JP2001520007A - オステオプロテゲリンの発現を欠く哺乳類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 オステオプロテゲリンコード遺伝子の発現が抑制された哺乳類が開示される。さらに、そのような哺乳類を作製するのに有用な核酸構築物、およびそのような構築物を含む細胞株も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景 発明の属する技術分野 本発明は、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）の内因性遺伝子によりコードされ
たタンパク質の生成が完全に抑制された哺乳類に関する。

【０００２】 関連技術の説明 オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）は最近単離され、骨密度を増加させる能力が
あるＴＮＦＲファミリーの新規メンバーとして特徴づけられている（Ｓｉｍｏｎ
ｅｔら、 Ｃｅｌｌ ８９， ３０９−３１９ （１９９７）、およびＰＣＴ出
願第ＵＳ９６／２０６２１号）。ＯＰＧは、前駆細胞から破骨細胞への分化およ
び／または活性化の最終ステップを止めることにより、骨吸収と骨形成との密接
な連結の平衡を保つ能力を有する因子の一つである。正常マウスまたは卵巣を切
除したラットに組換えＯＰＧを投与すると、骨質量は増加し、骨吸収は減少する
。ＯＰＧは発生過程のマウス胚の軟骨原基痕跡で発現し、このことはＯＰＧは骨
形成の過程における生理的調節因子であることを示唆している。

【０００３】 トランスジェニックマウスでＯＰＧを過剰発現すると、破骨細胞数の減少と骨
幹端の小柱骨の活性化を伴った重篤な大理石骨病が生じる（Ｓｉｍｏｎｅｔら、
上記）。ＯＰＧトランスジェニックマウスの表現型は、他の大理石骨病ネズミモ
デルのものとは顕著に異なる。ｏｐ／ｏｐマウス（ｃｓｆ−１^−／−） （Ｙｏ
ｓｈｉｄａら、 Ｎａｔｕｒｅ ３４５：４４２−４４４ （１９９０）； Ｗ
ｉｋｔｏｒ−Ｊｅｄｒｚｅｊｃｚａｋら、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ
． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：４８２８−４８３２ （１９９０）； Ｍａｒｋ
ｓら、 Ｊ． Ｈｅｒｅｄｉｔｙ ６７：１１−１８ （１９７６）； Ｗｉｋ
ｔｏｒ−Ｊｅｄｒｚｅｊｃｚａｋら、 Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １５６：１
５１６−１５２７ （１９８２））、小眼球症マウス（ｍｉ／ｍｉ） （Ｅｂｉ
ら、 Ｂｌｏｏｄ ７５：１２４７−１２５１ （１９９０）； Ｇｒａｖｅｓ
ら、 Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓ． １４５：１０２−１０９ （１９９０）
； Ｓｉｌｖｅｒｓ Ｔｈｅ ｃｏａｔ ｃｏｌｏｒｓ ｏｆ ｍｉｃｅ： Ａ
ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｅ ａｃｔｉｏｎ ａｎｄ
ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ， （１９７９）； Ｉｓｏｚａｋｉら、 Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈ． １４５： ８２７−８３６ （１９９４））、およびｃ−ｓｒｃ^−／−とｃ−ｆｏ
ｓ^−／−マウス（Ｓｏｒｉａｎｏら、 Ｃｅｌｌ ６４：６９３−７０２ （１
９９１）； Ｗａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３６０：７４１−７４５ （１９９２
）； Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓら、 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：４４３−４４８
（１９９４）； Ｊｏｈｎｓｏｎら、 Ｃｅｌｌ ７１：５７７−５８６ （
１９９２））などの遺伝子変異体はすべて、歯牙萌出障害と成長の遅延を伴う大
理石骨病を示す。これらの遺伝子変異体で見られる欠陥は、一般に、破骨細胞数
の減少または不活性の破骨細胞に起因する骨吸収の減少に関連している（Ｙｏｓ
ｈｉｄａら、上記； Ｗｉｋｔｏｒ−Ｊｅｄｒｚｅｊｃｚａｋら、上記； Ｇｒ
ａｖｅｓら、上記； Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓら、上記； Ｂｏｙｃｅら、Ｊ．
Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９０：１６２２−１６２７ （１９９２）；
Ｌｏｗｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：
４４８５−４４８９ （１９９３））。一般に、特性が調べられている大理石骨
病マウスモデルの長骨は長さが短く、マウスは顔と頭蓋にわずかに異常を示す。
ＯＰＧトランスジェニック動物での大理石骨病は、多く発現しているもので重篤
だが、長骨の短縮化と歯牙萌出障害を伴わずに起こる（Ｓｉｍｏｎｅｔら、 ｓ ｕｐｒａ ）。

【０００４】 ＯＰＧの薬理学的用量により骨密度が上昇することが証明された。しかしなが
ら、骨質量の発達や維持および他の代謝過程におけるＯＰＧの生理的役割を理解
する必要がある。特に、ＯＰＧが骨質量の生理的調節因子であるのか否か、ＯＰ
Ｇが非存在の場合に他の因子が正常な骨質量の維持を補償するのか否かを決定す
る必要がある。さらに、骨密度が減少した動物モデルは、骨減少の疾患の新規治
療薬をスクリーニングするのに役立つ。

【０００５】 したがって、本発明の目的はＯＰＧをコードする遺伝子の発現が抑制された哺
乳類を提供することにある。

【０００６】 この目的とそのような他の諸目的は、当業者に容易に明白であろう。

【０００７】 発明の要約 本発明はＯＰＧをコードする遺伝子の発現が抑制された哺乳類に関する。さら
に、そのような哺乳類を作製するのに有効な核酸構築物、およびそのような構築
物を含む細胞株も提供する。

【０００８】 一つの実施形態では、本発明は、一方の対立遺伝子が破壊されていて、ＯＰＧ
をコードする遺伝子を含む哺乳類を提供する。別の実施形態では、この発明は、
両方の対立遺伝子が破壊されていて、ＯＰＧをコードする遺伝子を含む哺乳類を
提供する。さらに別の実施形態では、この発明は、破壊がＯＰＧするコード遺伝
子のヌル変異を生じる、破壊されたＯＰＧ変異を含む哺乳類を提供する。

【０００９】 好ましくは、哺乳類は非ヒト哺乳類である。さらに好ましくは、哺乳類はげっ
歯類である。場合によって、げっ歯類はマウスである。

【００１０】 また、さらなる実施形態では、この発明はＯＰＧノックアウト構築物を含む核
酸分子を提供する。場合によって、この構築物は増幅および／または発現ベクタ
ーに挿入してよく、このベクターは原核細胞または真核細胞、あるいは胚の形質
転換に有用である。

【００１１】 さらなる一実施形態では、この発明はＯＰＧノックアウト構築物を含むネズミ
ＲＷ４胚幹細胞株を提供する。

【００１２】 ＯＰＧ発現の抑制により、骨密度が減少し骨吸収が上昇する表現型が生じる。
ここで述べるＯＰＧノックアウト哺乳類は、骨吸収を調節する化合物をスクリー
ニングする方法を提供し、骨粗鬆症等の骨疾患を治療する薬剤を同定するのに有
益である。

【００１３】 発明の詳細な説明 「ノックアウト」という用語は、哺乳類の一細胞、選択した細胞、または全細
胞の内因性遺伝子（ＯＰＧ等）がコードしているポリペプチドの少なくとも一部
分の発現ま部分的または完全な減少を意味する。哺乳類は、内因性遺伝子の一方
の対立遺伝子が破壊されている、「ヘテロ接合ノックアウト」でもよい。あるい
は、哺乳類は、内因性遺伝子の両方の対立遺伝子が破壊されている、「ホモ接合
ノックアウト」でもよい。

【００１４】 「ノックアウト構築物」という用語は、内因性遺伝子がコードしているポリペ
プチドの、哺乳類の一つまたはそれ以上の細胞における発現が減少または抑制さ
れるように設計されたヌクレオチド配列のことを言う。ノックアウト構築物とし
て使用されるヌクレオチド配列は、典型的には、（１）抑制すべき内因性遺伝子
のある部分由来のＤＮＡ（一つ以上のエキソン配列、イントロン配列、および／
またはプロモーター配列）と（２）細胞内でノックアウト構築物の存在を検出す
るのに利用するマーカー配列を含む。ノックアウトすべき内因性遺伝子を含む細
胞にノックアウト構築物を挿入する。ノックアウト構築物は、それにより内因性
ＯＰＧ遺伝子の一方または両方の対立遺伝子に組み込まれ、そのようなＯＰＧノ
ックアウト構築物の組み込みにより、全長内因性ＯＰＧ遺伝子の転写が妨げられ
または阻止される。細胞の染色体ＤＮＡへのＯＰＧノックアウト構築物の組み込
みは、典型的には、相同的組換えによって達成される（すなわち、ノックアウト
構築物が細胞に挿入されると、内因性ＯＰＧＤＮＡ配列に相同的または相補的な
ＯＰＧノックアウト構築物の部分が、相互にハイブリダイズし、これらの領域が
次いで再組換えを起こし、結果としてノックアウト構築物が内因性ＤＮＡの対応
する位置に組み込まれる）。

【００１５】 典型的には、ノックアウト構築物は胚幹細胞（ＥＳ細胞）と称する未分化細胞
に挿入する。ＥＳ細胞は通常、以下に述べるように、この中に挿入することがで
きる、発生中の胚と同じ種の胚または胚盤胞由来である。

【００１６】 「遺伝子の破壊」、「遺伝子破壊」、「発現抑制」、および「遺伝子抑制」と
いう語句は、内因性ＯＰＧ遺伝子のコード領域（通常一つ以上のエキソンを含む
）および／またはこの遺伝子のプロモーター領域細胞内において全長ＯＰＧ分子
の発現が減少されまたは妨げられるように、相同領域にＯＰＧヌクレオチド配列
ノックアウト構築物を挿入することを意味する。挿入は通常相同的組換えによっ
て完了する。例として、抗生物質耐性遺伝子を含むヌクレオチド配列を破壊すべ
きＯＰＧをコードする単離されたヌクレオチド配列の一部分に挿入して、ヌクレ
オチド配列ノックアウト構築物を構築する。次にこのノックアウト構築物を胚幹
細胞（“ＥＳ細胞”）に挿入すると、この構築物は少なくとも一方のＯＰＧ対立
遺伝子のゲノムＤＮＡに組み込まれる。このように、ＯＰＧの内因性コード領域
の少なくとも一部分は抗生物質耐性遺伝子によって破壊されているので、この細
胞の多くの子孫は少なくともある細胞内ではＯＰＧを発現せず、または低レベル
でおよび／または切断型として発現する。

【００１７】 「マーカー配列」という用語は、（１）より大きなヌクレオチド配列構築物（
すなわち、“ノックアウト構築物”）の一部としてＯＰＧの発現を破壊するため
に利用される、および（２）ＯＰＧノックアウト構築物が染色体ＤＮＡに組み込
まれている細胞を同定する手段として使用される、ヌクレオチド配列のことを言
う。マーカー配列はこれらの目的にかなういずれかの配列であるが、典型的には
、抗生物質耐性遺伝子または細胞内に天然には見出されないアッセイ可能な酵素
等の、同定可能な形質を細胞に与えるタンパク質をコードする配列である。マー
カー配列は典型的には、その発現を制御する同種または異種のプロモーターも含
む。

【００１８】 「げっ歯類」という用語はＲｏｄｅｎｔｉａ系統目のすべてのメンバーを意味
し、そこから派生する全後世代のいずれかおよびすべての子孫を含む。

【００１９】 「ネズミ」という用語はＭｕｒｉｄａｅ科のいずれおよびすべてのメンバーを
意味し、これらに限定されないが、ラットとマウスを含む。

【００２０】 「子孫」という用語は、特定の哺乳類由来のまたは派生のいずれかおよびすべ
ての後世代を表し、すなわち、哺乳類がノックアウト構築物についてヘテロ接合
であってもまたはホモ接合性であってもそのゲノムＤＮＡ内に挿入された一つ以
上のノックアウト構築物を含む哺乳類を表す。ノックアウト構築物を不確定に含
むＦ１、Ｆ２、Ｆ３世代等がこの定義に含まれるように、いずれの連続的な世代
の子孫もこの中に含まれる。

【００２１】 ＯＰＧ対立遺伝子の一方または両方、他遺伝子の対立遺伝子の一方または両方
がノックアウトされた哺乳類が、この発明の範囲に含まれる。そのような哺乳類
は、他の遺伝子を用いずにＯＰＧノックアウト哺乳類を作製するここで説明した
方法を繰り返すことにより、あるいは、ＯＰＧがノックアウトされた一方または
両方の対立遺伝子を有する哺乳類と、第２遺伝子がノツクアウトされた一方また
は両方の対立遺伝子と有する哺乳類とを、互いに交配し、ダブルノックアウト遺
伝子型を有する子をスクリーニングすることにより、作製することができる（ダ
ブルヘテロ接合またはダブルホモ接合ノックアウト遺伝子型、あるいはそれの変
形である）。

【００２２】 １）一方または両方のＯＰＧ対立遺伝子、および場合によって他の遺伝子の一
方または両方の対立遺伝子がノックアウトされている、および２）一つ以上の導
入遺伝子（すなわち、哺乳類において天然に存在するかまたはしないポリペプチ
ドをコードする外因性ＤＮＡ配列）が挿入された哺乳類も、この発明の範囲に含
まれる。

【００２３】 ノックアウト技術 １． ＯＰＧ遺伝子の単離 ＯＰＧノックアウト構築物は、典型的には、ゲノムまたはｃＤＮＡＯＰＧヌク
レオチド配列の一部分（通常、少なくとも一つのエキソンと一つのイントロンを
コードしている）を単離し、ＯＰＧ配列にマーカー配列を挿入することにより構
築される。この構築物の調製に利用されるＯＰＧ遺伝子または遺伝子フラグメン
トは、様々な方法で得られる。通常、ＯＰＧ ＤＮＡ分子の長さは少なくとも約
１キロベース（ｋｂ）であり、好ましくは３〜４ｋｂであり、それによってノッ
クアウト構築物がＥＳ細胞のゲノムＤＮＡに導入された時に染色体ＤＮＡの認識
（すなわち相同的組換え）のために十分な相補的配列が得られる（以下で説明）
。

【００２４】 ノックアウト構築物の調製に利用するゲノムＯＰＧフラグメントまたはｃＤＮ
Ａ分子は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ， ＮＹ （１９８９））によって記述されたような、この分野で周知の方
法を利用して得ることができる。そのような方法には、例えばオリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いる特定のＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅すること、あるいはＯＰＧ
ゲノム配列の少なくとも一部分を得るために、同じまたは相同性の高いＯＰＧ遺
伝子の少なくとも一部をコードするｃＤＮＡプローブを用いてＯＰＧ遺伝子を含
む細胞または組織から調製されたゲノムライブラリーをスクリーニングすること
が含まれる。あるいは、ｃＤＮＡ配列をノックアウト構築物に用いるのであれば
、オリゴヌクレオチドプローブ、相同的なｃＤＮＡプローブまたは抗体を用いて
ｃＤＮＡライブラリー（好ましくはＯＰＧを発現する組織から調製されたもので
あり、組織または細胞はノックアウト哺乳類とするのと同じまたは類似の哺乳類
由来である）をスクリーニングしてｃＤＮＡを得ることができる（ライブラリー
が発現ベクターにクローン化されている場合）。プロモーター配列をノックアウ
ト構築物に用いるのであれば、ゲノムライブラリーのスクリーニングまたはＰＣ
Ｒを用いた増幅用に、それぞれ合成ＤＮＡプローブまたはプライマーを設計する
ことができる。

【００２５】 内因性ＯＰＧ遺伝子のＤＮＡ配列が既知である場合、Ｅｎｇｅｌｓら（Ａｎｇ
ｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．， ２８：７１６−７３４
（１９８９））によって記述されたような化学合成法を利用して、その遺伝子
の目的部分をコードするＤＮＡフラグメントを合成して作製することができる。
このような方法にはとりわけ、核酸合成のホスホトリエステル、ホスホラミダイ
ト、およびＨ−ホスホネート法が含まれる。典型的には、調製すべきゲノムＤＮ
Ａフラグメントは長さが数百塩基対である。この中で説明したＤＮＡ合成法は約
１００塩基対までの核酸配列を作製するのに用いることができるため、天然なゲ
ノムＤＮＡを１００ｂｐのフラグメントで合成し、次に標準のＤＮＡ連結法を用
いて連結することが可能である。

【００２６】 ノックアウト構築物に利用するために調製するＯＰＧゲノムＤＮＡフラグメン
トまたはＯＰＧｃＤＮＡ分子は、遺伝子操作のため十分量作製しなければならな
い。１）フラグメントを適当なベクターに組み込み、そのベクターを迅速に増幅
できる細菌または他の細胞と形質転換することにより、２）ＰＣＲ増幅により、
３）ＤＮＡ合成機での合成により、あるいは４）他の適当な方法により増幅を行
う。

【００２７】 ２． ＯＰＧノックアウト構築物の調製 ＯＰＧノックアウト構築物を構築するのに用いるＯＰＧゲノムＤＮＡフラグメ
ント、ｃＤＮＡ分子、あるいはＰＣＲフラグメントを、構築物に用いるＯＰＧゲ
ノムＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡ分子、あるいはＰＣＲフラグメントの適した
位置にマーカー遺伝子をコードする第２のＤＮＡ分子が挿入されるような部位で
切断されるよう選択した一つ以上の制限酵素で、切断する。マーカー遺伝子の挿
入に適した位置は、全長内因性ＯＰＧ遺伝子の転写および／または翻訳を減少さ
せまたは妨げるのに利用できる位置である。この位置は様々な要因に依存し、切
断する配列内で利用できる制限部位、エキソン配列またはプロモーター配列ある
いはその両方を妨げるのか、その哺乳類にいくつかのＯＰＧアイソフォームが存
在するのか（選択的スプライシングによる）そしてそのアイソフォームの一つだ
けを妨げるのか等によって決まる。好ましくは、ＯＰＧゲノムＤＮＡフラグメン
ト、ｃＤＮＡ分子、あるいはＰＣＲフラグメントを切断するために選択した酵素
により長い方のアームと短い方のアームを生じ、短い方のアームは少なくとも約
３００塩基対（ｂｐ）である。ある場合には、この天然ゲノムの一つ以上のイン
トロンまたはエキソンあるいはｃＤＮＡ分子の、一部またはすべてを実際に除去
するのが望ましい。これらの場合、適当なサイズと適当な位置のフラグメントを
除去するのに適した制限酵素でＯＰＧゲノムＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡ分子
、あるいはＰＣＲフラグメントを切断する。

【００２８】 ノックアウト構築物に用いるマーカー遺伝子は、ＥＳ細胞、最終的にはノック
アウト哺乳類のゲノムＤＮＡに組み込まれた後に検出可能および／またはアッセ
イ可能ないずれかの核酸分子であるが、典型的には抗生物質耐性遺伝子またはゲ
ノム内での発現あるいは存在が容易に検出可能な他の遺伝子である。好ましくは
、マーカー遺伝子は哺乳類には天然に存在しないポリペプチドをコードする。マ
ーカー遺伝子は通常、自身のプロモーター、あるいはいずれかの起源のチミジン
キナーゼ（ＴＫ）プロモーターやホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモ
ーター等の、挿入した細胞内で活性であるかまたは容易に活性化可能な強いプロ
モーターに機能的に連結されている。しかし、マーカー遺伝子は、ノックアウト
する遺伝子のプロモーターを利用して転写されるため、自身のプロモーターを必
要性としない。さらに、マーカー遺伝子は通常、３’末端に付加したポリＡ配列
を有する。この配列はマーカー遺伝子の転写を終結するように働く。好ましいマ
ーカー遺伝子は、ｎｅｏ（ネオマイシン耐性遺伝子）等のいずれかの抗生物質耐
性遺伝子とβ−ｇａｌ（βガラクトシダーゼ）である。

【００２９】 ＯＰＧゲノムＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡ分子、あるいはＰＣＲフラグメン
トを適当な制限酵素で切断した後、当業者には周知でありＳａｍｂｒｏｏｋら、
上記によって記述された方法を利用して、マーカー遺伝子分子を天然のゲノムＤ
ＮＡまたはｃＤＮＡ分子に連結する。ある場合には、マーカー配列をＯＰＧ核酸
配列に関して逆またはアンチセンスの向きに挿入するのが好ましい。この逆向き
挿入は、マーカー遺伝子が特に強いプロモーターに機能的に連結している場合に
好ましい。

【００３０】 連結するＤＮＡ分子の末端は連結可能になっていなければならない；これは連
結可能な末端を生じる制限酵素で全フラグメントを切断するか、またはＤＮＡ連
結前に末端を平滑末端化することによって行う。平滑末端化は、例えばクレノウ
フラグメント（ＤＮＡポリメラーゼＩ）により突出末端を埋める等、この分野で
周知の方法を用いて行う。ＤＮＡ連結後、連結した構築物を選択的な制限酵素消
化によりスクリーニングし、どの構築物が目的の向きにマーカー遺伝子を含んで
いるかを決定する。

【００３１】 連結したＤＮＡノックアウト構築物は胚幹細胞（以下で述べる）に直接形質導
入するか、または挿入前にまず増幅に適したベクターに組み込む。好ましいベク
ターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）またはｐＧＥＭ７（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒ
ｐ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）等の、細菌細胞内で迅速に増幅するベクター
である。

【００３２】 ３． 胚幹細胞の形質導入 ＯＰＧノックアウト構築物は、典型的には、胚由来の幹細胞（胚幹細胞、また
は“ＥＳ細胞”）に形質導入する。ＥＳ細胞は、染色体外のＤＮＡを取り込みそ
れを染色体ＤＮＡへ組み込む能力を有する未分化細胞である。通常、ノックアウ
ト哺乳類を作製するのに用いるＥＳ細胞は、作製するノックアウト哺乳類と同じ
種のものである。よって例えば、ノックアウトマウスを作製するには通常マウス
胚幹細胞を用いる。

【００３３】 用いる胚幹細胞株は、ノックアウト構築物の生殖系列伝達を行うため、分化し
ている胚の生殖系列に組み込むまたは一部となる能力によって典型的に選択され
る。したがって、この可能性を有すると考えられるいずれのＥＳ細胞株がここで
の利用に適している。ノックアウトマウスを作製するのに好ましいＥＳ細胞株は
マウス細胞株Ｄ３とＥ１４（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， １２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｏｃ
ｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ ２０８５２−１１７６ ＵＳＡ， カタログ番号それぞ
れＣＲＬ １９３４とＣＲＬ １８２１）、またはＲＷ４（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， ８６２０ Ｐｅｎｎｅｌｌ Ｄｒｉｖｅ， Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉ ６３１１４ ＵＳＡ， カタログ番号ＥＳＶＪ−１１８
２）である。Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ （ｉｎ： Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉ ｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ， Ｅ．Ｊ． Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， ｅｄ． ＩＲ
Ｌ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ （１９８７））、Ｂｒａｄ
ｌｅｙら、 （Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｄｅｖｅｌ． Ｂｉｏｌ
．， ２０：３５７−３７１ （１９８６））、およびＨｏｇａｎら（Ｍａｎｉ ｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ
（１９８６））によって説明されたような当業者に既知の方法を利用して、細胞
を培養しＤＮＡ挿入の準備をする。

【００３４】 ノックアウト構築物のＥＳ細胞への挿入（「トランスフェクション」（形質導
入）とも称する）は、この分野で周知の様々な方法、例えば、エレクトロポレー
ション、マイクロインジェクション、およびリン酸カルシウム法等が含まれる（
Ｌｏｖｅｌｌ−Ｂａｄｇｅ， ｉｎ Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， ｅｄ．， 上記を
参照）。挿入の好ましい方法はエレクトロポレーションにより行われる。

【００３５】 細胞に形質導入するＯＰＧノックアウト構築物ＤＮＡ分子は、ノックアウト構
築物が予め環状ベクターに挿入されている場合、まず直鎖状化する。直鎖状化は
、ベクター配列内でのみで切断しノックアウト構築物内で切断しないように選択
した適当な制限酵素によりＤＮＡを切断することにより行う。単離したＯＰＧノ
ックアウト構築物ＤＮＡを、選択した挿入法に適した条件下でＥＳ細胞に加える
。一つ以上の構築物をＥＳ細胞に挿入する場合、それぞれの構築物をコードする
ＤＮＡ分子は同時にまたは順次的に挿入する。必要により、ホモ接合のＯＰＧノ
ックアウトＥＳ細胞は、過剰なＯＰＧノックアウト構築物を細胞に加えることに
より、あるいはトランスフェクションを連続的に何回も繰り返すことにより、両
方の内因性ＯＰＧ対立遺伝子においてノックアウト構築物の相同的組換えを達成
して、作製することができる。

【００３６】 ＥＳ細胞がエレクトロポレーション導入される場合、エレクトロポレーション
機器を利用しメーカーの利用ガイドラインに従って、ＥＳ細胞とノックアウト構
築物ＤＮＡに電気的パルスを与える。エレクトロポレーション後、典型的には、
適当なインキュベーション条件下で細胞を回復させる。次に、ノックアウト構築
物の存在について細胞をスクリーニングする。

【００３７】 ＥＳ細胞のスクリーニングは様々な方法で行うが、典型的には、ノックアウト
構築物のマーカー配列部分の存在についてスクリーニングする。マーカー遺伝子
が抗生物質耐性遺伝子である場合には、致死的濃度の抗生物質存在下で細胞を培
養する。生存した細胞がおそらくノックアウト構築物を組み込んでいる細胞であ
る。マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子以外である場合には、ＥＳ細胞のゲノ
ムＤＮＡのサザンブロットを、マーカー配列のみにハイブリダイズするよう設計
したＤＮＡ配列でプローブ検出する。マーカー遺伝子が酵素をコードする遺伝子
であり、その活性が検出可能である場合（例えばβガラクトシダーゼ）、適当な
条件下で酵素基質を細胞に加え、マーカー遺伝子の酵素活性を解析する。

【００３８】 ノックアウト構築物は、ＥＳ細胞ゲノムにおいていくつもの位置に組み込まれ
ることもあれば、各細胞のゲノムの異なる位置に組み込まれることもあるが、こ
れはランダム挿入現象が起こったためである。挿入の望ましい位置はＯＰＧ内因
性遺伝子配列内である。典型的には、ノックアウト構築物を取り込んだＥＳ細胞
の約１〜１０％以下が、実際に目的の位置にノックアウト構築物を組み込んでい
る。ノックアウト構築物を適切に挿入した細胞を同定するため、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら、上記によって記述された方法等の標準法を用いて細胞から染色体ＤＮＡを
抽出する。次にこのＤＮＡをサザンブロット上で、ある制限酵素で切断したノッ
クアウト構築物にハイブリダイズするよう設計したプローブを用いてプローブ検
出する。あるいは、さらに、適切な位置にノックアウト構築物を含む細胞のみ適
当なＤＮＡフラグメントを産生するような適当な大きさのＤＮＡ配列を増幅する
よう特異的に設計したプローブでＰＣＲすることにより、特異的ゲノムＤＮＡ配
列を増幅する。

【００３９】 ４． 胚のＥＳ細胞取り込み／移植 適切な位置にノックアウト構築物を含む適当なＥＳ細胞を同定した後、次にそ
の細胞を胚に取り込ませる。取り込みは様々な方法で行うことができる。ＥＳ細
胞取り込みの好ましい方法は、分化過程の胚盤胞期にある胚へのマイクロインジ
ェクションである。マイクロインジェクションでは、約１０〜３０個の細胞をマ
イクロピペットに回収して胚盤胞に注入し、ＥＳ細胞を分化中の胚盤胞に取りこ
ませる。

【００４０】 胚盤胞の適切な分化期は種に依存するが、マウスでは約３．５日である。胚盤
胞は、妊娠した雌の子宮を灌流することにより得られる。これを行うのに適した
方法は当業者には既知であり、Ｂｒａｄｌｅｙ （ｉｎ Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，
ｅｄ．，上記）による例で述べられている。

【００４１】 分化の最も適した齢／時期にあるいずれの胚盤胞も使用には適しているが、好
ましい胚盤胞は雄で、ＥＳ細胞の遺伝子にコードされる毛の色や他の表現型マー
カーとは異なる毛の色や他の表現型マーカーをコードする遺伝子を有する。この
方法により、モザイクの毛色や他の表現型マーカーを見ることで（ＥＳ細胞が中
の胚に取り込まれたことを示す）、子におけるノックアウト構築物の存在を容易
にスクリーニングすることが可能となる。よって、例えばＥＳ細胞株が白毛の遺
伝子をもつとすれば、選択する胚は好ましくは黒または茶の毛色の遺伝子を有す
る。

【００４２】 ノックアウト構築物を有するＥＳ細胞を含む胚を作製する代替の方法として、
“集合キメラ”の作製がある。適切な分化期（マウスでは約２ １／２日）の桑
実胚を単離する。桑実胚を弱い酸で約３０秒間処理することにより透明帯を除去
し、それによって桑実胚を構成する細胞の“凝集塊”を露出する。次に、マウス
ではＲ１細胞株等のＥＳ細胞のあるタイプを桑実胚細胞と共培養し、桑実胚とＥ
Ｓ細胞の集合キメラ胚を形成する。

【００４３】 集合キメラ胚法の精緻さから、これを利用して、基本的にノックアウト構築物
を含むＥＳ細胞のみからなる胚を作製することが可能である。この技術では、非
常に早い時期の接合子（例えば、マウスでは２細胞期の接合子）に軽い電気ショ
ックを与える。このショックにより接合子の細胞の核が融合され、これによって
天然に存在する同じ分化期の接合子の２倍（またはそれ以上）のＤＮＡを有する
一つの核が形成される。これらの接合子細胞は本来の分化中の胚とは異なり、胚
体外膜等の付加的胚構造の形成にのみ寄与する。したがって、ＥＳ細胞をこの接
合子細胞と共培養すると、分化する胚は全くＥＳ細胞のみで構成されることにな
る。

【００４４】 ＥＳ細胞を取り込んだ後、集合キメラまたはトランスフェクションした胚を偽
妊娠した仮親の子宮に移植する。いずれの仮親も利用できるが、好ましい仮親は
典型的に受精および繁殖能力がよく、子を世話をする能力で選択する。このよう
な仮親は典型的に、同じ種の精管切除した雄との交配により作製する。移植の成
功には仮親の偽妊娠の段階が重要であり、これは種に依存する。マウスの場合、
この段階は２〜３日偽妊娠である。

【００４５】 ５． ＯＰＧノックアウト遺伝子のスクリーニング 仮親から生まれた子を、まず表現型選択ストラテジー（上記のような毛の色等
）が利用できるモザイクの毛色または他の表現型マーカーでスクリーニングする
。さらに、あるいは代替法として、子の尾部組織の染色体ＤＮＡを上記したよう
なサザンブロットおよび／またはＰＣＲを用いてノックアウト構築物の存在につ
いてスクリーニングしてもよい。ＯＰＧノックアウト構築物について陽性である
子は、ホモ接合ノックアウトも存在するものの典型的にはヘテロ接合であり、典
型的にサザンブロットにハイブリダイズするプローブ量を視覚的に定量すること
により同定できる。

【００４６】 ホモ接合ノックアウト哺乳類を望むのであれば、生殖系列にノックアウト構築
物を伝達すると考えられるヘテロ接合の子同士を交配して作製する；そのような
交配により、ホモ接合ノックアウト哺乳類が作製できる。もし子が生殖系列へ伝
達するかどうかはっきりしなければ、親または他の株と交配し、子のヘテロ接合
についてスクリーニングする。ホモ接合体は、この交配でできた子、ヘテロ接合
体とわかっている同種の哺乳類、および野生型哺乳類由来の等量のゲノムＤＮＡ
のサザンブロッティングにより同定できる。ゲノムＤＮＡ中のノックアウト構築
物の存在についてサザンブロットをスクリーニングするプローブは、上記で説明
したように設計する。

【００４７】 ノックアウトの子を同定し特徴づけする別の方法もある。例えば、ノーザンブ
ロットを利用して、ノックアウト、マーカー遺伝子、あるいはその両方をコード
する転写産物の存在または非存在について子の様々な組織から得たｍＲＮＡをプ
ローブ検出する。さらに、ウェスタンブロットを利用して、ノックアウトした遺
伝子によりコードされたタンパク質に対する抗体を用いて、または、この遺伝子
が発現されている場合には、マーカー遺伝子産物に対する抗体を用いてウェスタ
ンブロットをプローブ検査することにより、これらの子の様々な組織中のノック
アウト遺伝子の発現レベルを評価する。最後に、適当な抗体を用いて子の様々な
細胞のｉｎ ｓｉｔｕ解析（細胞の固定と抗体による標識等）および／またはＦ
ＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）解析を行い、ノックアウト構築物遺伝子産物
の存在または非存在を調べる。

【００４８】 ＯＰＧは破骨細胞の分化と活性化の制御に関連しているため、この発明のヘテ
ロ接合およびホモ接合ＯＰＧノックアウト哺乳類には両方とも多様な利用法があ
る。そのような一つの利用は、骨吸収に影響を与える薬剤のｉｎ ｖｉｖｏスク
リーニングシステムとしてのこの哺乳類の利用である。ある骨疾患や骨吸収を刺
激するあるサイトカインまたはホルモン（すなわち、インターロイキン１（ＩＬ
−１）または副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ））に対する反応で、破骨細胞数が上昇
することが知られている。さらに、骨粗鬆症等のある疾患では通常、骨吸収と骨
形成の不均衡が生じる。このように、特許請求の範囲に記載されている哺乳類を
、破骨細胞の数および／または活性を変化させるのに有効な薬剤、すなわち研究
する疾患によるがこれらの活性を増強または阻害する薬剤のスクリーニングに利
用できる。

【００４９】 そのような有効な薬剤のスクリーニングでは、典型的に、哺乳類にある範囲の
用量の候補薬を投与し、評価する障害への薬剤の骨密度効果について様々な時点
でアッセイする。そのようなアッセイには、例えば、破骨細胞数の増減、骨吸収
の増減、骨生成および密度の増減、インターロイキン等の化学メッセージのレベ
ルおよび／または活性の増減、および／または骨密度の制御に関わる遺伝子の発
現レベルの増減を測定することが含まれる。

【００５０】 例えば、骨粗鬆症の患者はよく骨折する。破骨細胞を介した骨吸収をブロック
する効果をもたらす治療薬を患者に投与することにより、患者の骨吸収をブロッ
クすることが望ましい。この発明の哺乳類を利用して、様々な化合物を単独ある
いは組み合わせでスクリーニングし、そのような薬剤の利用による破骨細胞を介
した骨吸収の部分的または全体的な阻害を調べることができる。

【００５１】 同様のストラテジーを適用して、がん性高カルシウム血症等の他の骨減少疾患
の患者、またＰａｇｅｔ病等の骨リモデリング疾患の患者において、骨吸収を抑
制するのに有効な化合物を見つけることが可能である。

【００５２】 さらに、この発明の哺乳類は骨格系の様々な構成成分の発達と機能を評価し、
ある遺伝子の変異の影響を研究するのに有効である。例えば、ＯＰＧを発現しな
い哺乳類で、骨格系の他の構成成分に対するそのような発現の欠除の影響を解析
することが可能である。

【００５３】 特許請求の範囲に記載されている哺乳類と化合物の別の利用法は、当業者には
容易に明らかであろう。

【００５４】 本発明は以下の実施例を参考にすることによりさらに十分に理解されよう。こ
れらの実施例は、いかなる点においてもこの発明の範囲を限定するためのもので
はない。

【００５５】 実施例 実施例１：ＯＰＧノックアウト構築物の構築 ネズミＯＰＧゲノムＤＮＡクローンを得るため、λＦｉｘＩＩベクター中１２
９ＳＶＪマウスゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｉｎｃ．， １
１０１１ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ， Ｌａ Ｊｏｌ
ｌａ， ＣＡ ９２０３７， カタログ番号９４６３０９番）をマウスＯＰＧ
ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ９４３３１番）のヌクレオチド９０〜１２
９６に相当する放射標識ＤＮＡフラグメントでスクリーニングした。約４０ｍＭ
リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中で約５５℃のストリンジェンシイでライブラリ
ーをスクリーニングし、１１クローンが得られた。コード領域の５’および３’
末端のｃＤＮＡフラグメントでスクリーニングすることにより、これらのクロー
ンをさらに分割した。５’クローンをＥｃｏＲＩ消化した後、サザンブロットに
より解析した。

【００５６】 クローニングした配列の回収とプラスミドの増幅は、ＬｍｄａＳｏｒｂ Ｐｈ
ａｇｅ Ａｄｓｏｒｂｅｎｔ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｉｎｃ．， ２
８００ Ｗｏｏｄｓ Ｈｏｌｌｏｗ Ｒｏａｄ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５
３７１１−５３９９ ＵＳＡ， カタログ＃ Ａ７０５１）を利用し、メーカー
のプロトコールに従って行った。第１のクローン（フラグメント１）をＥｃｏＲ
Ｉ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして調製し、サイズは約１．７ｋｂであった。第
２のクローン（フラグメント２）をＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして
調製し、長さは約５．５ｋｂであった。フラグメント１はイントロン１とエキソ
ン２のほとんどを含み（図１を参照）、フラグメント２はエキソン２の３’部分
、イントロン２、エキソン３、およびイントロン３のほとんどを含んでいた（図
１を参照）。１．１ｋｂのＸｍｎＩ／ＸｍｎＩフラグメントとして調製した第３
のクローン（フラグメント３）は、フラグメント１の細フラグメントであった（
図１を参照）。標準のＤＮＡ連結技術を利用して、フラグメント２とフラグメン
ト３をｐＫＪ−１ベクター（Ｔｙｂｕｔｅｗｉｃｚら、Ｃｅｌｌ， ６５：１１
５３−１１６３ （１９９１）； Ａｄｒａら、Ｇｅｎｅ， ６０：６５−７４
（１９８７））由来のＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーターを
含むｎｅｏカセットとＴＫカセット（ＰＧＫプロモーターを有するチミジンキナ
ーゼ遺伝子；Ｔｙｂｕｔｅｗｉｃｚら、上記）とともに、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔベクター （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）に方向性
をもってクローニングし、５’から３’の向きにＯＰＧゲノムフラグメント３、
ｎｅｏカセット、ＯＰＧゲノムフラグメント２、およびＴＫを含むノックアウト
構築物を構築した（図１を参照）。ＴＫカセットとｎｅｏカセットは両方ともア
ンチセンスの向きに連結した。連結が正しく行われているかを確認するため、ク
ローニングの接合部を配列決定した。

【００５７】 正しい方向にすべての成分を含むこのベクターをＮｏｔＩで直鎖状化し、次に
以下のようにしてＲＷ４胚幹細胞にエレクトロポレーション導入した：約２５μ
ｇの直鎖状化ＤＮＡを約９００μｌ量のＰＢＳ中で約９×１０^６個のＥＳ細胞に
添加した。約０．２３キロボルト、約５００μＦで細胞をパルスし、それぞれの
バイアルの細胞をフィーダー細胞の入った２枚の６０ｍｍ細胞培養プレートに置
いた。そのプレートには、約１０ｍｌのＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，
Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）、１５パーセントのウシ胎児血清（Ｇｉｂ
ｃｏ／ＢＲＬ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹまたはＨｙｃｌｏｎｅ Ｌ
ａｂｓ， Ｌｏｇａｎ， ＵＴの相当物）、白血病抑制因子（Ｆｕｎｇ−Ｌｅｕ
ｎｇら、Ｃｅｌｌ， ６５：４４３−４４９ （１９９１））、１０^−５ Ｍ
βメルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、および１ ｍＭピルビン酸
ナトリウムを添加していた。培養の２日後、相同的組換えが起こった細胞を濃縮
するため、ｇａｎｇｃｙｃｌｏｖｉｒとＧ４１８の存在下で細胞を選択した（Ｃ
ａｐｐｅｃｃｈｉ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４：１２８８ （１９８９）；
Ｓｈａｈｉｎｉａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６１：６０９ （１９９３））；
生存した細胞を採集し、Ｇ４１８を含むがｇａｎｇｃｙｃｌｏｖｉｒを含まない
培地でさらに培養した。相同的組換えを確認するため、Ｇ４１８存在下で増殖し
た細胞から調製してＥｃｏＲＩで切断したゲノムＤＮＡ利用し、サザンブロット
解析によりスクリーニングした（図２を参照）。

【００５８】 相同的組換えを起こしＯＰＧノックアウト構築物をそのゲノムＤＮＡに組み込
んだＲＷ４細胞のサンプルは、登録番号ＣＲＬ−１２４１８番、寄託日１９９７
年１０月９日としてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ （“ＡＴＣＣ”， １２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ ２０８５２， ＵＳＡ）に寄託した。

【００５９】 実施例２：ＯＰＧノックアウトマウスの作製 ＯＰＧノックアウト構築物を含むＲＷ４細胞を、約３．５日齢の受精した胚（
胚盤胞）に挿入した。この胚盤胞は、雄のマウスと交配した雌のＣ５７ＢＬ／６
マウスの子宮を灌流することによりＣ５７ＢＬ／６マウスから得たものである。
挿入は、それぞれの胚盤胞に約１０〜３０個の細胞をマイクロインジェクション
導入して行った。次にこの胚を妊娠のための交尾後２．５日のＣＤ１偽妊娠雌マ
ウスに移植した。これら仮親の子のうちキメラの雄をアグーチの毛の色について
スクリーニングし、雌のＣ５７ＢＬ／６またはスイスブラックの雌と交配した。
ノックアウト構築物の生殖系列への伝達はＦ１の子の毛の色で決定した；アグー
チの子をヘテロ接合性ＯＰＧノックアウトとして同定した。これらのＦ１の子を
互いに交配し、Ｆ２のホモ接合体を作製した。ＰｓｔＩで切断したゲノムＤＮＡ
を相同的組換えを確認するのに用いたＥｃｏＲＩ／ＸｍｎＩＯＰＧ特異的プロー
ブでプローブ検出するサザンブロット解析により、ホモ接合体（ＯＰＧ^−／−）
を同定し、ヘテロ接合体（ＯＰＧ^＋／−）と野生型（ＯＰＧ^＋／＋）と区別した
（図３を参照）。

【００６０】 実施例３：ＯＰＧノックアウトマウスの特徴づけ 以下で説明するすべての解析（ＯＰＧノックアウトマウスと対照マウスの骨お
よび他の組織の定性的および／または定量的表現型解析を行った）には、次の方
法を利用した。８〜１０週齢の３匹のホモ接合ＯＰＧノックアウトマウス（ＯＰ
Ｇ^−／−）、５匹のヘテロ接合ＯＰＧノックアウトマウス（ＯＰＧ^＋／−）、お
よび４匹の対照マウス（ＯＰＧ^＋／＋）を屍検した（表１参照）。全体を解剖す
る前にＸ線撮影をした。マウスの血清を臨床化学的および血液学的に解析した。
全身と主要な器官の重量を測定し、ホルマリンで固定した。ｐＱＣＴ測定のため
の脛骨は７０％ ＥＴＯＨで固定した。野生型、ヘテロ接合性、およびＯＰＧ^{− ／−} マウスの基部脛骨骨幹端および脛骨皮質骨幹の骨密度を、定量的ＣＴスキャ
ン（ｐＱＣＴ）（Ｓｔｒａｔｅｃ， Ｇｅｒｍａｎｙ）によって測定した。脛骨
の基部末端から１．５ｍｍで厚さ０．５ｍｍの２つの標準骨切片と、脛骨の基部
末端から４ｍｍで厚さ０．５ｍｍの１つの切片を用いて、それぞれ骨幹端におけ
る小柱骨密度と皮質骨幹のミネラル含有量および密度を測定した。他の骨組織を
ギ酸溶液を用いて脱灰し、すべての切片をＨ＆Ｅで染色した。酵素組織化学によ
り、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）の発現を測定した。血清化学的
解析のため、８から１６週齢のさらに７匹のＯＰＧ^−／−マウスから血を抜き取
った。これらのマウスを１−５１、１−５６、１−６８、１−７４、１−８３、
４−７８および４−７９と称する。

【００６１】

【表１】

【００６２】 ８〜１０週齢のＯＰＧ野生型、ヘテロ接合ノックアウト、およびホモ接合ノッ
クアウトマウスの病理学的評価によって、３匹のホモ接合（ＯＰＧ^−／−）ノッ
クアウトマウスすべてが重篤な骨粗鬆症を生じていたことが示された。ＯＰＧ^{− ／−} マウスを野生型および／またはヘテロ接合マウスの隣で同じＸ線フィルムを
用いてＸ線撮影し、骨密度と構造を直接比較した（図４ａを参照）。３匹のＯＰ
Ｇ^−／−マウスはサイズが顕著に異なっており、２７と３８は野生型マウスと同
様のサイズであったが、２６は全くの発育不全であった。マウス３８の胸椎は明
らかに通常の位置と変わっており、このことは死亡原因として脊髄骨折が示唆さ
れる。

【００６３】 ノックアウトマウスの骨の放射線学的外見と野生型およびヘテロ接合性マウス
のそれとの間には、いくつかの一貫した相違があった。最も明白に異なる領域は
大腿骨末端であった（図４ｂを参照）。大腿骨末端の骨幹端で顕著な密度の減少
が見られ、３８と２６で激しく２７ではそうでもなかった。特に、野生型とヘテ
ロ接合性マウスで見られる放射性高密度による成長板のはっきりとした輪郭は、
どのノックアウトマウスにも見られなかった。大腿の皮質骨は３８と２６で細く
、すべてのノックアウトマウスにおいて皮質骨の放射性密度は減少していた。ま
た、通常では丸い大腿骨の末端が明らかに平板化し、これにより大腿骨末端骨端
の部分的崩壊と圧縮が示唆された。脛骨の基部末端では、明らかな成長板の減少
が見られた。椎骨においても、野生型マウスと比較して骨密度の減少があり、２
６と３８で減少が最も大きく２７で最も小さかった。

【００６４】 ＯＰＧノックアウトマウスの組織学的形態についても評価した。腰椎と上腕骨
基部の骨幹端部位は全くの骨粗鬆症で、柵状織がほとんど全く欠けていた（図５
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄを参照）。これらの骨における上腕骨の皮質骨幹は、豊富な破骨
細胞と骨芽細胞で証明されるように、皮質骨の非常に積極的なリモデリングの存
在とともに皮質空隙率の上昇を示した（図５Ｅ、Ｆ）。野生型マウスの皮質骨に
は空洞や血管チャネルがほとんどなく、リモデリングの証拠はないが（図５Ｅ）
、ＯＰＧ^−／−マウスでは広範な皮質骨の空隙が存在した（図５Ｆ）。ＯＰＧ^{− ／−} マウスの基部骨端では、小柱骨のリモデリングの上昇を伴う軟骨下骨の再吸
収と関節表面での崩壊の証拠があった（図５Ｂ）。

【００６５】 小柱骨密度は骨幹端部位で顕著に減少していた（ヘテロ接合体では２６８．５
±０．１６ｍｇ／ｃｍ^３対４４３．８±２７ｍｇ／ｃｍ^３、野生型グループでは
４７３．４±３０ｍｇ／ｃｍ^３）。脛骨の皮質骨幹において、骨のミネラル含量
（ヘテロ接合体では０．５２６ｍｇ／ｃｍ^３対０．９±０．１１ｍｇ／ｃｍ^３、
野生型グループでは０．８６±０．２ｍｇ／ｃｍ^３）、および皮質の厚さ（野生
型では０．３±０．０４ｍｍから０．２３±０．０３ｍｍ、ヘテロ接合性グルー
プでは０．３２±０．０３ｍｍ）が著しく減少し、皮質密度は顕著ではあるが統
計的には有意でないほどに減少していた。

【００６６】 椎骨と上腕骨の組織形態計測により、上腕骨の基部骨端幹の小柱骨量は著しく
減少し（野生型グループで６．５８±１．９％対２１．６６±８．６％）、小柱
骨周囲のｍｍ当たりの破骨細胞数は著しく増加していた（野生型グループで４．
８８±１．１９対３．２±０．２５）。椎骨においても小柱骨に同様の変化が記
されたが、破骨細胞数はＯＰＧ^−／−および野生型マウスと同様であった（図５
ＧおよびＨ）。

【００６７】 血液学的パラメーターは、ＯＰＧ^＋／＋とＯＰＧ^＋／−のグループ間に相違は
なかった。ＯＰＧ^−／−マウス２７は前グループと相違なく、発育不全の＃２６
は末端の血液濃縮のため、ヘマトクリット、白血球数、白血球、赤血球、リンパ
球、単球と好酸球数が上昇していた。＃３８からは解析用の血液が得られなかっ
た。

【００６８】 ほとんどの化学値は正常で、グループを通して同様であった。発育不全の＃２
６では血清カルシウムとコレステロールレベルが上昇し、血清グルコースが顕著
に減少していた。しかしながら、さらに血を抜き取って検査した７匹も含めてす
べてのＯＰＧ^−／−で血清アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）レベルが上昇して
いた。殺したＯＰＧノックアウトとさらに血を抜き取ったＯＰＧノックアウトの
血液化学データをまとめて解析したところ、ＯＰＧ^＋／−マウスではＡＬＰ値が
１１５．７±５５ ＩＵ／ｌ、ＯＰＧ^＋／−マウスでは１１６．４±３６．６
ＩＵ／ｌ、であるのに対し、ＯＰＧ^−／−マウスは３７６．３±３６．６ ＩＵ
／ｌであった（ｐ＜０．００１）。

【００６９】 この発明を好ましい実施形態の点から説明したが、変更と修飾が起こるであろ
うことは当業者に理解されよう。それゆえ、添付の請求項は特許請求する本発明
の範囲内にあるすべてそのような同等の変更を包含することが意図される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＯＰＧノックアウト構築物の構築を示す。制限部位を以下のように表す：“Ｒ
Ｉ”はＥｃｏＲＩ；“Ｘ”はＸｍｎＩ；“Ｐ”はＰｓｔＩ。エキソンは黒四角で
、イントロンは細い黒線で表す。 （Ａ）は、エキソン２〜５、イントロン１の一部分、およびイントロン２〜４
を含むＯＰＧネイティブ遺伝子のフラグメントを示す。 （Ｂ）は、チミジンキナーゼ（ＭＣ１−ＴＫ）カセットとネオマイシン（Ｎｅ
ｏ）カセットがＯＰＧに挿入したノックアウト構築物を示す。 （Ｃ）は、ＯＰＧ遺伝子座での相同的組換え後の標的遺伝子の構造を示す。小
さい白四角は、組換えＥＳ細胞クローンのスクリーニングに用いたプローブを表
す。

【図２】 野生型（＋／＋）または標的とする（＋／−）ＥＳ細胞クローンのＥｃｏＲＩ
消化したゲノムＤＮＡのサザンブロット解析を表す。野生型対立遺伝子は１．７
ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントであり、標的とする対立遺伝子は３．２ｋｂのＥ
ｃｏＲＩフラグメントである。

【図３】 野生型（＋／＋）、ヘテロ接合（＋／−）、およびホモ接合（−／−）ＯＰＧ
ノックアウトマウスのＰｓｔＩ消化したゲノムＤＮＡのサザンブロット解析を表
す。野生型対立遺伝子は２．３ｋｂのＰｓｔＩフラグメントであり、標的とする
対立遺伝子は３．０ｋｂのＰｓｔＩフラグメントである。

【図４ａ】 ２ヶ月齢の野生型（＋／＋）、ヘテロ接合（＋／−）、およびホモ接合（−／
−）ＯＰＧノックアウトマウスの全身Ｘ線を表す。

【図４ｂ】 ＯＰＧ −／−、＋／＋、および＋／−マウスの大腿骨のＸ線を表す。最も強
い表現型が＃１−３８に見られる。皮質骨が細くなり、成長板が見えない。＋／
−マウスは＋／＋マウスと相違ない。

【図５ａ】 正常コントロール（＃４５）マウスに対するＯＰＧ −／− （＃３８）の骨
形態を示す。 Ａ − 正常コントロール上腕骨（＃４５）、Ｈ ＆ Ｅ、サイズバー５００
ミクロン、正常形態。 Ｂ − ＯＰＧ −／−上腕骨（＃３８）、Ｈ ＆ Ｅ、サイズバー５００ミ
クロン、重篤な骨粗鬆症と関節表面の構造障害。 Ｃ − 正常コントロール椎骨（＃４５）、Ｈ ＆ Ｅ、サイズバー５００ミ
クロン、正常形態。 Ｄ − ＯＰＧ −／−椎骨（＃３８）、Ｈ ＆ Ｅ、サイズバー５００ミク
ロン、重篤な骨粗鬆症と椎間板の退行性障害。

【図５ｂ】 正常コントロール（＃４５）マウスに対するＯＰＧ −／− （＃３８）の骨
形態を示す。 Ｅ − 正常コントロール上腕骨（＃４５）、Ｈ ＆ Ｅ、サイズバー１００
ミクロン、正常形態。 Ｆ − ＯＰＧ −／−上腕骨（＃３８）、Ｈ ＆ Ｅ、サイズバー１００ミ
クロン、皮質骨の空隙率の上昇した重篤な骨粗鬆症。 Ｇ − 正常コントロール椎骨（＃４５）、ＴＲＡＰ染色、サイズバー２５ミ
クロン、正常な破骨細胞数（矢印）。 Ｈ − ＯＰＧ −／−椎骨（＃３８）、ＴＲＡＰ染色、サイズバー２５ミク
ロン、破骨細胞数のわずかな上昇（矢印）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ダンスタン，コリン アメリカ合衆国、カリフオルニア・91320、 ニユーベリー・パーク、テユーペロ・ウツ ド・コート・887 (72)発明者 サロジ，イルデイコ アメリカ合衆国、カリフオルニア、ニユー ベリー・パーク、ナンバー・139、ノー ス・ベンチユ・パーク・ロード・587・エ フ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一方の対立遺伝子が破壊されていて、ＯＰＧをコードする遺
   伝子を含む非ヒト哺乳類。
2. 【請求項２】 両方の対立遺伝子が破壊されていて、ＯＰＧをコードする遺
   伝子を含む非ヒト哺乳類。
3. 【請求項３】 破壊されたＯＰＧ変異を含み、その破壊がＯＰＧコードする
   遺伝子のヌル変異を生じる非ヒト哺乳類。
4. 【請求項４】 げっ歯類である請求項１、２、および３のいずれか一項に記
   載の非ヒト哺乳類。
5. 【請求項５】 マウスである請求項４に記載の非ヒト哺乳類。
6. 【請求項６】 減少した骨密度のまたは上昇した骨吸収を有することを特徴
   とする請求項１、２、および３のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳類。
7. 【請求項７】 ＯＰＧノックアウト構築物を含む核酸分子。
8. 【請求項８】 請求項７の核酸を含むベクター。
9. 【請求項９】 請求項８の核酸分子を含むマウスＲＷ４胚幹細胞株。
10. 【請求項１０】 請求項１、２、および３のいずれか一項に記載の非ヒト哺
    乳類に化合物を導入し、骨吸収の増減を測定することを含む、骨吸収を調節する
    化合物をスクリーニングする方法。