JP2001523224A

JP2001523224A - 血管疾患の治療法及び製剤

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Publication number: JP2001523224A
Application number: JP54320098A
Authority: JP
Inventors: カエセマイアー，ウェイン，エイチ
Original assignee: カエセマイアー，ウェイン，エイチ
Priority date: 1997-04-10
Filing date: 1998-04-10
Publication date: 2001-11-20
Also published as: EP1022945A2; EP1022945A4; US5968983A; CA2286671A1; US6465516B1; AU744813B2; AU7115098A; US20050085548A1; WO1998044893A2; WO1998044893A3; CA2286671C

Abstract

(57)【要約】内皮機能不全（endothelial dysfunction）に関連する疾患の治療に用いるL-アルギニン及びHmg-CoAレダクターゼ抑制薬から成る治療混合薬を開示し、一酸化窒素シンターゼ（cNOS）の構成形態を刺激して固有一酸化窒素（NO）を生成することにより内皮機能不全を緩和する。

Description

【発明の詳細な説明】血管疾患の治療法及び製剤発明の背景本発明は、概括的に、一酸化窒素シンターゼ（「NOS」）の基質及びNOS作用物質を混合して有益な効果を発揮し、潜在的な心血管・脳血管・腎血管（cardioce rebrorenovascular）の疾患及び症状を回避するのみならず、心血管・脳血管・腎血管の疾患を治療する方法に関連する。関連技術の説明心臓疾患の分野の多くは、体内のコレステロールの存在に集中してきた。高コレステロール血症（hypercholesterolemia）は、冠状動脈性心臓病による死亡の主な危険因子として知られる。人体内の全コレステロールの５０%以上は内因性生合成（intrinsic biosynthesis）により発生することが公知である。また、コレステロールの生合成の重要な律速過程は、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素Aレダクターゼ（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase）又はHmg-CoAレダクターゼとして知られる酵素のレベルであることも公知である。ある包括概念の化合物は、高コレステロール血症及び冠状動脈死の危険因子を低減するためにコレステロールの内因性生合成を抑制及び減少させることが当業者に知られている。この包括概念の化合物は、Hmg-CoAレダクターゼ抑制薬として知られる。心臓疾患を治療する他の方法は、体内の血管を拡張させることである。この点で、血管の内皮中のアルギニンからの通常の代謝産物として酵素により形成される一酸化窒素は、内皮由来弛緩因子（EDRF）を形成する重要な構成要素となることが判明した。EDRFは内皮由来一酸化窒素（EDNO）と同義であり、本明細書で使用する通り、特段の明示がない限りEDRF及びEDNOは入れ換え可能である。また、マクロファージ及びニューロンは、細胞死滅（cell killing）及び／又は細胞質ゾル機能（cytosolic function）の構成要素として体内で一酸化窒素を生成することが示された。近年、一酸化窒素シンターゼ（「NOS」）と呼ばれる種類の酵素がL-アルギニンから一酸化窒素を形成すること並びに生成された一酸化窒素は可溶性グアニル酸シクラーゼの内皮依存緩和及び活性化、中枢及び末梢神経系中の神経伝達及び活性化されたマクロファージ細胞毒性の原因となることが確認されている。一酸化窒素シンターゼには、構成形態（構成品種）（cNOS）及び誘導形態（誘導品種）（iNOS）を含む多数の明確な異性体がある。構成形態は通常の内皮細胞、ニューロン及び他の組織内に存在する。内皮細胞中の構成形態による一酸化窒素の形成は、平常の血圧の規制、高脂血症（hyperlipodemia）、動脈硬化（arte riosclerosis）、血栓症（thrombosis）及び再狭窄（restenosis）等の内皮機能不全の防止に重要な役割を果たすと考えられる。一酸化窒素シンターゼの誘導形態は活性化マクロファージ中に存在し、例えば血管の平滑筋細胞において種々のサイトカイン（cytoklnes）及び／又は微生物生成物により誘導されることが判明している。 L-アルギニン等のEDNOの前駆体基質が一酸化窒素に変換される際に、NOSによって酵素触媒作用を受け、L-アルギニンの変換の結果生ずる副産物はL-シトルリン（L-citrulline）である。前記の通り、先に内皮について説明したが、以下多数の細胞型についてNOS活性を説明する。脳、内皮及びマクロファージ異性体は、約５０%アミノ酸同一性（amino acid identity）を有する種々の遺伝子の生成物と考えられる。脳内NOSと内皮内NOSは極めて類似する性質を有するが、主として脳内NOSは細胞質ゾル（cytosolic）であるのに対し、内皮内酵素の大部分は膜付随性蛋白質である点で両者は相違する。脳及び内皮に存在する優れたシンターゼである一酸化窒素シンターゼの構成形態（「cNOS」）は、機能的に基底条件下で活性を有し、更にレセプタに媒介される作用物質（agonists）又はカルシウムイオノホア（calcium ionophores）に応答して発生する細胞内のカルシウムの増加により刺激される。cNOSは酵素の「生理学的」形態と考えられ、生物学的過程の多様な群において役割を果たす。試験管内（in vitro）での研究の結果、一酸化窒素シンターゼの活性は一酸化窒素自体による負フィードバック法で規制できることが判明した。心血管・脳血管・腎血管の循環では、構成形態的に生成された一酸化窒素の主要なターゲットは、血管の平滑筋、心筋（ミオサイト）及び冠状血管の平滑筋に存在する可溶性グアニル酸シクラーゼであると考えられる。 cNOSとは対照的に、誘導カルシウム独立形態即ちiNOSは初めにマクロファージで説明されるに過ぎなかった。現在では、多くの他の細胞型内で一定の刺激に応答して一酸化窒素シンターゼが誘導されることが知られている。このため、通常、例えば心筋の細胞等のみならず血管の平滑筋細胞等は、一酸化窒素シンターゼの構成形態を示さず、相当なレベルの構成異性体を示す。 iNOSが基礎的条件下で示す活性はごく僅かであるが、例えばリポポリサッカリド（lipopolysaccharide）及びあるサイトカイン等のファクタに反応する場合には一定時間にわたり活性を示す。酵素の誘導形態は構成形態に比べ極めて多量の NOを生成し、iNOSによって生成された高濃度のNOは細胞に有毒であるため、NOS は酵素の「病態生理学的（pathophysiological）」形態であると考えられる。グルココルチコイド（glucocorticoids）及びサイトカインによりiNOSの誘導を阻止できる。iNOSの転写後規制（posttranscriptional regulation）については殆ど何も知られていない。NOの細胞毒性効果は、グアニル酸シクラーゼ及びサイクリックGMP形成から殆ど影響を受けないと考えられる。この分野での研究の大部分は、L-アルギニンの種々の誘導体を使用するiNOS刺激の抑制薬に集中してきた。 cNOS活性化分野での研究により多数のcNOS作用物質が明らかとなり、その一部は、本明細書中で全体を引用する米国特許第５５４３４３０号に記載されている。しかしながら、現在まで、Hmg-CoAレダクターゼ抑制薬がcNOS作用物質として機能することを示す研究結果が知られていなかった。発明の概要本明細書中で使用する用語「生体（subject）」は、アルギニンから一酸化窒素が形成される人間を含むあらゆる哺乳類を意味する。本明細書では、生体に対し使用する方法は、既存の条件での療法による治療法のほかに疾患予防に対する使用法も想定する。本明細書中で使用する用語「固有NO（native NO）」は、L-アルギニンの生体内変化又はL-アルギニン依存経路によって生成される一酸化窒素を意味する。「 EDRF」又は「EDNO」は「固有NO」と入れ換えて使用される場合がある。本明細書中で使用する用語「終端（endpoints）」は、心血管の疾患の治療過程で遭遇する臨床の出来事、即ち死（死亡率）を含む。本明細書中で使用する用語「L-アルギニン」は、全ての生化学的均等物（即ち塩、前駆体及びその基本的形態）を包含する。本明細書中で定義するL-アルギニンは、cNOS基質として機能すると考えられる。本明細書中で使用する用語「混合する（to mix）」、「混合（mixing）」又は「混合物（mixture(s)）」は、基質（即ちL-アルギニン）及び作用物質（即ちHm g-CoAレダクターゼ抑制薬）を混合することを意味する。即ち、１）投与前に混合する（「試験管内混合」）、２）同時及び／又は連続的だが別個に（即ち別個の静脈内のラインに）基質を投与して混合する（L-アルギニン及び作用物質の「生体内混合」）、及び、３）NOS基質で飽和させた後でNOS作用物質を投与する（即ち、NOS作用物質（ニトログリセリン又はHmg-CoAレダクターゼ）を投与する前にL-アルギニンを投与して体内供給量を増加する）、又は、血管の疾患の治療に対し付加的又は相乗的（synergistic）方法でNOS作用物質及びNOS基質の治療の量の組合せとなる前記１）〜３）のあらゆる組合せを意味する。用語「作用物質（agonist）」は、酵素活性又は増大する遺伝子発現のいずれかにより例えばEDNO又はEDRFに対するL-アルギニン等の基質（即ち蛋白質レベルの増大したcNOS）の生体内変化を刺激する製剤を意味する。勿論、前記化学的機構のいずれか又は両方を同時進行させてもよい。本発明の一目的は、基質が内因性（endogenous）一酸化窒素又は「固有」一酸化窒素へ生体内変化することによって進行する疾患条件を予防、治療、抑制又は改善する方法を提供することにある。本発明の他の目的は、L-アルギニンがNOSの酵素活性により「固有」一酸化窒素へ生体内変化することによって進行する疾患条件を予防、治療、抑制又は改善する方法を提供することにある。本発明の他の目的は、頻脈（tachycardia）を改善又は回避すると共に、虚血（ischemia）を予防又は治療することにある。本発明の他の目的は、「固有」一酸化窒素の生成量を増加又は最大化することにより疾患条件を治療する際の有益な効果を達成し、死亡率を含む臨床の終端を低減することにある。本発明の他の目的は、血液流が突然回復した生体の再環流損傷（reperfusion injury）を防止することにある。本発明の更に他の目的は、動脈硬化（arteriosclerosis）、アンギーナ(angin a）、心筋梗塞（myocardial infarction）、冠状動脈血栓症（coronary thrombo sis）、血管形成後の再狭窄（restenosis post angioplasty）及び突然死を含む高血圧症（hypertension）、高血圧性心臓病（hypertensive heart disease）、冠状血管性心臓病（coronary heart disease）並びに広範囲の心血管の疾患（心不全、脈拍及び末梢血管の疾患）及び腎血管（renovascular）の虚血／高血圧症の治療のために、Hmg-CoAレダクターゼ抑制薬及びL-アルギニンの生物学的均等物の混合薬を提供することにある。本発明の前記目的及び他の目的は、後述する１又は２以上の実施の形態の説明から明らかとなろう。本発明の一実施の形態では、それぞれ治療学的に効果的な量のEDNOの前駆体及びNOS作用物質を生体へ投与する前に混合する。本発明の他の実施の形態では、それぞれ治療学的に効果的な量のEDNOの前駆体及びNOS作用物質を別個に投与しかつ「生体内で」混合する。本発明による他の実施の形態では、それぞれ治療学的に効果的な量のL-アルギニン及びHmg-CoAレダクターゼ抑制薬を生理学的に許容できるpHで混合して生体（患者）に投与する。本発明による他の実施の形態では、血管拡張又は血管緊張低下による生体の高血圧症の治療法は、高血圧症生体を選択する過程と、L-アルギニン及びHmg-CoA レダクターゼ抑制薬を生体に投与する過程と、周期的に生体の血圧を測定する過程と、生体に望ましい血圧又は治療の効果が現れるまでL-アルギニン及びHmg-Co Aレダクターゼ抑制薬の投与を継続する過程とを含む。高血圧症生体の望ましい血圧は、最終的に下記範囲内、即ち、血管収縮期では好ましくは９５〜１８０mm Hgの範囲、より好ましくは１０５〜１６５mmHgの範囲、更に好ましくは１２０〜１４０mmHgの範囲であり、血管拡張期では好ましくは５５〜１１５mmHgの範囲、より好ましくは６５〜１００mmHgの範囲、更に好ましくは７０〜９０mmHgの範囲、最も好ましくは７５〜８５mmHgであることを要する。いかなる場合にも血管収縮期に９５mmHgを下回ることは認められない。本発明による他の実施の形態では、血管拡張又は血管緊張低下による非高血圧症生体の心血管の疾患の予防法又は治療法は、生体を選択する過程と、Hmg-CoA レダクターゼ抑制薬及び一酸化窒素の内皮依存供給源（即ちL-アルギニン）の混合薬を含む製剤を生体に投与する過程と、生体の血管緊張低下を周期的に測定する過程と、生体の血管緊張低下の望ましい状態又は望ましい治療の効果が現れるまで製剤の投与を継続する過程とを含む。望ましい血管緊張低下の状態とは、例えば収縮期で約２０mmHg低下した状態、拡張期に約１０mmHg低下する状態をいう。いかなる場合にも収縮期に９５mmHgを下回ることは認められない。更に他の実施の形態では、生体中のcNOSの刺激方法は、生体を選択する過程と、L-アルギニン及びHmg-CoAレダクターゼ抑制薬の混合薬を含む製剤を生体に投与する過程とを含み、「固有」NOの生成量を最大化しかつ死亡率を含む終端を低減する。図面の簡単な説明図１は、提案されたNOS活性化経路の概要図である。図２は、プラバスタチン（pravastatin）によるNOSの刺激を示す棒グラフである。好適な実施の形態の詳細な説明本明細書に記載するデータでは、Hmg-CoAレダクターゼ抑制薬は高血圧症及び心血管の疾患の治療に二重の適用可能性があり、コレステロールの内因性生合成の抑制薬として及び一酸化窒素シンターゼの作用物質又は刺激剤としての両方の役割を果たすと考えられる。Hmg-CoAレダクターゼが一酸化窒素シンターゼの作用物質又は刺激剤となり得る事実は注目すべき示唆を含む。「試験管内」又は「生体内」でHmg-CoAレダクターゼ抑制薬をL-アルギニンと混合することにより、過剰のL-アルギニンが一酸化窒素シンターゼの追加の基質を供給すると共に、NO SがL-アルギニンの一酸化窒素への生体内変化を増大する酵素触媒作用を受けるために起こると考えられる予想外の有益な効果が得られることが判明した。 NO生成によって明らかに影響を受ける全疾患又は条件を予防、治療、抑制又は改善するために、過剰のL-アルギニン又は他の固有NO（EDRF又はEDNO）の基質前駆体の存在下でのNOSの刺激を使用できる。その条件として、非高血圧性の心血管・脳血管・腎血管の疾患のみならず、高血圧性の心血管・脳血管・腎血管の疾患及び症状が含まれる。この混合薬は特に固有NO生成の必要な患者（生体）に役立つ。この混合薬は以下に有効に適用できる：（１）慢性の安定なアンギーナ；（２）不安定なアンギーナ；（３）急性心筋梗塞（Acute myocardial infarctio n）；（４）冬眠状態の心筋（Hibernating myocardium）；（５）気絶状態の心筋（Stunned myocardium）；（６）心筋梗塞後の心室の回復（ventricular remo deling）の限界及び後続の鬱血性心不全（congestive heart failure）の危険；（７）再発性心筋梗塞の予防（Prophylaxis of recurrent myocardial infarcti on）；（８）心筋梗塞による突然死の防止；（９）血管痙攣性アンギーナ（Vaso spastic angina）；（１０）前記１〜６の収縮期の鬱血性心不全；（１１）前記１〜１０及び後記１２〜１５の弛緩期の鬱血性心不全；（１２）前記１〜１１及び後記１５、１６の微小血管アンギーナ；（１３）前記１〜１２及び後記１５、１６の無症候性虚血（Silent ischemia）；（１４）前記１〜１３及び後記１５の心室異所性活性の低下（Reduction of ventricular ectopic activity）；（１５）高血圧性心臓病と連携しかつ冠状血管拡張薬の保有量を損なう虚血性心筋（ischemic myocardium）の前記１〜１４の状態のいずれか又は全て；（１６）高血圧症による危機、手術による高血圧（perioperative hypertension）、本態性一次性高血圧（essential hypertension）及び二次性高血圧（secondary hype rtension）の治療中の血圧制御；（１７）前記１５、１６の左心室肥大の回帰（ Regression of left ventricular hypertrophy）；（１８）前記１〜１７の心外膜の冠状動脈硬化症（epicardial coronary arteriosclerosis）の予防及び／又は回帰；（１９）血管形成後の再狭窄（restenosis post angioplasty）の予防；（２０）前記１〜１９の再環流損傷に媒介されたフリーラジカルの予防及び／又は改善；（２１）冠状動脈のバイパスにより心臓麻痺（cardioplegic）を抑制する間又は他の心臓外科手術中での心筋損傷（myocardial injury）の予防に対する併用、即ち心臓麻痺の解決策に対する併用；（２２）移植後の心筋症（Post transplant cardiomyopathy）；（２３）腎血管の虚血（Renovascular i schemia）：（２４）脳血管の虚血（Cerebrovascular ischemia）（一過性虚血発作（Transient Ischemic Attack，ＴＩＡ）及び脈拍）；及び（２５）肺の高血圧症（Pulmonary hypertension）。血管の平滑筋細胞は主として静脈、動脈及び冠状動脈に存在する。以下、血管拡張薬によって刺激された平滑筋及びミオサイトの弛緩に焦点を当てて説明する。前記のように、細胞中の一酸化窒素シンターゼは通常cNOS、即ち構成形態の一酸化窒素シンターゼであり、発生細胞は内皮細胞、標的細胞は血管の平滑筋細胞である。図１は概略図であり、種々の作用位置間の細胞の関連性又は組織的配列（geography）を示すのではなく、それらの機能の関連性を示す。使用する原則的組合せは、水中にそれぞれ治療濃度のL-アルギニン及びHmg-Co Aレダクターゼ抑制薬を含む混合薬である。どんな製薬等級のL-アルギニンでも十分であるが、好ましくは２.５〜６０%w/v(g/ml)、より好ましくは５〜４５%w/ v(g/ml)、更に好ましくは７.５〜３０%w/v(g/ml)、更により好ましくは１０〜１５%w/v(g/ml)、そして最も好ましくは１０%のw/v(g/ml)まで、それぞれL-アルギニンを希釈する。予想される一般的な薬量は無菌水（sterile water）中にＬ− アルギニン３０ｇである（全体積３００cc）。Ｌ−アルギニンでは、「塩酸塩：塩基としてのＬ−アルギニン」は、最終的に約１０：１から約２５：１、より好ましくは１５：１から２０：１、最も好ましくは１５：１と予想される。この例では、Ｌ−アルギニンの２８〜２９ｇは塩酸塩、１〜２ｇは塩基である。 L-アルギニンは、実質的にHmg-CoAレダクターゼ抑制薬として公知の種類の物質と併用してもよい。本発明による製剤に関連する使用に最適な特定のHmg-CoA レダクターゼ抑制薬は、シンバスタチン（simvastatin）、ロバスタチン（lovas tatin）、プラバスタチン（pravastatin）、コンパクチン（compactin）、フルバスタチン（fluvastatin）、ダルバスタチン（dalvastatin）、HR-７８０、GR ９５０３０、CI９８１、BMY２２０８９及びBMY２２５６６から成る群より選択される。前記多数のHmg-CoAレダクターゼ抑制薬を示す米国特許第５３１６７６５号を全体として引用する。特に好適な本発明の実施の形態では、使用するHmg-Co Aレダクターゼ抑制薬はプラバスタチン又はロバスタチンである。更に好適な本発明の実施の形態はHmg-CoAレダクターゼ抑制薬プラバスタチンの投与を含む。「混合薬」の一部として、Hmg-CoAレダクターゼ抑制薬をL-アルギニンに含ませるが、臨床上効果的な重量比は１：２から１：１５０である。特に、製剤中の Hmg-CoAレダクターゼ及びL-アルギニンの比は１：５から１：１００である。「混合薬」の最適な実施の形態では、Hmg-CoAレダクターゼ抑制薬（特にプラバスタチン）のL-アルギニンに対する比は１：５０である。Hmg-CoAレダクターゼ抑制薬のL-アルギニンに対する比の範囲は、実質的にあらゆるHmg-CoAレダクターゼ抑制薬に適用できる。特定のHmg-CoAレダクターゼ抑制薬がプラバスタチンの場合、プラバスタチンのL-アルギニンに対する比（重量：重量）は１：２から１：５０の範囲が好ましい。例えば、１：２のプラバスタチン／L-アルギニンはプラバスタチン４０mg/ 日及びL-アルギニン８０mg/日を含有する。例えばプラバスタチン／L-アルギニンの比が１：２０の場合、プラバスタチン２０mg/日をL-アルギニン４００mg/日と共に投与することになろう。Hmg-CoAレダクターゼ抑制薬、ロバスタチン及びプラバスタチンに関し本明細書で記載する成分重量比を全Hmg-CoAレダクターゼ抑制薬に適用できる。前記の分量が効果的であることが判明したが、投与する経路（即ち、IV、口腔（oral）、皮膚通過（transdermal）等）はそれぞれ必要に応じて変化する。更に、本明細書で開示する「混合薬（混合物）」は、継続的な毎日及び／又は毎月の養生法の一部として投与される相対濃度（グラム）により記載できる。特定の一実施の形態では、毎日の薬量として、１日当たり２０〜４０mgのHmg-CoA レダクターゼ抑制薬（即ちプラバスタチン）を１日当たり１００〜２００mgのL- アルギニンと共に患者に製剤を投与する。最も好ましくは、毎日の薬量として、１日当たり約２０mgのロバスタチン等のHmg-CoAレダクターゼ抑制薬を１日当たり約２００mgのL-アルギニンと共に投与する。請求の範囲に記載された本発明による製剤の特定の実施の形態では、製剤の効率的なレベルを患者内で維持する必要がある。単なる例示として、種々のHmg-CoAレダクターゼ抑制薬のリストを表１に示す。これらの物質はHmg-CoAを抑制する効能及び能力が異なる。表１シンバスタチンロバスタチンプラバスタチンコンパクチン（別名メバスタチン（mevastatin））フルバスタチンダルバスタチン GR９５０３０ HR７８０ SQ３３６００ BMY２２０８９ BMY２２５６６ CI９８１また、本発明のHmg-CoAレダクターゼ抑制薬は、高コレステロール血症抑制剤（anti-hypercholesterolemic）として及びHmg-CoAレダクターゼの競合的抑制剤として肝臓の低密度リポ蛋白質（LDL）のレセプタ媒介クリアランスを刺激する能力を特徴とする。使用するHmg-CoAレダクターゼ抑制薬は、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、XU-６２-３２０（ナトリウム３.５-ジヒドロキシ-７[３-(４-フルオロフェニル)-１(メチルエチル)-IH-インドール−２イル]-ヘプト-６-エノアート)、メバスタチン（別名コンパクチン）、BNY２２０８９、CI９８１、SQ３３６００、BMY２２０８９、CI９８１、HR７８０、SQ３３６００又はHmg-CoAレダクターゼを抑制する他のいかなる種類の化合物でもよい。ロバスタチン、シンバスタチン及びプラバスタチンの調製法は特許文献に記載される。XU-６２-３２０（フルバスタチン）の調整法はWIPO特許国際公開第WO８４／０２１３１号公報に記載される。また、BMY２２０８９（１３）、CI９８１（１４）、HR７８０（１５）及びSQ3３６００（１６）は本明細書で引用する文献に記載され、前記Hmg- CoAレダクターゼ抑制薬の化学構造及び合成法を更に充分に説明するため当該文献を特に関連付けて引用する。これらの調整法について本明細書で全体として引用する。また、例えばプラバスタチンナトリウム（メバスタチンの生体活性代謝産物）等の表１に列挙する化合物の生体活性代謝産物は、本発明による前記Hmg-CoAレダクターゼ抑制薬の範囲内に含まれる。表１に列挙するHmg-CoAレダクターゼ抑制薬化合物いずれか１種又は数種で、プラバスタチンをL-アルギニン又は内因性一酸化窒素の基質前駆体と混合して、治療学的に効果的な治療を患者に行ってもよい。今までは、L-アルギニンの「固有」一酸化窒素への生体内変化と、高コレステロール血症を抑制する（anti-hypercholesterolemic）Hmg-CoAレダクターゼ抑制薬との間に関連付けが存在しなかった。しかしながら、現時点で、Hmg-CoAレダクターゼ抑制薬はcNOS刺激効果を有すると確信できる。化学的メカニズムは必ずしも充分に解明されている訳ではないが、Hmg-CoAレダクターゼ抑制薬及びL-アルギニンの混合薬がcNOS刺激に今まで予想できなかった協働効果を発揮することが考えられる。cNOSの刺激は、NOを刺激する出来事の連鎖を開始するHmgレダクターゼ抑制薬又はHmg-CoAレダクターゼ抑制薬の特有なレセプタサイトを有するｃNOSの結果となり得る。また、２つを投与することにより、同時にNOSの酵素活性を刺激する一方でL-アルギニンを過剰に加えるので、L-アルギニンのcNOS過程に適切な基質が提供される。協働効果又は付加的効果であるかに関係なく、「固有」一酸化窒素の前駆体基質をHmg-CoAレダクターゼ抑制薬と「混合」すると、今まで予想できなかったNO生成の増加が起こることが明らかとなった。以下、この予想外の作用を実施例について説明する。実施例オキシヘモグロビンのメトヘモグロビンへの変化を検出する高感度光度測定分析法により、ウシ大動脈内皮細胞（bovine aortic endothelial cells，BAEC）中のNO生成へのアセチルコリン（acetylcholine）及びプラバスタチンの直接的効果を決定した。NO酸化は、オキシヘモグロビン（HbO₂）のメトヘモグロビン（ metHb）への反応として「HbO₂＋NO→metHb＋NO₃」のように進行する。HbO₂が metHbに酸化する吸光度の変化を測定することによって、内皮細胞によるNOの生成量を定量した。オキシヘモグロビンは４１５nmに吸光度のピークを有し、metH bは４０６nmに吸光度のピークを有する。HbO₂からmetHbの吸光度を差し引くことにより、NO濃度を評価できる。一般的な方法は、フェーリッシュ他（Feelisch e t al.）の手法に倣った（「生化学及び生物物理学研究情報（Biochem．and Biop hy．Res．Comm.）」１９９１年；第１８０号NcI：第２８６頁〜第２９３頁）。この分析のため、ウシの大動脈から内皮細胞を分離した。ペニシリンG（１００ml^-1）、ストレプトマイシン（１００mg/ml）、グルタミン（１００mg/ml）、チミジン（１００mg/ml）及び１０%ウシ胎児血清（ギブコ（Gibco））で満たしたメディア１９９を使用し、１５０mmの板（コーニング（Corning））上でBAEC を集密状態（confluency）に成長させた。集密状態で、１%リン酸緩衝塩／EDTA 溶液を用い細胞を２度洗浄した。トリプシン／EDTAを加え、板から離脱したとの合図として細胞が丸くなるまで細胞を３７℃に保持した。細胞を損傷するおそれのある更なるトリプシン活性を抑制するため、等量のトリプシン抑制薬を加えた。５分間、１５０〜２００ｇで回転させて細胞をペレット状に形成した。細胞を培地で再懸濁（resuspend）し、これらの細胞の約１０⁷を使用して０.５ｇのマイクロキャリアビーズ（サイトデックス３（Cytodex#3））に接種した。細胞、ビーズ及びメディアを回転フラスコ（ウィートン（Wheaton））へ移し、ここで培養物を３７℃で９５%O₂及び５%CO₂の下でかき乱すことなく２９分間静置し、その後同一環境の下で１分間回転させた（２０rpm）。この静置サイクルにより細胞をビーズに付着させ、回転により細胞及びビーズを均一に分配した。この付着時期（attachment phase）の４時間後、ビーズが均一に細胞を被覆するように回転フラスコを低速度の撹拌機上に２〜３日間放置した。ビーズ／細胞を２回濯ぎ、その後、必要な共同因子を全て含むヘペス緩衝クレプス−リンガー溶液（Hepes-buffered Krebs-Ringer solution）に懸濁させた。 NOとスーパーオキシド（O₂）との間の反応を防止するため、スーパーオキシドジスムターゼ（２００U/ml）を緩衝液に加えた。カタラーゼ（１００U/ml）を加えて水素ペルオキシダーゼを分解し、ヘモグロビンの活性状態を保持した。２mlの EC／ビーズを水ジャケット付クロマトグラフィコラム（ファーマシア（Pharmaci a））に配置し、３uMオキシヘモグロビンを含むヘペス緩衝クレプスーリンガー溶液で２ml/分で過融解（superfuse）させた。その後、二波長分光光度計の流動セル（flow-through cuvettte）に環流液（perfusate）を流して吸光度を測定し、基底状態及び刺激状態の各NO生成量を決定した。平行なコラム回路にビーズのみ（細胞なし）を充填し、このシステムの細胞が無い場合の基底状態及び自発的状態の各NO生成量を決定した。ビヒクル（作用物質のない緩衝液）を細胞−ビーズコラムに注入しても、ビヒクルの吸光度は変化しなかった。マイクロシリンジポンプを用いて速度４５ul/分で緩衝液環流にアセチルコリン（ACH）プラバスタチン（PRA）を３分間注入して実験的刺激を与え、最終的な緩衝液の濃度をACHについて１０^-6及び１０^-5M、PRAについて１０^-6及び１０^-5M とした。これらの試薬の作用の阻止におけるL-NAME（N^G-nitro-L-arginine meth yl ester，N^G-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル）（１０^-3M）を含む緩衝液の効果と、続いてL-NAMEを含まず過剰のL-アルギニン（１０^-3M）を加えた緩衝液の逆L-NAME効果とを調べた。３つの緩衝液系の各々に対し、各試薬濃度を２倍とした。試薬の注入時間を１０分間とした。得られたデータは、この細胞環流及び監視システムが少なくとも４〜６時間安定した状態に維持されることを実証している。各実験の最後に、トリパンブルー排除法（trypan blue exclusion）により細胞生存度を検査した。分析のため、基準線レベルの上で各試薬により得られた吸光度反応／単位時間（分）のグラフ中で変化曲線の下部の面積を決定すると共に、吸光係数３９mM¹ を使用してmetHb生成量を計算した。３分間の試薬注入の間、吸光度は急速に増大した。基準線レベルに戻るまで反応のサイズに従い前記試薬の吸光度の変化を通常２〜８分間継続した。この反応の化学量論的バランスは公知であり、NO及び metHb生成量について一対一対応すると仮定した。また、各緩衝液系に対する環流間の基底状態のNO生成変化を決定した。いずれかの薬剤により誘導された反応から基底状体のNOの値を減じて、薬剤の作用によるNO生成量を決定した。表２は以上の実験結果を示す。表２基礎緩衝液１０^-3M L-NAME １０^-3M L-アルギニン（NOの絶対生成量単位：nmole*分）１０^-6M Ach １９７.６０７２.２０３３０.６０１０^-5M Ach ６１９.４０２８８.８０７５６.２０１０^-6M Prav １６３.４０４５.６０２０１.４０１０^-5M Prav ５１３.００２０９.００７５２.４０図２は、１）制御（基礎）緩衝液中の１０^-5MのL-アルギニン、２）緩衝液中の１０^-3MのL-NAME及び３）緩衝液中の１０^-3MのL-アルギニンと共に、アセチルコリン及びプラバスタチン（１０^-5及び１０^-5M）をNO生成の細胞／ビーズ環流系に３分間投与して発生した効果を示すデータの棒グラフである。基底状態レベル上のNO生成量の一過性の高さで反応度を示す。制御緩衝液（１００%）に対する反応度のパーセントとしてL-NAME及びL-アルギニンを増加した緩衝液の反応のデータを示し、基礎緩衝液の棒グラフ中の数は単位nmole（ナノモル）*分でのNO の絶対生成量を示す。残り２つの棒グラフは、基礎緩衝液に対するL-NAME緩衝液及びL-アルギニン添加緩衝液の反応度の相違を示す。 NO生成での内皮細胞の活性に対するプラバスタチンの効果を、NOS活性によってNO生成を特に刺激することで知られるアセチルコリンと比較した。ビーズ上で成長させたウシ大動脈内皮細胞（BAEC）の過融解緩衝液にアセチルコリンを添加すると、オキシヘモグロビンのメトヘモグロビンへの酸化によって測定されるように、NO生成量が増大した（図２）。アセチルコリンでは、濃度に対して基準線レベル上でNO生成量が過渡的に増加した。５×１０^-5MのL-アルギニンを含む基礎緩衝液中で、１０^-5MのL-アルギニンの間のNO生成量は約２倍に増加し、１０^- ⁵ 及び１０^-6Mのアセチルコリンの間のNO生成量は約２倍に増加した。続いて１０^-3 MのL-NAMEを含む緩衝液でこれらの細胞を処理すると、アセチルコリンによって誘導されたNO生成量は８０%も激減した。増量したL-アルギニンを含む（１０^- ³ M）他の液にこのL-NAME緩衝液を置き換えると、アセチルコリンにより惹起されたNO生成量は制御レベルに戻った。また、プラバスタチンでは、基準線レベル上でNO生成量が濃度に対応して増加した。アセチルコリンと比較して、プラバスタチン（〜３ X）の１０^-5M濃度に応答した大きな増加が見られた。また、L-NAME（１０^-3M）での細胞懸濁の過融解により、プラバスタチンに応答してNO生成量が鈍化した。これは、NO生成量の少なくとも一部がNOS活性によるものであることを示唆している。続いてL-アルギニン１０^-3Mを含む緩衝液で細胞を環流すると、NO生成量は、制御（基準）緩衝液中でプラバスタチンによって誘導される量より上のレベルへ戻った。このようなL-アルギニン添加後のプラバスタチンへの反応の復旧は、アセチルコリンの場合に比べて大きかった。細胞無しでビーズだけを含む環流系ヘプラバスタチン又はアセチルコリンを投与しても、metHb/NO生成は誘発されなかった。表２及び図２に示すように、プラバスタチンは、コレステロール生合成に対する抑制効果から独立して米国特許第５５４３４３０号に記載された他のNOS作用物質と殆ど同じ要領でcNOSを刺激すると考えられる。好適な方法を詳細に説明したが、本明細書に添付した請求の範囲によって画定されるように、本発明では種々の変更、置換及び代替が可能であることを理解されたい。例えば、他のcNOS作用物質を識別（identify）してもよい。予備データによりエストロゲンがNOS作用物質として機能しうることが示されたため、製剤の一例としてエストロゲン及びL-アルギニンの混合薬が考えられる。本発明は添付の請求の範囲により定まる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年４月１日（１９９９．４．１）【補正内容】請求の範囲１．生体を選択する過程と、 L-アルギニン及びHmg-CoAレダクターゼ抑制薬の混合薬を投与する過程と、生体の血管緊張低下の周期的な指標（indicator）を得る過程と、血管緊張低下の望ましい状態が得られるまで混合薬の投与を継続する過程とを含み、 Hmg-CoAレダクターゼ抑制薬は、ロバスタチン（lovastatin）、プラバスタチン（pravastatin）、シンバスタチン（simvastatin）、フルバスタチン（fluvas tatin）、ダルバスタチン（dalvastatin）、コンパクチン（compactin）、HR７８０、BMY２２０８９、BMY２２５６６、SQ３３６００，GR９５０３０及びCI９８１から成る群より選択されることを特徴とする血管拡張又は血管緊張低下による生体中の疾患条件の治療法。２．静脈内に（intravenously）、頬内に（buccal）、冠状動脈内に（intra coronary）、筋肉内に（intramuscularly）、局所的に（topically）、鼻腔内に（intranasally）、直腸内に（rectally）、舌下に（sublingually）、口腔に（ orally）、皮下に（subcutaneously）又はパッチ若しくは吸入により製剤を投与する請求項１に記載の方法。３．前記疾患は、高血圧症（hypertension）、高血圧性心臓病（hypertensi ve heart disease）、冠状動脈性心臓病（coronary heart disease）、心血管の疾患（cardiovascular disease）、脳血管の疾患（cerebrovascular disease）、及び腎血管の疾患（renovascular disease）である請求項１に記載の方法。４．前記冠状動脈性心臓病は血管形成後の再狭窄（restenosis post angiop lasty）である請求項３に記載の方法。５． L-アルギニン及びHmg-CoAレダクターゼ抑制薬を生体内で混合する請求項１に記載の方法。６． L-アルギニン及びHmg-CoAレダクターゼ抑制薬を治療濃度で投与する請求項５に記載の方法。７． L-アルギニンの治療濃度は７.５%から約３０%w/v(g/ml)である請求項６に記載の方法。８． L-アルギニンの治療濃度は１０%から約１５%w/v(g/ml)である請求項６に記載の方法。９． L-アルギニンの治療濃度は１０%w/v(g/ml)である請求項６に記載の方法。１０． pH６〜８.０の範囲内に保持する請求項６に記載の方法。１１． pH７〜７.４の範囲内に保持する請求項６に記載の方法。１２． Hmg-CoAレダクターゼ抑制薬はプラバスタチンである請求項１に記載の方法。１３． Hmg-CoAレダクターゼ抑制薬及びNOS基質（substrate）の混合薬であり、NOS基質はアルギニンの生物学的均等物であり、Hmg-CoAレダクターゼ抑制薬は、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、ダルバスタチン、コンパクチン、HR７８０，BMY２２０８９、BMY２２５６６、SQ３３６００、GR9５０３０及びCI９８１から成る群より選択されることを特徴とする治療混合薬。１４． Hmg-CoAレダクターゼ抑制薬はNOS作用物質である請求項１３に記載の治療混合薬。１５． Hmg-CoAレダクターゼ抑制薬はプラバスタチンである請求項１３に記載の治療混合薬。１６． Hmg-CoAレダクターゼ抑制薬はプラバスタチンであり、アルギニンの生物学的均等物はL-アルギニンである請求項１３に記載の治療混合薬。１７． L-アルギニンと異なりかつロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、ダルバスタチン、コンパクチン、HR７８０、BMY２２０８９、BMY２２５６６、SQ３３６００、GR９５０３０及びCI９８１から成る群より作用物質を選択し、一酸化窒素シンターゼレセプタサイトを有する生体にL- アルギニン及び一酸化窒素シンターゼの作用物質を投与する過程と、一酸化窒素シンターゼを一酸化窒素シンターゼの作用物質と同じ望ましいレベルまで刺激する過程とを含むことを特徴とする一酸化窒素シンターゼを刺激して一酸化窒素を生成する方法。１８． L-アルギニンは作用物質に対して過剰である請求項１７に記載の方法。１９．生体に投与する前に、治療学的に効果的な量のL-アルギニンを治療学的に効果的な量の作用物質と混合する請求項１７に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 31/44 Ａ６１Ｋ 31/44 31/662 31/662 45/00 45/00 Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 9/00 43/00 １１１ 43/00 １１１ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．生体を選択する過程と、 L-アルギニン及びHmg-CoAレダクターゼ抑制薬の混合薬を投与する過程と、生体の血管緊張低下の周期的な指標（indicator）を得る過程と、血管緊張低下の望ましい状態が得られるまで混合薬の投与を継続する過程とを含むことを特徴とする血管拡張又は血管緊張低下による生体中の疾患条件の治療法。２．静脈内に（intravenously）、頬内に（buccal）、冠状動脈内に（intra coronary）、筋肉内に（intramuscularly）、局所的に（topically）、鼻腔内に（intranasally）、直腸内に（rectally）、舌下に（sublingually）、口腔に（ orally）、皮下に（subcutaneously）又はパッチ若しくは吸入により製剤を投与する請求項１に記載の方法。３．前記疾患は、高血圧症（hypertension）、高血圧性心臓病（hypertensi ve heart disease）、冠状動脈性心臓病（coronary heart disease）、心血管の疾患（cardiovascular disease）、脳血管の疾患（cerebrovascular disease）、及び腎血管の疾患（renovascular disease）である請求項１に記載の方法。４．前記冠状動脈性心臓病は血管形成後の再狭窄（restenosis post angiop lasty）である請求項３に記載の方法。５． L-アルギニン及びHmg-CoAレダクターゼ抑制薬を生体内で混合する請求項１に記載の方法。６． L-アルギニン及びHmg-CoAレダクターゼ抑制薬を治療濃度で投与する請求項５に記載の方法。７． L-アルギニンの治療濃度は７.５%から約３０%w/v(g/ml)である請求項６に記載の方法。８． L-アルギニンの治療濃度は１０%から約１５%w/v(g/ml)である請求項６に記載の方法。９． L-アルギニンの治療濃度は１０%w/v(g/ml)である請求項６に記載の方法。１０． pH６〜８.０の範囲内に保持する請求項６に記載の方法。１１． pH７〜７.４の範囲内に保持する請求項６に記載の方法。１２． NOS作用物質（agonist）及びNOS基質（substrate）の混合薬であることを特徴とする治療混合薬。１３． NOS基質はL-アルギニンの生物学的均等物である請求項１２に記載の治療混合薬。１４． NOS作用物質はHmg-CoAレダクターゼ抑制薬である請求項１３に記載の治療混合薬。１５．作用物質は、ロバスタチン（lovastatin）、プラバスタチン（pravas tatin）、シンバスタチン（simvastatin）、フルバスタチン（fluvastatin）、ダルバスタチン（dalvastatin）、コンパクチン（compactin）、HR７８０、BMY ２２０８９、BMY２２５６６、SQ３３６００、GR９５０３０及びCI９８１から成る群より選択される請求項１４に記載の治療混合薬。１６． L-アルギニンと異なりかつロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、ダルバスタチン、コンパクチン、HR７８０、BMY２２０８９、BMY２２５６６、SQ３３６００、GR９５０３０及びCI９８１から成る群より作用物質を選択し、一酸化窒素シンターゼレセプタサイトを有する生体にL- アルギニン及び一酸化窒素シンターゼの作用物質を投与する過程と、一酸化窒素シンターゼを一酸化窒素シンターゼの作用物質と同じ望ましいレベルまで刺激する過程とを含むことを特徴とする一酸化窒素シンターゼを刺激して一酸化窒素を生成する方法。１７． L-アルギニンは作用物質に対して過剰である請求項１６に記載の方法。１８．生体に投与する前に、治療学的に効果的な量のL-アルギニンを治療学的に効果的な量の作用物質と混合する請求項１６に記載の方法。