱空間内を密閉構造とする。当
然、空冷ファン１６０５も停止されている。ノズルを冷
却する場合、電圧印加を止め、同時にシャッター１６０
４及び１６０７を開放し、空冷ファン１６０５を駆動
し、外気をノズル外面に吹き付ける。このように、本発
明の反応装置では、反応容器となるべきノズルを加熱し
たり、冷却したりすることが自在にできるので、ＰＣＲ
法及びシーケンス反応に必要な温度サイクルを実現で
き、斯くしてＤＮＡサンプルを効果的かつ効率的に作成
することができる。

【００１６】本発明のＤＮＡサンプル作成用反応装置１
６は図４に示されるような、ＤＮＡサンプル自動作成装
置に組み込んで使用することが好ましい。このＤＮＡサ
ンプル自動作成装置は少なくとも、ＤＮＡサンプル作成
用反応装置１６を支持する分注ヘッド移動機構１４と、
酵素供給装置１８と、プレート載置台２０、とノズル封
止装置２２と洗浄装置２４と、プレートをロード／アン
ロードするための搬送ロボット２６と、プレートスタッ
カー２８を有する。これらは全て水平な取付台１０の上
面に配設されている。水平な取付台１０の上に２本の並
行なガイドレール１２が配設されており、このガイドレ
ール１２上に分注ヘッド移動機構１４が載架されてい
る。分注ヘッド移動機構１４はガイドレール１２上を前
後又は左右などの横方向に移動可能に構成されている。
この分注ヘッド移動機構１４に反応装置１６が取付られ
ている。そして、ガイドレール１２と並行に、酵素供給
装置１８と、プレート載置台２０と、ノズル封止装置２
２と洗浄装置２４が同じ軸線上に直列状に配列されてい
る。

【００１７】図５は、図４に示された装置の概要斜視図
である。プレートスタッカー２８は、水平な棚段が複数
個設けられており、各棚段に供給プレート又は回収プレ
ートが収納される。供給プレート用及び回収プレート用
の各専用プレートスタッカー２８を設けることもでき
る。例えば、処理の開始時において、搬送ロボット２６
がプレートスタッカー２８の棚段に収納されている供給
プレートをハンドリングし、これをプレート載置台２０
へ搬送し、所定位置に載置する。反応装置１６は上下方
向に昇降可能なように分注ヘッド移動機構１４に取り付
けられている。反応装置１６の昇降機構自体はステッピ
ングモータ式、水圧式、油圧式、ボールスクリュー式な
ど公知慣用の機構を使用できる。従って、新たなプレー
トがプレート載置台２０に載置されると、分注ヘッド移
動機構１４はプレート載置台２０の位置にまで移動し、
反応装置１６を昇降させ、プレートの所定の穴（ウエ
ル）内の試薬などを吸引し、予めプログラムされたルー
チンに従い、酵素供給装置１８、ノズル封止装置２２又
は洗浄装置２４などの適宜の位置に移動し、後記におい
て詳述する所定の処理操作を行うことができる。全ての
処理が完了すると、プレート載置台２０のプレートは再
び搬送ロボット２６によりハンドリングされて、プレー
トスタッカー２８の回収プレート用棚段に収納される。

【００１８】図４及び図５には、何れも、本発明のＤＮ
Ａサンプル自動作成装置を操作するための操作パネル、
各処理動作を制御するためのプログラムなどが格納され
た制御ユニット及びその他必要な付帯設備類などが図示
されていないが、このような操作パネル、制御ユニット
及び付帯設備類などが必要に応じて配備されることは当
業者に周知である。また、説明するまでもなく、本発明
のＤＮＡサンプル自動作成装置の水平な取付台１０には
適当な密閉容器を被せることもできる。このような密閉
容器はサンプルや試薬類が空気中の塵埃や浮遊雑菌に汚
染されることを効果的に防止する。

【００１９】本発明のＤＮＡサンプル自動作成装置で使
用されるプレートは例えば、その上面に複数個の凹陥穴
（又はウエル）を有する常用のマイクロタイタープレー
トである。プレートの材質としては、セラミック、ガラ
ス、プラスチックなど適宜の材料を使用できる。図６
に、３８４個の凹陥穴を有するマイクロタイタープレー
ト３０の部分概要平面図を示す。この凹陥穴を４個一組
として９６ウエル単位で４分割して使用する。縦軸をａ
〜ｈの８区分とし、横軸をＡ〜Ｌの１２区分とすると、
座標Ａａには（１，１），（１，２），（２，１），
（２，２）で特定される４個の穴が含まれることとな
る。そして、この各穴に、各処理段階で使用される必要
な試薬類を充填しておく。例えば、（１，１）の穴には
ＰＣＲ法の最初の工程で使用される反応混合物及びプラ
イマーが充填され、（２，１）の穴は反応用ウエルとし
て使用し、（１，２）の穴にはシーケンス用のプライマ
が充填され、更に、（２，２）の穴にはシーケンス反応
用の反応混合物が充填される。ＰＣＲ増幅は米国のパー
キン・エルマー社から市販のキットを用いて行うことが
できる。この反応混合物キットは、テンプレートＤＮＡ
３μｌ（例えば、ヒトゲノム約２００ｎｇ）、１０倍Ｐ
ＣＲバッファ３μｌ、ｄＮＴＰ（２．５ミリモル）３μ
ｌ、プライマ１（１０マイクロモル）３μｌ、プライマ
２（１０マイクロモル）３μｌ、ＥｘＴａｑ０．２μ
ｌ及びＨ_２Ｏ１５μｌからなる全量３０μｌの溶液であ
る。言うまでもなく、その他の反応混合物及びプライマ
ーも使用できる。座標Ａｂ〜Ａｈ及び座標Ｂａ〜Ｂｈ、
Ｃａ〜Ｃｈ、・・・、Ｌａ〜Ｌｈの各穴にも前記（１，
１），（１，２），（２，１），（２，２）と同じ試薬
類が充填される。言うまでもなく、これ以外の試薬類な
ども各穴に充填することができる。また、用途に応じ
て、穴は２個一組、３個一組などに適宜アレンジするこ
ともできる。

【００２０】図７に示されるように、反応装置のノズル
１６０１を処理段階に応じて、（１，１），（１，
２），（２，１），（２，２）のうちの何れかの所定の
穴に挿入するために、プレート３０は、プレート載置台
２０でＸ−Ｙ方向に移動される。プレート３０のＸ−Ｙ
方向への移動は、プレート載置台２０自体をＸ−Ｙ方向
に移動可能に構成することによって実施できるが、プレ
ート３０を搬送ロボット２６のアームに保持させること
によっても実施できる。別法として、反応装置１６をＸ
−Ｙ方向へ移動させることによっても同じ目的を達成す
ることができる。

【００２１】図８は、酵素供給部１８の構成の一例を示
す概要斜視図である。酵素供給部１８はＰＣＲ法で使用
された未反応酵素類を分解し、精製処理するためのもの
である。サンプル生成工程において、従来、ＰＣＲ増幅
後の精製処理を遠心分離器により行っていたが、本発明
では酵素により行うことで全自動化に成功した。酵素と
しては、未反応ｄＮＴＰを除去するためのAlkaline Pho
sphatase Shrimp(APS)と未反応プライマを除去するため
のExonuklease I(Exol)を使用する。その他の分解酵素
も使用できる。各酵素を例えば、ＴＥで２０倍に希釈
し、所定量（例えば、２μｌ）づつ供給する。酵素供給
部１８は基本的に、複数個（例えば、９６個）の酵素供
給ポット１８０１が立設された、上部開放型の矩形状容
器１８０３と、この矩形状容器１８０３に一体的に連接
された密閉型の酵素タンク１８０５を有する。酵素タン
ク１８０５の上面にはタンク内に酵素溶液を供給するた
めの開閉可能な蓋１８０７を有する酵素溶液供給口１８
０９が配設されている。酵素溶液の供給は図示されてい
ない適当な手段により自動的に行うこともできるし、あ
るいは、作業員が手作業で行うこともできる。タンク１
８０５内の酵素溶液の残量を検知するための液面センサ
１８１１を配設することが好ましい。この液面センサ１
８１１の検出信号に基づき、タンク１８０５への酵素溶
液の供給をコントロールする。

【００２２】また、酵素タンク１８０５から酵素供給ポ
ット１８０１へ酵素溶液を給送するための輸液機構１８
１３を有する。輸液機構１８１３は例えば、ステッピン
グモータ１８１５などを使用し、精密送りネジ１８１７
を回転させて、シリンジ１８１９のピストン１８２１を
進退させることにより構成されている。精密送りネジ１
８１７とピストン１８２１とは、接続アーム１８２３で
連結されている。

【００２３】Alkaline Phosphatase Shrimp(APS)及びEx
onuklease I(Exol)のような分解酵素は温度が上昇する
と失活することがあるので、矩形状容器１８０３及び酵
素タンク１８０５の底面全体を覆うように、冷却ユニッ
ト１８２５が配設されている。この冷却ユニット１８２
５により、酵素溶液を約４℃程度の温度に維持し、酵素
自体をドーマント状態にしておくことが好ましい。

【００２４】図９は、図８に示された輸液機構１８１３
の部分拡大断面図である。シリンジ１８１９の先端に
は、略Ｔ字形の三叉パイプ１８２７が接続されている。
この三叉パイプ１８２７の一方の端部には逆止弁１８２
９が接続され、他方の端部には逆止弁１８３１が接続さ
れている。逆止弁１８２９の他端には、酵素タンク１８
０５からのパイプ１８３３が接続され、また、逆止弁１
８３１の他端には酵素供給ポット１８０１に配管された
パイプ１８３５が接続されている。従って、ピストン１
８２１を引くと、酵素タンク１８０５から酵素溶液が逆
止弁１８２９を通過してシリンジ１８１９内部に充満さ
れる。この際、逆止弁１８３１は閉じているので酵素溶
液は酵素供給ポット１８０１へは流れない。一方、ピス
トン１８２１を押し込むと、シリンジ１８１９内の酵素
溶液は逆止弁１８３１を通過して、酵素供給ポット１８
０１に給送される。この際、逆止弁１８２９は閉じてい
るので、シリンジ１８１９内の酵素溶液が酵素タンク１
８０５に戻されることはない。

【００２５】図１０は、酵素供給ポット１８０１の部分
拡大断面図である。各酵素供給ポット１８０１の底部に
は、パイプ１８３５から分枝する供給パイプ１８３７が
接続されている。従って、ピストン１８２１の押し込み
によりシリンジ１８１９内の酵素溶液は逆止弁１８３１
を通り、パイプ１８３５及び枝パイプ１８３７を経て、
ポット１８０１の底部から上端面まで充満される。ポッ
ト１８０１内にノズル１６０１が挿入されると、ポット
１８０１内の酵素溶液が溢れることがあるが、このよう
な酵素溶液は、各ポット１８０１に隣接する排液空間１
８３９に落ち込み、そして、廃液ドレン１８４１により
容器１８０３外へ廃棄される。

【００２６】図１１は、ノズル封止装置２２の構成例の
一例を示す概要断面図である。ノズル封止装置２２は、
パラフィン２２０１が充填されたトレー２２０３と、こ
のトレー２２０３の底部に接着された加熱冷却手段２２
０５と、この加熱冷却手段２２０５の他方の面に接着さ
れたヒートシンク２２０７とからなる。しかし、ヒート
シンク２２０７の使用は本発明の必須要件ではない。加
熱冷却手段２２０５は例えば、ペルチェ素子などであ
る。

【００２７】金属製ノズル１６０１（図２参照）を反応
容器にしたＰＣＲ法及びシーケンス法を実施する場合、
ノズル１６０１内に充填したサンプル反応液に温度サイ
クルを与える際、高温加熱時に起こり得るノズル内の気
泡の熱膨張によるサンプル反応液の吐出を避けるため
に、温度サイクルの始まる前にパラフィン２２０１によ
り金属製ノズル１６０１の先端を封止する。このパラフ
ィン封止を用いることにより、ＰＣＲ法及びシーケンス
法を全自動で行うことが可能となった。

【００２８】図１２は、このパラフィン封止処理の一連
のステップを示す模式図である。ステップＡでは、ペル
チェ素子２２０５を駆動して加熱し、トレー２２０３内
のパラフィンを溶融させる。ピストン１６１７を極僅か
だけ引き上げ、サンプル液の充填されたノズル１６０１
の先端に空間を形成させておく。次に、ステップＢにお
いて、このノズル１６０１を下降させ、溶融パラフィン
内にノズル先端を浸漬する。この浸漬により、ノズル１
６０１の先端部空間内にパラフィン２２０１が進入す
る。その後、ステップＣにおいて、ペルチェ素子２２０
５を逆駆動させて冷却し、トレー２２０３内のパラフィ
ンを凝固させる。これにより、ノズル１６０１の先端部
はパラフィンで完全に封止される。ペルチェ素子２２０
５でパラフィン浴２２０３を冷却しながら、すなわち、
パラフィン２２０１を凝固したままの状態に維持しなが
ら、図５に示すように、先端部封止状態のノズル１６０
１に電流を流してＰＣＲ法又はシーケンス法に必要な温
度にまで加熱し、所定の反応をノズル内で実施し、その
後、電流を止め、ノズル１６０１を冷却し、所定の温度
サイクルを繰り返す。ノズル１６０１の先端部は加熱さ
れないので、ノズル１６０１の先端を封止しているパラ
フィンは溶融されず、凝固状態を維持することができ
る。所定の温度サイクルを繰り返し、ＰＣＲ法又はシー
ケンス法に必要な反応が完了したら、ステップＤにおい
て、ペルチェ素子２２０５を駆動して加熱し、トレー２
２０３内のパラフィンを溶融させる。パラフィン２２０
１が完全に溶融したら、ノズル１６０１をパラフィン浴
トレーから引き上げる。ノズル１６０１の先端部を封止
していたパラフィンも溶融されるので、ノズル１６０１
を引き上げると、ノズル１６０１の先端部はステップＡ
で示される元の空間状態に戻る。前記のように、ノズル
１６０１の内面及び外面にはテフロン被膜がコーティン
グされているので、液状になったパラフィンはノズル１
６０１の先端部から簡単に除去される。

【００２９】別法として、パラフィンの代わりに、図１
３に示されるように、ノズル１６０１の先端をマット２
２１０の表面に押しつけることにより、パラフィン封止
と同様な作用効果を得ることもできる。すなわち、サン
プル液の充填されたノズル１６０１の先端に空間を形成
させた状態で、ノズル１６０１の先端をマット２２１０
の表面に押しつけ、この状態のまま、ノズル１６０１に
電流を流してＰＣＲ法又はシーケンス法に必要な温度に
まで加熱し、所定の反応をノズル内で実施し、その後、
電流を止め、ノズル１６０１を冷却し、所定の温度サイ
クルを繰り返す。ノズル１６０１の先端に必要十分な容
積の空間が存在するため、サンプルが加熱されて膨張し
ても、サンプルがノズル外部へ吐出することは効果的に
防止される。所定の温度サイクルを繰り返し、ＰＣＲ法
又はシーケンス法に必要な反応が完了したら、ノズル１
６０１をマット２２１０の表面から引き上げ、次の処理
工程へ移動させる。なお、図１３において、符号２２１
２はマット２２１０の支持台を示す。

【００３０】先のノズル先端封止のために使用されたマ
ット２２１０の表面の同じ箇所に再度、異なるノズル１
６０１の先端が押しつけられるとコンタミネーションを
引き起こす恐れがあるので、新たなＰＣＲ増幅処理のた
めのノズル１６０１の先端は必ず、マット２２１０の表
面の別の新たな箇所に押しつけなければならない。従っ
て、図示されていない公知慣用の手段により、マット２
２１０を前後及び／又は左右に移動させることが好まし
い。マットはＰＣＲ増幅処理の終了毎に交換する枚様式
であることもできるが、図１４に示されるように、長尺
の連続シート状のものを、各ＰＣＲ増幅処理毎に少しず
つ繰出して使用することもできる。図１４において、符
号２２１４はテンションロールを示し、２２１６は繰出
ロール、２２１８は巻取ロールを示す。これにより、１
回のＰＣＲ増幅処理が終了する毎にマットの位置を変
え、ＰＣＲ増幅処理間のコンタミネーションを防ぐこと
ができる。その結果、本発明のＤＮＡサンプル作成用反
応装置を長時間にわたって連続的に運転することが可能
となる。

【００３１】このような目的に使用されるマット２２１
０は例えば、耐熱性で、柔軟性、弾力性があり、非導電
性の材料から形成することができる。このような材料と
しては、例えば、フッ素樹脂、フッ素ゴム、ウレタンゴ
ム、シリコンゴム、クロロプレンゴムなどが好適であ
る。マットの厚さは一般的に、１．０ｍｍ〜１０ｍｍの
範囲内であることが好ましい。マットの厚さが１．０ｍ
ｍ未満の場合、ノズル先端の封止効果が不十分となるば
かりか、ノズル先端によりマットが破損される恐れがあ
る。一方、マットの厚さが１０ｍｍ超の場合、ノズル先
端の封止効果が飽和し、不経済となるばかりか、取り扱
い性が低下するので好ましくない。特に、図１４に示さ
れるような長尺の連続シート状マットを使用する場合、
その厚さは１．０ｍｍ〜５．０ｍｍの範囲内であること
が特に好ましい。

【００３２】図１５は洗浄装置２４の構成の一例を示す
部分概要断面図である。洗浄装置２４は、洗浄槽２４０
１からなり、洗浄槽２４０１は、その内側に、所定の高
さの洗浄ポット２４０３と、排水トレンチ２４０５を有
する。洗浄槽２４０１は矩形形状を有することができ
る。洗浄ポット２４０３の底部には洗浄水供給口２４０
７が配設されている。洗浄水としては、純水、脱イオン
水、蒸留水など不純物を含まない適宜の水を使用するこ
とができる。洗浄水供給源（図示されていない）と洗浄
水供給口２４０７との間には適当なパイプなどを配管す
ることができる。洗浄ポット２４０３の容量はノズルの
内部容量と同じか若干大きいことが好ましい。洗浄中
は、洗浄ポット２４０３内に常に新鮮な洗浄水を供給
し、洗浄ポット２４０３の上端面からオーバーフローさ
せ続けることが好ましい。このような状態で、ノズル１
６０１の先端を洗浄ポット２４０３の上端面から洗浄水
中に浸漬させる。この浸漬状態において、ピストン１６
１７を進退させることにより、ノズル１６０１内に洗浄
水を吸い込み、そして吐き出して、ノズル１６０１の内
部を洗浄する。吐き出しは洗浄ポット２４０３内へする
こともできるし、あるいは、排水トレンチ２４０５へす
ることもできる。洗浄ポット２４０３内を清浄に保つた
めに、吐き出しは排水トレンチ２４０５へすることが好
ましい。洗浄水の吸い込み、吐き出しは１回でもよい
が、複数回行うこともできる。ノズル１６０１から吐き
出された洗浄水及び洗浄ポット２４０３からオーバーフ
ローした洗浄水は、排水トレンチ２４０５の底部に配設
された排水口２４０９から洗浄槽２４０１の外部の適当
な排水タンク（図示されていない）に貯留される。洗浄
槽２４０１はノズル１６０１の洗浄だけでなく、反応生
成物を純水で希釈するなどの目的にも使用できる。

【００３３】

【実施例】図１６は、本発明のＤＮＡサンプル自動作成
装置により、単一の蛍光色素で標識されたＤＮＡサンプ
ルの作成を行う際の一連の処理を示す流れ図である。ス
テップ１４０１で作成処理が開始される。この場合、Ｄ
ＮＡサンプル自動作成装置には、酵素溶液、洗浄水、マ
イクロタイタープレートなど、ＤＮＡサンプル作成に必
要な準備が全て整えられている。すなわち、搬送ロボッ
ト２６がプレートスタッカー２８から供給プレート３０
を把持し、プレート載置部２０へ供給プレートを載置す
る。ステップ１４０２において、分注ヘッド１６がプレ
ート載置部２０の位置に移動し、分注ヘッド１６を下降
させ、プレート３０の座標（１，１）のウエル内の反応
混合物とプライマーとの混合液２４μｌのうち２０μｌ
をノズル１６０１で吸引する。その後、ステップ１４０
３で、分注ヘッド１６をパラフィン浴部２２に移動さ
せ、分注ヘッド１６を下降させ、ノズル先端をパラフィ
ンで封止し、ＰＣＲ法を実施し、所定の温度サイクルを
完了した後、パラフィン封止を解く。ステップ１４０４
で、ノズルをプレートの座標（１，２）の空ウエルに移
動させ、ノズル内容物を全てこの空ウエル内に分注す
る。ステップ１４０５で、ノズルに精製処理用分解酵素
を５μｌ吸引させ、これをステップ１４０４のウエル内
容物に添加する。この混合物を２０μｌ吸引する。その
後、ステップ１４０６でノズル先端をパラフィン封止
し、ノズルを加熱し、混合物内の未反応残留物（ｄＮＴ
Ｐ及びプライマ）を酵素で分解し、精製する。ステップ
１４０７において、精製物３μｌを洗浄ポット２４０２
に分注し、残りを廃棄する。その後、洗浄ポット内に純
水６０μｌを送入し、希釈する。ステップ１４０８にお
いて、希釈液１μｌをノズルで吸引し、これをプレート
の座標（２，１）のウエル内のプライマーに分注し、総
量８．３μｌとする。ステップ１４０９において、座標
（２，１）のウエル内のプライマー混合液７μｌを吸引
し、プレートの座標（２，２）のウエル内の反応混合物
５μｌにプライマー混合液７μｌ全量を分注し、十分に
攪拌する。ステップ１４１０において、得られた混合液
１２μｌをノズルで吸引し、パラフィン封止し、シーケ
ンス反応を行う。反応終了後、パラフィン封止を解き、
ステップ１４１１で新鮮な９６穴ウエルプレートの各穴
にノズルから１２μｌ全量を分注する。ステップ１４０
２において、シーケンス反応生成物を更に精製処理する
か否か決定する。精製処理が不要な場合、ステップ１４
１３において、９６穴ウエルプレートを搬送ロボット２
６によりプレートスタッカー２８の所定の棚段に収納
し、一連の処理を終了する。精製処理を行う場合、ステ
ップ１４１４で実施する。しかし、精製処理工程は本発
明の装置ではなく、ＰＳＳ社製のＳＧ−８ＧＣ精製装置
で行われる。ステップ１４１５で精製物を得る。この精
製物を吸引し、ステップ１４１６において、回収用サン
プルプレートの所定の穴に分注する。その後、ステップ
１４１７において、この回収用サンプルプレートを搬送
ロボット２６によりプレートスタッカー２８の所定の棚
段に収納し、一連の処理を終了する。

【００３４】ＤＮＡサンプルを標識する場合、単一の蛍
光色素だけでなく、複数の蛍光色素を使用することがで
きる。この場合、図１６に示された流れ図のステップ１
４０８における全量を１６μｌとし、ステップ１４０９
において、この１６μｌに反応混合物４μｌを加えて２
０μｌとし、ステップ１４１０において、この全量２０
μｌをシーケンス反応に使用すること以外は、単色の場
合の処理内容と同じである。

【００３５】図１７は、ＰＳＳ社製のＳＧ−８ＧＣ精製
装置で行われる精製処理（図１６のステップ１４１４参
照）の一例を説明する流れ図である。この精製処理はス
テップ１５０１で開始される。ステップ１５０１におけ
るシーケンス反応液入りサンプルプレートは図１６のス
テップ１４１１における９６穴ウエルプレートと同一で
ある。ステップ１５０２でビーズ液を添加し、吸引し、
２０μｌを分注する。ステップ１５０３で分注された２
０μｌを数回攪拌し、ステップ１５０４で室温で５分間
インキュベーションし、ステップ１５０５で磁気を付加
し、１分間静置する。ステップ１５０６で、７０％エチ
ルアルコールを添加し、吸引し、５０μｌを分注し、ス
テップ１５０７で１０回攪拌する。ステップ１５０８で
再度磁気付加し、１分間静置する。ステップ１５０９で
上清を除去し、ステップ１５１０で再度７０％エチルア
ルコールを添加し、吸引し、５０μｌを分注する。ステ
ップ１５１１で１０回攪拌する。その後、ステップ１５
１２で再度磁気付加し、１分間静置する。ステップ１５
０９で上清を除去する。このステップで得られた精製物
を平板泳動に使用するか、又はキャピラリ泳動に使用す
るかによって、その後の精製処理が異なる。例えば、平
板泳動に使用する場合、ステップ１５１４において、ス
テップ１５１３で得られた精製物にバッファ液を添加
し、吸引し、新鮮な９６穴ウエルプレートに２〜５μｌ
程度分注し、精製処理を終える。キャピラリ泳動に使用
する場合、ステップ１５１６において、ステップ１５１
３で得られた精製物にバッファ液を添加し、吸引し、１
０〜２０μｌ程度分注する。その後、ステップ１５１７
で全量吸引し、８０〜９０℃で２分間加熱し、ステップ
１５１８で上清を回収し、ステップ１５１９で精製処理
を終了する。

【００３６】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
ＰＣＲ法からシーケンス反応まで、１台の反応装置で一
貫的に実施することができ、ＤＮＡ塩基配列決定用のＤ
ＮＡサンプルを完全に自動的に作成することができる。
これにより、ＤＮＡサンプル作成のスループットが大幅
に向上される。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＤＮＡサンプル作成用反応装置の一部
切り欠き概要斜視図である。

【図２】図１に示された反応装置に組み込まれたノズ
ル、シリンジ及びピストンの組立状態を示す部分概要断
面図である。

【図３】図２に示された反応装置のノズルの加熱及び冷
却方式を示す模式的概要図である。

【図４】図１に示されるＤＮＡサンプル作成用反応装置
が組込まれたＤＮＡサンプル自動作成装置の構成の一例
を示す概要平面図である。

【図５】図４に示されたＤＮＡサンプル自動作成装置の
概要斜視図である。

【図６】本発明のＤＮＡサンプル自動作成装置で使用さ
れるプレートの一例の部分拡大模式図である。

【図７】図６に示されたプレートにノズルが挿入された
状態を示す部分拡大模式図である。

【図８】本発明のＤＮＡサンプル自動作成装置で使用さ
れる酵素供給装置の概要斜視図である。

【図９】図８に示された酵素供給装置に配設された輸液
機構の部分拡大断面図である。

【図１０】図８に示された酵素供給装置に配設された酵
素供給ポットの部分拡大断面図である。

【図１１】本発明のＤＮＡサンプル自動作成装置で使用
されるノズル封止装置の構成例の一例を示す概要断面図
である。

【図１２】図１１に示されたノズル封止装置におけるノ
ズルのパラフィン封止と解除を示す模式図であり、Ａは
パラフィン浴が加熱され、ノズル挿入前の状態を示し、
Ｂは溶融パラフィン内にノズルを挿入した状態を示し、
Ｃはノズルを挿入したままパラフィンを凝固させた状態
を示し、Ｄはパラフィンを再溶融させ、ノズルを引き抜
いた状態を示す。

【図１３】本発明のＤＮＡサンプル自動作成装置で使用
されるノズル封止装置の構成例の別の例を示す概要断面
図である。

【図１４】図１３に示されたノズル封止装置におけるマ
ットとして長尺な連続シート状マットを使用した実施態
様の概要断面図である。

【図１５】本発明のＤＮＡサンプル自動作成装置で使用
される洗浄装置の構成例の一例を示す部分概要断面図で
ある。

【図１６】本発明のＤＮＡサンプル自動作成装置により
ＰＣＲ法及びシーケンス法を実施する際の、一連の処理
を説明する流れ図である。

【図１７】図１６に示された流れ図のステップ１４１４
における精製処理の一例を説明する流れ図である。

【符号の説明】

１０水平取付台１２ガイドレ
ール１４分注ヘッド移動機構１６反応装置１８酵素供給装置２０プレート
載置台２２ノズル封止装置２４洗浄装置２６搬送ロボット２８プレート
スタッカー３０プレート１６０１ノズル１６０３筐体１６０４シャッター１６０５冷却
ファン１６０７シャッター１６０９導電
性基板１６１１導体１６１３整流
板１６１５シリンジ１６１７ピス
トン１６１９ピストンヘッド１６２１シリ
ンジ固定板１８０１酵素供給ポット１８０３矩形
状容器１８０５酵素タンク１８１３輸液
機構１８２５冷却手段２２０１パラ
フィン２２０３トレー２２０５ペル
チェ素子２２０７ヒートシンク２２１０マッ
ト２２１２マット支持台２４０１洗浄
槽２４０３洗浄ポット２４０５排水
トレンチ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者萩原久東京都渋谷区東３丁目16番３号日立電子エンジニアリング株式会社内Ｆターム(参考） 4B029 AA09 AA23 BB16 BB20 HA09

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】複数本の中空状導電性ノズルと、該ノズ
ルに連接された中空状シリンジと、該シリンジの中空部
に挿入されたピストンを有し、該ピストンの上部には昇
降可能なピストンヘッドが固着されており、前記導電性
ノズルの中間部は両側に開口部を有する筐体内に収容さ
れており、一方の開口部に隣接して冷却機構が配設され
ており、前記筐体内側の導電性ノズルの中間部が、導体
により電源と接続されていることを特徴とするＤＮＡサ
ンプル作成用反応装置。
【請求項２】前記ＤＮＡサンプル作成用反応装置は横
方向に移動可能な分注ヘッド移動機構に昇降可能に支持
されており、前記ピストンヘッドは前記ＤＮＡサンプル
作成用反応装置と独立に昇降することができることを特
徴とする請求項１に記載のＤＮＡサンプル作成用反応装
置。
【請求項３】前記ノズルはステンレス製であり、該ノ
ズルの内面及び外面にはテフロン（登録商標）コーティ
ングが施されていることを特徴とする請求項に１記載の
ＤＮＡサンプル作成用反応装置。
【請求項４】ＰＣＲ法及びシーケンス反応のための反
応容器として使用されることを特徴とする請求項に１記
載のＤＮＡサンプル作成用反応装置。
【請求項５】酵素供給装置、ノズル封止装置及び洗浄
装置と共に使用されることを特徴とする請求項に１記載
のＤＮＡサンプル作成用反応装置。
【請求項６】前記酵素供給装置は、複数個の酵素供給
ポットが内側に立設された上部開放型の矩形状容器と、
この矩形状容器に一体的に連接された密閉可能な酵素タ
ンクと、該酵素タンクから前記酵素供給ポットへ酵素溶
液を給送する輸液機構と、前記矩形状容器の外側底部に
配設された冷却手段とからなることを特徴とする請求項
５に記載のＤＮＡサンプル作成用反応装置。
【請求項７】前記ノズル封止装置は、少なくとも、パ
ラフィンの充填されたトレーと、該トレーの外側底部に
配設された加熱冷却手段とを有することを特徴とする請
求項５に記載のＤＮＡサンプル作成用反応装置。
【請求項８】前記加熱冷却手段はペルチェ素子であ
り、前記ペルチェ素子の前記トレーとの接着面と反対側
の面にヒートシンクが更に接着されていることを特徴と
する請求項７に記載のＤＮＡサンプル作成用反応装置。
【請求項９】前記ノズル封止装置は、耐熱性、柔軟
性、弾力性、非導電性の材料から形成されたマットから
なり、該マット表面にノズル先端を押しつけることによ
り前記ノズルを封止することを特徴とする請求項５に記
載のＤＮＡサンプル作成用反応装置。
【請求項１０】前記マットは、フッ素樹脂、フッ素ゴ
ム、ウレタンゴム、シリコンゴム及びクロロプレンゴム
からなる群から選択される材料から形成されていること
を特徴とする請求項９に記載のＤＮＡサンプル作成用反
応装置。
【請求項１１】前記マットは枚葉式又は長尺な連続シ
ート状の何れかの形状であることを特徴とする請求項９
に記載のＤＮＡサンプル作成用反応装置。
【請求項１２】前記洗浄装置は、複数個の洗浄ポット
が内側に立設され、該洗浄ポットに隣接して排水トレン
チが存在する上部開放型の矩形状容器からなる洗浄槽を
有し、前記洗浄ポットにはその底部から洗浄水が供給さ
れ、前記排水トレンチは排水ドレンに通じていることを
特徴とする請求項５に記載のＤＮＡサンプル作成用反応
装置。
【請求項１３】前記筐体の両側の開口部には開閉可能
なシャッターが配設されており、前記シャッターのうち
の一方のシャッターに隣接して冷却ファンが配設されて
いることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡサンプル
作成用反応装置。