JP2001522354A - 平滑筋腫を治療および診断するための方法およびキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、特定のメタロプロテイナーゼを阻害する１種の作用物質もしくはあるいは複数の作用物質の治療上有効な量を被験体に投与することを含んで成る、平滑筋腫に罹っている被験体の治療方法を提供する。本発明はさらに、ある被験体の腫瘍が平滑筋腫であるかどうかを決定する診断方法を提供する。本発明はさらに、本方法を実施するための製薬学的組成物およびキットを提供する。最後に、本発明は、ある作用物質があるメタロプロテイナーゼを特異的に阻害するかどうかの決定方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 平滑筋腫を治療および診断するための方法およびキット 本発明は、国立保健研究所(the National Institute of Health)からの助成金 番号ＨＤ３０４９６での援助でなされた。従って、米国政府は本発明にある一定 の権利を有する。 発明の背景 本明細書を通じて、多様な刊行物がアラビア数字により引用される。これらの 刊行物の開示は、これにより、本発明が関する技術状態をより完全に記述するた めに本明細書に引用により組み込まれる。 子宮平滑筋腫（類線維腫としてもまた知られる）は女性における最も普遍的な 骨盤の非悪性腫瘍であり、生検で実施される調査によれば、罹患率は生殖年齢の 女性の臨床診断における20％〜30％から生検で実施される研究における50％まで の範囲にわたる（１）。子宮類線維腫は異常な子宮出血および骨盤の圧もしくは 痛みを引き起こす。現在、子宮摘出が平滑筋腫の唯一の治療法であるが、とは言 え、最近の研究は、ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニストもしくは抗プロゲス テロンＲＵ４８６のようなホルモン療法が子宮平滑筋腫の大きさを34％〜61％減 少させ得ることを示した（２−５）。臨床上の婦人科学における平滑筋腫の大き な重要性にもかかわらず、それらの基本生物学およびそれらの成長の調節につい てほとんど知られていない。 子宮平滑筋腫は単一細胞から生じ、そして生じる腫瘍は迅速に成長しかつ過剰 な細胞外マトリックス形成後に線維性となる。個々の類線維腫の分析は、腫瘍内 の細胞が、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの１種の変異体、ホスホグ リセロキナーゼ、およびＸ染色体の同一の制 限断片長多形を表わすことを示し、これらの腫瘍が単細胞起源を有することを実 証する（６−８）。臨床報告は、平滑筋腫が、とりわけプロゲスチン、クロミフ ェンもしくはタモキシフェン療法の間に迅速に成長し得ることを示した（９，１ ０）。この腫瘍の線維性の性質は大量の細胞外マトリックス沈着物の結果として 発生し、それは子宮筋層が含有するより大きな濃度のコラーゲンおよびプロテオ グリカンを含有する（６，１１）。子宮平滑筋腫の細胞外マトリックスの増大さ れた沈着物の存在は、マトリックス形成および再造形(remodelling)に関与する 調節機構が不適切に制御されうることを示唆する。 マトリックスメタロプロテイナーゼは、再造形が起こる場合に月経周期の期の 間に正常な子宮内膜の上皮および間質双方の層中に存在することが示されている 酵素である。ストロメライシン−１、ストロメライシン−２、ストロメライシン −３およびマトリライシンを包含するいくつかのメタロプロテイナーゼのｍＲＮ Ａのレベルがその周期の後期分泌月経期および早期増殖期の間に子宮内膜中で上 昇することが示されてきた（１２−１４）。子宮内膜におけるメタロプロテイナ ーゼの発現は生殖腺ステロイドにより調整されかつこれに依存性であることが一 般に受け入れられる。 子宮内膜の生殖腺ステロイド依存性の成長に類似に、子宮筋層の成長は、エス トロゲンおよびプロゲステロンレベルの変化により影響を受ける。低エストロゲ ン状態を誘発するようにＧｎＲＨアゴニストで患者を治療することにより生殖腺 ステロイドを除去することは、類線維腫および子宮全体の大きさの低下をもたら す一方で、ＧｎＲＨ療法を中断することは平滑筋腫および子宮の再生をもたらし た（２，３）。プロゲステ ロンもまた子宮類線維腫の成長を促進することが示され（１５）、また、抗プロ ゲステロンＲＵ４８６での治療は類線維腫の大きさを49％減少させることが示さ れた（５，１６）。正常のもしくは異常な子宮筋層におけるメタロプロテイナー ゼの関与は未知である一方、メタロプロテイナーゼは、平滑筋腫のステロイド依 存性の成長および子宮筋層に比較して平滑筋腫での異所性の細胞外マトリックス 形成に関連する。 内在性のメタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ）は、多くの研 究で、メタロプロテイナーゼの触媒活性を阻害することが示された。メタロプロ テイナーゼ発現の増大は、しばしば、関節炎（１７，１８）および浸潤癌（１９ ，２０，２１）を包含するいくつかの疾患での低レベルのＴＩＭＰ発現と整合す る。女性の子宮内膜におけるＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２のｍＲＮＡのレベ ルは、月経周期の後期分泌および月経の期の間に子宮内膜の間質および上皮中で 上昇される（１３，２２）。メタロプロテイナーゼは月経周期のこれらの段階の 間に上昇されることもまた報告されているとは言え、メタロプロテイナーゼに対 するＴＩＭＰの比は、所定の組織での組織再造形の程度の決定において決定的で ありうる。平滑筋腫および冒されていない子宮筋層におけるＴＩＭＰ−１および ＴＩＭＰ−２のレベルは現在のところ未知である。 従って、当該技術から、平滑筋腫のステロイド依存性の成長、およびさらに子 宮筋層に比較して平滑筋腫での細胞外マトリックス形成の正常な調節の欠如によ り証明されるように、当業者は、メタロプロテイナーゼが平滑筋腫形成に関与す るという可能性を推測しうる。 しかしながら、この可能性および子宮内膜再造形におけるメタロプロテイナー ゼの役割にもかかわらず、当業者は、メタロプロテイナーゼが 一般に平滑筋腫形成に関与することを正当に期待し得なかった。さらに、当業者 は、あるメタロプロテイナーゼかつ他ではないものが平滑筋腫形成に関与するこ とを正当に期待し得なかった。 発明の要約 本発明は、ストロメライシン−２、ストロメライシン−３およびマトリライシ ンから成る群から選択される最低１種のメタロプロテイナーゼを特異的に阻害す る作用物質の治療上有効な用量を被験体に投与することを含んで成る、平滑筋腫 に罹っている被験体の治療方法を提供する。 本発明はまた、ストロメライシン−２、ストロメライシン−３およびマトリラ イシンから成る群から選択される最低１種のメタロプロテイナーゼを特異的に阻 害する作用物質、ならびに製薬学的に許容できる担体を含んで成る、平滑筋腫に 罹っている被験体を治療するための製薬学的組成物も提供する。 本発明はさらに、本製薬学的組成物の治療上有効な用量を被験体に投与するこ とを含んで成る、平滑筋腫に罹っている被験体の治療方法を提供する。 本発明はさらに、そのそれぞれがストロメライシン−２、ストロメライシン− ３およびマトリライシンから成る群から選択される最低１種のメタロプロテイナ ーゼを特異的に阻害する複数の作用物質の治療上有効な用量を被験体に投与する ことを含んで成る、平滑筋腫に罹っている被験体の治療方法を提供する。 本発明はさらに、そのそれぞれがストロメライシン−２、ストロメライシン− ３およびマトリライシンから成る群から選択される最低１種のメタロプロテイナ ーゼを特異的に阻害する複数の作用物質、ならびに製 薬学的に許容できる担体を含んで成る、平滑筋腫に罹っている被験体を治療する ための製薬学的組成物を提供する。 本発明はさらに、本製薬学的組成物の治療上有効な用量を被験体に投与するこ とを含んで成る、平滑筋腫に罹っている被験体の治療方法を提供する。 本発明はさらに、（ａ）被験体から腫瘍のサンプルを得ること；（ｂ）サンプ ル中に存在する最低１種のメタロプロテイナーゼの量を測定すること、ここでメ タロプロテイナーゼはストロメライシン−２、ストロメライシン−３およびマト リライシンから成る群から選択されるものである；そして（ｃ）段階（ｂ）で測 定された各メタロプロテイナーゼの量を既知の標準品と比較してそれによりその 腫瘍が平滑筋腫であるかどうかを決定すること、の段階を含んで成る、被験体の 腫瘍が平滑筋腫であるかどうかの決定方法を提供する。 本発明はさらに、（ａ）被験体から腫瘍のサンプルを得ること；（ｂ）サンプ ル中に存在する最低１種のメタロプロテイナーゼをコードするｍＲＮＡの量を測 定すること、ここでメタロプロテイナーゼはストロメライシン−２、ストロメラ イシン−３およびマトリライシンから成る群から選択されるものである；そして （ｃ）段階（ｂ）で測定された各メタロプロテイナーゼをコードするｍＲＮＡの 量を既知の標準品と比較してそれによりその腫瘍が平滑筋腫であるかどうかを決 定すること、の段階を含んで成る、被験体の腫瘍が平滑筋腫であるかどうかの決 定方法を提供する。 本発明はさらに、（ａ）被験体から採取された腫瘍サンプル中に存在するメタ ロプロテイナーゼの量を測定するのに適する作用物質であって、メタロプロテイ ナーゼはストロメライシン−２、ストロメライシン−３ およびマトリライシンから成る群から選択され；ならびに（ｂ）それと、段階（ ａ）で測定された各メタロプロテイナーゼの量が、その腫瘍が平滑筋腫であるか どうかを決定することを可能にするように比較され得る既知の標準品を含んで成 る、被験体の腫瘍が平滑筋腫であるかどうかの決定での使用のためのキットを提 供する。 本発明はさらに、（ａ）被験体から採取された腫瘍サンプル中に存在するメタ ロプロテイナーゼをコードするｍＲＮＡの量を測定するのに適する作用物質であ って、メタロプロテイナーゼはストロメライシン−２、ストロメライシン−３お よびマトリライシンから成る群から選択され；ならびに（ｂ）それと、段階（ａ ）で測定された各メタロプロテイナーゼをコードするｍＲＮＡの量が、その腫瘍 が平滑筋腫であるかどうかを決定することを可能にするように比較され得る既知 の標準品を含んで成る、被験体の腫瘍が平滑筋腫であるかどうかの決定での使用 のためのキットを提供する。 最後に、本発明は、ある作用物質がストロメライシン−２、ストロメライシン −３およびマトリライシンから成る群から選択される最低１種のメタロプロテイ ナーゼを特異的に阻害するかどうかの決定方法を提供し、これは、当該作用物質 が、（ａ）ストロメライシン−２、ストロメライシン−３もしくはマトリライシ ンの反応速度を最低50という係数だけ遅らせ、かつ、（ｂ）ストロメライシン− ２、ストロメライシン−３、マトリライシンならびにゼラチナーゼａおよびｂ以 外のいずれかのメタロプロテイナーゼの反応速度を25という係数を越えるだけ遅 らせないかどうかを決定することを含んで成り、それにより部分（ａ）および（ ｂ）の基準を満足する作用物質は、ストロメライシン−２、ストロメライシ ン−３およびマトリライシンから成る群から選択される最低１種のメタロプロテ イナーゼを特異的に阻害するものである。 図面の簡単な説明 図１Ａおよび１Ｂ これらの図はコラゲナーゼ、α−チューブリンおよびストロメライシンのノー ザンブロットを示す。図１Ａでは、冒されていない子宮筋層（Ｍ）および平滑筋 腫（Ｌ）からのサンプル（５μｇのポリアデニル酸化ＲＮＡ）を、２％ホルムア ルデヒド−アガロースゲルにより電気泳動し、そしてニトロセルロースに移した 。ブロットを、コラゲナーゼのｃＤＮＡ（ｐＣｏｌｌ−４からの1.5kb断片（下 の材料および方法を参照））でプロービングし、また、α−チューブリンで再プ ロービングした。2.9kbのバンドはコラゲナーゼのｍＲＮＡの既知の大きさに対 応し、また、1.2kbのバンドはα−チューブリンのｍＲＮＡの既知の大きさに対 応する。図１Ｂでは、図１Ａからのポリアデニル酸化ＲＮＡの同一サンプルおよ び２名の追加の患者からのＲＮＡを、上述されたと同一の方法に従いストロメラ イシンのｃＤＮＡ（ｐＳｔｒ−３３）でプロービングした。図２Ａ−２Ｄ これらの図は、臭化エチジウム染色により２％アガロースゲル上で検出された 増幅されたＭＭＰ産物を増幅周期の数の関数として示す。ストロメライシン−１ （図２Ａ）；ストロメライシン−２（図２Ｂ）；ストロメライシン−３（図２Ｃ ）；レーン１、ＲＴ反応からのｃＤＮＡが添加されず、ストロメライシン−３の ＰＣＲプライマーを35周期の間添加した；レーン１４、「ラダー(ladder)」＝10 0bpのＤＮＡラダーマーカー。マトリライシン（図２Ｄ）；レーン１、ＲＴ反応 からのｃＤＮＡが 添加されず、マトリライシンのＰＣＲプライマーを38周期の間添加した；レーン ７、８および９、それぞれ類線維腫、子宮筋層および子宮内膜からのＲＮＡを、 ランダムヘキサマーもしくはＭｕＬＶ逆転写酵素なしで逆転写酵素段階に添加し 、次いでマトリライシンのプライマーを38周期のＰＣＲの間に添加した；レーン １０、100bpのラダー分子量マーカー（ＲＴ−ＰＣＲについての詳細は下の材料 および方法に提供される）。 図３Ａ−３Ｅ 図３Ａは予測される制限酵素消化切断部位を示し（数字は完全長ｃＤＮＡのbp を示す）、また、図３Ｂ−３Ｅは、臭化エチジウムを含有する２％アガロースゲ ル上でのストロメライシン−１（図３Ｂ）、ストロメライシン−２（図３Ｃ）、 ストロメライシン−３（図３Ｄ）およびマトリライシン（図３Ｅ）の電気泳動後 の実際の制限消化物を示す。ラダー＝100bpのＤＮＡラダー。 図４Ａ−４Ｄ これらの図は、各患者から収集された子宮類線維腫、冒されていない子宮筋層 および子宮内膜からの、患者を合わせられた(matched)（すなわち同一患者から 得られた）代表的サンプル中のストロメライシン−１（図４Ａ）、ストロメライ シン−２（図４Ｂ）、ストロメライシン−３（図４Ｃ）およびマトリライシン（ 図４Ｄ）の発現の比較を示す。ラダー＝100bpのＤＮＡラダー；ｆｉｂ＝類線維 腫；ｍｙｏ＝子宮筋層；ｅｎｄｏ＝子宮内膜；ｐｒｏｌｉｆ＝月経周期の増殖期 ；ｓｅｃｒｅｔ＝月経周期の分泌期。 図５Ａ−５Ｂ これらの図は、22例の患者における子宮類線維腫、子宮筋層および子 宮内膜からのストロメライシン−２（図５Ａ）およびストロメライシン−３（図 ５Ｂ）発現の半定量分析を示す。示される値は、各患者について２回の別個の実 験的ＲＴ−ＰＣＲ測定からの各サンプルについてのβ−アクチン産物に関するス トロメライシン−２産物（図５Ａ）もしくはストロメライシン−３産物（図５Ｂ ）の比である。Ｐｒｏｌｉｆ、Ｐｒｏ＝月経周期の増殖期；Ｓｅｃｒｅｔ、Ｓｅ ｃ＝月経周期の分泌期。横線は平均値±ＳＥＭを表わす。 図６ この図は、子宮類線維腫、子宮筋層および子宮内膜からの患者を合わせられた 代表的サンプル中のメタロプロテイナーゼの組織インヒビター−２（ＴＩＭＰ− ２）の発現を示す。ラダー＝100bpのＤＮＡラダー；ｆｉｂ＝類線維腫；ｍｙｏ ＝子宮筋層、ｅｎｄｏ＝子宮内膜；ｐｒｏｌｉｆ＝月経周期の増殖期；ｓｅｃｒ ｅｔ＝月経周期の分泌期；ａｔｒｏｐｈ＝委縮性子宮。 図７ この図は、子宮平滑筋腫、子宮筋層および子宮内膜におけるＥＧＦのｍＲＮＡ 発現の比較を示す。各患者について２回の別個の実験的ＲＴ−ＰＣＲ測定からの ＴＩＭＰ−２産物のレベルを、同一の２回の実験のそれぞれから測定されたβ− アクチン産物のレベルに対し正規化した。示される値は、各サンプルについての 28周期の増幅後のβ−アクチン産物に対する30周期の増幅後のＴＩＭＰ−２産物 の比である。Ｐｒｏ＝月経周期の増殖期；Ｓｅｃ＝月経周期の分泌期。横線は平 均値±ＳＥＭを表わす。 発明の詳細な記述 本発明は、ストロメライシン−２、ストロメライシン−３およびマトリライシ ンから成る群から選択される最低１種のメタロプロテイナーゼを特異的に阻害す る作用物質の治療上有効な用量を被験体に投与することを含んで成る、平滑筋腫 に罹っている被験体の治療方法を提供する。 本明細書で使用されるところの「被験体」は平滑筋腫に感受性のマウスのよう ないずれかの動物を意味する。他の動物は、例として、ラット、イヌ、モルモッ ト、フェレット、ウサギおよび霊長類を包含する。好ましい態様においては、被 験体はヒトである。加えて、「平滑筋腫」は胃および子宮双方の平滑筋腫を包含 する。好ましい態様においては、平滑筋腫は子宮平滑筋腫である。 一態様において、本方法で使用される作用物質は小有機分子である。使用され うる小有機分子の例は、 ここで、Ｒ₂、ＸおよびＹはそれぞれＣＨ₂ＣＨＭｅ₂、ＨおよびＰｈであり、そ してＲ₁はＣＨ₂ＣＨＭｅ₂もしくはＣ−Ｃ₆Ｈ₁₁である、のようなイミダゾールヒ ドロキサメートを包含する。 別の態様において、作用物質はポリペプチドである。本発明で使用されうるポ リペプチドの例は、限定されるものでないが、少なくともマトリックスメタロプ ロテイナーゼインヒビターの部分を含んで成るポリペプチドを包含する。 本明細書で使用されるところの、作用物質がストロメライシン−２、ストロメ ライシン−３もしくはマトリライシンを「特異的に阻害する」 とは、それが酵素の反応速度を最低50という係数（「第一係数」）だけ遅らせ、 かつ、25という係数（「第二係数」）を越えるだけ、ストロメライシン−２、ス トロメライシン−３、マトリライシンならびにゼラチナーゼａおよびｂを除いた いずれかの他のメタロプロテイナーゼの反応速度を遅らせない場合をいう。別の 態様において、第一および第二係数はそれぞれ500および５である。好ましい態 様において、第一および第二係数はそれぞれ1000および１である。酵素反応速度 および酵素阻害の測定方法は当該技術分野の標準的なものである。 一態様において、当該作用物質は、ストロメライシン−２、ストロメライシン −３もしくはマトリライシンから選択される１種のメタロプロテイナーゼのみを 特異的に阻害する。別の態様において、当該作用物質は、ストロメライシン−２ 、ストロメライシン−３およびマトリライシンから成る群から選択される２種の メタロプロテイナーゼを特異的に阻害する。さらなる一態様において、当該作用 物質は、ストロメライシン−２、ストロメライシン−３およびマトリライシンの それぞれを特異的に阻害する。 本発明はまた、そのそれぞれがストロメライシン−２、ストロメライシン−３ およびマトリライシンから成る群から選択される最低１種のメタロプロテイナー ゼを特異的に阻害する複数の作用物質の治療上有効な用量を被験体に投与するこ とを含んで成る、平滑筋腫に罹っている被験体の治療方法も提供する。 本発明はさらに、ストロメライシン−２、ストロメライシン−３およびマトリ ライシンから成る群から選択される最低１種のメタロプロテイナーゼを特異的に 阻害する作用物質、ならびに製薬学的に許容できる担 体を含んで成る、平滑筋腫に罹っている被験体を治療するための製薬学的組成物 を提供する。 本発明はまた、そのそれぞれがストロメライシン−２、ストロメライシン−３ およびマトリライシンから成る群から選択される最低１種のメタロプロテイナー ゼを特異的に阻害する複数の作用物質、ならびに製薬学的に許容できる担体を含 んで成る、平滑筋腫に罹っている被験体を治療するための製薬学的組成物も提供 する。 製薬学的に許容できる担体は当業者に公知であり、そして、0.01〜0.1Mそして 好ましくは0.05Mリン酸緩衝液もしくは0.8％生理的食塩水を包含するがしかしこ れらに制限されない。加えて、こうした製薬学的に許容できる担体は、水性もし くは非水性の溶液、懸濁液および乳濁液であってよい。非水性溶媒の例は、プロ ピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およ びエチルオレエートのような注入可能な有機エステルである。水性担体は、水、 生理的食塩水および緩衝媒体を包含するアルコール性／水性の溶液、乳濁液もし くは懸濁液を包含する。非経口ベヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブド ウ糖(Ringer’s dextrose)、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液 もしくは固定油を包含する。静脈内ベヒクルは、液体および栄養素補充物(reple nisher)、リンゲルブドウ糖を基礎とするもののような電解質補充物などを包含 する。保存剤および例えば抗菌物質、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどの ような他の添加物もまた存在してよい。 本発明はさらに、本製薬学的組成物の１種の治療上有効な用量を被験体に投与 することを含んで成る、平滑筋腫に罹っている被験体の治療方法を提供する。 本明細書で使用されるところの投与は、当業者に既知の多様な方法のいずれか を使用して遂げられもしくは実施されることができる。投与は、例えば、静脈内 に、筋肉内におよび皮下に投与することを含んでよい。 本製薬学的組成物の治療上有効な用量は、苦しめられる被験体における平滑筋 腫の大きさもしくは関連する症状（例えば、子宮出血および子宮の炎症）のひど さのいずれかを50％低下させるのに十分な用量である。好ましい態様において、 苦しめられる被験体の治療は、ある時間の期間にわたって複数の治療上有効な用 量を投与することから成ることができる。用量および時間の期間は既知の方法に より決定され得る。一態様において、治療上有効な用量は、ポリペプチド作用物 質について30μg/kgから30mg/kgまで、また、小有機作用物質について60μg/kg から30mg/kgまでである。別の態様において、治療上有効な用量は、ポリペプチ ド作用物質について300μg/kgから３mg/kgまで、また、小有機作用物質について 600μg/kgから３mg/kgまでである。 「被験体」という用語、平滑筋腫の型、ならびに当該作用物質（１種もしくは 複数）単独を使用する本方法について上で列挙される作用物質の性質および挙動 の多様な態様は、本製薬学的組成物およびそれの使用方法に当てはまる。 本発明はさらに、被験体の腫瘍が平滑筋腫であるかどうかを決定する２種の診 断方法を提供する。第一の方法は、（ａ）被験体から腫瘍のサンプルを得ること ；（ｂ）サンプル中に存在する最低１種のメタロプロテイナーゼの量を測定する ことであって、メタロプロテイナーゼはストロメライシン−２、ストロメライシ ン−３およびマトリライシンから成る群から選択され；そして（ｃ）段階（ｂ） で測定された各メタロプロ テイナーゼの量を既知の標準品と比較してそれによりその腫瘍が平滑筋腫である かどうかを決定すること、の段階を含んで成る。 第二の方法は、（ａ）被験体から腫瘍のサンプルを得ること；（ｂ）サンプル 中に存在する最低１種のメタロプロテイナーゼをコードするｍＲＮＡの量を測定 することであって、メタロプロテイナーゼはストロメライシン−２、ストロメラ イシン−３およびマトリライシンから成る群から選択され；そして（ｃ）段階（ ｂ）で測定された各メタロプロテイナーゼをコードするｍＲＮＡの量を既知の標 準品と比較してそれによりその腫瘍が平滑筋腫であるかどうかを決定すること、 の段階を含んで成る。 タンパク質およびｍＲＮＡについて濃縮されたサンプルを包含する腫瘍サンプ ルを苦しめられる被験体から得る方法は当該技術分野で慣用されており、かつ、 下の実験の詳細の節で例示される。サンプル中の所定のタンパク質の量の測定方 法は公知であり、かつ、免疫組織化学、免疫ブロッティング、酵素活性アッセイ および酵素電気泳動を包含するがしかしこれらに制限されない。サンプル中のｍ ＲＮＡの量の測定方法は公知であり、かつ、ノーザンブロッティング、ＲＴ−Ｐ ＣＲ、インシトゥ検出およびそれらの組み合わせを包含するがしかしこれらに制 限されない。 本方法において、「既知の標準品」は、平滑筋腫、正常な子宮筋層もしくは双 方に存在することが既知のメタロプロテイナーゼもしくは対応するｍＲＮＡ（応 用可能であるどちらでも）の量を含んでよい。好ましい態様において、「既知の 標準品」は、平滑筋腫および正常な子宮筋層双方に存在することが既知のメタロ プロテイナーゼもしくは対応するｍ ＲＮＡ（応用可能であるどちらでも）の量を含んで成る。 また、本診断方法の一態様において、メタロプロテイナーゼはストロメライシ ン−３である。好ましい態様において、メタロプロテイナーゼはストロメライシ ン−２、ストロメライシン−３およびマトリライシンである。 本発明はさらに、被験体の腫瘍が平滑筋腫であるかどうかの決定での使用のた めの２種のキットを提供する。第一のキットは、（ａ）その被験体から採取され た腫瘍サンプル中に存在するメタロプロテイナーゼの量を測定するのに適する作 用物質であって、メタロプロテイナーゼはストロメライシン−２、ストロメライ シン−３およびマトリライシンから成る群から選択され；ならびに（ｂ）それと 、段階（ａ）で測定された各メタロプロテイナーゼの量が、その腫瘍が平滑筋腫 であるかどうかを決定することを可能にするように比較され得る既知の標準品を 含んで成る。 一態様において、メタロプロテイナーゼの量を測定するのに適する作用物質は抗 体である。抗体は標識（検出可能なマーカーを使用して）もしくは未標識（標識 された抗体とともに使用される場合）；全ポリクローナル、全モノクローナルま たはそれらの断片；および天然に存在するもしくは天然に存在しないであってよ い。検出可能なマーカーは、例えば放射能もしくは蛍光でありうる。こうした抗 体の作成および使用方法は当該技術分野で公知である。 第二のキットは、（ａ）その被験体から採取された腫瘍サンプル中に存在する メタロプロテイナーゼをコードするｍＲＮＡの量を測定するのに適する作用物質 であって、メタロプロテイナーゼはストロメライシン −２、ストロメライシン−３およびマトリライシンから成る群から選択され；な らびに（ｂ）それと、段階（ａ）で測定された各メタロプロテイナーゼをコード するｍＲＮＡの量が、その腫瘍が平滑筋腫であるかどうかを決定することを可能 にするように比較され得る既知の標準品を含んで成る。 一態様において、メタロプロテイナーゼをコードするｍＲＮＡの量を測定する のに適する作用物質は検出可能な核酸プローブである。こうしたプローブおよび それの作成方法は当該技術分野で既知であり、かつ、下の実験の詳細の節で例示 される。 最後に、本発明は、ある作用物質が、ストロメライシン−２、ストロメライシ ン−３およびマトリライシンから成る群から選択される最低１種のメタロプロテ イナーゼを特異的に阻害するかどうかの決定方法を提供し、これは、当該作用物 質が、（ａ）ストロメライシン−２、ストロメライシン−３もしくはマトリライ シンの反応速度を最低50という係数だけ遅らせ、かつ、（ｂ）ストロメライシン −２、ストロメライシン−３、マトリライシンならびにゼラチナーゼａおよびｂ 以外のいずれかのメタロプロテイナーゼの反応速度を25という係数を越えるだけ 遅らせないかどうかを決定することを含んで成り、それにより部分（ａ）および （ｂ）の基準を満足する作用物質は、ストロメライシン−２、ストロメライシン −３およびマトリライシンから成る群から選択される最低１種のメタロプロテイ ナーゼを特異的に阻害するものである。 ある作用物質がメタロプロテイナーゼの反応速度を遅らせる程度を定量的に測 定する方法は当該技術分野で既知である。こうした方法は蛍光アッセイ（８０） を包含するがしかしこれに制限されない。ストロメラ イシン−２、ストロメライシン−３、マトリライシンならびにゼラチナーゼａお よびｂ以外のメタロプロテイナーゼは、例として、ヒト線維芽細胞コラゲナーゼ （ＭＭＰ−１としてもまた当該技術分野で知られる）を包含する。 本発明は、以下に続く実験の詳細の参照によりより良好に理解されることがで きるが、しかし、当業者は、詳述される特定の実験が、その後に続く主題の発明 においてより十分に記述されるように、単に本発明の具体的説明であることを容 易に真価を認めるであろう。 実験の詳細 以下の実験を実施して、冒されていない子宮筋層および子宮内膜と比較して子 宮平滑筋腫でのマトリックスメタロプロテイナーゼファミリーのある構成員のｍ ＲＮＡ発現のレベルを測定した。コラゲナーゼおよびストロメライシン１のｍＲ ＮＡの発現はノーザンブロッティングにより測定し、また、ストロメライシン− １、ストロメライシン−２、ストロメライシン−３およびマトリライシンのｍＲ ＮＡのレベルは半定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によ り測定した。内在性のメタロプロテイナーゼの組織インヒビター−１および−２ （ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２）のｍＲＮＡのレベルはＲＴ−ＰＣＲを使用 して測定した。 材料および方法 患者 組織試料を、いかなる型のホルモンもしくは薬物療法も受けておらず、かつ、 選択的子宮摘出を受けていた症候性子宮類線維腫の閉経前の女性から得た。組織 の収集物は、ブリガム・アンド・ウィメンズ病院(Brigh am & Women’s Hospital)の方針に従って、廃棄されたヒト組織の使用について の同意のもとに得た。月経周期の段階は、増殖および分泌双方の期のサンプルに ついての子宮内膜の組織学的日付診により決定した。 組織の収集およびＲＮＡの調製 平滑筋腫組織サンプルを、潜在的な子宮筋層の汚染を避けるように腫瘍の中央 近くから切断した。子宮筋層組織を子宮内膜層および平滑筋腫から十分離れて切 断した。子宮内膜組織を小刀の刃で子宮表面から掻き取り、かように機能層(fun ctionalis layer)を除去ししかし根底にある子宮筋層での可能な汚染を避けるよ うに基底下部(lower basalis)を無傷のままにした。組織は患者からの除去の30 分以内に得、そして全ＲＮＡを調製するため４Mグアニジンイソチオシアネート 中でホモジェナイズした（２３）。 ノーザンブロッティング ノーザンブロットを以前に確立された方法（２４）に従って実施した。簡潔に は、ポリアデニル酸化ｍＲＮＡを全ＲＮＡから精製し、そして、５μgのポリＡ ＲＮＡを電気泳動し、ニトロセルロース（シュライヒャー アンド シュエル (Schleicher and Schuell)、ニューハンプシャー州キーン）に移し、そして、コ ラゲナーゼ、ストロメライシン−１およびα−チューブリンのｍＲＮＡについて プロービングした。ハイブリダイゼーションおよび洗浄（上に記述された方法） の後に、ブロットをオートラジオグラフィーのフィルムに24時間曝露し、そして その後フィルムを現像した。ノーザンブロットをプロービングするのに使用され るコラゲナーゼおよびストロメライシン−１のｃＤＮＡは既知の方法（１７）に 従って調製した。 ＲＴ−ＰＣＲ 平滑筋腫、子宮筋層および子宮内膜サンプルからの等量のＲＮＡ（１μg）を 、逆転写についての製造元の推奨された条件に従い（パーキン エルマー シー タス(Perkin Elmer Cetus)；ジーンアンプ(GeneAmp)ＲＮＡ ＰＣＲ）、第一鎖 の合成のためのチューブに添加した。逆転写された産物のアリコート（３〜９μ l）を取り出し、そして標的ＤＮＡのＰＣＲ増幅のための新たなチューブに添加 した。簡潔には、ＰＣＲ増幅混合物は、100μl反応チューブ（パーキン エルマ ー シータス(Perkin Elmer Cetus)）中に、最終濃度２mMＭｇＣｌ₂、200μMｄ ＮＴＰ、0.2μMプライマーおよび2.5UＴａｑポリメラーゼを含有した。表１は、 各増幅増幅についての特定の量のＲＴ産物、オリゴヌクレオチドの配列および増 幅の周期の数を提供する。*クロンテック ラブス インク(Clontech Labs，Inc.)からのヒトβ−アクチン およびトランスフェリンレセプターのアンプライマー(amplimer)の組。 §ヌオヴォ(Nuovo)ら、1995（２５）からのヒトＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ− ２のアンプライマー。 オリゴヌクレオチドは合成した（クルアケム(Cruachem)、バージニア州スター リング）かもしくは購入した（クロンテック ラブス インク(Clontech Labs， Inc.)、カリフォルニア州パロアルト）かのいずれかであった。増幅プロトコル は、95℃で１分間変性、55〜60℃で１分間アニーリング（表１を参照）、および 72℃で２分間伸長から成り、最終周期は72℃で５分間伸長を包含した。完了され た反応を４℃で一夜維持した。逆転写およびＰＣＲはジーンアンプ(GeneAMP)９ ６００サーマルサイクラー(Thermal Cycler)（パーキン エルマー(Perkin Elme r)、コネチカット州ノーウォーク）を使用して実施した。各遺伝子産物の増幅の ための周期の数は、産物の直線状の増大を生じた周期数から選んだ。ＰＣＲ産物 を、0.2μg/ml臭化エチジウム（シグマ(Sigma)、ミズーリ州セントルイス）を含 有する２％アガロースゲル（バイオラッド(BioRad)、カリフォルニア州ハーキュ リーズ）中で分離した。増幅産物のバンドの強度をポラロイドフィルムに記録し 、そして、ヒューレット パッカード(Hewlett Packard)のスキャナーで定量し た。 遺伝子発現の半定量的分析をＲＴ−ＰＣＲにより測定した実験において、２種 の内在性遺伝子すなわちトランスフェリンレセプターおよびアクチン（クロンテ ック ラブス インク(Clontech Labs，Inc.)、カリフォルニア州パロアルト） を、それぞれ、共増幅(co-amplified)産物と して同一チューブ中でもしくは平行した反応チューブ中でのいずれかで増幅した 。トランスフェリンレセプターは、その発現および増幅のレベルが低度数(low-a bundance)遺伝子産物に類似であるため、同一チューブ中で共増幅する内在性遺 伝子として選んだ（製造元の推奨、クロンテック ラブス インク(Clontech La bs，Inc.)）。低度数ｍＲＮＡに比較して通常はより高レベルで発現されるアク チンは、同一チューブ中での共増幅に十分適しなかったが、しかし、遺伝子増幅 の内在性対照として以前に使用されている。従って、アクチンを平行したチュー ブで増幅してＲＴ−ＰＣＲの結果の正規化のための入力ＲＮＡの第二の推定値(e stimator)を提供した。多様なメタロプロテイナーゼの発現をアクチンに対し正 規化し、そして発現の相対的レベルをトランスフェリンレセプターのレベルとの 比較により実証した。アクチンのｍＲＮＡレベルを基礎として正規化された結果 をその後比較して、平滑筋腫、子宮筋層および子宮内膜からのサンプル中の平均 の正規化された発現レベルを提供した。トランスフェリンレセプターのオリゴプ ライマーの存在もしくは非存在下でマトリライシンのオリゴプライマーで得られ た増幅産物の量は変動し、マトリライシンのプライマーおよびトランスフェリン レセプターのプライマーが共増幅に対し適合性でなかったことを示唆した。従っ て、アクチンのｍＲＮＡレベルのみを使用してマトリライシンのｍＲＮＡの発現 を正規化した。 増幅産物の正体(identity)を確認するため、類線維腫、子宮筋層および子宮内 膜の増幅産物を別個にプールし、そして制限消化にかけた。増幅産物を、キアゲ ン(QIAgen)カラム（キアゲン(QIAgen)、カリフォルニア州チャッツワース）でＲ Ｔ−ＰＣＲ反応から精製し、そして精製され たＰＣＲ産物のアリコートを制限消化反応に添加した。ＰＣＲ産物の配列を、Ａ ＢＳ２６００装置を使用して、ブリガム・アンド・ウィメンズ中央配列決定施設 (Brigham and Women’s Core Sequencing Facility)により、同一の精製された ＰＣＲ産物の付加的アリコートで決定した。 統計学 平滑筋腫、子宮筋層および子宮内膜中のマトリックスメタロプロテイナーゼの 正規化されたレベルを２因子(factor)共分散分析で比較した。２因子は、増殖も しくは分泌のいずれかの月経周期の期、および、平滑筋腫、子宮筋層もしくは子 宮内膜のいずれかの組織の供給源であり、また、共変数は患者であった。組織と 月経周期の期との間の発現の差異を、スーパーアノヴァ(SuperAnova)統計学パッ ケージ（アバカス コンセプツ インク(Abacus Concepts，Inc.)、カリフォル ニア州バークレイ）のフィッシャー(Fisher)の保護最小有意差検定(Protected L east Significant Difference test)を使用して決定した。 結果 コラゲナーゼおよびストロメライシン−１のｍＲＮＡの発現を、それぞれ８も しくは10例の患者からの平滑筋腫および子宮筋層から調製されたポリＡ ＲＮＡ の合わせられたサンプルの間で比較した（図１Ａおよび１Ｂ）。ポリＡ ＲＮＡ の等しいサンプル負荷を実証するために、α−チューブリンのｍＲＮＡのレベル を比較した。コラゲナーゼのｍＲＮＡのレベルは、数例を除いては個々の患者か らの平滑筋腫および子宮筋層で類似であった。子宮筋層と比較しての平滑筋腫で のストロメライシン−１のｍＲＮＡのレベルは患者の間で変動し、また、数例の 患者では、平滑筋腫中のストロメライシンのｍＲＮＡのレベルがノーザンブロッ ティ ングによる検出には低すぎた。ポリＡ ｍＲＮＡのノーザンブロットからの結果 は、平滑筋腫と子宮筋層との間のコラゲナーゼもしくはストロメライシン−１の いずれかのｍＲＮＡの発現の一貫した差異を立証することに失敗した。 他のＭＭＰのｍＲＮＡのレベルが平滑筋腫で子宮筋層に比較して異なって発現 されたかどうかを決定するため、ＭＭＰのｍＲＮＡの発現の調査をＲＴ−ＰＣＲ 法を使用して実施した。ストロメライシン−１、ストロメライシン−２、ストロ メライシン−３およびマトリライシンの増幅のためのオリゴヌクレオチドプライ マーおよび条件を表１に列挙する。選ばれたオリゴヌクレオチドは、ＯＬＩＧＯ （バージョン４．０）（ナショナル バイオサイエンシーズ インク(National Biosciences，Inc.)メーン州プリマス）で決定されるように至適なアニーリング 条件を提供することが見出され、また、予測された産物に対するそれらのオリゴ ヌクレオチドの特異性を、ＦＡＳＴＡ比較（ジェネティックス コンピュータ グループ(Genetics Computer Group)、ウイスコンシン州マジソン）を使用する ジェンバンク(GenBank)中の既知の配列との比較により確認した。ＲＴ−ＰＣＲ 産物の予測された大きさは：ストロメライシン−１、505bp；ストロメライシン −２、480bp；ストロメライシン−３、545bp；およびマトリライシン、457bpで あった。図２Ａから２Ｄは、臭化エチジウム染色により２％アガロースゲル上で 上昇されたレベルの産物を含有するサンプル中で検出された増幅産物の量を増幅 周期の数の関数として示す。多様なメタロプロテイナーゼについての増幅周期の 数はこれらの実験からの結果を基礎として選んだ（表１を参照）。その後の研究 で使用した周期数は増幅周期曲線の直線部分内にあった。ＴＩＭＰ−１ およびＴＩＭＰ−２のオリゴヌクレオチドプライマーは以前に特徴づけられてお り（２５）、そしてこれらの実験の産物の直線的増大について確認した（データ は示されない）。ＴＩＭＰ−１は30周期の間増幅し、また、ＴＩＭＰ−２は34周 期の間増幅した。 図２Ａ〜２Ｄに示される検出された増幅産物が正しいｍＲＮＡに対応したこと を保証するため、増幅産物の制限消化分析を実施した。図３Ａは、適切な制限酵 素で切断された増幅産物の予測される消化パターンの図解表示を示す。図３Ｂ〜 ３Ｅは、ＲＴ−ＰＣＲ増幅および産物の精製後の類線維腫、子宮筋層および子宮 内膜のＲＮＡサンプルからの制限酵素の存在（切断）もしくは非存在（未切断） 下の多様な産物の実際の制限酵素消化分析を表わす。増幅されたストロメライシ ン−１産物は505bpであることが予測され、そして、増幅産物をＨｉｎｄIIIによ り２回切断し、３個の断片、すなわち264bpの断片に対応する不鮮明なバンド（ 図３Ｂ）ならびに臭化エチジウム染色で見えなかった68および173bpの２個のよ り小さな断片を生じた。増幅されたストロメライシン−２は480bpであることが 予測され（図２Ａ）、そして、増幅産物を２個の断片にＨｉｎｄIIIにより１回 切断して、414bpの目に見えるバンドおよびゲル上で見えないより小さな断片（6 6bp）を生じた（図３Ｃ）。増幅されたストロメライシン−３は545bpであること が予測され、そして、増幅産物はＢｓｔＹＩにより340bpおよび205bpの２個の断 片に切断され、それらは双方とも目に見えた（図３Ｄ）。増幅されたマトリライ シン産物は447bpであることが予測され、そして、増幅産物はＸｈｏIIにより278 bpおよび169bpの２個の断片に切断され、それらは双方とも目に見えた（図３Ｅ ）。検査された全４種のメタロプロテイナーゼのＲＴ−ＰＣＲ産物 の制限酵素消化パターンはそれらの予測された消化パターンと矛盾せず、増幅産 物が所望のメタロプロテイナーゼのｍＲＮＡに対応するという証拠を提供した。 ストロメライシン−１、ストロメライシン−２、ストロメライシン−３、マト リライシン、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２のｍＲＮＡのレベルを、アクチン に正規化された半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定し、そして、各酵素のｍＲＮＡ の発現の相対的レベルを、平滑筋腫と子宮筋層との間、および子宮筋層と子宮内 膜との間で比較した(図４Ａ〜４Ｄ)。ストロメライシン−１のｍＲＮＡのレベル は検査された全３種の子宮組織中で低かった。所定の患者内では、ストロメライ シン−１のｍＲＮＡが類線維腫で子宮筋層に比較して上昇される傾向が存在した （図３Ａの患者１、３および４を患者２と比較せよ）。しかしながら、ストロメ ライシン−１のｍＲＮＡのレベルは子宮筋層中より類線維腫中で一貫してより大 きくはなかった。ＲＴ−ＰＣＲにより測定される、子宮筋層に比較して平滑筋腫 でのストロメライシン−１のｍＲＮＡの低レベルの発現および変動性の発現は、 より早期のノーザンブロッティングの結果（図１）と一致した。ストロメライシ ン−２およびストロメライシン−３のｍＲＮＡをそれらのそれぞれのオリゴヌク レオチドの存在下で増幅し、また、加えて、トランスフェリンレセプターのｍＲ ＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲに関してのＲＮＡの等しい負荷を確認するための内在性対 照として共増幅した。トランスフェリンレセプターのアンプライマー（クロンテ ック(Clonetech)、カリフォルニア州パロアルト）は、ヒトトランスフェリンレ セプターのｃＤＮＡのおよそ1300bpの領域を増幅した。ストロメライシン−２（ 図４Ｂ）およびストロメライシン−３（図４Ｃ）のｍＲ ＮＡのレベルは、とりわけ月経周期の分泌期の間、平滑筋腫で子宮筋層に比較し てより高かった。類似の結果（示されない）を、ストロメライシン−２もしくは ストロメライシン−３のいずれかのｍＲＮＡを増幅した場合に得、そして、その 結果を、平行した反応チューブ中で増幅されたヒトβ−アクチンのｍＲＮＡに対 し正規化した。子宮内膜中のストロメライシン−２およびストロメライシン−３ のｍＲＮＡのレベルは月経周期の期の間で有意に異ならなかった。しかしながら 、増殖期群の６例の患者の２例のみが、分析のための生検試料を得るのに十分な 子宮内膜を有した。マトリライシンのｍＲＮＡは検査された全３種の組織で発現 され、そして、マトリライシンのｍＲＮＡのレベルは周期のいずれの期の間でも 平滑筋腫と子宮筋層との間で異ならなかった（図４Ｄ）。子宮内膜でのマトリラ イシンのｍＲＮＡのレベルは、増殖期の間で分泌期に比較してより大きいようで あった。これらの結果は、ストロメライシン−２およびストロメライシン−３が 、子宮筋層に関して平滑筋腫で起こる細胞外マトリックス沈着のより高レベルに 関与することを示唆する。 子宮筋層に比較して平滑筋腫でのストロメライシン−２およびストロメライシ ン−３のｍＲＮＡレベルは、検査された22例の患者で一貫した様式で上昇されて いるようであった（代表的サンプルは図４Ｂおよび４Ｃに示される）。アクチン のｍＲＮＡに関して正規化されたストロメライシン−２およびストロメライシン −３のｍＲＮＡのレベルの定量的測定を、22例の患者について平滑筋腫と冒され ていない子宮筋層との間で比較し、また、メタロプロテイナーゼのレベルを共分 散分析により分析した。22例の患者のなかで、ストロメライシン−２およびスト ロメライシン−３のレベルは、月経周期の期に無関係に、平滑筋腫で冒されてい ない子宮筋層に比較して有意により高かった（Ｐ＜0.025）。ストロメライシン −２およびストロメライシン−３のｍＲＮＡのレベルを月経周期の関数として比 較した場合、ストロメライシン−２のｍＲＮＡ（図５Ａ；Ｐ＜0.04）およびスト ロメライシン−３のｍＲＮＡ（図５Ｂ；Ｐ＜0.04）は、分泌期の間、平滑筋腫で 子宮筋層に比較して有意により高かったが、しかし増殖期の間はそうでなかった 。周期の増殖期でのストロメライシン−２もしくはストロメライシン−３のレベ ルの正確な推定は、分泌期（ｎ＝16）に関して増殖期（ｎ＝６）にサンプリング された患者のより少ない数のため、より困難であることができた。 ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２のｍＲＮＡのレベルを測定して、平滑筋腫で のストロメライシン−２およびストロメライシン−３のｍＲＮＡの増大されたレ ベルがＴＩＭＰ発現のレベルの代償性変化により付随されたかどうかを決定した 。ＴＩＭＰ−１のレベルは、平滑筋腫、子宮筋層および子宮内膜の間で同等であ り、かつ、増殖と分泌期との間でほとんど変動しなかった（データは示されない ）。ＴＩＭＰ−２のレベルは、周期の増殖期の間、平滑筋腫で子宮筋層に比較し てより低い傾向があり（図６；ｎ＝６、Ｐ＝0.15）、また、ＴＩＭＰ−２のｍＲ ＮＡのレベルは、周期の分泌期の間、平滑筋腫および子宮筋層で類似であった。 ＥＧＦのｍＲＮＡの上昇されたレベルが以前に平滑筋腫で測定され、また、平 滑筋腫の成長および増殖の刺激におけるＥＧＦの役割が提案されている（２６） 。本実験において、子宮筋層に比較して平滑筋腫でのＥＧＦのｍＲＮＡのレベル の差異（図７）を測定した。ＥＧＦのｍＲＮＡのレベルは、増殖期からの平滑筋 腫で、分泌段階の間に収集された平滑筋腫に比較してより高レベルに向かう傾向 を立証した（Ｐ＝0.08）。 しかしながら、月経周期の増殖もしくは分泌のいずれかの期の間、平滑筋腫と子 宮筋層との間のＥＧＦのｍＲＮＡの差異は存在しなかった。 考察 これらの実験の結果は３個の重要な知見を示す。すなわち、（１）子宮筋層に 関して平滑筋腫でのストロメライシン−２およびストロメライシン−３のｍＲＮ Ａ発現の増大されたレベル；（２）平滑筋腫および子宮筋層でのマトリライシン のｍＲＮＡの存在；ならびに（３）上昇されたメタロプロテイナーゼに関連する ＴＩＭＰ−１もしくはＴＩＭＰ−２のいずれかのｍＲＮＡレベルの何らかの明ら かな増大の非存在。これらの知見は、冒されていない子宮筋層に比較して平滑筋 腫でのメタロプロテイナーゼの選択的アップレギュレーションの役割の証拠を提 供する。 子宮平滑筋腫は迅速に成長する良性腫瘍であるが、しかしそれらを子宮筋層か ら分離する結合組織障壁を免れない。平滑筋腫の迅速な成長の潜在性は以前に立 証されている（４，１７）。平滑筋腫の迅速な成長は、冒されていない子宮筋層 に類似である、平滑筋腫の比較的小さい分裂速度と対照的である（１）。迅速な 腫瘍の成長は良性および転移性双方の腫瘍で起こるとは言え、平滑筋腫のような 良性腫瘍は基底膜および転移をめったに逃れない線維性腫瘍である（平滑筋肉腫 ）。さらに、最近の研究は、平滑筋腫で子宮筋層に比較してより高レベルのコラ ーゲンＩ、コラーゲンIIIおよびコネキシンを見出した（ノワク(Nowak)、未発表 の結果、２７）。集合的には、最近の研究からの結果は、平滑筋腫が比較的小さ な増殖速度、しかし活性の細胞外マトリックス環境を保有することを示唆する。 子宮筋層に対する平滑筋腫での上昇されたレベルのコラゲナーゼの非存在下では 、細胞増殖に関し、平滑筋腫細胞は周囲の子宮 筋層もしくは周辺部位のそれらの浸潤中に制限される。平滑筋腫内での継続され た細胞増殖は、膨張を引き起こすがしかし侵襲を引き起こさない結合組織の境界 に対し力を発揮しうる。 良性腫瘍と対照的に、浸潤性腫瘍からの細胞は、迅速に増殖し、そして上昇さ れたレベルのメタロプロテイナーゼを発現するかもしくは周囲の間質細胞からの 酵素の発現を誘導するかのいずれかであることが示されている（２８）。線維肉 腫、絨毛癌および膠芽腫からの細胞はゼラチナーゼを産生することが示されてい る（２９−３１）。転移性の結腸直腸および前立腺癌からの細胞（上皮由来）は マトリライシンを産生することが示されており、そして、浸潤癌細胞からのマト リライシン産生の阻害は侵襲性を減少させることが示されている（３２−３５） 。高比率（＞95％）の浸潤性かつ転移性の乳癌が周囲の間質細胞からのストロメ ライシン−３発現を誘導する一方、非浸潤性の非転移性乳癌を取り囲む間質細胞 はストロメライシン−３をめったに発現しない（３６，３７）。これらの浸潤性 腫瘍のなかで共通の要素は、転移性侵襲に先立つ腫瘍細胞の間質細胞との近位で ある。浸潤癌と対照的に、平滑筋腫は周囲組織を侵襲せず、また、子宮筋層内に 封鎖された平滑筋腫は子宮間質と接触しない。 メタロプロテイナーゼは、それらの構造および基質特異性を基礎として３個の 一般的範疇に細分されている酵素の一族である。細胞外マトリックス再造形にお けるコラゲナーゼ、ゼラチナーゼおよびストロメライシンの構造、機能および役 割、ならびに多様な酵素が分解する基質が最近概説された（３８−４１）。簡潔 には、コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８）の基質は、細胞外マトリックス の構造的枠組を形成する間質 性コラーゲン（コラーゲンＩ、III）であることが示されている。ゼラチナーゼ は、変性された非らせん状ドメインのコラーゲン（コラーゲンIV）、接着タンパ ク質、および基底膜を形成するプロテオグリカンを分解することが示されている 。ストロメライシン１および２はアミノ酸レベルで80％同一かつ89％類似であり 、また、コラーゲンIV、プロテオグリカンおよびマトリックス糖タンパク質に対 する類似の酵素活性を有することが記述されている（４２）。ストロメライシン −２により優先的に切断される基質の個別の分類は未だ同定されていない。スト ロメライシン−３はセリンプロテアーゼインヒビター（セルピン）、α１−アン チトリプシンをタンパク質分解することが示されており、そして、今日まで、こ れがストロメライシン３の唯一の特徴づけられた基質である（４３）。マトリラ イシンもまたα１−アンチトリプシン、ならびにコラーゲンIV、フィブロネクチ ンおよびラミニンを分解することが示されている（４４−４６）。ストロメライ シン−２およびストロメライシン−３のこれらの報告された基質の好みは、細胞 外マトリックス内の接着タンパク質および糖タンパク質が、平滑筋腫で子宮筋層 に比較してより大量に再造形されることを示唆する。これらの基質の好みはまた 、ストロメライシン−１、コラゲナーゼおよびゼラチナーゼにより切断される基 底膜および線維性コラーゲンの成分が、平滑筋腫で正常な子宮筋層に比較してよ り少なく代謝回転しかつ腫瘍の密集した線維性の性質に寄与することも示唆する 。 子宮は、細胞の分解および再造形のレベルならびに発生する細胞外マトリック スに関して成人の器官のなかで独特である。多数の研究が子宮内膜でのメタロプ ロテイナーゼの発現を検査し（１２−１４）、そして、 組織の成長および再造形と一致したメタロプロテイナーゼ発現の顕著な増大を立 証した。しかしながら、情報は、子宮筋層でのメタロプロテイナーゼの役割に関 してほとんど入手可能でない。本実験は、平滑筋腫もしくは子宮筋層でのストロ メライシン−１、２および３、ならびにマトリライシンのｍＲＮＡの存在および 量を立証する最初のもの、かつ、正常な子宮筋層に比較して平滑筋腫でのストロ メライシン−２およびストロメライシン−３のｍＲＮＡの上昇されたレベルを立 証する最初のものである。 本実験の前には、ストロメライシン−３およびマトリライシンは、子宮内膜の 間質細胞および上皮細胞に関連して独占的に見出されると考えられた。最近、ス トロメライシン−３は、筋線維芽細胞、分化された型の間質細胞、および皮膚線 維腫すなわち平滑筋腫に類似の表現型をもつ線維性腫瘍に関連して見出された（ ４７）。主題の実験はどの細胞型がメタロプロテイナーゼの産生に関与するかを 未だ同定していないとは言え、子宮筋層は、平滑筋腫の成長および発達の間のス トロメライシン−３産生の潜在的供給源でありうる筋線維芽細胞もまた含有する 。子宮筋層内の他の細胞型もまた他の系において他のプロテアーゼを産生するこ とが示されており、そして、これらの細胞型はメタロプロテイナーゼを産生する 潜在能力を有する。子宮内の肥満細胞は少なくとも２種のタンパク質分解酵素、 トリプターゼおよびキマーゼを産生することが示されている（４８）。トリプタ ーゼ、もしくはキマーゼと一緒になったトリプターゼの産生を特徴とする肥満細 胞の表現型は、肥満細胞が存在する組織により影響されることが示されている。 肥満細胞が子宮でのメタロプロテイナーゼの発現に直接もしくは間接的に影響を 及ぼすかどうかは 知られていない。好中球、単球およびマクロファージのような子宮にもまた存在 する他の炎症細胞型がメタロプロテイナーゼの供給源であることが示されている （４９−５４）。従って、炎症細胞が子宮筋層もしくは平滑筋腫内で独特の表現 型をとりそしてメタロプロテイナーゼを分泌するという潜在性が存在する。平滑 筋腫の発達は染色体異常に結びつけられることが示されているとは言え（５５， ５６）、炎症成分が腫瘍の悪化に関与しうる。 平滑筋腫での上昇されたストロメライシン−２およびストロメライシン−３の 供給源は現在のところ問題のままであるが、しかしながら、増大されたレベルの 酵素の存在は、子宮筋層に比較してタンパク質分解的により活性の細胞外マトリ ックスを提供し得る。ストロメライシン−２およびストロメライシン−３を必要 とするメタロプロテイナーゼの活性化のカスケードは、ストロメライシン−３の 唯一の既知の基質、α１−アンチトリプシンのタンパク質分解によりトリプシン 活性もまた増大させ得る（４３）。上昇されたトリプシン様活性と組み合わせら れれば、選択的マトリックスメタロプロテイナーゼの増大は子宮筋層の限界内で の腫瘍の拡大につながりうる。これらは平滑筋腫の成長におけるマトリックスメ タロプロテイナーゼの関与についての仮説の説明であるとは言え、基底膜を越え る浸潤を伴わない平滑筋腫の迅速な成長、マトリックス沈着および再造形の原因 である正確な機構は現在のところ未知である。 主題の実験で、マトリライシンのｍＲＮＡの発現が平滑筋腫および子宮筋層で 示された。以前の研究は、主として子宮内膜の上皮中で発現されるはずであるマ トリライシンを示した（１２，１３，５７）。子宮内膜上皮以外の子宮組織中で 発現されているマトリライシンを擁護して、 他の研究者（５８）は、子宮内膜症の患者ではマトリライシンが正常位置および 子宮外双方の子宮内膜の間質層で発現されたことを見出した。（上に挙げられた 研究所により実施されるような子宮内膜生検の間に、子宮筋層が生検の間に得ら れなかったかもしくはマトリライシン発現が子宮筋層で測定されなかったかのい ずれかであった。）マトリライシンは、それがマトリックス成分へのＭＭＰ付着 に重要なＣ末端ビトロネクチン様ドメインを欠くことにおいて、今までのところ 記述されたメタロプロテイナーゼのなかで独特であることが示されている（５９ ，６０）。マトリライシンの独特の構造のため、マトリライシンがＭＭＰの新た な亜族(sub-family)の第一の構成員を代表することができ（６１）、また、組織 型におけるその発現は、子宮内膜症および子宮平滑筋腫のような疾患の存在下で 変動しうることが提案された。 内在性のメタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ）は、しばしば 、メタロプロテイナーゼを産生する同一の細胞もしくは隣接する細胞のいずれか により産生される。子宮におけるＴＩＭＰの存在および活性は以前に報告されて いる（６２−６４）。主題の実験において、分泌期の間、平滑筋腫で子宮筋層に 比較して減少されたＴＩＭＰ−２レベルに向かう傾向が存在したが、しかし増殖 期の間はなかった。分泌期の間のＴＩＭＰ−２の減少された発現が、ストロメラ イシン−２および３のｍＲＮＡの発現の増大するレベルの存在下で、子宮筋層に 比較して平滑筋腫の再造形のより大きな機会を提供しうることが可能である。間 質細胞でのＴＩＭＰ−１のレベルは月経周期を通じて類似であったが、しかし、 上皮層でのＴＩＭＰ−１の発現はより周期性のパターンを立証した（１３）。Ｔ ＩＭＰ−１のｍＲＮＡレベルは、子宮再造形の最も活 動性の時間の間のいくつかのメタロプロテイナーゼの最高レベルと一致して、周 期の月経期の間に最大であった。ＴＩＭＰは、休眠性から活性の酵素へのゼラチ ナーゼの転化を予防することにより（６５）、そして、第二に、非共有複合体中 のマトリックスメタロプロテイナーゼのＮ末端触媒ドメインを阻害することによ り（６６，６７）メタロプロテイナーゼを阻害することが示されている。メタロ プロテイナーゼ阻害はインビトロおよびインビボで立証されている。ＴＩＭＰは いくつかの癌細胞の遊走および侵襲を阻害することが示されている（１９−２１ ，６８）が、しかし、上昇されたレベルのＴＩＭＰは他の癌細胞の侵襲を阻害し ないこともまた示されている（６９−７１）。関節炎モデルにおいて、ＭＭＰ発 現を抑制する抗炎症剤がＴＩＭＰのレベルをまた増大もすることが示され、関節 でのＭＭＰとＴＩＭＰのレベルとの間の均衡を回復する（１７，７２，７３）。 最近の研究はもうひとつのＴＩＭＰ、ＴＩＭＰ−３を同定した（６４）が、しか し、平滑筋腫もしくは子宮筋層でのＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２もしくはＴＩＭ Ｐ−３の相対的重要性は未知である。 上昇されたメタロプロテイナーゼ活性とともに、平滑筋腫での上昇されたＥＧ Ｆレベルが子宮筋層に比較して測定され、ＥＧＦ、および平滑筋腫で上昇される ことが示された他の成長因子に関する以前の報告と一致した。主題の実験におい て、ＥＧＦのｍＲＮＡの上昇されたレベルは月経周期の増殖期の間に測定された 一方、以前の報告は分泌期の間に測定されたＥＧＦのｍＲＮＡの上昇されたレベ ルを示す（２６）。主題のおよび以前の双方の実験は平滑筋腫でのＥＧＦのｍＲ ＮＡの上昇されたレベルを示し、月経周期に関するような結果の差異の理由（２ ６）は未 知である。子宮の成長に対するエストロゲンとＥＧＦの影響との間の緊密な相互 関連は、ＥＧＦがエストロゲンの作用の調節剤(modifier)として機能しうること を示唆した（７４−７６）。しかしながら、上昇されたプロゲステロンレベルは 平滑筋腫でのより大きな分裂速度と相互に関連するがしかし上昇されたエストロ ゲンレベルはせず（７７，７８）、細胞の成長およびマトリックスの膨張が周期 の分泌期の間に上昇されうることを示唆する。ＥＧＦに加え、塩基性線維芽細胞 成長因子およびヘパリン結合上皮成長因子のようなヘパリン豊富な細胞外マトリ ックスと関連することが既知の他の成長因子もまた、平滑筋腫で子宮筋層に関し て上昇されることが示されている（７９）。平滑筋腫の成長に対するエストロゲ ンおよびプロゲステロンの独占的な役割は分離することが困難であった。加えて 、平滑筋腫の成長および分裂速度に対する細胞外マトリックス中に含有されるＥ ＧＦおよび他の成長因子の正確な役割は現在のところ明らかでない。 メタロプロテイナーゼのレベルは、組織の再造形を伴う多くの生理学的状態お よび疾患で上昇されることが報告されている。平滑筋腫は、間葉起源の成長する 腫瘍の境界内の細胞外マトリックスの迅速な成長および膨張が存在する独特の疾 患である。本明細書で考察された実験は、マトリックスメタロプロテイナーゼの サブセット、すなわちストロメライシン−２およびストロメライシン−３が平滑 筋腫で子宮筋層に比較して上昇されるという証拠を提供する。平滑筋腫の物理的 な性質は、これらの酵素が、上昇されたコラゲナーゼおよびストロメライシン− １の非存在下で腫瘍の線維性の表現系の発生においてある役割を有しうることを さらに示唆する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１１年４月２３日（１９９９．４．２３） 【補正内容】 ２８．メタロプロテイナーゼをコードするｍＲＮＡの量を測定するのに適する作 用物質が検出可能な核酸プローブである、請求の範囲２７のキット。 ２９．ある作用物質が、ストロメライシン−２、ストロメライシン−３およびマ トリライシンから成る群から選択される最低１種のメタロプロテイナーゼを特異 的に阻害するかどうかの決定方法であって、これは、当該作用物質が、 （ａ）ストロメライシン−２、ストロメライシン−３もしくはマトリライシンの 反応速度を最低50という係数だけ遅らせ、かつ、 （ｂ）ストロメライシン−２、ストロメライシン−３およびマトリライシン以外 のいずれかのメタロプロテイナーゼの反応速度を25という係数を越えるだけ遅ら せない かどうかを決定することを含んで成り、 それにより部分（ａ）および（ｂ）の基準を満足する作用物質が、ストロメライ シン−２、ストロメライシン−３およびマトリライシンから成る群から選択され る最低１種のメタロプロテイナーゼを特異的に阻害するものである方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/573 Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｚ 33/574 Ａ６１Ｋ 37/64 // Ｃ１２Ｎ 9/64 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，Ａ Ｕ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ， ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ノワク・ロマナ アメリカ合衆国マサチユセツツ州02131ウ エストロクスベリイ・ウエルドストリート 224

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ストロメライシン−２、ストロメライシン−３およびマトリライシンから成 る群から選択される最低１種のメタロプロテイナーゼを特異的に阻害する作用物 質の治療上有効な用量を被験体に投与することを含んで成る、平滑筋腫に罹って いる被験体の治療方法。 ２．ストロメライシン−２、ストロメライシン−３およびマトリライシンから成 る群から選択される最低１種のメタロプロテイナーゼを特異的に阻害する作用物 質、ならびに製薬学的に許容できる担体を含んで成る、平滑筋腫に罹っている被 験体を治療するための製薬学的組成物。 ３．請求の範囲２の製薬学的組成物の治療上有効な用量を被験体に投与すること を含んで成る、平滑筋腫に罹っている被験体の治療方法。 ４．被験体がヒトである、請求の範囲１もしくは３の方法。 ５．平滑筋腫が子宮平滑筋腫である、請求の範囲１もしくは３の方法。 ６．作用物質がストロメライシン−２を特異的に阻害する、請求の範囲１もしく は３の方法。 ７．作用物質がストロメライシン−３を特異的に阻害する、請求の範囲１もしく は３の方法。 ８．作用物質がマトリライシンを特異的に阻害する、請求の範囲１もしくは３の 方法。 ９．作用物質が、ストロメライシン−２、ストロメライシン−３およびマトリラ イシンを特異的に阻害する、請求の範囲１もしくは３の方法。 １０．そのそれぞれがストロメライシン−２、ストロメライシン−３およびマト リライシンから成る群から選択される最低１種のメタロプロテイナーゼを特異的 に阻害する複数の作用物質の治療上有効な用量を被験 体に投与することを含んで成る、平滑筋腫に罹っている被験体の治療方法。 １１．そのそれぞれがストロメライシン−２、ストロメライシン−３およびマト リライシンから成る群から選択される最低１種のメタロプロテイナーゼを特異的 に阻害する複数の作用物質、ならびに製薬学的に許容できる担体を含んで成る、 平滑筋腫に罹っている被験体を治療するための製薬学的組成物。 １２．請求の範囲１１の請求の範囲の治療上有効な用量を被験体に投与すること を含んで成る、平滑筋腫に罹っている被験体の治療方法。 １３．被験体がヒトである、請求の範囲１０もしくは１２の方法。 １４．平滑筋腫が子宮平滑筋腫である、請求の範囲１０もしくは１２の方法。 １５．作用物質がストロメライシン−２を特異的に阻害する、請求の範囲１０も しくは１２の方法。 １６．作用物質がストロメライシン−３を特異的に阻害する、請求の範囲１０も しくは１２の方法。 １７．作用物質がマトリライシンを特異的に阻害する、請求の範囲１０もしくは １２の方法。 １８．作用物質が、ストロメライシン−２、ストロメライシン−３およびマトリ ライシンを特異的に阻害する、請求の範囲１０もしくは１２の方法。 １９．（ａ）被験体から腫瘍のサンプルを得ること； （ｂ）サンプル中に存在する最低１種のメタロプロテイナーゼの量を測定するこ とであって、メタロプロテイナーゼはストロメライシン−２、 ストロメライシン−３およびマトリライシンから成る群から選択され； そして （ｃ）段階（ｂ）で測定された各メタロプロテイナーゼの量を既知の標準品と比 較してそれによりその腫瘍が平滑筋腫であるかどうかを決定すること、 の段階を含んで成る、被験体の腫瘍が平滑筋腫であるかどうかの決定方法。 ２０．（ａ）被験体から腫瘍のサンプルを得ること； （ｂ）サンプル中に存在する最低１種のメタロプロテイナーゼをコードするｍＲ ＮＡの量を測定すること、ここで、メタロプロテイナーゼがストロメライシン− ２、ストロメライシン−３およびマトリライシンから成る群から選択されるもの である；そして （ｃ）段階（ｂ）で測定された各メタロプロテイナーゼをコードするｍＲＮＡの 量を既知の標準品と比較してそれによりその腫瘍が平滑筋腫であるかどうかを決 定すること、 の段階を含んで成る、被験体の腫瘍が平滑筋腫であるかどうかの決定方法。 ２１．被験体がヒトである、請求の範囲１９もしくは２０の方法。 ２２．平滑筋腫が子宮平滑筋腫である、請求の範囲１９もしくは２０の方法。 ２３．メタロプロテイナーゼがストロメライシン−３である、請求の範囲１９も しくは２０の方法。 ２４．メタロプロテイナーゼが、ストロメライシン−２、ストロメライシン−３ およびマトリライシンである、請求の範囲２３の方法。 ２５．（ａ）被験体から採取された腫瘍サンプル中に存在するメタロプロテイナ ーゼの量を測定するのに適する作用物質であって、メタロプロテイナーゼはスト ロメライシン−２、ストロメライシン−３およびマトリライシンから成る群から 選択され；ならびに （ｂ）それと、段階（ａ）で測定された各メタロプロテイナーゼの量が、その腫 瘍が平滑筋腫であるかどうかを決定することを可能にするように比較され得る既 知の標準品 を含んで成る、被験体の腫瘍が平滑筋腫であるかどうかの決定での使用のための キット。 ２６．メタロプロテイナーゼの量を測定するのに適する作用物質が抗体である、 請求の範囲２５のキット。 ２７．（ａ）被験体から採取された腫瘍サンプル中に存在するメタロプロテイナ ーゼをコードするｍＲＮＡの量を測定するのに適する作用物質であって、メタロ プロテイナーゼはストロメライシン−２、ストロメライシン−３およびマトリラ イシンから成る群から選択され；ならびに（ｂ）それと、段階（ａ）で測定され た各メタロプロテイナーゼをコードするｍＲＮＡの量が、その腫瘍が平滑筋腫で あるかどうかを決定することを可能にするように比較され得る既知の標準品 を含んで成る、被験体の腫瘍が平滑筋腫であるかどうかの決定での使用のための キット。 ２８．メタロプロテイナーゼをコードするｍＲＮＡの量を測定するのに適する作 用物質が検出可能な核酸プローブである、請求の範囲２７のキット。 ２９．ある作用物質が、ストロメライシン−２、ストロメライシン−３ およびマトリライシンから成る群から選択される最低１種のメタロプロテイナー ゼを特異的に阻害するかどうかの決定方法であって、これは、当該作用物質が、 （ａ）ストロメライシン−２、ストロメライシン−３もしくはマトリライシンの 反応速度を最低50という係数だけ遅らせ、かつ、 （ｂ）ストロメライシン−２、ストロメライシン−３、マトリライシンならびに ゼラチナーゼａおよびｂ以外のいずれかのメタロプロテイナーゼの反応速度を25 という係数を越えるだけ遅らせない かどうかを決定することを含んで成り、 それにより部分（ａ）および（ｂ）の基準を満足する作用物質が、ストロメライ シン−２、ストロメライシン−３およびマトリライシンから成る群から選択され る最低１種のメタロプロテイナーゼを特異的に阻害するものである方法。