JP2001521148A - 毛細管アッセイ方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は光を放射する毛細管内のアッセイ系中の構成成分の濃度を測定するための方法であって、その光がアッセイする構成成分の量に比例する方法に関連する。この系からの光を検出及び定量化し、そして検出は実質的に毛細管の縦方向から行われる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明はサンプル中の物質の未知の濃度をアッセイする方法に関する。より詳
しくは、本発明は毛細管内でアッセイ系中の構成成分の濃度を当該系由来の放射
光を検出して定量化することにより測定する方法に関連し、ここでこの光は当該
系内でアッセイされる構成成分の量に比例するものである。

【０００２】 バイオテクノロジー分野において、高度に効率的なアッセイシステムについて
の需要が高まっている。いくつかのシステムは光、例えば化学発光反応に由来す
る光を基礎とし、そしていくつかの利点、例えばスピード及び有害物質の欠如を
有する。

【０００３】 発光反応は固相系を基礎とするいくつかのイムノアッセイに利用されている。
これらのアッセイは、生理学的サンプル、例えば血液又は尿中の所定の免疫原性
物質についての定性且つ定量的な情報の双方に関連し、そして１又は複数の特異
的な認識分子を利用する。反応性物質の少なくとも一方を固相に付加し、他方は
サンプルを含む液体媒質と接触させる。得られる免疫原複合体は反応の程度の決
定のための方法として利用できる。反応の程度は未知サンプル中の被検物の量の
指標であり、そして様々なモードで採用できうる。

【０００４】 例えば、酵素連結免疫収着アッセイは酵素ラベル化免疫反応体（抗原又は抗体
）及び免疫収着体（固相支持体に結合した抗原又は抗体）を利用する。この高感
度分析技術において、酵素を抗原又は抗体に複合させる。この複合体形成に関与
する過剰な物質を洗浄により除去し、次いで結合量、それ故濃度に正比例する活
性を発揮する基質を添加する。

【０００５】 この技術はいくつかの組合せにおいて実施してよく、最も利用されている方法
はマイクロタイタープレートのウェルを抗原でコーティングし、そして適当な酵
素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリ性ホスファーゼに接合した
抗体と反応させることである。他方、ウェルをモノクローナル抗体でコーティン
グし、次いで抗原と反応させることができる。次いで抗原を適当な酵素に接合し
た別のモノクローナル抗体と反応させる。前者は直接ＥＬＩＳＡ技術と称され、
後者はサンドイッチＥＬＩＳＡと称される。更なる別の方式において、ウェルを
抗原でコーティングし、次いでモノクローナル抗体と反応させ、これを更にこの
第一抗体に特異的な別の抗体−酵素コンジュゲートと反応させる。かかるアッセ
イにおいて、酵素は反応の程度の測定のためのタグとして働く。例えば、ウェル
に結合した酵素分子の数はウェル内に存在する抗原の量の指標となる。

【０００６】 特開昭６２−１６９０５４号において、固相イムノアッセイが示され、それに
おいては少量の抗原溶液が、ポリマーチューブの内壁に抗原を収着させ、次いで
サンプル溶液中の抗原−抗体反応を実施することにより決定される。

【０００７】 米国特許第５，６２４，８５０号は特に乳中の抗生物質を検査するための半透
明毛細管内でのイムノアッセイを開示する。タンパク質に共有結合させたハプテ
ンであるタンパク質コンジュゲートを使用する。検査は蛍光ラベルに接合した特
異的結合性ペアー構成員を照射に付すことにより成し遂げる。

【０００８】 同様に、競合イムノアッセイにおいて除草剤が測定される（Dzgoevら、Analty
ca Chimica Acta 347 (1997) 87-93）。イメージングＥＬＩＳＡの支持体を担う
金被覆化ガラス毛細管は、除草剤／牛血清アルブミンと結合し、それをルミノゲ
ン基質の酵素分解に由来する化学発光の定量により決定する。毛細管の全長に沿
って放射される光は得られるデーターの解釈を複雑にする。

【０００９】 ＥＬＩＳＡは上述のタンパク質全ての濃度を測定するための高感度な分析免疫
化学方法であるが、一層高感度な方法の需要がまだある。生理学的に重要な物質
、例えば急性期タンパク質は従来約１０^-7Ｍに至る低い範囲内で測定され、そし
て除草剤は−１０^-10 Ｍに至る低い濃度で検出されている。

【００１０】 更に、現在のアッセイシステム、例えばめんどうなＥＬＩＳＡ手順は費用及び
時間がかかる。かくしてより安価且つ迅速であり、例えば生理学的サンプルの洗
浄工程が簡略化されたアッセイが要求される。また、丈夫であり、そして現場で
利用できるアッセイシステムを達成することも所望される。

【００１１】 本発明の目的は上記の問題を解消し、例えばより少容量の生理学的サンプルか
らより高感度且つ迅速に光を検出することを可能にするアッセイ方法を達成する
ことにある。

【００１２】 この目的を達成するため、本発明に係る方法は請求項１の特定事項を供する。

【００１３】 本発明に係る方法は、サンプル中の構成成分の未知の濃度のアッセイのために
開発されたものであり、その構成成分は毛細管内のアッセイ系でそれから放射さ
れる光を検出して定量化することによりアッセイされる。この構成成分は天然タ
ンパク質性物質、又はこの物質に対して自発的に結合する分子であってよい。好
ましくは、この構成成分は生物活性物質である。

【００１４】 本発明に係るアッセイ系由来の光は実質的に毛細管の縦方向から検出する。尚
、毛細管とは個々の管を意味するだけでなく、ユニタリーブロック内の中腔をも
含んで成る。

【００１５】 様々な材質の毛細管が本発明に係る方法において利用できる。一体型毛細管及
びユニタリーブロックは、その毛細管内のアッセイ系により生成される光子が壁
材料で反射されることを条件として、ガラス、プラスチック又は金属、例えば銅
製であってよい。好ましくは、ガラス又はプラスチック製の毛細管が利用される
。

【００１６】 かくして毛細管はアッセイ系のための反応セルを担う。多重溝毛細管ブロック
を単独で利用してよく、又は一体型毛細管を利用してよく、それらの管はアッセ
イ系から放射される光を検出して定量化するときにかかるブロックの中に配置す
る。好ましくは、これらの毛細管は一端においてシールされている。このように
して、多重物質分析、即ち、複数の物質を一度にアッセイする分析が実施される
。

【００１７】 次いで放射される光を、毛細管の開口端から最適な距離に配置された感光検出
のための検出デバイスを利用して光学的にスクリーニングし、ここで本発明に係
る毛細管由来の放射光は実質的にその縦方向から検出する。かかる光増幅システ
ムは例えば光電子増倍管、フォトダイオード又はアバランシェフォトダイオード
（ＡＰＤ）を含んで成ってよい。

【００１８】 毛細管由来のマイクロメーターサイズビームは、多重分析能力を有する光学ス
キャニング機構に存在する増感管の領域を本質的に意味する。実際には、毛細管
の領域は一体型毛細管を利用するとき、毛細管用のブロックの中の溝の寸法より
も大きくないのが好ましい。毛細管の出口点は検出且つ定量化すべき光源の点を
規定し、なぜなら境界発光体は毛細管の全長ではなく、小さな領域に集中するか
らである。これは本発明に係る毛細管から放射される光を実質的に毛細管の縦方
向から検出することにより成し遂げられる。毛細管のかかる配置により、光の最
大集約が得られ、そしてこのアッセイの効率は従来技術に係るアッセイ方法と比
べて著しく高まる。

【００１９】 検出は、感光デバイスをモニターすることにより成し遂げられ、そして系内の
構成成分の量に比例する光を多重分析能力を有する光学スキャニング機構及びイ
メージシステムを介して定量化する。モニターシステムの例はＣＣＤ（電荷結合
素子）カメラセットアップであり、これは半導体インターフェースでの光集約を
基礎とする。

【００２０】 本発明に係るアッセイ方法は比色、蛍光及び化学発光システムから放射される
光のために適当である。かくして、例えば化学発光反応由来の放射シグナルを構
築する定量アッセイが実施でき、そのシグナルは多重分析能力を有する光学スキ
ャニング機構を介して数字的にモニターできる。しかしながら、かかる測定は、
分散液相と比べ、固定化固相で実施したときの方が信頼できることを強調してお
く。

【００２１】 定量アッセイ結果は例えば発光からシグナルを構築するシステムを利用して得
ることができ、ここで特異的な結合試薬はアッセイ媒体内に分布しているのでは
なく、固相に拘束されているものとする。これは、毛細管内の固相から構築され
たシグナルを感光デバイス、例えばＣＣＤカメラを介して記録するなら、成し遂
げることができる。かくして、高価な光学モニターシステムは回避でき、そして
構築されるシグナルは時間、対、強度プロファイルとして直接保存されうる。大
量のサンプルをスクリーニングする場合、この形態の分析結果が極めて有用であ
る。コーティングの施された毛細管は光をその縦方向で伝達し、そして放射光を
毛細管に対して垂直方向で検出するときよりもこの方向での方が検出のための一
層強い光強度が供される。このセットアップにより、１０^-18 Ｍほどの低い濃度
でサンプル中の構成成分が本発明の方法に従ってアッセイされうる。

【００２２】 本発明に係る方法を利用することにより、丈夫で簡単なアッセイが提供され、
それはイムノアッセイにおいて生理学的被検物の濃度を決定するために利用でき
る。より詳しくは、生理学的サンプル中のタンパク質物質についてのアッセイが
提供され、ここでこの被検物の測定において利用されるシグナルは適当なインタ
ーフェースを利用してパーソナルコンピューターで直接記録される。記録される
光は毛細管内の光源に由来し、それはビームへと運ばれ、その強度が被検物濃度
の尺度となる。

【００２３】 更に、本発明の方法を利用することにより、サンプル中の天然タンパク質又は
それに自発的に結合する分子の存在を決定するアッセイが提供される。酵素イム
ノアッセイにおける固相に対する免疫収着結合体は例えば抗原性タンパク質又は
それに対する抗体であってよい。最も効率的に作業するため、アッセイを実施す
る固相支持体は好ましくは多孔質マトリックスを含んで成る。

【００２４】 本発明に係る方法は生理学的サンプル中の様々なタンパク質性物質の濃度を測
定するために利用できる。その例は、患者が「急性期」に入ったときに濃度の変
化する急性期タンパク質である。今まで、急性期タンパク質を測定するための標
準的な手段は赤血球沈降速度であった。

【００２５】 伝統的な急性期タンパク質の例はセルロプラスミン、補体Ｃ３及びＣ４、オロ
ソムコイド、α₁ −アンチトリプシン、α₁ −アンチキモトリプシン、ハプトグ
ロビン、フィブリノーゲン、Ｃ−反応性タンパク質及び血清アミロイドＡであっ
た。最近開示された急性期タンパク質も本発明に係る方法によりアッセイできる
。これらのタンパク質の例はレチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）及びマンノー
ス結合タンパク質（ＭＢＰ）である。同様に、プラミノーゲンアクチベーターイ
ンヒビター１型（ＰＡＩ−１）がすばらしい結果をもって本発明の方法によりア
ッセイできた。本発明に係る方法を基礎とするアッセイはサンプル中のレチノー
ル結合タンパク質（ＲＢＰ）又はレチノールに対し、例えばＲＢＰに対して特異
性を有する固定化モノクローナル抗体を含む固相に対する特異的結合、直接、サ
ンドイッチ又は競合型反応に関与する酵素ラベル化免疫反応体を介して実施され
る。特異的結合試薬としてＲＢＰを利用することによりレチノールの未知の濃度
を検出するために変性型レチノールを利用するアッセイ手順も実施してよい。こ
の酵素ラベル化免疫反応体は注目のタンパク質に対する抗体又はそのタンパク質
に自発的に結合する分子であってよい。

【００２６】 酵素ラベルは好ましくは発光反応、最も好ましくは化学発光反応に関与する。
放射される光を免疫収着体と酵素ラベル化反応体との間での複合体形成の度合を
決定する手段として利用する。次いで固相に対するラベル化試薬の結合を、化学
発光シグナルをモニターするＣＣＤカメラにより検出し、そして増幅した電子シ
グナルを例えばパーソナルコンピューターで記録する。従って、反応の度合はカ
メラから適切な距離にある毛細管ブロックの点起源から構築される強度単位とし
てモニターする。

【００２７】 典型的には、特異的結合試薬で均質にコーティングされた毛細管は、サンドイ
ッチ形態で本発明に従う方法に委ねると、様々な被検物濃度で直線性を示す。毛
細管の外部のπは発光ラベルのはるかに大きな領域から得られる点起源を規定す
る。適切な定量アッセイ結果を得るために、この態様はそれ自体、暗電流、検出
器からの点光源の距離、ブロック内の隣接し合う毛細管由来のファジー効果によ
る構築イメージ上のピクセルの重なり、等の観点で、ＣＣＤカメラの光感度が最
適となることを保証する。

【００２８】 毛細管の寸法はむろん特異的なアッセイ用途に依存して変わることができる。
その直径は約０．５mm〜約２mmで変えることができる。効率的に処理及び／又は
取り扱うため、毛細管の長さは少なくとも２cmから１０cm又はそれより長くある
べきである。個々の毛細管は好ましくは直径１mm、長さ７．５cm、壁厚０．１mm
であるのが好ましい。ブロック内の中腔間の距離は放射光を検出するために利用
する感光デバイスに依存する。

【００２９】 典型的なセットアップにおいては、頂部において約０．８mmの内径、そして長
さが約７．５cmの慣用の一体型毛細管が利用される。ブロック内に配置された毛
細管の開口頂部端とカメラとの間の距離は使用するフォーカスレンズに依存する
。当業者は任意のアレンジメントにおいて、このようなパラメーターの最適値を
確認するための簡単な実験を行わなくてはならないことを理解するであろう。こ
のセットアップの今回のデザインのささいな利点は、毛細管の開口部が点起源を
規定し、それ故この点起源が毛細管を有するブロックの事実上の本体と独立して
いることにある。更に、このブロックは未結合のラベルにより構築される任意の
外生光がバックグランドシグナルに寄与するのを防ぐためのスクリーンとして働
くように選定できる。

【００３０】 実施例 以下に示す本発明の態様は本発明の原理を説明するために選定し、そして説明
する。

【００３１】 本発明を明確に例示するため、ガラス毛細管において改変ＥＬＩＳＡ手順を利
用することによるレチノール及びレチノール結合タンパク質の特異的な検出に適
用されるアッセイ手順を示し、その検出はＰＣウィンドーズ環境におけるＰＭＩ
Ｓ（Photometric Imaging System）ソフトウェアで作動する高感度ＣＣＤ（電荷
結合素子）カメラを利用することによるモニターとした。

【００３２】 レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）は急性期タンパク質の例であり、即ち、
組織損傷のすぐ後に濃度が劇的に上昇する血漿タンパク質である。ＲＢＰはレチ
ノール（ビタミンＡの不活性形態）の輸送に関与し、そして日常生活及び生命に
とってのレチノールの重要性はよく知られている。それは視覚サイクルに関与し
、そしてその欠乏症はいくつかの形態の視覚障害に結びつく。しかしながら、レ
チノールは水及び血漿（水を９０％含む）の中で不溶性であるため、それは我々
の体内でＲＢＰとの複合体としてでしか輸送されることができない。

【００３３】 ヒト血漿中のＲＢＰの正常レベルは約４０〜５０μｇ／mlである。正常な生物
学的流体内のＲＢＰの免疫化学測定は以下の平均値を供する：血清４６mg／ｌ；
尿０．１１mg／２４ｈ容積、脳脊髄流体０．３５mg／ｌ。管状尿タンパク質を患
う患者は２４ｈ当り１５０mgまでのＲＢＰをその尿に分泌する。

【００３４】 毛細管で実施する改良イムノアッセイを利用することによるレチノールのアッ
セイはレチノールの代わりにレチノイドにも適用できる。レチノイドはレチノー
ルと構造的に類似した数多くの合成及び天然化合物の代表であり、その多様な薬
学及び抗腫瘍活性は今現在かなり発表されている。その高度な疎水性により、天
然レチノイドはそれを体液の中で可溶化させ、標的細胞に輸送するための特異的
な担体タンパク質を必要とする。かくして、ＲＢＰはこのような天然レチノイド
に対しても親和性を示す。しかしながら、ＲＢＰはＦｅｎｒｅｔｉｎｉｄｅ（商
標）及びＡｃｃｕｔａｎｅ（商標）の如き合成レチノイドに対しても強く結合す
る。更に、ＲＢＰはその他の分子、例えばａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノール、β
−カロテン、レチニルアセテート、レチナール、レチノン酸、コレステロール及
びフィトールにも結合することが見い出され、このことはレチノールの輸送低下
を招き得、ＲＢＰレベルの低下の病理症状に至ることがある。かくして、臨床学
的観点から、ＲＢＰ及びＲＢＰに自発的に結合する分子の測定は関連の障害の診
断のための一般基準を形成する。本発明に従ってアッセイできる臨床学的に注目
されるその他のタンパク質又はタンパク質性物質は生物活性ペプチド、例えばホ
ルモン、触媒性ペプチド及び糖タンパク質、例えばマンノース結合タンパク質で
ある。

【００３５】実施例１ 固定化前の毛細管の処理 使用したガラス毛細管は長さ７．５cm、直径１mm、そして壁厚０．１mmの市販
のものとした。毛細管を希薄ＨＮＯ₃ で洗い、次いで大量の脱イオン水ですすぎ
、そして１００℃で１ｈ乾燥させた。

【００３６】 特異的な試薬の固定化前の毛細管の処理の種類は重要である。第一のアプロー
チでは、ガラス毛細管の形態の固相を特異的な試薬で前処理して妨害分子を除去
し、次いでその表面をシランベース化合物でシラン処理する。特に、シランの種
類は極めて注目され、その理由は固相支持体に対する試薬の結合に対する効果に
ある。２通りの独立のアプローチが採用されうる。第一に、処理は毛細管上にゾ
ル−ゲル型のコーティングを好適に形成する一の形態のシランに制約してよく、
そして第二に、短い調製時間に由来する混合シランを固相の表面上に均質なマト
リックスを形成するために利用してよい。

【００３７】 しかしながら、処理の態様はシランによる毛細管の充填のためにも重要である
ことが見い出された。揺動／回転運動又はペリスタルポンプを利用することによ
るシラン溶液の連続流下でのコーティングが化学発光アッセイのための支持体の
性能に著しい影響を及ぼすことが認められた。例えば、約１ml／min 以下のシラ
ン溶液の連続流が固相支持体の均質なシラン処理のために適切であり、はるかに
高い反応効率をもたらす。

【００３８】 ゾル−ゲルコーティングのためのシラン溶液は５mlのテトラメトキシシラン（
ＴＭＯＳ）、５mlの３−グリシジルプロポキシトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＯ
Ｓ）、９０mlの脱イオン水及び１００μｌの０．１ＭのＨＣｌを混合することに
より調製した。シラン溶液のpHは１０％の酢酸溶液で４．０にし、そしてこの溶
液を４℃及び２００rpm で気密容器の中で一夜撹拌してシランを加水分解し、ゾ
ル溶液を得た。得られる透明溶液をゾル−ゲルコーティングプロセスのために利
用した。４５μｌの総容積を有するガラス毛細管を１０％の硝酸で５分すすぎ、
そして熱湯で１ｈ煮沸した。それらを更に脱イオン水で中性pHとなるまですすぎ
、次いで室温で風乾した。使用前に、その毛細管を９０℃で１ｈ、温風オーブン
の中で乾かした。ガラス毛細管のゾル−ゲルコーティングは三通りのアプローチ
、即ち、静止、振盪又は連続流を利用して実施した。「静止」技術では、毛細管
をゾル溶液で充填し、そしてベンチに放置した。「振盪」技術では、毛細管をゾ
ル溶液で充填し、そして未シール端を３０rpm の揺動速度で揺動するロッカーに
ひっかいた。毛細管の未シール端での蒸発による効果は無視できるほどである。
「連続流」法では、ゾル溶液を毛細管に上方向で１ml／min の流速において連続
的に汲み上げた。ゾル−ゲルコーティングは一般に室温で９０分実施した。しか
しながら、連続流の場合、コーティングは様々な時間、即ち、１５，３０，６０
，９０，１２０及び２４０min でも実施した。

【００３９】 シラン処理手順の後、各毛細管は好ましくは約０．５mmの最小開口部を有すべ
きである。更に、固定化のために利用する固相支持体が毛細管の壁の上にコーテ
ィングされた多孔質材料であることは本発明の重要な観点である。好ましくは、
ゾル−ゲルの加熱後に形成される特殊なゾル−ゲルであるキセロ−ゲルを使用す
る。

【００４０】実施例２ 検出システム 反応の程度も本アッセイ混合物への追加の化合物の添加を経て決定できうる。
特に注目されるのは光化学、化学又は電気化学手段を介して発光できる化合物で
ある。光学発光において、この化合物は工程において発光するように誘導される
ものであり、ここでその工程においてこの化合物は電磁線、例えば蛍光又は燐光
線を吸収する。化学発光では、発光物質は注目の化合物へのエネルギーの化学転
移により生ずる。

【００４１】 かかる化合物が化学手段により発光状態にまで励起されると、高エネルギー誘
導体が例えば化学酸化により得られる。酸化により、化学発光物質は光子を放射
する。発光ベース方法に利用できるいくつかの化合物、例えばルミノールは検出
可能現象の性質において反復性ではないが、１分子当り１個の光子しか生成せず
、従ってかかる化合物が本発明に関して特に利用するのに適する。ルミノールは
化学発光剤として極めて好適である。しかしながら、一連のその他の化合物、例
えばイソルミノール、ルシフェリン及びその他のアクリジニウムエステルが利用
できる。

【００４２】 かくして、この反応媒体において例えばルミノール及びペルオキシド（例えば
Ｈ₂ Ｏ₂ ）に西洋ワサビペルオキシダーゼの伴う有効な検出システムが提供され
る。

【００４３】 一般に、化学発光反応は短い半減期を有し、従って実験手順における時間的拘
束を供する。これは有効な発光時間を改善するエンハンサーの利用により解消で
きる。かかる試薬は発光を適当な期間延長し、そして適切な測定を可能にする。

【００４４】 かくして、十分に化学的に不活性であり、且つペルオキシド反応に影響されな
い適当なエンハンサーの反応媒体への添加により、この媒体から反応後のシグナ
ルの増強を可能にするのに十分に大きい適当な波長を有する光が供される。好ま
しくは、化学発光反応の増強は、本質的に置換化フェノールである化合物、例え
ばｐ−ヨードフェノールを利用することにより成し遂げられる。かくして、適当
な化学発光カクテルは０．５Ｍのルミノール、０．０１mMの４−ヨードフェノー
ル及び５０％の過酸化水素の溶液を含んで成る。

【００４５】実施例３ 蛍光物質の組込み 化学発光を吸収でき、且つ異なる波長にて発光できる蛍光システムを反応混合
物の中に組込むことが有利である。かかるシステムは、特に放射される光が適当
なフィルターを介して見えるとき、バルクサンプル中で構築される光の効果を排
除するのに役立つ。例えば、ルミノールからの青光は、黄／緑光を発するであろ
うクマリンにより吸収されうる。この蛍光剤はシグナル感知手段の上に又はその
近傍に配置する。他方、蛍光体はバルクサンプル内に分布するマーカーとして利
用でき、かくして局部的に構築された化学発光のみが検出されるであろう。

【００４６】実施例４ サンドイッチアッセイ シラン処理した毛細管をまず第一特異的試薬（抗タンパク質抗体）で３７℃で
１ｈかけてコーティングし、牛血清アルブミンでブロッキングし、そして標準タ
ンパク質と反応させる。酵素ラベルを有する第二特異的試薬を加える。ルミノー
ルとのペルオキシド反応で発生する光は反応の度合の尺度となり、それはＣＣＤ
カメラでモニターし、そして定量化する。

【００４７】 好適とされる十分にデザインされたサンドイッチイムノアッセイにおいて、被
検物（例えばタンパク質）に対して特異的反応性を有する第一特異的試薬（モノ
クローナル抗体）を固相上に固定化する。尚、特異的抗体とはいくつかの似た適
当な抗体から選定された抗体を意味する。

【００４８】 一般に水性であるアッセイ媒体は被検物に対する特異性を有する第二結合試薬
及び付加ラベルを含む。被検物の非存在下では、第一試薬とのカップリングは生
ぜず、それ故、検出可能なシグナルは発生しないであろう。サンドイッチ形態に
おいて、被検物は本質的にラベルされていない（第一）特異的試薬とラベルされ
た（第二）特異的試薬との間での連結分子を担い、そしてカップリングの程度は
サンプル中の被検物の濃度の尺度を供する。

【００４９】 ガラス毛細管でのタンパク質、即ちＲＢＰについてのサンドイッチアッセイの
典型的な結果を図１に示す。添付の統計学的詳細で得られる結果のバリデーショ
ンを図２に示す。４９２nm（Ｏ．Ｐ．）での化学発光シグナルの強度を測定した
。

【００５０】実施例５ 直接イムノアッセイ 典型的な直接イムノアッセイは一般に固相と接した水性媒体の中で実施され、
この固相は測定すべき認識分子（即ち、モノクローナル抗体）に対する所定の特
異性を有する固定化特異的分子（即ち、アッセイする既知量の被検物）を含む。
このアッセイ媒体は、実施例３と同様に、様々な量の固定化被検物と反応できる
過剰量のラベル化モノクローナル抗体（又は同一の認識部位を有するその類似体
）から成り、このようにして検量曲線が得られる。未知の量の被検物は毛細管壁
上に被検物を固定化し、そして不活性タンパク質（例えばゼラチン画分）で固相
の未反応部位を充填することにより測定する。次いでこの被検物を特異的且つラ
ベル化された試薬と反応させる。反応の度合はラベル化試薬由来のシグナルによ
り決定され、そして検出可能な発光を構築する酵素アッセイを利用してモニター
する。この光は例えば蛍光又は化学発光であってよく、適当な検出器を利用する
ことによりモニターされる。放射される光を標準結果、即ち、被検物の非存在下
で得られる結果と比較し、そしてサンプル中の被検物の濃度の尺度が得られる。
典型的な直接イムノアッセイで得られる結果のバリデーションを図３に、統計学
的詳細と共に示す。

【００５１】実施例６ 競合イムノアッセイ 一般に固定化特異的モノクローナル抗体を含む固相と接した水性相で実施され
る競合イムノアッセイにおいては、被検物は液相の中にある。競合はラベル化被
検物と非ラベル化被検物との間で起こる。被検物がサンプル中に存在しているな
ら、適当な比率のラベル化被検物をサンプルと混合し、そして固定化固相の特異
的な試薬と反応させる。コントロールは、ラベル化被検物を固定化固相と反応さ
せることにより得られ、総合的な反応の尺度となる。サンプル中の非ラベル化被
検物の存在はシグナルの所定のパーセントの損失をもたらし、これはサンプル中
の非ラベル化被検物の尺度となる。通常、サンプルの希釈はサンプル中の被検物
のもとの濃度をどのようにして計算するかを決定する。

【００５２】実施例７ 放射シグナルの検出 サンプル及び可溶性特異的結合試薬とインキュベーションすると、固定化特異
的結合試薬を有する多孔質固相材料は感光検出カメラに隣接する液体媒体内に所
在化し、光を点起源、即ち、ユニタリーブロック又は毛細管の配されたブロック
（図４参照）から検出されることを可能に、アッセイのモニター及び定量化がで
きるようになる。尚、点起源とは、検出すべき光が毛細管から出ていく点をいう
。このラベルは発光をもたらす化学反応に関与することができ、そして液体媒体
は光を増強する能力をもついくつかの追加の試薬を含む。

【００５３】 市販のＣＣＤカメラをチップにおいて−４０℃の温度に保つウォータージャケ
ットと共に利用する。典型的なセットアップを図４に模式的に示す。

【００５４】 毛細管の底から生ずる光を固定化マトリックスの領域を通り、そしてほとんど
の光は毛細管の縦方向で伝搬され、カメラ中のシリコンチップに達する。尚、ブ
ロックとカメラとの距離は最大光集約効率を達成するように最適化する。かくし
て最大集約効率は毛細管の一端に伝搬される光により達成され、最大光強度が得
られる。

【００５５】 毛細管由来の光をそれと垂直方向でモニターする従来技術に従う従前の測定と
の比較を行った。水平方向の代わりに鉛直方向で毛細管をモニターすると、本発
明に係る典型的なアッセイでアッセイの感度の６倍の増大が得られた。

【００５６】 毛細管をブロックの中でカメラに対して鉛直な位置に配置することにより、複
数のアッセイを同時に調べることができる。即ち、毛細管ブロック内に配された
複数の個別の毛細管の結果をモニターするために一回の単独曝露を利用すること
ができる。

【００５７】 ＣＣＤカメラはビンド（ｂｉｎｎｅｄ）モード及びフルカメラモードで使用し
てよく、良好な検出限界を有する高感度アッセイが得られる。例えば、９６本の
毛細管を同時に測定できる。かくして、複数のサンプル（即ち、１００サンプル
）を一回の曝露で検出でき、そしてコンピューター計算して未知量のアッセイす
べき物質を定量化するアッセイ手順が供される。

【００５８】実施例８ ＲＢＰ及びレチノールをアッセイするための方法 ＲＢＰ及びレチノールをアッセイするための方法を提供する。この方法は下記
の工程を含んで成る： （Ｉ）適当な寸法、且つ適当なモード、即ち、揺動又は連続流システムのガラス
毛細管の固相支持体上に多孔質固定化マトリックスを固定又は配置する； （II）水性アッセイ媒体であって、（ａ）ＲＢＰに特異的なモノクローナル抗体
が中に固定され、且つこの水性アッセイ媒体に懸濁されているが容易にこの固相
支持体に局在する多孔質固相、（ｂ）被検物、即ち、測定すべきＲＢＰ又はレチ
ノールを通常水性環境内で含むサンプル、（ｃ）アッセイ媒体中で可溶性又は分
散性であるラベル化試薬（これは、被検物との反応に関与する第二特異的結合試
薬であるか、又は被検体自体もしくはその類似体が検出されうるサンドイッチ形
態における第一特異的結合試薬のいずれかであり、そしてラベルは化学発光シグ
ナルの発生に関与する）を含む媒体を用意する； （III ）前記アッセイ媒体をインキュベーションし、前記ラベル化第二試薬を通
常は多孔質状態にあり、且つ前記マトリックスへのカップリングに有効な適当な
基を含む粒状固相に結合させる； （IV）前記アッセイ媒体を、シグナルを増強するのに、特に化学発光シグナルの
強度及び測定期間中より長い時間かかるシグナルの安定性を向上させるのに必須
でありうるかかる追加の反応体を有する流体を利用することにより希釈する；そ
して （Ｖ）ガラス毛細管支持体上の固相マトリックスに結合したラベルを含んで成る
点起源から放射される化学発光を測定するために高感度ＣＣＤカメラを利用する
ことにより光を検出する。

【００５９】実施例９ ＲＢＰ及びレチノールをアッセイするための手順の改良 本発明の別の態様において、２段インキュベーションによる上記の手順の改良
方法を実施した。この改良方法は固相支持体上に局在化した第一特異的試薬及び
サンプルとの、ラベル化試薬の非存在下での一次インキュベーションを包含し、
ここで少なくともこのサンプルに由来する被検物のバルクが第一特異的試薬に結
合されている。次いで、第二特異的試薬による化学発光シグナルを供与するラベ
ルとのインキュベーションを実施した。

【００６０】 通常、サンプルのバルクを除去する前にこの２段インキュベーション工程の間
に局在化工程を挿入する。

【００６１】 更なる又は別の改良手順として、化学発光反応を引き起こすのに必要な１もし
くは複数の試薬、又は事実上全ての試薬をこの手順の早期に、例えば（ａ）段階
の間に、又はラベル化試薬を２段インキュベーションに加える。

【００６２】実施例１０ 適当な多孔質マトリックスでコーティングされた固相支持体の利用 毛細管の固相支持体を多孔質マトリックスでコーティングしてから反応に利用
した。本発明のこの態様において、前述の試薬を毛細管に注入する必要はない。
直接、サンドイッチ及び競合イムノアッセイの様々なモードの用途それぞれ全て
において、この試薬を毛細管力を介して直接毛細管に吸引させた。これは固有の
利点であり、その理由は時間及び試薬の観点で節約できるからである。

【００６３】 毛細管を充填した後、その底端を好ましくはセラミックパッドを利用してシー
リングする。かくして耐漏性シールが、発光の検出のために自由になっている毛
細管の上端からの光の測定のために設けられる。

【００６４】 約４０μｌという毛細管の容積は、数１００μｌの試薬容積を採用する慣用の
イムノアッセイと比べて、アッセイには極端に少ない容積である。かくして、こ
のアッセイ方式は最小限の容積、且つ９０秒以内の曝露という効率的な化学発光
反応を提供する。必要なら、サンプルのバルク中に残っている任意の未結合ラベ
ル由来の妨害光の危険性を、前記毛細管の固相支持体内の多孔質マトリックスに
対するかかる非特異的結合をブロッキングする減衰剤をこのアッセイ媒体に組込
むことにより最小限とすることができる。

【００６５】実施例１１ 化学発光シグナルの連続構築のための特異的結合成分のラベリング 本実施例において、ラベルが反応媒体、通常はバッファー内で化学発光シグナ
ルを連続的に構築するようにラベルされた特異的結合パートナーを利用するイム
ノアッセイが提供される。このシグナルをマスキングもしくはクエンチングし、
又は何らかの手段で抑制し、その間ラベル化結合パートナーはこの反応媒体に均
質に分配されている。この結合は検出可能な化学発光シグナルを供する局部光束
をもたらし、その程度は結合の度合に依存し、そしてラベルは反応媒体に居なが
ら連続的に発光する。このラベルを洗浄媒体から流し出し、そして唯一の特異的
に結合した試薬をこのアッセイ方式でモニターした。検出可能なシグナルはラベ
ルを有する第二特異的試薬、又は被検物に直接カップリングされたラベルが固相
マトリックス上の第一特異的試薬と反応したときにのみ供される。

【００６６】実施例１２ 使用する媒体への適用 好ましくは、媒体の他の成分との反応により関与する化学発光ラベルを本発明
の方法に利用する。しかしながら、使用する媒体は往々にしてラベルにより構築
される光に対して完全に透光性ではなく、そして不透明又は半透明媒体の存在は
検出器に伝搬されるのには不十分な量の光をもたらす。従って、この反応媒体は
発光システムの成分と相互作用し、発光システムからの発光を増強させる化学物
質を含んでよい。マトリックスに対する第一特異的成分のその後の固定化、それ
に続く被検分子へのそのカップリングは検出するのに十分な強度の局在光学シグ
ナルをもらたす。

【図面の簡単な説明】

【図１】 レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）についての毛細管におけるサンドイッチ
アッセイの典型的な結果。

【図２】 レチノール結合タンパク質についての毛細管におけるサンドイッチアッセイか
ら得られる結果のバリデーション。

【図３】 レチノール結合タンパク質についての毛細管における直接イムノアッセイから
得られる結果のバリデーション。

【図４】 電荷結合素子カメラ及びアッセイのモニター及び定量化のための毛細管を有す
るブロックを含んで成るセットアップの原理の模式図。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年４月１７日（２０００．４．１７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 モメニ，ナギ スウェーデン国，エス−226 43 ルンド， マギストラツブ．19ベー (72)発明者 カイヤミ，マソウド スウェーデン国，エス−223 55 ルンド， カルヘグストルイ ４ベー (72)発明者 ダニエルソン，ベント スウェーデン国，エス−245 62 ヒエル プ，ブロムステルゴルデン 33 (72)発明者 ベンマルク，スティグ スウェーデン国，エス−224 68 ルンド， バリートングレンデン 17 (72)発明者 ラルソン，ペル−オロフ スウェーデン国，エス−226 53 ルンド， フォゲルフンドスベーゲン 56 Ｆターム(参考） 2G054 AA06 AB04 BB11 BB13 CA23 CB01 CD01 CE03 EA01 EA03 EB01 EB05 FA07 FA12 FA32 FA36 FA44 GA04 GB01 GE01 JA01 JA05 JA06 JA07 2G057 AA04 AA12 AA14 AC01 BB01 BB06 BB08 BD06 CA01 CB01 GA04 HA03

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 静止構成成分の濃度を毛細管内での発光アッセイで当該アッ
   セイ由来の放射光を検出して定量化することにより測定するためのシステムであ
   って、ここで当該光はアッセイする構成成分の量に比例するものであり、前記毛
   細管がユニタリーブロック内に複数の中腔を含んで成り、当該放射光は当該中腔
   内の壁材料により反射され、そして同時に光の最大集約のために前記ブロックか
   ら最適な距離に配置された感光デバイスを介して実質的に前記中腔の縦方向から
   検出されることを特徴とする、システム。
2. 【請求項２】 前記中腔が一端においてシールされた個々の毛細管を含んで
   成ることを特徴とする、請求項１記載のシステム。
3. 【請求項３】 前記中腔の壁材料がガラス、プラスチック又は金属であるこ
   とを特徴とする、請求項１又は２記載のシステム。
4. 【請求項４】 前記金属が銅であることを特徴とする、請求項３記載のシス
   テム。
5. 【請求項５】 前記ユニタリーブロックが１００個までの中腔を有すること
   を特徴とする、請求項１記載のシステム。
6. 【請求項６】 前記感光デバイスが光電子増倍管、フォトダイオード又はア
   バランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）であることを特徴とする、請求項１記載
   のシステム。
7. 【請求項７】 前記検出光が多重分析能力を有する光学スキャニング機構を
   介して定量されることを特徴とする、請求項１又は６記載のシステム。
8. 【請求項８】 前記光学スキャニング機構が電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ
   であることを特徴とする、請求項７記載のシステム。
9. 【請求項９】 前記アッセイが前記毛細管の内側に載っている固相支持体上
   で実施する酵素連結免疫収着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）であり、前記構成成分が前
   記アッセイ内で形成される生成物の量に比例し、そして更なる発光化合物を前記
   系に添加することを特徴とする、請求項１記載のシステム。
10. 【請求項１０】 前記構成成分が天然タンパク質性物質、又は生理学的サン
    プルから獲得した当該物質に自発的に結合する分子であることを特徴とする、請
    求項９記載のシステム。
11. 【請求項１１】 前記アッセイを実施する前記固相支持体が多孔質マトリッ
    クスであることを特徴とする、請求項９又は１０記載のシステム。
12. 【請求項１２】 前記天然タンパク質性物質が急性期タンパク質、生物活性
    ペプチド又は触媒性タンパク質であることを特徴とする、請求項１０記載のシス
    テム。
13. 【請求項１３】 前記急性期タンパク質がレチノール結合タンパク質（ＲＢ
    Ｐ）であることを特徴とする、請求項１２記載のシステム。
14. 【請求項１４】 前記天然タンパク質性物質に自発的に結合する分子がレテ
    ノイド又はレチノールであることを特徴とする、請求項１３記載のシステム。
15. 【請求項１５】 前記多孔質マトリックスがシラン又は変性シランであるこ
    とを特徴とする、請求項１４記載のシステム。
16. 【請求項１６】 前記変性シランがゾル−ゲル型のシランの加熱後に形成さ
    れたキセロ−ゲルであることを特徴とする、請求項１５記載のシステム。
17. 【請求項１７】 前記天然タンパク質性物質が前記多孔質マトリックスに直
    接結合され、そして競合的にアッセイされるものであり、酵素ラベルされた反応
    体が当該タンパク質性物質、レテノイド又はレチノールに特異的であることを特
    徴とする、請求項１２記載のシステム。
18. 【請求項１８】 前記天然タンパク質性物質がそれに対する第一特異的抗体
    を介して前記多孔質マトリックスに結合され、そしてサンドイッチアッセイでア
    ッセイされ、ここで酵素ラベル化反応体は前記天然タンパク質性物質に対する第
    二特異的酵素ラベル化抗体であることを特徴とする、請求項１２記載のシステム
    。
19. 【請求項１９】 前記天然タンパク質性物質がそれに対する特異的抗体を介
    して前記多孔質マトリックスに結合され、そして当該結合分子は間接ＥＬＩＳＡ
    でアッセイされ、ここで酵素ラベル化反応体が当該天然結合分子であることを特
    徴とする、請求項１２記載のシステム。