JP2001521370A

JP2001521370A - 細胞懸濁液と三次元組織培養物の大規模生育と包装のための装置

Info

Publication number: JP2001521370A
Application number: JP53730397A
Authority: JP
Inventors: カージャン，クリスティン; アップルゲート，マーク，エー; フラット，ジェームス，エイチ; アップルゲート，ドーン，オー; ブルーム，ニコル; バウムガートナー，マーク
Original assignee: アドバンストティシュサイエンシーズインコーポレーテッド
Priority date: 1996-04-16
Filing date: 1997-04-15
Publication date: 2001-11-06
Also published as: EP0896548A1; AU723592B2; US5763267A; EP0896548A4; CA2251594C; AU2669597A; CA2251594A1; WO1997038777A1; KR20000005485A; NZ332317A

Abstract

(57)【要約】細胞懸濁液や三次元組織や他の生物学的組織を大規模に培養および包装するための装置が開示される。装置は、１つ以上の個別の培養ポケットを含む複数の可撓性の処理チャンバと、複数の剛性スペーサと、流体注入マニホルドと、流体排出マニホルドと、流体貯蔵器と、装置内の流体を輸送する手段とを含む。処理中、液体培地は、流体貯蔵器から注入マニホルドへと輸送される。次に注入マニホルドは、接続された処理チャンバのそれぞれに培地を均等に配分する。流体排出マニホルドもまた、各処理チャンバが確実に均等に充填され、処理中に生じたいかなる気泡も処理チャンバから確実に除去されるよう備えられる。処理チャンバは、エンドユーザに培養済み移植体のすすぎ時や使用時の扱いやすさを提供するために可撓性か半可撓性である。処理チャンバの可撓性のせいで、処理時にチャンバ内に流体を均等に配分するのを確実にする剛性スペーサもまた備えられる。

Description

【発明の詳細な説明】細胞懸濁液と三次元組織培養物の大規模生育と包装のための装置技術分野本発明は、細胞懸濁液と三次元組織培養物の大規模生育と包装のための装置に関する。特に本発明は、細胞および遺伝子に基づいた療法のための細胞懸濁液の大規模な培養とその包装だけでなく、様々な移植用途のためにヒューマンエンジニアによる（human-engineered）組織構成物の培養とその包装のためのシステムに関する。関連技術の記載代償（置換）療法用の組織の植え付けと培養は本技術分野で公知である。例えば、Naughtonらへの米国特許第5,266,480号は、異なる用途に適した様々な三次元組織を提供するために、三次元マトリックスの形成、所望の細胞のこのマトリックスへの植え付け、培養の維持を開示している。三次元組織には、火傷の被害者の治療や糖尿病にしばしば伴う皮膚潰瘍の治療に組織を用いることを含めて、数々の用途がある。細胞および遺伝子に基づいた療法のために人間または動物の細胞の懸濁液を培養することもまた本技術分野で公知である。例えば、"Effect of Autolymphocyt e Therapy on Survival and Quality of Life in Patients with Metastatic Re nal-Cell Carcinoma"The Lancet，Vol.335，No.8696，pp.994-98(April 28，1990)と題する記事には、懸濁したリンパ球を有糸分裂促進剤で処理した単核細胞の培養物の上清を含む培地で培養し、数日間生育させ、患者に注入する直前にガンマ線を照射する方法が開示されている。細胞および遺伝子に基づいた療法は、細胞を転移性腎臓癌の治療や腎細胞癌に用いることを含めて、数々の用途がある。従来の組織および細胞培養手段は、組織や細胞の生育に必要な期間を通して組織や細胞に栄養を与えるべく大間によって培地を監視および管理しなければならず、そのため一回に培養できる細胞や組織の量が限られるということで制限があった。例えば、"The In Vitro Growth of a Three-Dimensional Human Dermal R eplacement Using a Single-Pass Perfusion System"43 Biotechnology and Bio engineering 740-746(April 1994)と題する記事には、生育培地が平行に配置されたテフロン^TMバッグバイオリアクタを通過する閉鎖型シングルパス潅流システムが開示されている。各バツグバイオリアクタは、テフロン^TMフレームの上の生分解性メッシュを含み、その上に組織が生育する。記載の関連技術システムは、 16個のバッグリアクタを備えるが、成長する組織に損傷を与えないように注意して扱わなければならない。発明の要旨したがって、本発明の目的は、無菌状態で大規模培養、個別包装、冷凍、貯蔵、出荷、使用を可能にする便利な形態の、細胞葱濁液および三次元組織を大規模に培養および包装できるシステムを提供することである。本発明のさらなる目的は、培養の開始から最終使用まで閉鎖型の無菌環境を提供することである。本発明のまださらなる目的は、細胞懸濁液および組織の均一な培養のための一定の培養環境を提供することである。本発明によれば、細胞懸濁液および三次元組織の大規模培養および包装のための装置が提供される。本発明による装置は、複数の可撓性処理チャンバ、複数の剛性スペーサ、流体注入マニホルド、流体排出マニホルド、流体貯蔵器、流体を貯蔵器から処理チャンバへと運ぶ手段からなる。処理中、液体培地は、流体貯蔵器から注入マニホルドに運ばれ、次に連結された各処理チャンバへ注入マニホルドが培地を均等に分配する。確実に各処理チャンバが均等に充填され、培地の輸送中に生成した気泡が処理チャンバから確実に除去されるように、流体排出マニホルドも備えられる。処理チャンバは、気体透過性を有して最小の機械的部品の使用による大規模培養に対応するために、可撓性であれば有利である。処理チャンバの可撓性は、培養された移植体のすすぎ中および使用中の最終ユーザの扱いやすさを得させる点でもまた有利である。処理チャンバの可撓性のため、処理中の各チャンバ内への均等な流体配分を確実にする剛性スペーサもまた備えられる。このように、本発明は、細胞懸濁液、三次元組織およびその他の生物学的組織の大規模培養および個別包装のための無菌かつ均一な環境を維持するコンパクトで機械的に複雑でない装置を有利に利用する。図面の簡単な説明本発明のこれらおよび他の特徴、観点及び利点は、添付の図面を参照して読まれるべき下記の詳細な記述からよりたやすく明らかになるであろう。図面において、図１Ａ−１Ｄは、細胞葱濁液と三次元組織の大規模培養と包装のためのシステムの第１の具体的実施態様を示し、図１Ａおよび１Ｂは、そのシステムの斜視図であり、図１Ｃはシステムの一方のエンドプレートを取り除いた斜視図であり、図１Ｄは、１枚の剛性スペーサの他の実施態様である；図２Ａ−２Ｂは、処理チャンバの第１の実施態様を示し、図２Ａは処理チャンバの平面図であり、図２Ｂは処理チャンバの製作前の処理チャンバの部品の斜視図である；図３Ａ−３Ｄは、細胞懸濁液と三次元組織の大規模培養と包装のためのシステムの別の具体的実施態様を示し、図３Ａは剛性スペーサを含むシステムの斜視図であり、図３Ｂは剛性スペーサ無しのシステムの斜視図であり、図3Ｃは流体注入マニホルドの斜視図であり、図３Ｄは流体注入マニホルドの流体注入部品の斜視図である；図４Ａ−４Ｄは、培養システムに用いる剛性スペーサを示し、図４Ａはこの剛性スペーサの斜視図であり、図４Ｂはこの剛性スペーサの平面図であり、図４Ｃはこの剛性スペーサの側面図であり、図4Ｄはこの剛性スペーサの端面図である；図５Ａ−５Ｊは、細胞懸濁液と三次元組織の大規模培養と包装のためのシステムのさらに別の実施態様を示し、図５Ａはシステムの斜視図であり、図５Ｂは排出マニホルドを取り除いたシステムの斜視図であり、図５Ｃは流体注入マニホルドの底部の斜視図であり、図５Ｄは流体注入マニホルドの中央部の平面図であり、図５Ｅはマニホルドのためのロックプレートの平面図であり、図５Ｆは剛性スペーサの斜視図であり、図５Ｇは複数の剛性スペーサのための支持構造体の斜視図であり、図５Ｈは流体排出マニホルドの中央部の平面図であり、図５Ｉは流体排出マニホルドの上部の平面図であり、図５Ｊはシステム支持棒材の斜視図である；図６は、処理チャンバの別の具体的実施態様の平面図である；そして図７Ａ−７Ｂは、処理チャンバのさらに別の具体的実施態様の平面図であり、図７Ａは処理チャンバの平面図であり、図７Ｂは処理チャンバの製作前の処理チャンバの部品の斜視図である。発明の詳細な記載本発明の下記の実施態様は、細胞懸濁液と三次元組織の大規模生育と包装のための装置との関連で述べられているが、当業者には開示された方法および構成がより広い用途にたやすく適応できることが分かるであろう。異なる図面に関し同じ参照番号が繰り返される時は、そのような各図面中で対応する構成を示す。本発明によれは、移植体の生育および培養中、複数の処理チャンバにマニホルドで分配される。これらの処理チャンバは、気体透過性と、すすぎ中および使用中における培養された移植体の最終ユーザによる取扱いやすさを考慮して、可撓性があることに利点がある。しかしながら、可撓性のある処理チャンバは、処理中チャンバ内の一定の培養環境を維持するには理想的ではない。例えば、処理中、封入された移植体から破裂のおそれがある気泡を除去するのを促進するためにチャンバを垂直に配置すれば、可撓性のチャンバは底が膨れるだろう。処理中のこのチャンバの変形は、移植体に対して不規則で不均一な培養環境を作り出す。さらに、チャンバの変形は、膨張性及び気体透過性のあるチャンバの酸素移動（ oxygen transfer）のための表面積を変化させ、培地の一定体積あたりの細胞および組織の均一な産生を損なう可能性がある。したがって、処理中の各チャンバ内への均等な流体分配を確実にできる剛性スペーサが備えられる。より具体的には、流体の適切な分配は、正確に形成され規格された剛性のチャンバを使った場合とほぼ同じように各チャンバ内に流体が均等分配される形態に、システムの各処理チャンバを剛性スペーサの間に位置させることによって維持される。前記によれば、図１Ａ−ＡＤは、細胞懸濁液や三次元組織のような生物学的組織の大規模培養と包装のためのシステム１００を開示する。発明の第１の実施態様によれば、このシステムはまず、複数の処理チャンバ１０６と、複数の剛性スペーサ１０７と、流体注入マニホルド１０８と、オバーフローバッグ１１２及び通気フィルタ１１４の両方に接続された流体排出マニホルド１１０と、流体貯蔵器１０２と、流体貯蔵器から処理チャンバへ流体を搬送するポンプ１０４のような手段からなる。流体貯蔵器１０２はシステムのために流体を貯えるのに用いられる。例示の適切な貯蔵器は、任意の可撓性１リットル培地バッグであるが、当業者であれば滅菌が可能な流体容器ならいかなる物でも用いてよいことが理解できるであろう。このシステムで用いてよい流体の例として、細胞を含む流体や培養培地を含む流体、様々な冷凍用溶液を含む流体があげられるが、これに限定されるものではない。培養中、流体は人間の体温に保ち得ることが有利であることか理解されるであろう。貯蔵器１０２に入れられた流体は、ポンプ１０４のような流体輸送方法によって流体管路１０３を通じて取り出される。ここでは発明の構成と機能の説明にポンプ１０４を用いているが、流体を運ぶ他の適切な手段もまた本発明の範囲に入ることを理解するべきである。例えば、屋内供給用（house supply）の清浄な圧縮窒素等の圧縮ガスの通常の供給源を用いて流体を貯蔵器１０２から流体管路１０３へ送り出してよい。また、処理チャンバやマニホルドより高い位置に置かれた流体貯蔵器から重力によって流体を移動させてもよい。流体管路１０３ばかりでなくシステムの他のすべての流体路は、使用する流体の輸送に適切ないかなる種類の滅菌可能な耐久性のある管で形成されてよい。ポンプ１０４は、可変の２方向性の流量を実現できるいずれかの流体ポンプであることが好ましい。そのようなポンプの１つは、Cole-Palmer製のMaster flex L/S Digital Drive蠕動ポンプであるが、当業者であれば、種々の市販のポンプから選択することができるであろう。ポンプ１０４は貯蔵器１０２から流体管路１０５を介して流体注入マニホルド１０８へ流体を送り込む。図１Ａから図１Ｃに示すように、複数の処理チャンバ１０６は、流体注入マニホルド１０８を利用して一度に分配してよい。流体注入マニホルド１０８は、このマニホルドに入るいかなる気泡もマニホルド内に捕らわれることがないように都合よい角度および形状にすることができる。複数の処理チャンバ１０６の充填時にチャンバへの流体の適切な分配を確実にするため、システム１００は垂直方向に向け、注入マニホルド１０８が処理チャンバ１０６と排出マニホルド１１０の直下にくるようにするべきである。システム１００がこのように向けられると、システム内の流体が相互に連結された処理チャンバ間で重力によって釣り合うことになる。図２Ａに示すように、処理チャンバ１０６の注入口に長さの短い小径のチュービング２０２が用いられてよい。排出マニホルド１１０を流体貯蔵器１０２に戻して接続することによってシステムが連続流体循環モードで運転されるのであれば、この小径のチュービング２０２は、各処理チャンバと注入マニホルド１０８の間で圧力の降下を起こすので有利である。この圧力の降下はさらに、処理中のチャンバ１０６内への適切な流体の配分をもたらす。この連続流体循環モードにおいて、チュービング２０２の最適な直径と公差は、少なくとも部分的に、処理中に用いられる実際の流体流量と注入マニホルド１０８の寸法によるであろう。図２Ａから２Ｂは、システム１００の中で多岐接続（manifolded)され得る処理チャンバ１０６の第１の実施態様を示す。図２Ａから２Ｂに示すように、処理チャンバ１０６は、注入口２０２と排出口２０４を含む。処理チャンバ１０６はまた、複数の組織基台（scaffold）２０６を収容する形状および寸法にしてもよい。組織基台２０６は生物学的適合性のあるメッシュ材料からなるのが好ましい。適切な材料には、ニュージャージー州サマービルのEt hicon社製造のVicryl^TM、マサチューセッツ州マンスフィールドのAlbany Intern ational社およびコネティカット州ダンベリーのDavis&Geck製造のポリグリコール酸（PGA）メッシュがあげられる。基台２０６は、メッシュが処理中、適所に保持されるよう処理チャンバ１０６内にその角（図２Ａの点Ａ）をスポット溶接またはバー（bar）溶接してよい。また、基台２０６は、処理チャンバそれ自体の制作時に溶接部の間に挟み込んでもよいし、剛性または半剛性フレーム構造に溶接または縫合してよい。この剛性または半剛性フレーム構造は、処理チャンバに溶接されるか、または各培養ポケットを画定する外部溶接によって単に処理チャンバ内に収めておくことができるであろう。特により薄い組織基台の場合、基台のチャンバーへの固定は、組織が瘤状になったりカールしたりする原因になりうる収縮力に対抗することが処理中重要となる。生物学的適合性のあるVicryl^TMやPGAメッシュに加えて、基台２０６はまた、D ow-Hickam製造のBiobrane^TM等のナイロンとシリコンゴムの組み合わせで構成してもよい。これらのシリコンゴム膜は使用時、人工表皮として働き、膜の１方の面に培地が接する生育系を必要とするだけである。したがって、処理チャンバ１０６にBiobrane^TM材料を使用した場合、Biobrane^TM材料は内部表面チャンバに直接置くことができ、静電気力及び疎水性による力によって適切な位置を保つので、スポット溶接は不要である。 PGAメッシュ、Vicryl^TMおよびBiobrane^TMのみを開示してきたが、当業者は、他の種類のメッシュや支持構造体もまた本発明の範囲内で可能であることを理解するであろう。また、図２Aと２Bは６つの基台２０６のみを収容するチャンバ１０６を示しているが、当業者は、任意の数の基台２０６を処理チャンバ１０６の中に収容してよいことも理解するであろう。また、細胞に基づいたいくつかの療法において、基台を置く必要がないかもしれないことも理解されるべきである。図２Bに示すように、処理チャンバ１０６は、２片のフィルム２１０を所定のパターンに溶接して作ってもよい。フィルム２１０は、生物学的適合性がなければならないし、下記にさらに詳細に説明する滅菌／培養および冷凍／解凍サイクル下で構造的、組成的一体性を保たなければならない。要するに、フィルム２１０は、培養に先立って処理チャンバ１０６を滅菌するための照射処理、化学的処理または熱処理に耐えられなければならない。また、フィルム２１０は、培養した細胞または組織の保存に必要な温度−７０℃以下での冷凍および貯蔵のみならず、それに続く、細胞または組織を使用する必要ができた時の室温または体温への解凍に耐えられるべきである。培養中に静止流体系が用いられることもあるので、フィルム２１０はまた、組織の成長を持続するために気体透過性でなければならない。またフィルム２１０は、熱溶接、RF溶接および超音波溶接を含む、信頼性があり利用し易い封止および溶接方法に適応可能なものでなければならない。上記の要件を満たす可撓性材料はどのようなものでも好ましく処理チャンバ１０６の構成のために考慮してよい。すでに述べたように、複数の処理チャンバは、培養済みの移植体のすすぎ中および使用中のエンドユーザによる扱いの容易性を考慮して、可撓性であることが有利であるかもしれない。条件に合う可撓性材料の例として、ポリオレフィン類、ポリオレフィン共 FE、FEP、高密度ポリオレフィン類および熱成形プラスチックスがあげられる。中でもEVAとEVA共重合体の配合物が、低コスト、製造のたやすさ、光学的透明さから非常に好ましい組織の適切な成長と培養を確保するために処理チャンバ１０６は、気泡が基台２０６の近くに留まらないように形成されるべきである。図２Aと２Bに示すように、培養中の垂直の配置向きと共に（水平配置向きもまた用いてもよく、本発明の範囲に含まれるであろうが、好ましい処理手段ではない）、培養ポケット２１０に沿って傾斜した辺（好ましくは５度以上）を含む好ましいパターンが、培養流体の中に含まれる破裂のおそれがある気泡をチャネル２１２と排出口２０４の方へ、したがって培養ポケット２１０と組織基台２０６から遠くに導く。処理チャンバ１０６はまた、フローチャネル２１２に溶接された島状部位２１４を含んでもよい。これらの島状部位２１４は、処理後に培養ポケット２１０を個々の貯蔵チャンバに分けるために行われる溶接の量を減らすので有利である。島状部位２１４はまた、（図１Cに示すような）支持棒材１１１のために開口を提供し、流体が処理チャンバの中央を単に流れるのを防ぐ（すなわち、流体が横の培養ポケットに向けられる）ので有利である。図２Aの点Bは、処理後に溶接が生じるのが好ましい場所を示し、したがって島状部位２１４によって提供される処理後の溶接の省力を示す。前述のように、処理中の垂直の配置向きは、破裂のおそれがある気泡を基台２０６から離すのに役立つであろう。しかしながら、垂直の配置向きはまた、可撓性で膨張性のあるチャンバ１０６の底部近くに流体を集める。したがって流体の適切な量と分配は、各処理チャンバ１０６を剛性スペーサ１０７の間に置くことによって有利に維持される。剛性スペーサ１０７は、処理チャンバ内に均等な流体分配を維持する一方で適切な気体および熱伝搬が起るように、図１Aから１Cに示すように波形にしてもよいし、また図１Dに示すように穿孔を有してもよい。チャンバ１０６をスペーサ１０７の間に位置させることはまた、チャンバどうしの接触、およびチャンバと細胞または組織の処理を監視している職員との接触を最小限にするという点で利点がある。接触を最小限にするのが好ましいのは、そのような接触が処理チャンバの損傷を引き起こし、及び／または、危険性のある、処理チャンバの内容物を職員にさらすこともあるからだ。図１Ａから図１Ｃに示すように、複数の処理チャンバ１０６およびスペーサ１０７は、各処理チャンバにおいて所定の流体の分配および流量を得るために必要な力を正確に加えるための構造安定性と剛性を提供するエンドプレート１０９および棒材１１１によって支持されてもよい。エンドプレート、棒材およびスペーサの組み合わせは、可撓性を持つ処理チャンバの工程中の偶発的な破裂を防止する剛性の構造を提供し、従って無菌かつ安全な細胞および組織の培養を促進する上でさらに有利である。エンドプレート１０９は、スペーサ１０７のように、エンドプレートに直接向かい合って配置された処理チャンバ内での処理中の適度な気体や熱の移動を確保するように穿孔を有する形状または波状でもよい。スペーサ１０７、エンドプレート１０９および棒材１１１は、スチレン、アルミニウム、マグネオレフィンまたはステンレス鋼などの剛性および耐久性のあるいずれの物質から構成されていてもよい。別の実施態様では、エンドプレート１０９および棒材１１１は構造的一体性を確保するための手段として使用されない。この別の実施態様では、棒材とエンドプレートを組み合わせた場合にみられた構造と類似の剛性構造を確保するような公知の方法によりスペーサ１０７を注入マニホルド１０８および排出マニホルド１１０に取り付けるだけでよい。使用中、一旦全ての処理チャンバ１０６が貯蔵器１０２からの流体で充填されると、流体は処理チャンバ１０６から排出口２０４を通過し流体排出マニホルド１１０へ排出される。流体排出マニホルド１１０はシステムからの過剰な空気及び流体を除去するためにオーバーフローバッグ１１２及び／またはエアフィルタ１１４に接続されてもよい。流体貯蔵器１０２のように、オーバーフローバッグ１１２は可撓性プラスチックの１リットル培地バッグで構成されてもよいが、殺菌可能な容器であればどんなものでもよい。あるいは前記のように、システム１００は流体が取り出される貯蔵器と流体を受け入れる貯蔵器の両方として機能するただ１つの流体貯蔵器を有してもよい。この形態では、一旦流体培地がシステムから除去される用意ができると、流体は単にポンプ方向を逆にするかまたは重力を利用することにより流体貯蔵器へ送られ、システムから排出される。この単一貯蔵器構造では閉鎖型の無菌でコンパクトな培養環境が有利に提供される。排出マニホルド１１０はまた、処理中に必要とされない気泡のシステムからの除去を促進し、処理チャンバ１０６への均一で急速な充填を促進するエアフィルタ１１４に接続されてもよい。処理チャンバ１０６内での細胞懸濁液や三次元組織の植え付け及び培養は一般的に、ここに開示する新規で大規模な培養方法で得られた成果及び有益性を公知の方法に加えて行われる。三次元細胞培養物の成長のための適切な植え付け及び培養の方法は、米国特許第５、２６６、４８０号に開示され、引例としてここに組み込まれる。米国特許第５、２６６、４８０号に記載の三次元マトリックスに所望の細胞を接種し培養を維持する三次元マトリックスの製造方法も当業者によって本発明を使用するために容易に適用されるだろう。細胞主体または遺伝子主体の治療用細胞懸濁液の公知の培養方法もまた本発明を使用するのに容易に適用されるだろう。一旦全ての処理チャンバ内がここに記載される構造と公知の植え付け・培養技術により適切な植え付け及び培養用の培地に充填されると、上部マニホルド１１０とオーバーフローバッグ１１２を接続するチュービング、オーバーフローバッグ１１２と通気フィルター１１４を接続するチューヒング及び注入マニホルド１０８とポンプ１０４を接続するチュービング１０５がクランプ止めされる。一旦このチュービングがクランプ止めされると、システム１００は培養中の細胞懸濁液を維持し、培養中に組織基台の均一な植え付けを確保するためにシステムの１つの軸線に沿って回転させてもよい。組織培養の場合、一旦組織基台が均一に植え付けられると、システムは残りの培養工程において回転させてもよいか、必ず回転させる必要はない。細胞と組織の植え付け及び培養中、システム１００は所望の成長状態を得るために温度や酸素及び二酸化炭素濃度などの環境要素が適宜制御される制御環境内に有利に置かれてもよい。一旦組織基台が所望の細胞密度に達すると、培地はシステムからポンプでシステム外へくみだされ、組織の冷凍保存を促進するため凍結溶液と置き換えられる。処理チャンバが凍結溶液で充填されると、処理チャンバの注入口２０２及び排出口２０４は、システム１００から分離可能な封止された処理チャンバを形成するため封止されてもよい。基台の形成を必要としない細胞懸濁液の培養の場合には、細胞懸濁液を含む処理チャンバ１０６への凍結溶液の注入は必要はなく、単に封止するだけでよい。一旦封止された処理チャンバ１０６がシステム１００から分離されると、各培養ポケット２１０は封止され、上記のように分離される。これらの各ポケットは上記既存の溶接方法により封止でき、公知のダイカット法または断裂シール(tea r seals)を使用することにより分離できる。その後各ポケットは、医療用途に応じた公知の冷凍法により冷凍されるかまたは全ての処理チャンバが１つの単位として冷凍されてもよい。このように、封止済み処理チャンバ１０６は細胞、組織培養及び他の生物学的組織の培養、貯蔵及び出荷に使用してもよい。図３Ａから３Ｄに細胞懸濁液及び三次元組織の大規模な培養方法とその包装のためのシステムの別の具体的実施態様を開示する。この別の実施態様３００は、まず流体貯臓器１０２、ポンプ１０４、複数の処理チャンバ１０６、複数のスペーサ３０６、流体注入マニホルド３１２、流体排出マニホルド３１４、オーバーフローバッグ（エンドプレート３１０に埋め込まれていてもよい）及び通気フィルター３１５からなる。流体貯蔵器１０２とポンプ１０４は図１Ａから１Ｄとともに上記された方法と同じ方法により機能する。より詳細には貯蔵器１０２はシステムのための流体を貯蔵し、ポンプ１０４はシステムに流体を供給し、システムから流体を回収するために使用される。ここではポンプ１０４を用いて本発明の構造及び機能を説明したが、流体を移動させるための他の適切な手段も本発明の範囲に入ることは理解されるべきである。図３Ａに示すように、流体注入マニホルド３１２は上記図２Ａから２Ｂを参照して記載した複数の処理チャンバ１０６（図３Ａには図示せず）を多岐接続するために使用されてもよい。流体注入マニホルド３１２を図３Ｃ及び３Ｄに詳細に示す。図３Ｃ及び３Ｄに示すように、流体注入マニホルドはロックプレート３２４、接続プレート３２２及び流体注入部分３２０からなる。ロックプレート３２４は成長チャンバと流体マニホルド間のチュービング２０２を固定するために使用される。特に、チュービング２０２は接続プレート３２２中の複数の開口３３０うちのの１つにしっかりと適合可能である。接続プレート３２２は、図３Ａ及び３Ｂに示すように、流体マニホルド３１２とエンドプレート３０９とを固定するために機能する。流体注入部分３２０はシステム内の流体貯蔵器から各開口３３０、そこから各処理チャンバ１０６への流体の流動を促進するための縦方向に伸びる流体チャネル３２１と流体注入口３２３を有する。流体チャネル３２１はマニホルドそのものに気泡が閉じこめられないことを確実にするように形成することが好ましい。図３Ａ及び３Ｂに示すように、処理チャンバ１０６と剛性のスペーサ３０６は棒材３０８及びエンドプレート３０９、３１０により支持されてもよい。このエンドプレートと棒材の組み合わせにより処理中における各チャンバ内に所定の流体分配を行うために処理チャンバ１０６に正確に力を加えるために必要な構造安定性と剛性が提供される。より詳細には、処理中のチャンバ１０６を垂直方向に配置することで可撓性チャンバ内の流体がチャンバの底部近傍に重力によって溜まる。従って、エンドプレート３０９、３１０と棒材３０８の組み合わせにより同様に固定される剛性スペーサ３０６の間に各処理チャンバ１０６を配置させることにより、適切な流体分配が有利に維持される。図４Ａから４Ｄには、剛性のスペーサ３０６の具体的実施態様を示す。図４Ａから４Ｄに示すように、スペーサ３０６はエンドプレート３０９及び３１０の溝３１６と摺動可能に嵌合するセクション４０２を有する。セクション４０２はこの嵌合を促進するように平滑な外部表面を有することが好ましい。スペーサ３０６は、また、端部４０５によって取り付けられた二つの平坦な表面４０４からなる中央部を有する。端部４０５は表面４０４間の所定の幅を不撓に支持する。また表面４０４は処理中のチャンバチュービング２０２と２０４へ容易にアクセスできる半円部４１０を有する。この容易なアクセスは流体分配の目視による観察と、処理後であってシステムから分離する前のチュービング２０２及び２０４の溶接に有利である。加えてエンドユーザが、たとえば、サイドポート（図２Ａに示す）などを処理チャンバに取り付けることを考慮して、表面４０４は開放部４１２を有していてもよい。また、表面４０４は処理中、処理チャンバ１０６からの適切なガスや熱の移動を行うが、チャンバ内での均一な流体分配の維持を損なわない穿孔部４０６を表面４０４との間に間隔を設けて有していてもよい。適切な穿孔パターンとしては、６０度パターンで５０％が外気に開かれた、直径０．５インチ以下の開口を有するものが挙げられる。しかし、当業者であれば、他の穿孔パターンも同様に適宜使用することができることを理解するであろう。これらの穿孔部４０６は、基台２０６または細胞懸濁液が占有する処理チャンバ１０６の領域と接する領域内に配置されると有効である。スペーサ３０６はステンレス鋼、からなることが好ましい。一旦全ての処理チャンバ１０６が流体で充填されると、流体はチャンバ１０６から排出口２０４を通り流体排出マニホルド３１４へ排出される。流体排出マニホルド３１４は、上記の図１Ａ〜１Ｄを参照して記載された排出マニホルド１１０のように、オーバーフローバッグ（エンドプレート３１０に埋め込まれていてもよい）及び空気通気フィルタ３１５と接続されていてもよい。さらに、システム３００は、流体が取り出される貯蔵器と流体を受け入れる貯蔵器の両方に機能する１つの流体貯蔵器を有していてもよい。処理チャンバ１０６内での細胞または組織基台２０６の植え付け、培養、冷凍および貯蔵は、一般的にシステム１００を参照して上記に記載された技術により行われる。加えて、細胞または組織の培養中、システム３００はシステム１００のように、所望の成長状態を得るために必要な温度、酸素および二酸化炭素濃度などの環境要素が制御された制御環境内に有利に置かれてもよい。図５Ａから５Ｊには細胞懸濁液および三次元組織の大規模な培養方法とその包装のためのシステムのさらに別の具体的実施態様を開示する。本発明のこのさらに別の実施態様５００によると、システムはまず流体貯蔵器１０２、ポンプ１０４、複数の処理チャンバ６００、複数のスペーサ５１２、流体注入マニホルド５１４、および疎水性エアフィルタ５２２に接続された流体排出マニホルド５０２からなる。流体貯蔵器１０２とポンプ１０４は図１Ａから１Ｄを参照して上記に記載された方法と同じ方法により機能する。図５Ａから５Ｊに示すように、流体注入マニホルド５１４は複数の処理チャンバ６００に多岐接続するために使用されてもよいが、その具体的実施態様は下記の図６を参照して記載される。注入マニホルド５１４はロックプレート５０８、中央部５１８、底部５２０からなる。中央部５１８および底部５２０は流体マニホルドチャネルを形成し、ロックプレート５０８はマニホルドそのものに処理チャンバ注入口を固定するように適合され形成される。加えて、封止マニホルドチャンパを形成するためのＯリングが溝５３５（図５Ｃに示す）に配置されてもよい。ポンプ１０４と流体路１０５からの流体は、注入口５３３を通り注入マニホルド５１４へ入る。この際、１つの注入口を注入口として用い、他の注入口をシステムから流体を排水するために排出口としてもよい。流体は注入口５３３からチャネル５３４を通り（図５Ｃに示す）複数の開口５３０、５３２（図５Ｄおよび５Ｅに示す）を通ってもよい。この方法では、流体は流体貯蔵器１０２から付属の各処理チャンバ６００に均一に分配される。前記のように、処理中の処理チャンバの垂直方向の重力により可撓性チャンバ内の流体がチャンバの底部近傍に溜まる。従って、スペーサ支持材５１０により同様に固定されている剛性のスペーサ５１２の間に各処理チャンバを配置することにより、適切で均一な流体分配が有利に維持される。図５Ｆおよび５Ｇはそれぞれ、剛性のスペーサ５１２とスペーサ支持材５１０の好ましい実施態様を開示している。図５Ｆに示すように、スペーサ５１２は二つの平坦な表面の間に所定の幅をもつ隙間５１３を形成する。処理中の適切な流体分配を確保するため、この隙間５１３内に処理チャンバ６００が配置されてもよい。これらのスペーサの表面は処理中、スペーサ５１２の間隔とともに処理チャンバ６００からの適切なガスまたは熱の移動を行うが、チャンバ内の均一な流体分配の維持を損なわないように波状かまたは表面上に穿孔を有してもよい。前記のように、適切な穿孔パターンとしては、６０度パターンで５０％が外気に開かれた、直径０．５インチ以下の開口を有するものが挙げられる。しかし、当業者であれば、他の穿孔パターンも同様に適宜使用することができることを理解するであろう。これらの穿孔を有する領域は組織基台や細胞懸濁液で占有されたチャンバ内の領域と接触するスペーサの領域内に配置される。スペーサ５１２はシステム５００の他の構成要素と同性の物質からなることが好ましい。処理中、一旦全ての処理チャンバ６００が流体で充填されると、流体は処理チャンバから排出口を通って流体排出マニホルド５０２へ排出される。流体排出マニホルド５０２は、上記図１Ａから１Ｄを参照して記載の排出マニホルド１１０のように、オーバーフローバッグおよび空気通気フィルタに接続されていてもよい。また、図５Ａに示すように、システム５００は排出マニホルド５０４内に固定されてもよい１つの空気フィルタ５２２を有していてもよい。さらに別の実施態様では、システム５００は流体が取り出される貯蔵器と流体を受け入れる貯蔵器の両方として機能する１つの流体貯蔵器を有していてもよい。排出マニホルド５０２はロックプレート５０８、中央部５０６および上部５０４からなる。ロックプレート５０８は処理チャンバ６００の排出口の排出マニホルドへの確実な取り付けを行い、中央部５０６および上部５０４はマニホルドの流体チャネルを形成する。さらに、上記のように空気フィルタ５２２を収容するために使用されてもよい封止済み排出マニホルドチャンバを形成するためにＯリングが溝５３８に配置されていてもよい。図５Ｂおよび５Ｊにも示すように、処理チャンバ６００および剛性のスペーサ５１２は注入マニホルドおよび排出マニホルドと同様、支持棒材５２３により支持されてもよい。マニホルド５０２、５１４および棒材５２３の組み合わせにより、処理中、各処理チャンバ内での所定の流体の量および分配を行うために正確に力を加えるために必要な構造安定性および剛性が提供される。システム５００の処理チャンバ６００内の組織基台２０６の植え付け、培養、冷凍および貯蔵は一般的に、システム１００を参照して上記に記載される技術により行われる。また、細胞や組織の培養中、システム５００はシステム１００および３００と同様、所望の成長状態を得るために温度および酸素や二酸化炭素濃度等の環境要素が適宜制御される制御環境内に置かれると有効である。図６には単独で使用されるかまたはシステム１００、３００および５００などのシステムに多岐接続される処理チャンバのさらに別の実施態様を示す。図６に示すように、処理チャンバ６００は注入口６０２と排出口６０４の両方を有する。処理チャンバ６００は上記図２Ａおよび２Ｂを参照して記載されるように、組織基台２０６を収容するように形成、成型される。また上記のように、基台２０６は処理中、定位置に保持されるようにチャンバ６００との接触点でチャンバ内に適宜、スポット溶接される。基台２０６はまた、処理チャンバそのものを形成する時に溶接部間に挟まれていてもよいし、剛性または半剛性のフレーム構造に溶接またはステッチ止め(stitched)されていてもよい。このフレームは、処理チャンバに溶接されるかまたは各培養ポケットを区分する外溶接部によりチャンバ内に固定される。処理チャンバ１０６と同様に、処理チャンバ６００は二つの可撓性フィルムを所定の形状に溶接することにより形成される。このフィルムは生物学的適合性のもので詳細に上記に記載された殺菌／培養および冷凍／解凍サイクル下で構造的および組成的な完全性を維持することができるものでなければならない。培養の際には静止流体系を使用することもあるので、フィルム２１０は組織成長を持続させるために気体透過性でなければならない。また、フィルム２１０は熱溶接、高周波溶接および超音波溶接などの確実で容易に利用可能な封止および溶接方法に対して適応しやすいものでなければならない。チャンバ６００の構成としては、上記の要求を満たすものであれば、いかなる可撓性物質でもよい。また前記のように、複数の処理チャンバは培養された移植組織の容易な洗浄および使用法をエンドユーザに提供するために有利な可撓性を有してもよい。適用できる可撓性物質としては、ポリオレフィン、ポリオレフィン共重合体、ＥＶＡとＥＶＡ共重合体の配合物、Ｅｘおよび熱成形プラスチックが挙げられるが、ＥＶＡとＥＶＡ共重合体の配合物が低コストであり、製造し易く光学的に透明であることから非常に好ましい。組織の適切な成長および培養を確保するために、チャンバ６００は処理中に気泡が基台２０６近傍にとどまらないような形状、寸法に形成される。図６に記載の好ましい形態は垂直方向に対して傾斜した先端および底部を有しており（好ましくは≧５°）、培養中、培養液に潜在的に含有される有害な気泡を排出口６０４に導き、組織基台２０６から除去することを確実にする。図７Aおよび７Bは、処理チャンバの第３の実施態様を示し、このチャンバは個別に利用してもよいし、またシステム１００、３００、５００等のシステム中で多岐接続するようにしてもよい。図７Aおよび７Bに示すように、処理チャンバ７００は注入口７０１と排出口７０３を含んでよい。しかしながら、処理チャンバ７００がシステム１００、３００等の多岐接続される構成で用いられるのでなければ、処理チャンバ７００は注入口と排出口との両方を含む必要はない。処理チャンバ７００はまた、組織基台７０６を収容する形状および寸法にしてもよい。組織基台７０６は、基台２０６同様に生物学的適合性のあるメッシュ材料からなるのが好ましい。適切なメッシュ材料にはVicryl^TMメッシュ、ポリグラクチン（polyglactin）またはPGAメッシュがあげられる。特により薄い組織基台については、組織が固まったり収縮したりする原因になる収縮力に対抗するために基台をチャンバに固定することが処理中大切なことである。したがって、基台７０６をフレーム構造７０４のいずれかの面に取り付けてもよい。フレーム構造７０４は、図７Aおよび７Bに示すように格子型に形成してよいが、当業者は、様々な医療現場では他の型が適切かもしれないと分かるであろう。基台７０６は、いかなる方法でもフレーム構造７０４に取り付けてよいが、RFまたは,超音波、熱溶接等確立された溶接方法が好ましい。生体吸収性(bioabsorbable)のVicryl^TMおよびPGAメッシュに加えて、基台７０６はBiobrane^TM等のナイロンとシリコンゴムの組み合わせからなってもよい。Bi obrane^TMは、培地が膜の１面に接する生育系を必要とするだけであり、静電力と疎水性による力のため正しい位置を維持するのでBiobrane^TM材料はフレーム構造７０４の表面に直接置くことができる。前述のように、Biobrane、PGAメッシュ、Vicryl^TMメッシュのみが開示されたが、当業者は他の組織の種類や支持構造体が本発明の範囲で可能なことを理解するだろう。図７Bに示すように、処理チャンバ７００は、フレームのついた基台７０６を２片のフィルム７０２の間に溶接して作製してよい。フィルム７０２とフレーム構造７０４は、生物学的適合性で、かつ上記に詳細に述べた滅菌／培養および冷凍／解凍サイクル下で構造上および構成上の一体性を維持できなければならない。培養中に静止流体系を用いることがあるので、フィルム７０２は組織のために生育を支えるよう気体透過性であるべきである。最後に、フィルム７０２は、確実かつ利用しやすい封止方法や溶接方法に適応しやすいものであるべきである。好ましくは、上記の要件を満たす材料はどれでもチャンバ７００の構成に考慮してよい。条件に合った材料の例には、ポリオレフィン類、ポリオレフィン共重合体類、EVAとEVA共重合ン類、熱形成プラスチックがあげられるか、EVAとEVA共重合体配合物がその低いコスト、製造しやすさ、光学的透明さから非常に好ましい。ここには本発明の様々な実施態様を記載してきたが、これらの記載は説明する目的のものであって、制限するものではない。したがって、当業者には、記載してきたような本発明に下記の請求項の範囲から離れることなく変更を加えてもよいことが明らかであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年５月１９日（１９９８．５．１９）【補正内容】請求の範囲１．流体の流入のための第1の口、流体の流出のための第2の口および組織の生育のための少なくとも１つの区画を定めるように所定の境界に沿って結合された可撓性の前方および後方シートからなる複数のグロース・チャンバと、各複数のグロース・チャンバ中に設置される、三次元組織の生育を促進するようにデザインされた少なくとも１つの基板と、可撓性のグロース・チャンバ中への流体の均等な配分を維持し、これによって細胞と組織の均等な生育を促進するように、可撓性のグロース・チャンバに接触させた複数のスペーサ部材と、注入口及びグロース・チャンバの第1の口に合わせた複数の排出口を備えた、グロース・チャンバに均一に流体を供給するための注入マニホルドと、グロース・チャンバの第２の口にそれぞれ合わせた複数の注入口を備えた排出マニホルドと、複数のスペーサ部材を注入および排出マニホルドにつなぐための支持部材とからなる装置。２．グロース・チャンバが、それぞれが基板を収容する形状および寸法である、グロース・チャンバ内の複数の生育区画と、複数の生育区画と第1及び第2の口とを流体的に接続する内部流路とからなる請求項１の装置。３．注入マニホルドの注入口と流体連通する流体の供給源と、注入マニホルドの注入口に流体を供給するための流体輸送手段とをさらに含む請求項１の装置。４．流体輸送手段が流体ポンプからなる請求項３の装置。５．スペーサ部材間の所定の距離を持続し維持する形状および寸法である第2の支持部材をさらに含む請求項１の装置。６．スペーサ部材が部材間の所定の距離を持続し維持する形状および寸法である請求項１の装置。７．注入および排出マニホルドかスペーサ部材間の所定の距離を持続し維持する形状および寸法である請求項１の装置。８．支持部材がスペーサ部材と注入および排出マニホルドからなる請求項１の装置。９．支持部材が、スペーサと注入および排出マニホルドを接続するための棒材である請求項１の装置。１０．排出マニホルドが、処理中に装置から空気を除去するためのエアフィルタをさらに含む請求項１の装置。１１．排出マニホルドが、排出マニホルドに入る過剰な流体を受け入れるためのオーバーフロー容器と流体連通する排出口をさらに含む請求項１の装置。１２．排出マニホルドが、装置内に閉鎖型の流体環状路を形成するために流体供給源と流体連通する排出口を含む請求項３の装置。１３．可撓性の前方および後方壁によって画定される、それぞれが流体を流すための第1の口及び第2の口を有する複数のグロース・チャンバと、複数のグロース・チャンバのそれぞれに設置される、三次元組織の生育を促進するようにデサインされた少なくとも1つの基板と、注入口及びそれぞれがグロース・チャンバの第1の口と１つと流体連通している複数の排出口とを備えた注入マニホルドと、注入マニホルドの注入口と流体連通している流体供給源と、注入マニホルドの注入口へ流体を供給するための流体輸送手段と、それぞれがグロース・チャンバの第２の口の1つと流体連通している複数の注入口を備えた排出マニホルドとからなる組織の生育を促進するための装置。１４．グロース・チャンバのそれぞれが、所定の境界に沿って結合された可撓性の前方および後方の壁によって画定される複数の生育区画と、複数の生育セルを流体的に接続し、さらに複数の生育区画と第1および第2の口を接続する内部通路とをさらに含む請求項１３の装置。１５．グロース・チャンバ内への均等な流体分配が維持されるように、各複数のチャンバの前方および後方壁と接触して位置させた複数のスペーサ部材をさらに含む請求項１３の装置。１６．排出マニホルドが、処理中に装置から空気を無菌除去するためのエアフィルタを含む請求項１３の装置。１７．閉鎖型の流体接続が、流体供給源と流体輸送手段との間、流体輸送手段と注入マニホルドとの間、注入マニホルドの各排出口のそれぞれとチャンバの第1の口の１つとの間、チャンバの各第2の口と排出マニホルドの注入口の1つとの間に提供される請求項１３の装置。１８．排出マニホルドが、排出マニホルドに入る過剰な流体を受け入れるためのオーバーフロー容器と流体連通する排出口をさらに含む請求項１３の装置。１９．排出マニホルドが、装置内に閉鎖型の流体環状流路を形成するために流体供給源と流体連通する排出口をさらに含む請求項１３の装置。２０．複数のスペース部材を注入および排出マニホルドと接続するための支持部材をさらに含む請求項１５の装置。２１．支持部材が、スペーサ部材と注入および排出マニホルドからなる請求項２０の装置。２２．請求項１から２０までのいずれかによる装置を用いることを特徴とする細胞と組織の培養およびその生育の促進のための方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者アップルゲート，マーク，エーアメリカ合衆国カリフォルニア 92107、サンディエゴ、サラトガアベニュ 4468 (72)発明者フラット，ジェームス，エイチアメリカ合衆国カリフォルニア 92014、デルマール、ハーフムーンベイドライブ 14121 (72)発明者アップルゲート，ドーン，オーアメリカ合衆国カリフォルニア 92107、サンディエゴ、サラトガアベニュ 4468 (72)発明者ブルーム，ニコルアメリカ合衆国カリフォルニア 94110、サンフランシスコ、ゲァレイロストリート 925、アパートメント 11 (72)発明者バウムガートナー，マークアメリカ合衆国カリフォルニア 92126、サンディエゴ、チャーマントドライブ 7215，915番

Claims

【特許請求の範囲】１．第１と第２の流体口を含む可撓性のグロース・チャンバ中の細胞と組織の培養およびその生育の促進のための装置であって、可撓性のグロース・チャンバ中への流体の均等な配分を維持し、これによって細胞と組織の均等な生育を促進するように、可撓性のグロース・チャンバに接触させた複数のスペーサ部材と、注入口及びグロース・チャンバの第１の口に合わせた複数の排出口を備えた、グロース・チャンバに均一に流体を供給するための注入マニホルドと、グロース・チャンバの第２の口にそれぞれ合わせた複数の注入口を備えた排出マニホルドと、複数のスペーサ部材を注入および排出マニホルドをつなぐための支持部材とからなる装置。２．複数のグロース・チャンバをさらに含み、このグロース・チャンバは、グロース・チャンバの中への流体の流入のための第１の口と、流体のグロース・チャンバからの流出のための第２の口と、それぞれが、基板の上での三次元組織の生育を促進するようにした基板を収容する形状および寸法である、グロース・チャンバ内の複数の生育区画と、複数の生育区画と第１および第２の口とを流体的に接続する内部流路からなる請求項１の装置。３．細胞と組織の生育のための少なくとも１つの区画の範囲を定める所定の境界に沿って結合された可撓性の前方および後方シートを含むグロース・チャンバをさらに含む請求項１の装置。４．注入マニホルドの注入口と流体連通する流体の供給源と、注入マニホルドの注入口に流体を供給するための流体輸送手段とをさらに含む請求項１の装置。５．流体輸送手段が、流体ポンプからなる請求項４の装置。６．スペーサ部材間の所定の距離を持続し維持する形状および寸法である第２の支持部材をさらに含む請求項１の装置。７．スペーサ部材が、該部材間の所定の距離を持続し維持する形状および寸法である請求項１の装置。８．注入および排出マニホルドが、スペーサ部材間の所定の距離を持続し維持する形状および寸法である請求項１の装置。９．支持部材が、スペーサ部材と注入および排出マニホルドからなる請求項１の装置。１０．支持部材が、スペーサと注入および排出マニホルドを接続するための棒材である請求項１の装置。１１．排出マニホルドが、処理中に装置から空気を除去するためのエアフィルタをさらに含む請求項１の装置。１２．排出マニホルドが、排出マニホルドに入る過剰な流体を受け入れるためのオーバーフロー容器と流体連通する排出口をさらに含む請求項１の装置。１３．排出マニホルドが、装置内に閉鎖型の流体環状路を形成するために流体供給源と流体連通する排出口をさらに含む請求項４の装置。１４．可撓性の前方および後方璧によって画定される、それぞれが流体を通すための第１の口及び第２の口を有する複数のグロース・チャンバと、注入口及びそれぞれがグロース・チャンバの第１の口の１つに流体連通している複数の排出口を備えた注入マニホルドと、注入マニホルドの注入口と流体連通している流体供給源と、注入マニホルドの注入口へ流体を供給するための流体輸送手段と、それぞれがグロース・チャンバの第２の口の１つと流体連通している複数の注入口を備えた排出マニホルドとからなる細胞と組織の生育を促進するための装置。１５．グロース・チャンバのそれぞれが、所定の境界に沿って結合された前方および後方壁によって画定される複数の生育区画と、複数の生育セルを流体的に接続し、複数の生育区画と第１および第２の口をさらに接続する内部流路とをさらに含む請求項１４の装置。１６．グロース・チャンバ内への均等な流体分配が維持されるように各複数のチャンバの前方および後方壁と接触して位置させた複数のスペーサ部材をさらに含む請求項１４の装置。１７．排出マニホルドが、処理中に装置から空気を無菌除去するためのエアフィルタを含む請求項１４の装置。１８．閉鎖型の流体結合が、流体供給源と流体輸送手段との間、流体輸送手段と注入マニホルドとの間、注入マニホルドの各排出口のそれぞれとチャンバの第１の口の１つとの間、チャンバの各第２の口と排出マニホルドの注入口の１つとの間に提供される請求項１４の装置。１９．排出マニホルドが、排出マニホルドに入る過剰な流体を受け入れるためのオバーフロー容器と流体連通している排出口をさらに含む請求項１４の装置。２０．排出マニホルドが、装置内に閉鎖型の流体環状流路を形成するために流体供給源と流体連通する排出口をさらに含む請求項１４の装置。２１．複数のスペーサ部材を注入および排出マニホルドと接続するための支持部材をさらに含む請求項１６の装置。２２．支持部材が、スペーサ部材と注入および排出マニホルドからなる請求項２１の装置。２３．請求項１から２２までのいずれかによる装置を用いることを特徴とする、細胞と組織の培養およびその生育の促進のための方法。