JP2001520008A - Ｇｆｐ−アネキシン融合タンパク質 - Google Patents

Ｇｆｐ−アネキシン融合タンパク質

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JP2001520008A JP2000516023A JP2000516023A JP2001520008A JP 2001520008 A JP2001520008 A JP 2001520008A JP 2000516023 A JP2000516023 A JP 2000516023A JP 2000516023 A JP2000516023 A JP 2000516023A JP 2001520008 A JP2001520008 A JP 2001520008A
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Abstract

(57)【要約】 二機能性緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)−アネキシン融合タンパク質はＧＦＰの固有の強い可視の蛍光特性を、アネキシンのアニオン性リン脂質結合特異性と組合わせる。組換え宿主細胞、特に細菌が、高速の一工程アフィニティー精製に好適な融合タンパク質を高収量かつ可溶形で効果的に発現するために使用される。用途には、例えばアポトーシス細胞の選択的標識のような、特にアニオン性種の選択的細胞及び生化学標識化が含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本件出願においてなされた研究はアメリカ国立衛生研究所の助成金＃ＨＬ５６
００１(0577508-92-002)により一部が支援されたものである。政府はこの出願に
基づいて発行されるあらゆる特許に権利を有するものである。
【０００２】 緒言 発明の分野 本発明の分野は、ある種のリン脂質に特異的に結合する蛍光標識タンパク質で
ある。
【０００３】 背景 アネキシン類は、カルシウム依存的に、ホスファチジルセリンを含むアニオン
性リン脂質に特異的に結合するタンパク質のファミリーである(Blackwood, R.A.
とErnst,J.D. (1990) Biochem.J. 266,195-200; Seaton,B.A. (1995) Annexins,
R.G.Landes, Austin,TX; Cell Mol Life Sci, Jun 1997; 53(6),発行物全体)。
全てのアネキシンはホスファチジルセリンとカルシウムに結合する一方、ホフフ
ァチジルセリンに対するその親和性は変化する：例えば、カルシウムの飽和濃度
(すなわち、＝１．０ｍＭ)では、アネキシンＶが、アネキシンファミリーの他の
メンバーと比較して２ないし１６０倍高いホスファチジルセリンに対する親和性
を示す(Tait,J.F.ら (1998) Biochemistry 27,6268-6276; Ernst,J.D., Mall,A.
とChew,G. (1994) Biochem Biophys Res Com 200, 867-876)。アネキシン結合特
異性は生物学的ターゲティングに利用されている(Taitら 1995 J.Biol.Chem. 27
0,21594-21599; Oshawaら, 1996, J.Neurochem. 67,89-97; Okabayashiら, 1996
,Gene 177,69-76)。
【０００４】 アポトーシス又はプログラムされた細胞死は、多細胞生物の発育、免疫系の調
節、及び異常(腫瘍性及びウィルス感染)細胞の排除において重要な普遍的なプロ
セスである(Thompson,C.B. (1995) Science 267,1456-62)。今日までに研究され
たあらゆる細胞型のアポトーシスの早期の徴候のなかに、原形質膜リン脂質の非
対称な分布の喪失があり、これにより、原形質膜の細胞外リーフレットへの(ホ スファチジルセリンを含む)アニオン性リン脂質の暴露が生じる。ホスファチジ ルセリンのこの暴露、従ってアポトーシスは、標識アネキシンの結合を含む様々
な方法により検出することができる(Koopman,G.ら (1994) Blood 84,1415-20; M
artin,S.J.ら (1995) J Exp Med 182,1545-56; Broaddus,V.C.ら (1996) J Clin
Invest 98,2050-2059; Zhang Gら 1997, Biotechniques, Sep; 23(3):525-531)
。最近、アネキシン結合特異性が他の細胞病理と相関付けられた。例えば、King
KB (1997) J Cell Biochem 65(2), 131-144を参照。これまでのほとんどの研究
では、アポトーシス細胞を同定し数え上げるためにＦＩＴＣ−アネキシンＶとフ
ローサイトメトリーが用いられてきた。ＦＩＴＣでアネキシンＶを標識するには
、タンパク質の複数回の操作が必要となり、結合ＦＩＴＣ分子の数と位置が変わ
りうる標識タンパク質分子の不均一混合物になる。更に、ＦＩＴＣによる標識化
に最も直ぐに利用できるアネキシンＶのアミノ酸残基は、リン脂質結合表面上又
は該表面の近くにあり、その結果、リン脂質膜の結合の際にＦＩＴＣ−アネキシ
ンＶ蛍光が４０−５０％失活する(Tait,1988; Ernst, 1994;上掲)。
【０００５】 ＦＩＴＣ−アネキシンのこれらの制約を克服するために、本発明者らは、均一
に標識され、膜リン脂質の結合の際に蛍光特性を変化させないアネキシンを調製
することを探求した。ここに開示するものは、アネキシン類に融合したアエキオ
レア・ビクトリア(Aequorea victoria)緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)を含む内因 的に蛍光のホスファチジルセリン結合タンパク質の調製と特徴づけである。これ
らの試薬は、フローサイトメトリー又は蛍光顕微鏡によるアポトーシス細胞の非
常に高感度の検出方法を提供し、また化学的に修飾されたアネキシン類に対して
いくつかの利点をもたらすことが示される。
【０００６】 発明の概要 本発明は、アエキオレア・ビクトリア(Aequorea victoria)ＧＦＰ−アネキシ ン融合タンパク質に関する方法と組成物；特に、緑色蛍光タンパク質の等価な又
は増強した測定蛍光特性とアネキシンの等価な又は増強した測定結合特異性をも
たらす二機能性緑色蛍光タンパク質−アネキシン融合タンパク質を含んでなる組
換えポリペプチドを提供する。特定の実施態様において、融合タンパク質は、ア
ラニンを含んでなるリンカーを介して全長アネキシンＶに融合した全長Ｎ末端Ｇ
ＦＰを含んでなり、ここで融合したＧＦＰ及びアネキシン部分は、それぞれ対応
する未融合ＧＦＰ及びアネキシンタンパク質と等しいかそれ以上の蛍光強度とア
ニオン性リン脂質結合親和性をもたらす。
【０００７】 本発明は、また、可溶形で主題のタンパク質を発現する細菌を含む、主題のタ
ンパク質を発現する宿主細胞と、そのような細胞を使用して融合タンパク質を作
成する方法を提供する。主題の融合タンパク質の使用には、選択的細胞及び生化
学的標識化、特にアニオン性リン脂質のようなアニオン種のものが含まれる。特
定の実施態様では、融合タンパク質は、アポトーシス、死滅及び／又は損傷細胞
を選択的に標識するために使用される。
【０００８】 発明の特定の実施態様の説明 主題の二機能性ＧＦＰ−アネキシン融合タンパク質は、緑色蛍光タンパク質の
固有の強い蛍光特性をアネキシンの結合特異性と組み合わせる。ＧＦＰはクラゲ
のアエキオレア・ビクトリア(Aequorea victoria)から誘導され(その定義につい
ては例えば米国特許第５４９１０８４号を参照されたい）、様々な異なった励起
及び発光波長をもたらす変異体が含まれる。例えばHeimとTsein, 1996, Current
Biology 6, 178-182を参照されたい。融合タンパク質のＧＦＰ部分は、対応す る未融合ＧＦＰタンパク質と比較して等価か増強された測定された定性的及び／
又は定量的蛍光特性をもたらす。好適な蛍光特性は、発光及び／又は励起ピーク
、好ましくは、未変化又は検出可能に最適化された波長での最大蛍光発光ピーク
及び／又は振幅又は全体強度の非減少又は増強である。
【０００９】 主題のアネキシン類は、様々な真核生物源から引き出すことができ、例えばCe
ll Mol Life Sci, 1997年6月; 53(6)の全体、特に516-521頁のLiemann S, Huber
Rと、508-515頁のMorgan ROを参照されたい。少なくとも１３の区別されるアネ
キシン型の何れも使用することができる。融合タンパク質のアネキシン部分は、
対応する未融合アネキシンタンパク質と比較して等価か増強された測定された定
性的及び／又は定量的結合特異性をもたらす。好適な結合特異性は、特定のアニ
オン性細胞成分、特にホスファチジルセリンのようなリン脂質に対して等価か増
強された親和性を有する。
【００１０】 ＧＦＰ及びアネキシン部分は、典型的には約１〜５０の残基の、リンカーペプ
チドにより別個なものとでき、これが、融合タンパク質の必須の二機能性を容易
にするか少なくともそれに干渉しない。リンカーは、ＧＴＰ及びアネキシン部分
の高次構造化の機会を高め、及び／又は融合タンパク質に第３の機能性、例えば
エピトープ、翻訳後プロセシング部位等々をもたらしうる。例示的なリンカーに
は、アラニン又はポリアラニン、グリシン又はポリグリシン、ＦＬＡＧのような
エピトープタグ、プロセシング部位、例えばリン酸化、ユビキチン結合又はプロ
テアーゼ認識／切断部位等々が含まれる。
【００１１】 二機能性融合タンパク質の例を表Ｉに示す。
【表１】
【００１２】 本発明は主題の融合タンパク質をコードする組換え核酸を提供する。典型的に
は、ＧＦＰ及びアネキシン部分をコードする天然の単離された核酸が、通常の方
法を使用して発現作成物中にスプライシングされる。例えば、Molecular Clonin
g, A Laboratory Manual (Sambrookら, Cold Spring Harbor laboratory)、Curr
ent Protocols in Molecular Biology (Ausubelら編, Greene Publ. Assoc., Wi
ley-Interscience, NY)及びそこに引用された文献を参照されたい。あるいは、 主題のペプチドのアミノ酸配列を用いて、選択された発現系に対して最適化され
たペプチドコード核酸を逆翻訳する(Hollerら, (1993) Gene 136, 323-328; Mar
tinら (1995) Gene 154, 150-166)。何れの場合でも、作成物は、細菌、昆虫、 植物及び哺乳動物発現系のような任意の通常の系での発現に対して設計される。
タンパク質は好適には可溶形で分泌され及び／又は発現される；好ましくは宿主
細胞により分泌されるか宿主細胞内に保持されるタンパク質のほとんどが可溶形
である。好適な可溶性発現では、変性／再生が避けられ、好ましくは少なくとも
１０、より好ましくは少なくとも２５ｍｇ／Ｌの収量での＞９０％、好ましくは
＞９５％の一段階のアフィニティー精製が許容される。特定の実施態様では、発
現する宿主の温度が、宿主の生理学的又は環境温度よりも(例えば大腸菌又はヒ ト細胞では３７℃以下)少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、より好まし くは少なくとも１５℃減少させられる。
【００１３】 主題の融合タンパク質の使用には、選択的細胞及び生化学的標識化、特にアニ
オン性リン脂質のようなアニオン種のものが含まれる。主題のタンパク質は、任
意の簡便な方法、例えば直接の外因的付加、細胞への間接的な導入及び核酸をコ
ードする融合タンパク質の発現等々により、標的細胞又は生化学成分に暴露する
ことができる。特定の実施態様では、融合タンパク質はアポトーシス、死滅及び
／又は損傷細胞を選択的に標識するために使用される。
【００１４】 更なる説明をしなくとも、当業者であれば、これまでの説明と次の例示的な実
施例を用いて、本発明の化合物を製造し、使用し、また本発明の方法を実施する
ことができる。従って、次の実施例は、本発明の好適な実施態様を特に指摘する
ものであって、如何なる形によっても開示の残りの部分を制限するものではない
。他の総括的な構成は当業者には明らかであろう。本明細書において引用した刊
行物と特許出願の全て及びここに引用した文献は、あたかも個々の刊行物、特許
出願又は文献が特に個別に出典明示によりここに取り込まれることが示されてい
るように、出典明示によりここに取り込まれる。
【００１５】 実施例 プラスミドの作成： ＧＦＰアネキシン融合体の作成のための親のアネキシンプラスミドを刊行され
た文献(上掲のSeaton, 1995及びそこに引用された文献を参照されたい)に過去に
記載されたようにして構築した。例えば、ＧＦＰ−アネキシンＶ融合体の作成の
ための親プラスミドはｐＥＴ９ｄＥ２で、これは過去に作成され、ヒトアネキシ
ンＶの発現に使用された(上掲のErnst, 1994)。同様に、ＧＦＰのパネルをコー ドする作成物が、市販されている及び／又は刊行されている材料と方法(例えば 米国特許第５４９１０８４号；Clontechniques, 1997年4月; Kaln, 1997, Biote
chnol. International 8/97; HeimとTsien, 1996, Current Biology 6, 178-182
)を使用して作成される。例えば、緑色蛍光タンパク質(Ｓ６５Ｔ変異体)のオー プンリーディングフレームを、ｐＥＴ９ｄＥ２のＮｃｏＩ部位へのライゲーショ
ンに対してＲｃａＩの部位を導入するように設計されたプライマーとテンプレー
トとしてｐＳ６５Ｔ−Ｃ１(クローンテック)を使用するＰＣＲにより増幅した。
この場合、テンプレートプラスミドによりコードされたグリシンよりむしろ、前
方プライマーがコドン２に変化を導入して(野生型ＧＦＰにおけるように)セリン
をコードし、後方プライマーがＧＦＰオープンリーディングフレームの３'末端 の停止コドンを削除し、アラニンコドンを導入して、アネキシンＶの５'末端と の結合を形成する。ＰＣＲ産物のＲｃａＩでの消化後に、ＮｃｏＩ−消化ｐＥＴ
９ｄＥ２にライゲーションさせ、大腸菌ＤＨ５αを形質転換するために使用し、
正しい配向性でＧＦＰフラグメントを含んでいた形質転換体を使用してタンパク
質発現のために大腸菌ＢＬ−２１(ＤＥ３)を形質転換する。
【００１６】 タンパク質の発現と精製： 標準的な条件下(３７℃での増殖、０．４ｍＭのＩＰＴＧでの誘導)での最初の
タンパク質の発現の試みの結果、明るい蛍光であるが不溶性のタンパク質を生じ
た。従って、可溶性の二機能性タンパク質の発現に対する方法を案出した。一実
施態様では、ＩＰＴＧ誘導なしに１８−２０時間の間室温でＬＢ培地中での増殖
により大腸菌ＢＬ−２１(ＤＥ３)中にＧＦＰ−アネキシン融合タンパク質を発現
させた。この結果、細菌懸濁物のリゾチーム消化とプローブ超音波処理後に、明
るい緑色で、可溶性フラクション(約８０％)として存在する融合タンパク質が得
られた。大腸菌溶菌液の上清フラクションにカルシウム(２．５ｍＭ)を添加した
後、調整孔ガラス上に固定したリン脂質(例えばホスファチジルセリン)を使用し
てアフィニティークロマトグラフィーによりＧＦＰ−アネキシンを精製した(Ern
st,J.D.ら, (1991) J.Biol.Chem. 266,6670-6673; Ernst, J.D. (1991) J. Immu
nol. 146, 3110-3114; Ernst, 1994)。
【００１７】 ＧＦＰ−アネキシンの特性化： 電動励起及び発光単色光分光器を備え４ｎｍの帯域通過条件のＳＬＭ８０００
Ｃ分光蛍光分析計を使用して蛍光励起及び発光スペクトルを得た。リン脂質含有
リポソームを過去に開示されているようにして調製した(上掲のErnst,1994)。
【００１８】 アポトーシス細胞の研究： ウサギ及びヒト胸膜中皮細胞をほぼ集密的に６ウェルプレートに蒔いた。以下
に詳細に説明する実験に対しては、アスベストファイバー上への血清コーティン
グを避ける無血清条件において、アポトーシス刺激剤、クロシドライト(５−２ ０μｇ／ｃｍ２)又はアクチノマイシンＤ(０．３３μＭ)中で細胞を一晩かけて インキュベートした。浮遊細胞を培地の吸引により収集した後、付着した細胞を
トリプシン(２．５％)で脱離させ、浮遊細胞に加えた。細胞を氷上に維持して進
行中のアポトーシスを最小化した。アスベストファイバーに暴露した細胞を１０
０μｍの細胞ストレイナーを通して濾過し、フォローサイトメトリー分析に先立
ってファイバーを除去した。ついで、細胞(１条件当り約２−５ｘ１０５細胞)を
スピニングさせ、２００μｌのアネキシンバッファー(１５ｍＭのＨｅｐｅｓと ２ｍＭの総カルシウム濃度の[ハンクス中に１．３ｍＭと更に０．７ｍＭのＣａ Ｃｌ２]ハンクスバッファー)に再懸濁させた。
【００１９】 細胞(２００μｌ中に２−５ｘ１０５)を氷上で１０分間ＧＦＰ−アネキシン又
はＦＩＴＣ−アネキシン(両方とも３μｇ／ｍｌ)と共にインキュベートした。フ
ローサイトメトリーによる分析の直前に、ヨウ化プロピジウム(１５μｇ／ｍｌ 、シグマケミカル社)を各チューブに添加した。更なる洗浄も固定化も実施しな かった。
【００２０】 氷上の細胞を、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェア(ベクトンディキンソン)を使
用する収集とデータ分析を伴うフローサイトメトリー(FACSort, ベクトンディキ
ンソン、サンノゼ、カルフォルニア)により分析した。二つの蛍光プローブの使 用に対する補正をＧＦＰ−アネキシン又はヨウ化プロピジウムの何れかのみで染
色した対照細胞を使用して行った。１試料につき１００００事象を取得して十分
な平均データを確保した。
【００２１】 細胞内抗原の検出に対しては、細胞には固定化と透過化処理が必要となる。Ｇ
ＦＰ−アネキシン結合がこれらの条件により変わるかどうかを決定するために、
様々な固定液と透過化処理を試験した。これらの研究の間、カルシウム濃度は５
ｍＭまで増大させた。細胞を上述のＧＦＰ−アネキシンで染色した後、細胞をア
ネキシンバッファー中で２回洗浄して全ての遊離のＧＦＰ−アネキシンを除去し
た。固定化中の結合ＧＦＰ−アネキシンの安定性を決定するために、細胞をつい
で暗所で１０分間グルタルアルデヒド(０．５−２％)かパラホルムアルデヒド( ２−４％)の何れかで固定化した。ついで細胞をアネキシンバッファー(５ｍＭの
ＣａＣｌ２含有)中で洗浄し、同じバッファー中で４分間トリトン０．１％で透 過化処理をした。更なる洗浄に続いて、ＧＦＰ−アネキシン結合の分析のために
、細胞をアネキシンバッファー(５ｍＭのＣａＣｌ２含有)中に再懸濁させた。
【００２２】 ＧＦＰ−アネキシンの発現と精製： 低温の発現条件下で、約８０％の発現したＧＦＰ−アネキシンが大腸菌溶解物
の可溶画分中に存在し、ほぼ＞９０％を単一工程のリン脂質アフィニティークロ
マトグラフィーで単離精製した。例えば、ＧＦＰ−アネキシンＶタンパク質をカ
ルシウム依存性ホスファチジルセリンアフィニティークロマトグラフィーにより
単一工程で＞９０％純度まで単離した。これは、効果的な精製工程となると共に
アネキシンドメインのリン脂質結合能がこれらのキメラ中に保存されていた証拠
を提供する。ＧＦＰがアネキシンＶのカルボキシル末端に融合した他のキメラタ
ンパク質もまた可溶性で蛍光であったが、ホスファチジルセリンには結合しなか
った。単離されたタンパク質はアミノ酸組成物(アネキシンＶ融合体に対して６ １ｋＤａ)により予想された電気泳動度を有し、アネキシン部分に対する抗体に より認識され、ゲルのＵＶ透照と共にＳＤＳ−耐性蛍光を示し、両前駆体の機能
特性を示した。対照的な配向でその部分を含むアネキシンＶ融合タンパク質(例 えばアネキシンＶのカルボキシル末端に融合したＧＦＰ)がリン脂質を結合でき なかったことは予想できず、ＧＦＰドメインがアネキシンのリン脂質結合表面を
覆った結果であったと思われる。
【００２３】 ＧＦＰ−アネキシンの蛍光特性： ＧＦＰへのアネキシンの融合がＧＦＰ部分の蛍光特性を低減させないことを確
認するために、ＧＦＰ−アネキシン融合タンパク質の励起及び発光スペクトルを
調べ、ＧＦＰのスペクトルは減少しなかったことが分かった。例えば、ＧＦＰ( Ｓ６５Ｔ)−アネキシンＶ融合タンパク質は、４９０ｎｍで励起されたとき、５ １２ｎｍが中心の蛍光発光の分散ピークを示した。残基６５をセリンからトレオ
ニンへ変更すると近紫外線範囲でのＧＦＰの励起の喪失を引き起こすという先の
見解に一致して、これらのＧＦＰ−アネキシンＶキメラが３７５ｎｍで励起され
たとき蛍光が検出されなかった。蛍光発光が５１０ｎｍで観測されたとき、４６
５−４９５ｎｍで単一の主要な励起ピークがあり、４８０ｎｍに小さな谷があっ
た。蛍光スペクトルは、カルシウム(１．０ｍＭ)、ホスファチジルセリン含有リ
ポソーム(１．０μＭ)又は双方の添加により影響を受けなかった。これらのＧＦ
Ｐ含有タンパク質は、アルゴンレーザーベースのフローサイトメーター(４８８ ｎｍでの励起／５３０ｎｍでの検出)での使用に理想的に適していた。
【００２４】 フローサイトメトリーによりアポトーシス細胞を検出するためのＧＦＰ−アネキ
シンＶの使用： アネキシンＶキメラが特異的かつカルシウム依存的にアポトーシス細胞に結合
するアネキシンＶの能力を保持しているかどうかを決定するために、胸膜中皮細
胞のアポトーシスのよく特徴づけされたモデル系を使用した(上掲のBroaddus,19
96)。ＧＦＰ−アネキシンＶキメラは正常細胞には結合しなかったが、フローサ イトメトリーによる検出では、アポトーシス中皮細胞に対して飽和性結合を示し
た。ＦＩＴＣ−アネキシンＶと比較して、ＦＩＴＣ−アネキシンＶの約１／２の
モル濃度でＧＦＰ−アネキシンＶキメラを使用したにもかかわらず、ＧＦＰ−ア
ネキシンＶキメラ標識アポトーシス細胞の蛍光は５倍明るかった。これらの実験
において、ＦＩＴＣ−アネキシンＶ又はＧＦＰ−アネキシンＶキメラの何れかで
の染色は、アクリジン・オレンジでの染色よりも、より高感度のアポトーシス細
胞の検出をもたらした。アポトーシス細胞に対するＧＦＰ−アネキシンＶキメラ
の結合はカルシウム依存的であり、非標識アネキシンＶと競合的に拮抗しうる。
従って、ＧＦＰの蛍光特性の保持に加えて、ＧＦＰ−アネキシンＶキメラはまた
アポトーシス細胞の原形質膜の外側リーフレット上へのアニオン性リン脂質の暴
露を特異的に検出するアネキシンＶの能力を維持する。ＧＦＰ−アネキシンＶキ
メをまた、ヨウ化プロピジウム(ＰＩ)を排除して早期のアポトーシス(ＧＦＰ− アネキシンＶ＋、ＰＩ−)細胞を遅発アポトーシス又は壊死細胞(ＧＦＰ−アネキ
シンＶ＋、ＰＩ−)と区別する実験において使用することができる。
【００２５】 インビボでのアポトーシスの研究においては、アポトーシスを受ける細胞型を
同定することが重要である。アポトーシス細胞の表現型を決める一つの手段は、
特異的細胞型を同定する抗体で同時染色(costain)することである。ある細胞、 例えば中皮細胞は独特の細胞表面抗原を持たず、中間フィラメント、すなわちサ
イトケラチンの細胞内発現により同定されなければならない。これ又は他の細胞
内抗原への抗体の接近には洗浄剤での細胞透過化処理が必要で、これは原形質膜
リン脂質の完全性を破壊する。アポトーシス細胞がＧＦＰ−アネキシンＶキメラ
で最初に標識され、洗浄されて未結合融合タンパク質が除去され、パラホルムア
ルデヒド又はグルタルアルデヒドで固定され、０．１％トリトンＸ−１００で透
過化処理がなされたとき、ＧＦＰ−アネキシンＶキメラ結合が保持された。更に
、サイトケラチンに対するモノクローナル抗体及びＰＥ−標識ヤギ抗マウスＩｇ
Ｇでの染色後に、二色のフローサイトメトリーを使用して、クロシドライトアス
ベストで処理したウサギの胸膜空間から得られた細胞混合物(リンパ球、マクロ ファージ、及び好中球)中のアポトーシス中皮細胞を同定し数量化することがで きる。
【００２６】 その二機能性のために、ＧＦＰ−アネキシンは、更なるアポトーシス及びリン
脂質の対称性の喪失とアニオン性リン脂質の暴露に特徴がある赤血球膜の疾患の
研究に対して有用な試薬である(Kuypers,F.A.ら (1996) Blood 87, 1179-1187;
Wood,B.L., Gibson,D.F.及びTait,J.F. (1996) Blood 88, 1873-80)。膜リン脂 質を研究するための試薬としてのＧＦＰ−アネキシンの有用性に加えて、ここに
記載したアプローチは、無傷の細胞における細胞内膜との特定のアネキシンの相
互作用を研究するためにＧＦＰへのアネキシン融合体を構築するのに有用である
。アネキシンは、ファゴソーム、エンドソーム、及び細菌病原体を含む細胞内小
胞の膜と相互作用することが見出されている(上掲のErnst, 1991; Emans,Nら (1
993) J Cell Biol 120,1357-1369; Desjardins,Mら (1994) J Biol Chem 269,32
194-200; Majeed,Mら (1994) Infect Immun 62, 127-134; Diakonova,Mら (1997
) J Cell Sci 110, 1199-213)。細胞内膜とのアネキシンの相互作用を研究する ために機能的によく特徴付けされている二機能性ＧＦＰ−アネキシン融合タンパ
ク質を使用する能力は、アネキシンタンパク質の細胞内機能の理解を更に進歩さ
せるであろう。
【配列表】
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年４月１０日（２０００．４．１０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G045 AA34 BB20 CB01 CB21 DA36 FB07 FB12 4B024 BA21 CA04 DA02 DA06 EA04 GA12 GA14 HA01 4B064 AG02 CA02 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26X AA90X AB01 AC20 BA02 CA24 CA44 CA46 4H045 AA10 BA10 BA41 CA40 DA50 EA20 EA50 FA74

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 二機能性アエキオレア・ビクトリア(Aequorea victoria)緑 色蛍光タンパク質−アネキシン融合タンパク質を含んでなる組換えポリペプチド
    であって、該融合タンパク質が、対応する未融合ＧＦＰ及びアネキシンタンパク
    質と等しいかそれ以上の蛍光強度及びアニオン性リン脂質結合親和性をもたらす
    ＧＦＰ及びアネキシン部分を含んでなるポリペプチド。
  2. 【請求項２】 ＧＦＰ及びアネキシン部分が、Ｓ６５Ｔ ＧＦＰ変異体／ｈ アネキシンＶの残基１−３２０(配列番号：１の残基１−３２０)；Ｓ６５Ｔ Ｇ ＦＰ変異体／ｈアネキシンＶの残基１２−３２０(配列番号：１の残基１２−３ ２０)；Ｓ６５Ｔ ＧＦＰ変異体／ｈアネキシンＶの残基３−３１９(配列番号： １の残基３−３１９)；Ｓ６５Ｔ ＧＦＰ変異体／ｍアネキシンＶの残基１−３１
    ９(配列番号：２の残基１−３１９)；Ｓ６５Ｔ ＧＦＰ変異体／ｒアネキシンＶ の残基１２−３１９(配列番号：３の残基１−３１９)；Ｓ６５Ｔ ＧＦＰ変異体 ／ｈアネキシンＩＶの残基１−３２１(配列番号：４の残基１−３２１)；Ｓ６５
    Ｔ ＧＦＰ変異体／ｈアネキシンＩＩＩの残基１−３２３(配列番号：５の残基１
    −３２３)；Ｙ６６Ｈ ＧＦＰ変異体／ｈアネキシンＶの残基１２−３２０(配列 番号：１の残基１２−３２０)；Ｙ６６Ｗ ＧＦＰ変異体／ｈアネキシンＶの残基
    ６−３２０(配列番号：１の残基６−３２０)；Ｆ６４Ｌ ＧＦＰ変異体／ｈアネ キシンＩＩＩの残基６−３２３(配列番号：５の残基６−３２３)；Ｓ６５Ｔ Ｇ ＦＰ変異体／ｈアネキシンＩの残基１−３４６(配列番号：６の残基１−３４６)
    ；及びＳ６５Ｔ ＧＦＰ変異体／ｈアネキシンＩの残基４１−３４６(配列番号：
    ６の残基４１−３４６)から選択される請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載の可溶性ポリペプチドを含んでなる細菌。
  4. 【請求項４】 二機能性緑色蛍光タンパク質−アネキシン融合タンパク質を
    含んでなるポリペプチドを調製する方法において、請求項１に記載のポリペプチ
    ドをコードする核酸を含んでなる細菌を、ポリペプチドが細菌中に可溶的に発現
    される条件下で培養する工程を含んでなる方法。
  5. 【請求項５】 請求項１に記載のポリペプチドに細胞を接触させる工程を含
    んでなる細胞の標識方法。
  6. 【請求項６】 請求項１に記載のポリペプチドを発現する細胞。
  7. 【請求項７】 請求項１に記載のポリペプチドを発現する哺乳動物細胞。
  8. 【請求項８】 請求項１に記載のポリペプチドを発現する培養細胞。
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