JP2001515505A

JP2001515505A - 軸索再生を促進する単核貪食細胞及びその使用

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Publication number: JP2001515505A
Application number: JP54028998A
Authority: JP
Inventors: アイゼンバック−シュワルツ，マイケル; スピーグラー，オルリー
Original assignee: イエダリサーチアンドディベロプメントカンパニー．リミテッド．
Priority date: 1997-03-14
Filing date: 1998-03-13
Publication date: 2001-09-18
Also published as: NZ337813A; IL131888A0; AU6634398A; CA2283891A1; EP0966292A1; WO1998041220A1; US6267955B1; AU731086B2

Abstract

(57)【要約】哺乳動物の中枢神経系において軸索の再生を促進するのに同種単核貪食細胞を使用するための方法及び組成物が開示される。一つの態様においては、同種単核貪食細胞を、損傷または疾患部位またはその近傍のCNSに投与し、哺乳動物を少なくとも１種の抗炎症剤で治療する。別の態様においては、同種単核貪食細胞を、損傷または疾患部位またはその近傍のCNSに投与し、１種以上の列挙したアジュバント因子（例えばaFGF）をCNSに投与し、哺乳動物の抗炎症療法が任意に加えられ得る。さらなる態様においては、同種単核貪食細胞を、まず１種以上の列挙した刺激因子で刺激し、次いで損傷または疾患部位またはその近傍のCNSに投与する。刺激性組織および細胞をスクリーニングする方法も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】軸索再生を促進する単核貪食細胞及びその使用 1. 発明の分野本発明は、中枢神経系の損傷あるいは疾患を有する哺乳動物において軸索再生を促進するための単核貪食細胞を含む組成物、及び単核貪食細胞の使用方法、並びに軸索再生を促進する単核貪食細胞の治療的能力を増強する組成物及び方法に関する。本発明は特に、（a）刺激された、あるいは刺激されていない同種単核貪食細胞を含む医薬組成物、あるいは前記同種単核貪食細胞を損傷あるいは疾患を有する哺乳動物の中枢神経系の部位あるいはその近傍に投与して軸索再生を促進する方法、（b）単核貪食細胞を刺激してその軸索再生を促進する能力を増強するための組成物及び方法、及び(c)組織、細胞、タンパク質、ペプチド及びその他の生物活性物質を、軸索を再生するために単核貪食細胞を刺激する能力についてスクリーニングする方法に関する。 2. 発明の背景軸索に損傷を受けると哺乳動物の中枢神経系(CNS)のニューロンの軸索を再生する能力は貧弱なものとなる。これに対し、哺乳動物末梢神経系(PNS)のニューロンは実質的により大きい軸索再生能力を有する。Schwartzら、1989，FASEB J ．3:2371-2378参照。 CNSとPNSとの間の軸索再生の相違はニューロンそのものではなく、ニューロンの細胞環境によるものであるとされている。ニューロンが損傷すると、PNSニューロンを取り囲むシュワン細胞が調節され、軸索再生を許容し、あるいはそれを促進するようになる。これに対し、CNSニューロンを取り囲む神経膠星状細胞、乏突起神経膠細胞、及びミクログリアはそのような調節を示さず、軸索再生を促進しないままであるか、それを阻害する。Schwartzら、1987，CRC Crit．Rev．B iochem．22:89-110参照。この調節の欠如は損傷後の炎症反応の違いと相関するものとされている。Perr y及びBrown，1992，Bioessays 14:401-406;Lotan及びSchwartz，1994，FASEB J ．8:1026-1033参照。特に、CNSの損傷に応答する単核貪食細胞の蓄積はPNSにおける損傷に対する応答と比較して遅れ、限定されたものとなる。この限定されたCN S単核貪食細胞応答により、（1）報告されたところによれば軸索再生を阻害するミエリン断片の除去が非効率的なものとなり、そして(2)神経膠星状細胞及び乏突起神経膠細胞の調節を促進して軸索再生を支持するマクロファージ由来サイトカインの放出が最適なものに達しなくなる。上記の観察により、マクロファージ応答を適切に調節すればCNS損傷の後の軸索再生を促進し得るという理論が想起された。Davidらはin vitro系において、正常ラット視神経のクリオスタット切片をラットCNSの病巣から得た単核貪食細胞と共培養すると、その視神経切片の胎児ニワトリ後根神経節細胞に対する接着性が増強されることを示した。Davidら、1990，Neuron 5:463-469。活性化された腹膜マクロファージからのコンディショニングされた培地も、このin vitroアッセイにおいて視神経切片の接着性を促進するのに有効であった。しかし、CNS損傷のin vivoモデルから得られた結果によれば、CNS損傷に対してマクロファージ反応を増強する処置は再生を増強しないことが示されている。例えば、腫瘍壊死因子α(TNF-α)あるいはコロニー刺激因子-1(CSF-1)を局所投与すると実験的な視神経損傷に対するマクロファージの応答は増強される。しかし、TNF-αのみがin vitroでアッセイした場合の神経接着に対する損傷視神経の許容性を増加させ、CSF-1は増加させなかった。Lotanら、1984，Exp．Neurol．1 26:284-290。一つの可能性のある説明として、「適切に刺激されたマクロファージのみが神経再生に影響し得る」ということが示唆されている。Schwartzら、19 94，Progress Brain Res．103:331-341，338。実際、本発明の教示とは相反して、単核貪食細胞はCNS損傷の後の損傷を悪化させ、回復を制限し得ると報告している他の研究者もいる。脳マクロファージは、サイトカインにより刺激された場合、神経毒活性を示す。Chamakら、1994，J ．Neurosci．Res．38:221-233。単核貪食細胞機能を薬剤により阻害すると、脊髄損傷のウサギモデルにおける回復が促進されることが報告されている。Giulia n及びRobertson，1990，Annals Neurol．27:33-42。マクロファージ由来サイトカインがグリア細胞瘢痕の形成を促進し、これにより軸索再生が阻害されるという報告もある。Khan及びWigley，1994，NeuroReport 5:1381-1385;Vickら、1992 ，J．Ne urotrauma 9:S93-S103。本出願の第2節(あるいはその他の節)における参考文献の引用や特定は、そのような文献が本発明の先行技術として利用できたものであることを認めるものと解されるべきものではない。 3. 発明の概要本発明は、同種単核貪食細胞を使用して哺乳動物の中枢神経系における軸索の再生を促進するための方法及び組成物に関する。同種単核貪食細胞は損傷あるいは疾患部位またはその近傍においてCNSに投与される。一つの実施形態においては、損傷または疾患部位またはその近傍におけるCNS への同種単核貪食細胞の投与は、少なくとも一種の抗炎症剤の哺乳動物への投与と併用される。別の実施形態においては、損傷あるいは疾患部位またはその近傍におけるCNS への同種単核貪食細胞の投与は、1種以上のアジュバント因子、例えば酸性繊維芽細胞増殖因子（aFGF）、トランスフォーミング増殖因子β（TGF-β）、インターロイキン６（IL-6）、神経成長因子（NGF）、神経栄養因子３（NT-3）、神経栄養因子４（NT-4）、神経栄養因子５（NT-5）及び脳由来神経栄養因子（BDNF）のCNSへの投与と併用される。所望により、これは哺乳動物の抗炎症療法と併用することができる。本発明の方法と組成物に有用な同種単核貪食細胞としては、限定するものではないが、同種の単球、マクロファージ、及び樹状細胞、及び自己由来の単球、マクロフアージ、及び樹状細胞が挙げられる。本発明はさらに、同種単核貪食細胞の軸索再生を促進する能力を増強するためにそれらを刺激するための方法及び組成物、及び刺激された同種単核貪食細胞を使用して哺乳動物の中枢神経系における軸索再生を促進するための方法及び組成物を提供する。単核貪食細胞は、β−インターフェロン（IFN-β）、γ−インターフェロン（IFN-γ）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターロイキン２（IL-2 ）、インターロイキン３（IL-3）、インターロイキン４（IL-4）、インターロイキン10（IL-10）、単球走化性因子（MCAF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、コロニー刺激因子１（CSF-1）、脂質Ａ、トリペプチドfMet-Leu-Phe、ムラミルジペプチド（MDP）、イオノホアA23187、またはビタミンD3結合タンパク質の中の1種以上を加えた培地中で培養することによって刺激される。生物学的に活性なタンパク質あるいはペプチドはその天然の形態あるいは組換体の形態で使用し得る。本発明はさらに、単核貪食細胞を刺激してその軸索再生を促進する能力を増強させるのに適したその他の組織、細胞、及び生物活性物質をスクリーニングまたは同定するためのアッセイを提供する。このアッセイによれば、まず単核貪食細胞を試験すべき組織あるいは細胞と共に培養するか、試験すべき組織あるいは細胞でコンディショニングした培地あるいは試験すべき生物活性物質を添加した培地中で単核貪食細胞を培養する。その後培養した単核貪食細胞を、酸化窒素産生量、あるいは酸化窒素産生量と貪食活性の両方についてアッセイする。酸化窒素の産生が増大した単核貪食細胞、または酸化窒素の産生が増大し、貪食活性が増大した単核貪食細胞が、増強された軸索再生を促進する能力を有するものである。 4. 図面の簡単な説明以下の発明の詳細な説明、本発明の特定の実施形態の実施例、及び添付の図面を参照することにより本発明をより完全に理解し得るであろう。添付の図面は以下の通りである。図1は、蛍光染料の網膜神経節細胞(RGC)への逆行性輸送により検出された、ラットの横断面形成視神経における軸索再生を示す。実験の詳細についてはテキストの第6節を参照。横断面を形成したすぐ後に、細胞を含まない(MED);2.5ｘ10³ 〜1ｘ10⁵の非刺激(刺激されていない、NS)単球を含む;2.5ｘ10³〜1ｘ10⁵の視神経刺激(視神経で刺激された、OS)単球を含む;あるいは2.5ｘ10³〜1ｘ10⁵の坐骨神経刺激(坐骨神経で刺激された、SS)単球を含む2μlのDCCM-1培地を損傷の部位に適用した。白丸は個々の実験動物を示す。黒丸は標識されたRGCを示さなかった動物を示す(MED、NS及びOS処理群のそれぞれの番号7、7及び6)。水平な線は各処理群の中央値を示す。図2には、横断面形成直後の損傷部位に適用した単球の数及び種類の関数として、横断面形成されたラットの視神経における軸索再生を示す。実験の詳細についてはテキストの第6節を参照。横断面形成の際に、視神経刺激単球(OS)あるいは坐骨神経刺激単球(SS)を2.5ｘ10³細胞;5ｘ10³細胞;10⁴細胞;あるいは10⁵細胞の合計投与量で含む2μlのDCCM-1培地を損傷の部位に適用した。図3(A，B)は、視神経横断面形成と、その後の(A)5ｘ10³坐骨神経刺激単球あるいは(B)対照培地の投与を受けたラットにおける網膜神経節細胞の逆行性標識化を示す代表的な顕微鏡写真である。実験の詳細についてはテキストの第6節を参照。図4(A〜E)は、視神経横断面形成と、その後の坐骨神経刺激単球(A〜D)あるいは対照培地(E)の投与を受けたラットにおける視神経繊維の順行性標識化を表す代表的な顕微鏡写真を示す。実験の詳細についてはテキストの第6節を参照。図4 Aは、HRPを適用した位置(H)、横断面形成の部位(ST)、及び周囲の硬膜(DU)を示す低倍率視野である。横断面形成部位に対して遠位の括弧を付した領域を図4B、 4C及び4Dにおいてより高倍率で示す。これらにおいては、繊維の先端に成長円錐状構造(gc)が見られる。図5は、坐骨神経と2〜17時間培養した単球を損傷の部位に適用した後のラットの横断面形成した視神経における軸索再生を示す。実験の詳細についてはテキストの第6節を参照。横断面形成の際に、5ｘ10³の非刺激単球(NS)、あるいはラット坐骨神経と2時間(2h)、12時間(12h)もしくは17時間(17h)培養した5ｘ10³の単球を含む2μlのDCCM-1培地を損傷の部位に適用した。図6は、マウス坐骨神経あるいはラット坐骨神経により刺激されたラット単球の損傷の部位における投与の後の横断面形成された視神経での軸索再生を示す。実験の詳細についてはテキストの第6節を参照。横断面形成の際に、マウス坐骨神経(マウス)あるいはラット坐骨神経(ラット)のいずれかと24時間培養した5ｘ1 0³の単球を含む2μlのDCCM-1培地を損傷の部位に適用した。図7は、ラット坐骨神経と2時間培養したラット単球の貪食活性を示す。実験の詳細についてはテキストの第6節を参照。2.5ｘ10⁵のラット単球を、1mlのDCCM-1 培地のみ(対照)、あるいはラット坐骨神経の2セグメント(2SS)、もしくはラット坐骨神経の4セグメント(4SS)を含む1mlのDCCM-1培地中で培養した。2時間後に単球を蛍光ビーズと接触させ、フローサイトメトリーにより細胞に結合した蛍光を測定した。図8は、ラット坐骨神経と24時間培養されたラット単球の貪食活性を示す。実験の詳細についてはテキストの第6節を参照。2.5ｘ10⁵のラット単球を、1mlのDC CM-1培地のみ(対照)、あるいはラット坐骨神経の1セグメント(1SS)、もしくはラット坐骨神経の4セグメント(4SS)を含む1mlのDCCM-1培地中で培養した。16〜24 時間後に単球を蛍光ビーズと接触させ、フローサイトメトリーにより細胞に結合した蛍光を測定した。図9は、ラット視神経と2時間培養したラット単球の貪食活性を示す。実験の詳細についてはテキストの第6節を参照。2.5ｘ10⁵のラット単球を、1mlのDCCM-1培地のみ(対照)、あるいはラット視神経の4セグメント(4OS)を含む1mlのDCCM-1培地中で培養した。2時間後に単球を蛍光ビーズと接触させ、フローサイトメトリーにより細胞に結合した蛍光を測定した。図10は、ラット視神経と24時間培養したラット単球の貪食活性を示す。実験の詳細についてはテキストの第6節を参照。2.5ｘ10⁵のラット単球を、1mlのDCCM-1 培地のみ(対照)、あるいはラット視神経の4セグメント(4OS)を含む1mlのDCCM-1 培地中で培養した。24時間後に単球を蛍光ビーズと接触させ、フローサイトメトリーにより細胞に結合した蛍光を測定した。図11は、ラット視神経によりコンディショニングされた培地の存在下でラット坐骨神経と一晩培養したラット単球の貪食活性を示す。5ｘ10⁵のラット単球を、ラット坐骨神経の6セグメントを含み、さらに添加物を含まない(0)、あるいは視神経によりコンディショニングされた培地を0.1μg/ml(0.1)、1.0μg/ml(1)、あるいは10μg/ml(10)の総タンパク質濃度で添加した1mlのDCCM-1培地中で培養した。24時間後に単球を蛍光ビーズと接触させ、フローサイトメトリーにより細胞に結合した蛍光を測定した。図12は、ラット坐骨神経またはラット視神経と24時間、48時間、72時間もしくは96時間培養したラット単球による酸化窒素産生量を示す。実験の詳細についてはテキストの第6節を参照。10⁶のラット単球を、1mlのDCCM-1培地のみ（対照）、またはラット座骨神経の１セグメント（1SS）、ラット視神経の１セグメント（1OS）、もしくはラット視神経の４セグメント（4OS）を含む1mlの同培地中で培養した。24、48、72または96時間後、培地を回収し、酸化窒素のレベルを測定した。図13は、ラット坐骨神経またはラット視神経によりコンディショニングされた培地とともに72時間培養したラット単球による酸化窒素産生量を示す。実験の詳細についてはテキストの第6節を参照。10⁶のラット単球を、さらなる添加物を含まない1mlのDCCM-1培地、あるいは座骨神経でコンディショニングした培地または視神経でコンディショニングした培地を10、100、200もしくは300μg/mlの合計タンパク質濃度で添加した1mlのDCCM-1培地中で培養した。72時間後、培地を回収し、酸化窒素のレベルを測定した。図14は、抗炎症療法と併用した視神経刺激単球の投与後のラットの横断面形成された視神経での軸索再生を示す。実験の詳細についてはテキストの第6節を参照。横断面形成の際に、細胞を含まないか、あるいは5ｘ10³の座骨神経刺激ラット単球を含む２μlのDCCM-1培地を損傷部位に適用した。同時に、ラットの何匹かには0.8mgのデキサメタゾンの腹腔内注射を行い、下記の治療群：治療せず（対照）、デキサメタゾンのみ（DEX）、単球のみ（SS）、およびデキサメタゾンおよび単球の両方（DEX/SS）を作った。図15は、完全な脊髄横断面形成を受けたラットに刺激ラット単球を投与した後の自発的運動機能の回復を示す。実験の詳細についてはテキストの第７節を参照。図15A中、実線は、脊髄横断面形成および刺激単球による治療後に運動性回復を示した12匹の動物のうち８匹についてのBBB運動スコア（平均±SEM）を示し、破線は、脊髄横断面形成後の対照動物のBBB運動スコアを示す。図15Bは、脊髄横断面形成を受け、４×10⁵刺激単球＋aFGFで治療された個々の動物についての連続BBB運動スコアを示す。図16は、刺激単球(A)または対照培地(B)で治療し、GFAP(a)またはニューロフィラメント抗原(b)の免疫組織化学的検出のために処理したラットにおける横断面形成脊髄の低出力顕微鏡写真を示す。実験の詳細についてはテキストの第７節を参照。各写真は、約100フレームのモンタージュであり、それぞれ10×倍率で撮影した。図17は、刺激単球(A)または対照培地(B)で処置し、ニューロフィラメント抗原 (a)またはGAP-43(b)の免疫組織化学的検出のために処理したラットにおける横断面形成脊髄の高出力顕微鏡写真を示す。実験の詳細についてはテキストの第７節を参照。バー：2.5μm。 5. 発明の詳細な説明 5.1 単核貪食細胞本発明は、同種単核貪食細胞を使用して中枢神経系(CNS)の損傷あるいは疾患の後の軸索の再生を促進するための方法及び組成物を提供する。同種単核貪食細胞はCNS損傷あるいは疾患の部位またはその近傍に導入される。本明細書で使用する「単核貪食細胞」の用語は、限定するものではないが、中枢または末梢血から得られた単球、任意の組織あるいは体腔を含む任意の部位から得られたマクロファージ、骨髄あるいは血液から得られたマクロファージ前駆体を培養することによって得られたマクロファージ、脾臓、リンパ節、皮膚、及びリンパ液を含む任意の部位から得られた樹状細胞、骨髄あるいは血液から得られた樹状細胞前駆体を培養することによって得られた樹状細胞を包含することを意図するものである。同種単核貪食細胞は、循環、あるいはそれらが存在する任意の組織から得ることができる。末梢血は容易に入手できる手近な同種単球の源であり、本発明の好ましい実施形態において源として使用する。特に好ましいのは、治療用調製物を投与することを意図した検体の末梢血から精製された自己由来の単球を使用することである。その他の源からの同種単核貪食細胞は当分野において周知であり、限定するものではないが、腹膜あるいは胸膜腔等の漿膜腔から得られたマクロファージ、肺胞マクロファージ、ならびにクッパー細胞(肝臓内)、ミクログリア細胞(CNS内) 等の種々の用語で知られているその他の組織(例えば、肝臓、脾臓、胸腺)に関連するマクロファージ等が挙げられる。同種単核貪食細胞はさらに樹状細胞を包含し、これもランゲルハンス細胞(皮膚内)、ベール細胞(リンパ液内)、相互鉗合細胞(リンパ節内)等の種々の用語により知られている。さらに単核貪食細胞は、骨髄あるいは血液から得られる、同種脳由来混合神経膠細胞あるいは同種前駆体細胞を培養しても得られる。好ましくは、同種単核貪食細胞はミクログリアではなく、脳由来混合神経膠細胞の培養により誘導されるものではない。好ましい実施形態においては、投与すべき細胞集団から単核貪食細胞以外の細胞を取り除く。濃縮技術は当業者に周知であり、限定するものではないが、水ひ法、Percoll勾配のような適切な密度の物質を介した遠心分離(Colottaら、1983 ，J．Immunol．132:936-944)、適切な表面への選択的接着とその後の低温あるいは低い二価カチオン濃度における除去(Rosen及びGordon，1987，J．Exp．Med．1 66:1685-1701)、機械的除去、あるいはリドカインの存在下における除去、及び血液(O'Dohertyら、1993，J．Exp．Med．178:1067-1078)、骨髄(Inabaら，1992 ，J．Exp．Med．176:1693-1702)及びリンパ様組織(Macatoniaら、J．Exp．Med． 169:1255-1264)から樹状細胞を単離するための方法等が挙げられる。好ましくは、少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、さらに好ましくは少なくとも80％、さらに一層好ましくは少なくとも90％の細胞が単核貪食細胞である。特に好ましいのは、単核貪食細胞の実質的に精製された調製物、例えば、細胞の少なくとも95％が単核貪食細胞である調製物である。単核貪食細胞が得られたら、患者の必要に従い、任意の所望される時点で治療に使用することができる。単核貪食細胞は、所望の場合には投与の前に任意の適切な培養培地中で培養することができる。好ましくは、単核貪食細胞を、該細胞が限られた接着を示すか全く接着しない滅菌材料で形成された容器中で培養する。好ましい実施形態においては、単核貪食細胞は投与の前に滅菌テフロンバッグ中で培養する。本明細書で使用する、「刺激された」単核貪食細胞は、軸索再生の促進の能力が増強された単核貪食細胞である。好ましくは、単核貪食細胞の軸索再生を促進する能力は非刺激単核貪食細胞と比較して少なくとも3倍に増強されているものであり、より好ましくは、単核貪食細胞の軸索再生を促進する能力は非刺激単核貪食細胞と比較して少なくとも15倍に増強されているものである。「刺激性の」組織、細胞及び生物活性物質は、単核貪食細胞と共に培養すると、単核貪食細胞の軸索再生を促進する能力を増強する組織、細胞及び生物活性物質である。好ましい実施形態においては、刺激性の組織、細胞または少なくとも一種の刺激性の生物活性物質を培養に添加して単核貪食細胞の軸索再生を促進する能力を増強する。好ましくは神経、最も好ましくは坐骨神経のような末梢神経の一以上のセグメントを培養に加える。異種神経がこの目的に適しており、あるいはより好ましくは同種あるいは自己由来の神経である。所望により、ヒト神経は利用可能な任意のヒト組織、例えばヒト死体、あるいは外科標本(例えば切断肢)等から得ることができる。あるいは別の刺激性の組織あるいは細胞を培養に加えてもよい。真皮がこの目的に適しており、生体ドナーあるいは死体からパンチバイオプシー、手術的切除、あるいはその他の任意の適切な技術により得ることができる。特に好ましいのは、パンチバイオプシーにより得られた皮膚、特に刺激単核貪食細胞が投与されるべきであると考えられる患者から得られた皮膚である。特に滑膜組織、腱鞘及び肝臓もこの目的に適しており、その他の再生組織も同様である。その他の刺激性の組織及び細胞は以下に記載するアッセイにより同定することができる。所望であれば、刺激性の組織あるいは細胞は培養に添加する前に均質化してもよい。当業者には明らかであるが、刺激性の組織あるいは細胞のホモジネートは使用の前に凍結保存等により保存することができる。別の実施形態においては、少なくとも一種の刺激性の生物活性物質を培養に添加して単核貪食細胞の軸索再生を促進する能力を増強する。神経栄養因子3(NT-3 )、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子、β−インターフェロン（IFN-β）、γ−インターフェロン（IFN-γ）、腫瘍壊死因子α（TFN-α）、インターロイキン２（IL-2）、インターロイキン３（IL-3）、インターロイキン４（IL-4）、インターロイキン10（IL−10）、単球走化性因子（MCAF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、コロニー刺激因子１（CSF-1）、脂質Ａ、fMet-Leu-Phe（fMLP）、ムラミルジペプチド（MDP）、イオノホアA23187、およびビタミンD3結合タンパク質がこの目的に適しており、単独でも組み合わせてもい。別の刺激性の生物活性物質(別の刺激性のタンパク質及びペプチドを含む)は、後記するアッセイにより同定することができる。生物活性タンパク質またはペプチドは、１〜5000ng/ml、より好ましくは10〜5 000ng/ml、さらに好ましくは100〜2500ng/ml、最も好ましくは約1000ng/mlの濃度（各タンパク質またはペプチドについて）で、その天然の形態あるいは組換体の形態で使用し得る。一つの実施形態においては、単核貪食細胞は、IL-4または IL-10（より好ましくはIL-4とIL-10の両方）を加えた培地中でそれらを培養することによって刺激される。好ましくは、単核貪食細胞を、刺激性の組織、刺激性の細胞、刺激性の組織もしくは刺激性の細胞のホモジネート、あるいは少なくとも一種の刺激性の生物活性物質と共に24時間培養する。より短い培養時間、例えば約2時間でも有効であるが、より長い培養期間、例えば一週間以上も有効である。別の実施形態においては、刺激性の組織または細胞、好ましくは神経の一以上のセグメント、最も好ましくは坐骨神経のような末梢神経のセグメントを、単核貪食細胞の培養に適した任意の培地でインキュベートすることにより刺激性のコンディショニングされた培地を調製する。組織または細胞を除去した後、単核貪食細胞を前記刺激性のコンディショニングされた培地で培養してその軸索再生を促進する能力を増強する。組織または細胞を除去した後に、刺激性のコンディショニングされた培地を貯蔵し、後に単核貪食細胞を刺激するために所望されるように使用することができる。このような刺激性のコンディショニングされた培地は市販用のキットの形態で得ることができる。好ましくは、刺激性のコンディショニングされた培地は、貯蔵の間、例えば液体あるいは凍結培地として冷蔵により保存する。あるいは、刺激性のコンディショニングされた培地を凍結乾燥する。好ましい実施形態においては、TNF-αの分泌などの望ましくない単核貪食活性を低減または排除するために、単核貪食細胞は、刺激前、刺激中、または刺激後にチルホスチンなどのチロシンキナーゼインヒビターに曝される。当業者には明らかであるように、単核貪食細胞は、培養の前あるいは後に、例えば低温保存により保存することができる。使用できる低温保存剤としては、限定するものではないが、ジメチルスルホキシド(DMSO)(Lovelock及びBishop，1959，Nature 183:1394-1395;Ashwood-Smith ， 1961，Nature 190:1204-1205)、グリセロール、ポリビニルピロリドン(Rinfret ，1960，Ann．N.Y．Acad．Sci．85:576)、ポリエチレングリコール(Sloviter及びRavdin，1962，Nature 196:548)、アルブミン、デキストラン、スクロース、エチレングリコール、i-エリスリトール、D-リビトール、D-マンニトール(Rowe ら、1962，Fed．Proc．21:157)、D-ソルビトール、i-イノシトール、D-ラクトース、塩化コリン(Benderら、1960，J．Appl．Physiol．15:520)、アミノ酸(Phan The Tran及びBender、1960，Exp．Cell Res．20:651)、メタノール、アセトアミド、グリセロールモノアセテート(Lovelock，1954，Biochem．J．56:265)、無機塩(Phan The Tran及びBender、1960，Proc．Soc．Exp．Biol．Med．104:388:Pha n The Tran及びBender、1961，Radiobiology，Proceedings of the Third Austr alian Conference on Radiobiology，Ilbery，P.L.T.，ed.，Butterworth，Lond on，p.59)、及びヒドロキシエーテルスターチ及びヒト血清アルブミンと組み合わせたDMSO(Zaroulis及びLeiderman，1980，Cryobiology 17:311-317)等が挙げられる。冷却速度を制御するのが重要である。凍結保護剤(Raspatzら、1968，Cryobiol ogy 5(1):18-25)及び細胞種によって最適な冷却速度が異なる。骨髄幹細胞の生存及びその移植能に対する冷却速度の影響については例えば、Rowe及びRinfret ，1962，Blood 20:636;Rowe，1966，Cryobiology 3(1):12-18;Lewisら、1967，T ransfusion 7(1):17-32;及びMazur，1970，Science 168:939-949を参照。水が氷に変わる溶融相における熱は最小限にしなければならない。冷却操作は、例えばプログラム可能な冷凍装置、あるいはメタノール浴法等を使用して行うことができる。プログラム可能な冷凍装置により最適な冷却速度を決定することができ、標準的で再現可能な冷却を容易に行える。CryomedあるいはPlanarのようなプログラム可能な速度制御冷凍機により、冷凍工程を所望の冷却速度曲線に合わせることができる。完全に凍結した後、細胞を迅速に長期低温保存容器に移すことができる。一つの実施形態においては、例えば約-80℃あるいは約-20℃の温度を維持する冷凍機のような機械的冷凍機にサンプルを低温貯蔵することができる。好ましい実施形態においては、サンプルを液体窒素(-196℃)あるいはその蒸気中に低温貯蔵することができる。このような貯蔵は、高効率液体窒素冷凍機を利用できることにより非常に容易に行うことができ、これは非常に低度の減圧と内部に超絶縁体を有する大きなThermos容器のようなものであり、熱の漏洩と窒素の損失が絶対最小となるように維持されるものである。特に骨髄あるいは末梢血から得た造血幹細胞の取り扱い、低温保存及び長期貯蔵についての注意事項及び方法は概ね本発明の単核貪食細胞に適用できる。これらについての記載は例えば、以下の文献、Gorin，1986，Clinics in Haematolog y 15(1):19-48;Bone-Marrow Conservation，Culture and Transplantation，Pro ceedings of a Panel，Moscow，July 22-26，1968，International Atomic Ener gy Agency，Vienna，pp．107-186に見られ、これらは引用により本明細書の一部とする。生存能のある細胞の低温保存法のその他の方法、及びその改変法が利用及び想起され、使用することができる。そのようなものとして例えば冷却金属鏡法がある。Livesey及びLinner，1987，Nature 327:255;Linnerら、1986，J．Histochem ．Cytochem．34(9):1123-1135参照。Senkenらによる米国特許第4,199,022号、Sc hwartzによる米国特許第3,753,357号、Fahyによる米国特許第4,559,298号も参照。凍結細胞は好ましくは迅速に解凍し(例えば37〜41℃に維持した水浴中で)、解凍したら直ちに冷却する。解凍時の細胞の凝集を防ぐために細胞を処理することが望ましい場合がある。凝集を防ぐためには種々の方法を使用することができ、限定するものではないが、DNアーゼ(Spitzerら、1980，Cancer 45:3075-3085)、低分子量デキストラン及びクエン酸塩、ヒドロキシエチルスターチ(Stiffら、19 83，Cryobiology 20:17-24)、あるいは酸性クエン酸デキストロース(Zaroulis及びLeiderman，1980，Cryobiology17:311-317)等を凍結の前及び／または後に添加する方法が挙げられる。凍結保護剤がヒトに有害である場合は、解凍した単核貪食細胞を治療に使用する前にそれを除去しなければならない。凍結保護剤を除去する一つの方法は、ごく薄い(insignificant)濃度まで希釈することによるものである。凍結された単核貪食細胞は、解凍し、回収した後、凍結していない単核貪食細胞について本明細書に記載したように軸索再生を促進するのに使用する。５．２使用方法本発明の一つの実施形態においては、単核貪食細胞を滅菌された製薬上許容される担体に懸濁し、ヒト検体等の哺乳動物のCNSに、損傷あるいは疾患の部位あるいはその近傍で投与する。好ましい実施形態においては、製薬上許容される担体はPBS、培養培地、あるいは単核貪食細胞を懸濁する製薬上許容される任意の液体である。しかしながら、代替できる製薬上許容される担体は当業者に容易に理解されるであろう。所望により、単核貪食細胞による治療は、任意に、局所または全身抗炎症療法、例えば、（a）デキサメタゾンまたはメチルプレドニソロンのようなステロイド、（b）アスピリン、インドメタシン、イブプロフェン、フェノプロフェン、ケトプロフェンもしくはナプロキセンのような非ステロイド性抗炎症剤（NSAID ）、または(c)Thr-Lys-Pro（TKP）のような抗炎症ペプチドの投与と併用され得る。本発明は、抗炎症剤の治療されるべき検体に有効な投与量での任意の使用を含む。そのような有効投与量は当業者には周知であり、例えば、ヒト成人に対してメチルプレドニソロンを毎日100mg全身投与するような標準投与量療法、ならびにヒト成人に対してメチルプレドニソロンを毎日1000mg全身投与するような高投与量療法が挙げられる。本発明によれば、単核貪食細胞による治療は、1種以上のアジュバント因子のC NSへの同時投与と任意に併用し得る。この目的に適したアジュバント因子としては、酸性繊維芽細胞増殖因子（aFGF）、トランスフォーミング増殖因子β（TGF- β）、インターロイキン６（IL-6）、神経栄養因子、例えば神経成長因子（NGF ）、神経栄養因子３（NT-3）、神経栄養因子４（NT-4）、神経栄養因子５（NT-5 ）及び脳由来神経栄養因子（BDNF）、ならびにL1として公知の神経細胞接着分子 (LICAM)が挙げられる。Kallunkiら，1997，J．Cell Biol．138:1343-1354を参照。酸性繊維芽細胞増殖因子（aFGF）が特に好ましい。各アジュバント因子は、６〜10ng/kgの投与量で、単回投与または繰り返し投与のどちらかで、例えば、週間隔で投与し得る。一つの実施形態においては、1種以上のアジュバント因子は、単核貪食細胞の投与といっしよに、あるいはその投与の少し前もしくは少し後に、単核貪食細胞で治療される疾患あるいは損傷部位またはその近傍においてCN Sに投与される。また、1種以上のアジュバント因子は、脳の治療のための脳室内投与、脊髄の治療のための硬膜下腔内投与、網膜もしくは視神経の治療のための眼内投与などにより、局所的に投与される。天然、組換体の両方のアジュバント因子を用いることができる。本発明はさらに、（a）単核貪食細胞、（b）ステロイドもしくは非ステロイド性抗炎症療法、および(c)1種以上のアジュバント因子による併用療法を包含する。好ましい実施形態においては、単核貪食細胞をCNS損傷の直後に投与し、例えばガラスマイクロピペットによりCNSの損傷部位に導入する。但し本発明は、CNS が損傷を被るか、罹患した後の任意の時点（例えば、1週間以内、２週間以内、1 ヶ月以内、２ヶ月以内、３ヶ月以内または６ヶ月以内）における単核貪食細胞の投与を包含し、CNS損傷あるいは疾患の部位あるいはその近傍において任意の神経外科的な適当な方法により単核貪食細胞を導入することを包含する。本発明の組成物及び方法は、軸索損傷を生じるかあるいはそれを伴うあらゆる CNSの損傷あるいは疾患を治療するのに有用である。上記損傷あるいは疾患は、脳、脊髄、あるいは視神経を含む任意の部分のCNSに存在し得る。そのような損傷あるいは疾患の一つの例は外傷であり、受傷直下損傷、反受傷直下損傷、貫通外傷、及び神経外科手術あるいはその他の処置の間に生じる外傷を含む。そのような損傷あるいは疾患の別の例は卒中であり、出血性卒中及び虚血性卒中が含まれる。前記のような損傷あるいは疾患のさらに別の例は視神経ニューロパシーあるいは緑内障を伴う視神経損傷である。CNS損傷あるいは疾患のさらに別の例は本明細書の記載から当業者に明らかであり、本発明に包含される。本発明の組成物及び方法は、患者がその他の中枢あるいは末梢神経系の疾患、例えば遺伝性、代謝性、毒性、栄養性、感染性あるいは自己免疫由来の神経疾患にも罹患しているかどうかにかかわらず、軸索損傷を生じるCNS損傷あるいは疾患を治療するのに有用である。単核貪食細胞の適当な投与量は、治療する部位におけるCNS損傷あるいは疾患に罹患する神経繊維の数に比例する。好ましい実施形態においては、例えばラット視神経の完全な横断面のような約10⁵の神経繊維が罹患する病巣を治療するための投与量は約2.5ｘ10³〜約10⁵の単核貪食細胞の範囲であり、例えばヒト視神経の完全な横断面のような約10⁶の神経繊維が罹患する病巣を治療するための投与量は約2.5ｘ10⁴〜約10⁶の単核貪食細胞の範囲である。より好ましくは、約10⁵の神経繊維が罹患する病巣を治療するための投与量は約10⁴〜約10⁵の単核貪食細胞の範囲であり、約10⁶の神経繊維が罹患する病巣を治療するための投与量は約10⁵ 〜約10⁶の単核貪食細胞の範囲である。当業者には明らかなように、単核貪食細胞の投与量は、治療される病巣または損傷部位に罹患した神経繊維の数に比例して多くしたり少なくしたりし得る。 5.3 刺激性の組織、細胞及び生物活性物質のアッセイ本発明は、刺激性の組織及び細胞及び刺激性の生物活性物質を同定するためのアッセイを提供する。単核貪食細胞は、試験される組織あるいは細胞と共に、試験される組織あるいは細胞でコンディショニングされた培地で、あるいは試験される生物活性物質を種々の濃度で添加した培地中で培養する。その後単核貪食細胞を貪食活性または酸化窒素産生量についてアッセイする。貪食活性が上昇した、または酸化窒素の産生が上昇した単核貪食細胞は、軸索再生を促進する能力が増強されている。好ましい実施形態においては、貪食活性と酸化窒素産生量の両方を測定し、単核貪食細胞刺激を、これらの活性のいずれかの上昇、より好ましくはこれらの活性の両方の上昇を観察することによって検出する。好ましくは、単核貪食細胞の貪食細胞能力は、少なくとも10パーセント、より好ましくは少なくとも25パーセント、さらに好ましくは少なくとも50パーセント上昇する。好ましくは、単核貪食細胞の酸化窒素産生量は、少なくとも50パーセント、より好ましくは少なくとも100パーセント、さらに好ましくは少なくとも2 00パーセント上昇する。一つの実施形態においては、単核貪食細胞を標識された粒子と接触させ、その後細胞に結合した標識の量を測定することにより貪食活性を測定する。この目的には広範な種類の粒子を使用することができ、限定するものではないが、ラテックスあるいはポリスチレンビーズ及び天然の細胞、例えば赤血球細胞、酵母、及び細菌等が挙げられる。任意に、例えば免疫グロブリンあるいは補体により粒子をオプソニン化することができる。粒子は任意の適当なマーカーで標識することができ、マーカーとしては、限定するものではないが、蛍光マーカー(例えばフルオレセインやローダミン)、放射性マーカー(例えばヨウ素、炭素あるいは水素の放射性同位体)、及び酵素等が挙げられる。あるいは、非標識粒子(例えば赤血球細胞あるいは酵母)を使用してアッセイを行うことができ、非標識粒子は任意の適当な方法、例えば染色してあるいは染色せずに、顕微鏡により検出する。好ましい実施形態においては、単核貪食細胞を最初に蛍光性ポリスチレンビーズに接触させ、その後細胞に結合した蛍光をフローサイトメトリーにより測定する。一つの実施形態においては、酸化窒素産生量は、Hibbsら，1987，Science 235 :473-476（これは参照により本明細書に含まれる）に記載されているようなGrie ss−試薬アッセイにより測定される。しかしながら、当業者に公知のその他の酸化窒素産生量についてのアッセイも使用し得る。例えば、Packer(ed.)，1996，M ethods in Enzymology 268:58-247（これは参照により本明細書に含まれる）を参照。本発明のアッセイは、単核貪食細胞を刺激するのに必要な培養期間を決定する手段ともなる。刺激性の組織あるいは細胞と共に、刺激性の組織あるいは細胞でコンディショニングされた培地中で、あるいは刺激性の一種以上の生物活性物質を添加した培地中で単核貪食細胞を培養する。その後単核貪食細胞の貪食活性または酸化窒素産生量、あるいはその両方を測定する。単核貪食細胞の貪食活性を少なくとも10%、好ましくは少なくとも25%、より好ましくは少なくとも50%増加させるのに十分な培養期間、あるいは単核貪食細胞の酸化窒素産生量を少なくとも50%、好ましくは少なくとも100%、より好ましくは少なくとも200%増加させるのに十分な培養期間が、単核貪食細胞の軸索再生を増強する能力を刺激するのに十分なものである。以下の実施例は例示のためにのみ示すものであり、いかなる意味においても本発明の範囲を限定することを意図するものではない。 6. 実施例:横断面形成された視神経において軸索再生を促進するための単球の使用 6.1 材料及び方法 6.1.1 単球の単離及び培養末梢血は成体Sprague-Dawley(SPD)ラットから集めた。これまでに記載されたようにして(F．Colottaら、1984，J．Immunol．132:936-944)、一段階Percoll勾配上での分画化により単球を単離した。単球濃縮フラクションをPercoll界面から回収し、PBSで一回洗浄して残存するPercollを除去し、DCCM-1培地(Beit Ha'e mek Ltd.，Kibbutz Beit Ha'emek，Israel)中に1ｘ10⁶細胞/mlで再懸濁した。細胞を以前に記載されたように(Andreesenら、1983，J．Immunolog．Meth．56:295 -304)37℃でテフロンバッグ中で当技術分野で従来通りに５％CO₂とともに培養した。通常は1ｘ10⁷の細胞を含む10mlを各バッグに入れた。貪食活性または酸化窒素産生量を測定するために、SPDまたはWistarラット由来の単球を使用し、ポリプロピレンチューブまたはテフロンバッグ中で培養した。 6.1.2 単球の刺激単離した単球を上記したようにテフロンバッグまたはポリプロピレンチューブ中で2〜24時間培養することにより非刺激単球(NS)を調製した。単球をテフロンバッグまたはポリプロピレンチューブ中でラット坐骨神経の少なくとも一つのセグメントと共に2〜24時間培養することにより坐骨神経刺激単球(SS)を調製した。単球をテフロンバッグまたはポリプロピレンチューブ中でラット視神経の少なくとも一つのセグメントと共に2〜24時間培養することにより視神経刺激単球(OS )を調製した。実験6.2.1及び6.2.2において各神経セグメントは1.0〜1.5cmの長さとし、実験6.2.3から6.2.9においては0.5〜1.0cmの長さとした。特に記載した場合を除いて１神経セグメントに対して5ｘ10⁶培養単球の一定の比を使用した。 2〜24時間の培養の後、単球を1000ｘ gで3分間遠心分離し、リン酸緩衝食塩水 (PBS)で一回洗浄し、1.25ｘ10⁵〜5ｘ10⁶細胞/mlでDCCM-1培地中に再懸濁した。単球は形態学的に、及びモノクローナル抗体ED1(Serotec，Oxford，England)を使用して記載されたようにして(Hirschbergら、1994，J，Neuroimmunol．50:9-1 6)、免疫細胞化学的に調べたところ純度95%であった。単球の刺激に皮膚も用いられる。いくつかの実験では、10⁶ラット単球をパンチバイオプシーにより無菌ラットから得た1cm×1cm四方の皮膚とともに培養した。その他の実験では、ラット皮膚をタンパク質を含まない培地中で培養して皮膚由来タンパク質を含む皮膚でコンディショニングした培地を製造し、その後10⁶ ラット単球を200μgのタンパク質を含む皮膚でコンディショニングした培地とともに培養した。 6.1.3 視神経横断面形成麻酔を施した8〜9週齢の平均体重300グラムの成体SPDラットに、記載されたようにして(Eitanら、1994，Science 264:1764-1768)、視神経の横断面形成を施術した。髄膜の小さな開孔を通して左の視神経を露出した。200μmの先端と平滑な鈍端を有する曲線ガラス解剖刃を、末梢血管を損傷しないように注意しながら神経を横切るように動かして眼球に対して2〜3mm遠位に完全な横断面を形成した。本明細書で使用する「遠位」の用語は、眼球から離れ、脳に近づくことを意味する。横断面形成のすぐ後に、培養した単球を含む2μlの培地、または2μlの培地のみを、25μm内孔を有する曲線ガラスマイクロピペットにより損傷の部位に導入した。横断面形成部位から約200μmに髄膜開孔を形成し、適用部位からの細胞の漏洩を防止した。いくつかの実験では、横断面形成の少し後にラットの何匹かにデキサメタゾン（0.8mg／ラット）を腹腔内注射により投与した。 6.1.4 軸索再生のアッセイ 6.1.4.1 軸索の逆行的標識化横断面形成の7〜8週後、親油性神経トレーサー染料、4-(4-(ジデシルアミノ) スチリル)-N-メチルピリジニウムイオダイド(4Di-10ASP)(Molecular Probes，Eu gene，Oregon，USA)を、損傷の部位に対して2mm遠位で損傷を受けた視神経に適用した。前記染料の適用の1週間後に網膜を切除し、4%パラホルムアルデヒド溶液中の平坦化全組織標本とし、蛍光顕微鏡で観察して網膜全体の標識網膜神経節細胞(RGC)を検出し、その数をカウントした。損傷の部位を過ぎて染料を適用した部位まで再成長した軸索のみが染料を取り込み、それを網膜神経節細胞に逆行的に輸送した。前以って横断面形成しなかったラット視神経に適用した場合、この方法により網膜あたり平均21,623 RGCが標識される。横断面形成した視神経についての結果はこの標準、4Di−10ASP標識法の効率の対照に対するパーセンテージで表す。 6.1.4.2 軸索の順行性標識化横断面形成の7〜8週間後、先に横断面形成した視神経の横断面形成部位に対して1mm近位に新たな切開を形成した。本明細書で使用する「近位」は眼球に向かい、脳から離れることを意味する。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)(VI-A型、 Sigma，Tel Aviv，Israel)を、PBS中のHRPの50%(W/V)溶液に浸した滅菌スワブにより切開部を通して導入した。HRPの適用の8〜12時間後、頸動脈からラットにPB Sを灌流させ、その後固定剤としてPBS中の4%パラホルムアルデヒドを灌流させた。視神経を切り出し、長さ方向の50μmの凍結切片を取り、これまでに記載された(Lavieら、1992，Brain Res．575:1-5)、ジアミノベンジジン及びコバルト強化を使用してHRP活性の可視化用に加工した。 6.1.5 貪食活性のアッセイ SPDまたはWisterラット由来の単球をDCCM-1培地に懸濁し(1ml中2.5ｘ10⁵または５×10⁵細胞)、さらになにも添加しないか、あるいは表示した数の同系ラット坐骨神経あるいは視神経セグメントとともに、または表示した合計タンパク質濃度で同系ラット視神経によりコンディショニングした培地を添加して培養した。詳細については第４節を参照。貪食活性をアッセイするために、蛍光非カルボキシル化マイクロスフィア(“FLUORESBRITE”^TM，Polysciences，Warrington，Pen nsylvania，USA,カタログ番号17152)の作業用溶液を、ストック溶液の一滴を10m lのDCCM-1培地に希釈することにより調製し、神経セグメントを除去した後にこの作業用溶液をさらに1:100の希釈率で単球懸濁液に加えた。37℃で3時間おいた後、細胞をDCCM-1培地またはリン酸緩衝食塩水で一回洗浄し、フローサイトメトリー(FACS)により細胞に結合した蛍光を測定した。いくつかの実験においては、 1mlの氷冷PBSを洗浄工程の前に加えて貪食を停止させた。 6.1.6 酸化窒素産生量のアッセイ SPDまたはWisterラット由来の単球をDCCM-1培地に懸濁し（１ml中に10⁶細胞）、さらになにも添加しないか、あるいは表示数の同系ラット坐骨神経あるいは視神経セグメントとともに、または表示した合計タンパク質濃度で同系ラット坐骨神経または視神経によりコンディショニングした培地を添加して培養した。詳細については第４節を参照。表示した時間培養した後、神経セグメントを（もしあるならば）除去し、試料を遠心分離し、上清を回収した。酸化窒素産生量をアッセイするために、上清の100μlアリコートを100μlのGriess試薬（2.5％H₃PO₄中の１％スルファニルアミド、10％N-(1-ナフチル)-エチレンジアミン塩酸塩）とともに室温で10分間インキュベートした。比色分析を550nmにてELISAリーダーを用いて行い、酸化窒素の量を標準として亜硝酸ナトリウム（Sigma、イスラエル）を用いた参照曲線により計算した。反応培地（DCCM-1）をブランクとして用いた。対照実験において、視神経セグメントおよび座骨神経セグメントがごく少量の酸化窒素を産生させるということが分かった。 6.2 結果 6.2.1 刺激単球及び非刺激単球による軸索再生の促進ラットにおいて視神経横断面形成を行い、損傷時に、対照培地、あるいは2.5 ｘ10³〜1ｘ10⁵非刺激(NS)単球、2.5ｘ10³〜1ｘ10⁵坐骨神経刺激(SS)単球、もしくは2.5ｘ10³〜1ｘ10⁵視神経刺激(OS)単球で処理した。各処理群からのラットの標識された網膜神経節細胞(RGC)の数を、正常視神経における標識RGCのパーセンテージとして図1に示す。細胞の投与を受けていないラットはRGCの標識化を殆ど示さなかった。NS単球を投与されたラットはRGCの中程度の数の標識化を示したが、OS単球による処理はより多数のRGCの標識化を生じた。SS単球を投与されたラットにおいては、標識RGCの中央値はOS単球で処理されたラットにおけるものよりも5倍以上高く、NS単球で処理されたラットにおけるものよりも約15倍高かった。 6.2.2 種々の投与量の坐骨神経刺激単球あるいは視神経刺激単球による処理の後の軸索再生投与した単球の投与量の関数としての再生を調べるために、ラットに視神経横断面形成を行い、損傷時に2.5ｘ10³、５ｘ10³、1x10⁴あるいは1ｘ10⁵細胞の合計投与量で、OS単球またはSS単球で処理した。各処理群の標識網膜RGCの平均値を、正常視神経における標識されたRGCのパーセンテージとして図2に示す。RGC標識化は5ｘ10³のSS単球での処理の後に最も高かった。SS単球のより多い投与量あるいはより少ない投与量でも軸索再生が促進されたが、有効性はより低かった。OS単球による処理でも同様に軸索再生が促進されたが、有効性はより低かった。OS及びSS単球のいずれによっても、ピーク効果は5ｘ10³単球投与時において見られ、より多い投与量あるいはより少ない投与量での軸索再生に対する有益な効果はより低いものであった。 SS単球あるいは対照培地による処理の後の網膜における標識RGCの代表的な蛍光顕微鏡像を図3に示す。対照培地による処理の後に標識RGCが見られないことは、横断面が完全であり、標識RGCは、横断面の部位を横切り、単に実験的な損傷から逃れた繊維ではない再生軸索を表すものであることを示している。図4の顕微鏡写真は再成長が起こったことをさらに証明するものである。対照培地で処理された神経(E)においては、HRP適用の部位から遠位に標識繊維はみられなかった。SS単球で処理された神経(A〜D)においては、神経の近位部分から現れ、横断面の部位(ST)を越えて遠位に伸びている標識繊維が見られた。成長円錐 (gc)に似た構造がこれらの標識繊維の先端に観察された。 6.2.3 ラット坐骨神経セグメントで種々の時間刺激した単球による処理の後の軸索再生坐骨神経セグメントにより種々の時間刺激された後に軸索再生を刺激する単球の能力を調べるために、ラットに視神経損傷を与え、ラット坐骨神経セグメントと共に2時間(2h)、12時間(12h)または17時間(17h)培養した5ｘ10³の単球により損傷時に処理した。各処理群からの個々のラットにおける標識RGCの数を正常視神経における標識されたRGCのパーセンテージとして図5に示す。単球は、試験した各時間の間の坐骨神経セグメントとの培養の後に軸索再生を促進する能力を増加させた。 6.2.4 ラットまたはマウス坐骨神経セグメントにより刺激された単球での処理の後の軸索再生ラット及びマウスから得た坐骨神経セグメントの、軸索再生を促進する単球の能力を刺激する能力を比較するため、ラットにおいて視神経横断面形成を行い、ラット坐骨神経の1〜8のセグメント(ラット)またはマウス坐骨神経の2〜16セグメント(マウス)のいずれかとともに24時間培養した5ｘ10³のラット単球で損傷時に処理した。各処理群からの個々のラットにおける標識RGCの数を正常視神経における標識されたRGCのパーセンテージとして図6に示す。ラット及びマウス坐骨神経はいずれも軸索再生を促進する単球の能力を刺激した。 6.2.5 ラット坐骨神経のセグメントとの培養の後の単球の貪食活性 2.5ｘ10⁵細胞のラット単球を1mlのDCCM-1培地中に懸濁し、さらに添加物を加えず(対照)、あるいはラット坐骨神経の1セグメント(ISS)、ラット坐骨神経の2 セグメント(2SS)、もしくはラット坐骨神経の4セグメント(4SS)と共に2〜24時間培養した。 2時間の培養後の2SS及び4SS調製物の貪食活性を対照単球の貪食活性と比較して図7に示す。坐骨神経の２つのセグメントとの2時間の培養の後、単球の貪食活性は増加し、坐骨神経の４つのセグメントとの2時間の培養の後には、単球の貪食活性はさらに増加した。 24時間の培養後の1SS及び4SS調製物の貪食活性を対照単球の貪食活性と比較して図8に示す。坐骨神経の１つのセグメントとの24時間の培養の後、単球の貪食活性は増加し、坐骨神経の４つのセグメントとの24時間の培養の後には、貪食活性の増加はさらに大きくなった。4SS調製物では、2時間後よりも24時間後の方が貪食活性の増加はより大きかった。単球培養物に坐骨神経でコンディショニングした培地を加えることにより、同様に単球の貪食活性が上昇した（データは示さず）。 6.2.6 ラット視神経のセグメントとの培養の後の単球の貪食活性ラット単球の2.5ｘ10⁵細胞を1mlのDCCM-1培地中に懸濁し、さらに添加物を加えず(対照)、またはラット視神経の4セグメント(4OS)と共に2〜24時間培養した。2時間の培養後の4OS調製物の貪食活性を対照単球の貪食活性と比較して図9に示す。視神経の４つのセグメントとの2時間の培養の後、単球の貪食活性は減少した。 24時間の培養後の4OS調製物の貪食活性を対照単球の貪食活性と比較して図10 に示す。視神経の４つのセグメントとの24時間の培養の後、単球の貪食活性は2 時間後において見られたのと同様に減少した。 6.2.7 視神経によりコンディショニングされた培地の存在下で坐骨神経と培養した後の単球の貪食活性 1mlのDCCM-1培地中でラット視神経の10セグメントを2時間培養することにより視神経によりコンディショニングされた培地を調製した。新鮮なDCCM-1培地はタンパク質を含まないが、視神経によりコンディショニングされた培地はタンパク質を含んでいた。ラット単球の2.5ｘ10⁵細胞を1mlのDCCM-1培地に懸濁し、ラット坐骨神経の1〜6セグメントと共に、さらに添加物を含ませず(0)、あるいは10 μg/ml(10)、1μg/ml(1)、もしくは0.1μg/ml(0.1)の総タンパク質濃度の視神経によりコンディショニングされた培地と共に24時間培養した。図11は、視神経でコンディショニングした培地の存在下に坐骨神経と共に培養した単球の貪食活性を、視神経でコンディショニングした培地の不存在下に坐骨神経と共に培養した単球の貪食活性と比較して示す。視神経でコンディショニングした培地の添加により、坐骨神経との培養により生じる貪食活性の増強が弱められた。この弱化は0.1μg/mlの視神経でコンディショニングした培地を添加した調製物において最も顕著であった。同様の結果（示さず）が、視神経セグメントをDCCM-1培地中で8時間培養し、得られた上清を４℃にてPBSに対して一晩透析し、その後-20℃または-70℃で保存した場合に得られた。 6.2.8 坐骨神経、視神経、またはコンディショニングした培地とともに培養した単球の酸化窒素産生量ラット単球を10⁶細胞にて1mlのDCCM-1培地中に懸濁し、さらに添加物を加えず (対照)、ラット坐骨神経の１セグメント(1SS)と共に、またはラット視神経の４セグメント（4OS）と共に24〜96時間培養した。これらの調製物の酸化窒素産生量を図12に示す。坐骨神経とともに培養した単球は、酸化窒素の産生量の有意な増大を示したが、視神経では有意な効果は得られなかった。図13は、ラット坐骨神経またはラット視神経によりコンディショニングした培地とともに72時間培養した単球の酸化窒素産生量を示す。坐骨神経でコンディショニングした培地は酸化窒素産生量を統計学的に有意に上昇させたが、視神経でコンディショニングした培地では統計学的に有意な効果は得られなかった。この結果は、坐骨神経による単核貪食細胞の刺激は1種以上の可溶性因子により媒介されることを示すものである。 6.2.9 抗炎症療法と併用した坐骨神経−刺激単球による治療後の軸索再生抗炎症療法が単球介在軸索再生を妨げるかどうかを試験するために、ラットに視神経横断面形成を施した。対照培地または坐骨神経により刺激された単球を、損傷の少し後に、さらに治療することなく、あるいはデキサメタゾンの腹腔内投与と共に横断面形成部位に投与した。８週間後、軸索再生を逆行的標識化(retro grade labeling)により測定した。図14に示したように、治療を受けていないラット（対照）またはデキサメタゾンのみを投与したラット（DEX）はごくわずかな再生を示したが、坐骨神経で刺激した単球は単独投与（SS）であろうと、腹腔内デキサメタゾンと同時投与（DEX/SS）であろうと、軸索再生を促進させた。 6.3 考察これらの実施例は、CNS損傷の部位に投与された単球が軸索再生を促進したことを示している。試験した全ての単球は軸索再生の促進に有効であった。但し単球は、ラットあるいはマウスからの神経セグメント、特に坐骨神経のような末梢神経のセグメントと共に培養することにより刺激された(即ち、軸索再生を促進する能力の増強を示した)。この刺激は、試験した培養の全ての時間、即ち2〜24 時間の後において明確であった。約10⁵の神経繊維を含むラット視神経の全横断面の処理については、約5ｘ10³の単球を投与することにより最適な結果が得られた。但し、試験した全ての投与量において軸索再生について有益な結果が示された。また、これらの実施例は、単球が坐骨神経の一つ以上のセグメントと共に、または坐骨神経でコンディショニングした培地中で培養した後に貪食活性を上昇させ、酸化窒素産生量を上昇させることも示している。したがって、貪食活性、酸化窒素産生量、またはこれらの特性の両方の測定により、軸索再生を促進するように単球を刺激する能力について組織及び細胞をスクリーニングする迅速で効率的な方法が得られる。 7. 横断面が形成された脊髄における軸索再生を促進するための単球の使用 7.1 材料および方法 7.1.1 単球の単離および刺激末梢血を成体Sprague-Dawley（SPD）ラットからヘパリン（5000u/ml、Calbioc hem、La Jolla、CA）で被覆した10ml注射器に引き込み、等容量のPBSで希釈し、 291×ｇ、30℃での25分間遠心分離による一段階Percoll（1.077g/ml、Pharmacia 、Sweden）勾配上での分画化にかけた。Colottaら、1984，J．Immunol．132:936 -944を参照。単球濃縮フラクションをPercoll界面から回収し、PBSで一回洗浄して残存するPercollを除去し、DCCM-1培地(Beit Ha'emek Ltd.，Kibbutz Beit Ha 'emek，Israel)中に1ｘ10⁶細胞/mlで再懸濁した。細胞を37℃でポリプロピレンチューブまたはテフロンバッグ中で５％CO₂下、新たに切り出したラット坐骨神経のセグメント（0.5〜1.0cm長）とともに２〜24時間インキュベートした（0.4 〜0.5x10⁶細胞／神経セグメント）。 7.1.2 脊髄横断面形成 200〜300ｇの雄Sprague-Dawleyラット（Hebrew University，Jerusalem，Isra el）を、ケタミン40mg/kgおよびキシリン100mg/kgで麻酔し、背部を切開してT8- T9椎骨を露出させた。背部および横の椎骨突起における筋挿入物を単極電気メス装置で解剖し、切断した。T8椎弓切除術は、骨鉗子を用いて、下にある脊髄に挫傷性損傷を与えないように行った。脊髄にマイクロシザーを用いて横断面を形成し、残りの繊維をマイクロナイフで切断した。下にある椎体を脊髄の切断末端間の約３mmの間隔により露出させた。椎体の露出表面および側陥凹を高倍率下でチェックして切断されていない繊維がないことを確認した。手術中、出血を双極電気メスを用いて、無菌ゲル発泡体スポンジ材（SPONGOSTAN^TM，Upjohn Co.，Kala mazo o，MI）を適用することにより調節した。実験プロトコルおよび手順は、動物研究についてのNIHガイドラインにしたがった。手術後、自律性膀胱クリアランスが第2週の終わり付近で生じるまで、膀胱の手動圧搾を少なくとも1日２回（最初の48時間においては最大1日3回まで）行った。何匹かの動物は下記の電気生理学的研究後に膀胱自動性を失い、神経原性調節が回復するまで膀胱の自動圧搾が必要であった。ラットを、尿路感染の形跡および全身性疾患のその他のあらゆる徴候について注意深く監視した。トリメトプリムおよびスルファメトキサゾール（RESPRIM^TM，Teva Laboratories，Israel， 1ml/日）を手術後の最初の週に各動物に経口投与し、その後は血尿のある動物に経口投与した。毎日の検査には、感染または血清収集の形跡についての椎弓切除部位の検査、および自食症またはとこずれの形跡についての後脚の評価が含まれていた。重病のラットはすべて麻酔を過剰投与して安楽死させた。そのようなラットは、治療群における数の10％を超えることはなく、データ分析から排除した。 7.1.3 単球の移植同系末梢血単球を、上記のように、1段階Percoll分画化およびラット坐骨神経のセグメントとの共培養により精製した。移植前に、坐骨神経セグメントを除去し、細胞を1回洗浄して新鮮なDCCM-1培地に再懸濁し、その生存率を測定した。一つの動物群においては、市販のキット（Octacol-FI5，OMRIX Biopharmaceut icals SA，Brussels，Belgium）から得たフィブリンにかわ(fibrin glue)を脊髄の切断末端間に作った間隙に塗布した。まず、2.5μlのBAC成分（ヒトフィブリノーゲン50mg/mlおよびその他のヒト血漿タンパク質、ならびにトラネキサム酸9 2mg/mlを含む）をこの間隙に注入し、次いで2.5μlのトロンビン成分（ヒトトロンビン1000IU/mlおよびCaCl₂40mMを含む）を間隙に注入した。フィブリンにかわを投与した後、表示数の培養単球を含む５μlの単球懸濁液（または対照培地）を損傷部位の遠位（すなわち尾）にある脊髄実質組織にハミルトン注射器を用いて投与した。第２の動物群においては、フィブリンにかわは用いず、単球懸濁液（または対照培地）を間隙に部分的に注入し、遠位実質組織に部分的に注入した。これらのフィブリンと非フィブリン治療群の間には有意な相違は観察されず、データ分析の目的で融合した。何匹かの動物においては、aFGF（7.5μg/ml、５μl/ラット、Calbiochem Mega pharm，Cat＃341580）を遠位実質組織に注入した。全ての場合において、損傷部位をSPONGOSTAN^TMのフィルムで被覆し、創傷を層に密閉した。 7.1.4 運動機能の評価運動機能をオープンフィールド歩行評価法(open field walking evaluation) を用いて監視した。Bassoら，1995，J．Neurotrauma 12:1-21;Bassoら，1996，E xp．Neurol．139:244-256。簡単に言うと、ラットを、なめらかな滑らない床を有する円形の成形プラスチック囲い（直径90cm、壁の高さ７cm）の真中に置いた。ラットを刺激してセッション中に連続運動を誘発した。これは４分間続いた。 BBB運動スコアを体幹、尾および後脚が関与する運動を観察することにより割り当て、０（運動無し）から22（正常な運動）の範囲のスコアを割り当てた。明らかに反射の一部である運動または試験者の接触により誘発された運動を除いた後脚全ての運動を記録した。オープンフィールドスコア範囲の中の低い部分の後脚の運動に特別な注意を払った。長い上行経路および下行経路に依存する応答を評価するために、コンタクト− プレーシング(contact-placing)反射を調べた。Galeら，1985，Exp．Neurol．88 :123-134;Kerasidisら，1987，J．Neurosci．Methods 20:167-179。簡単に言うと、この応答は、各足の背面および側面における固有受容刺激を伴わない軽い接触（毛の曲がり(hair bend)）により誘発された。陽性のコンタクト−プレーシング応答は、その表面の縁(edge)を取り除くための脚の屈曲、続いて保持のための表面上への脚の伸長および設置を含んでいた。 7.1.5 電気生理学的研究脊髄手術の1週間前に、各ラットの大脳半球の感覚運動皮質上の硬膜外にねじ電極の移植を行った。Simpson & Baskin，1987，Neurosurgery 20:131-137。簡単に言うと、中線に対してそれぞれ水平方向に１mm外側と冠状縫合に対して２mm 尾部方向のところに硬膜が露出するまで穴をあけた。3/16インチのねじを穴に挿入した（2.5〜３回転）。シアノアクリレートにかわの薄層を頭骨の表面に塗布し、乾燥し、その後開口部を歯科用セメントで密閉した。電気生理学的記録中、ラットは麻酔下に維持した（ケタミン40mg/kgおよびキシラジン10mg/kgの負荷用量を腹腔内投与し、30分毎に負荷用量の3分の1を補給した）。グランドニードル(ground needle)電極を首の背部近傍に経皮挿入した。対側性筋運動誘発電位を、対応する感覚運動皮質をGrass SD9刺激器からのツインパルスの陰極刺激で刺激し、0.1ミリ秒間10mAの定電流をかける（硬口蓋内の陰電極を用いた）ことによって誘導した。 50掃引(sweeps)を平均する少なくとも二つの運動誘発電位掃引(traces)を各筋肉から記録した。各後脚の前表面に沿って縦方向の皮膚切開を行った。腱膜層を切開して腓腹筋、前方脛骨筋、四頭筋、内転筋および大腿二頭筋を露出させた。単極ニードル電極を露出した筋肉に挿入して誘発EMG信号を捕獲し、これを増幅しフィルタリングし（マイクロ電極AC Amplifier，model 1800，A-M Systems，E verett，WA;100Hz〜5kHz帯域）、その後デジタル化し（MacintoshのLABVIEW（登録商標），National Instruments，Austin，TX）、次いで保存した。この操作後、皮膚を縫合し、予防抗生物質を翌数日間にわたって投与した。 7.1.6 免疫組織学的研究脊髄切片標本をグリア繊維酸性タンパク質（GFAP）、ニューロフィラメントタンパク質、または成長関連タンパク質（GAP-43）の検出のために間接的に免疫染色した。ラットに生理的食塩水および４％パラホルムアルデヒド／PBS溶液を経噴門的に(transcardially)灌流した。脊髄を取り出し、パラホルムアルデヒド内に後固定し、20％スクロースのPBS溶液中に一晩浸漬した。マクロファージ処理脊髄および対照脊髄の氷冷切片（20μｍ）を調製し、ゼラチン被覆スライド上に置き、室温で乾燥した。切片を無水エタノール中に室温で5分間固定し、二重蒸留水で数回洗浄し、PBS中で0.5％Tween-20（Sigma，Israel）とともに5分間インキュベートして組織の透過性を増大させた。切片をPBS中で５％ウシ血清アルブミンとともに37℃にて30分間インキュベートし、次いで抗GFAP抗体（Sigma，Isr ael;1:100希釈）、抗GAP-43抗体（Boerhinger-Mannheim，Germany;1:100希釈）、または68kDおよび200kDのニューロフィラメントタンパク質の混合物に対して生じさせた抗体（Novocastra Laboratories，UK;1:50希釈）とともに室温で１〜２時間インキュベートした。0.05％Tween-20/PBSで３回洗浄した後、切片をフルオレセイン−結合二次抗体（Jackson ImmunoResearch，Jackson，PA;1:100希釈）とともに室温で30分間インキュベートした。大規模な洗浄後、切片を抗退色剤(antifadin g agent)（1,4-ジアザビシクロ(2,2,2)オクタン;Sigma;PBS中22mM）に入れ、蛍光顕微鏡検査により調べた。 7.2 結果 7.2.1 刺激された単球による横断面形成脊髄における軸索再生の促進ラットに完全な脊椎横断面を形成し、損傷時に(1)刺激された単球およびaFGF ；(2)刺激された単球単独；(3)対照培地およびaFGF；ならびに(4)対照培地単独で治療した。各治療群の動物の数および得られた結果を表1にまとめる。表1 脊髄横断面形成後の機能回復 * 回復は、オープンフィールド運動スコア＞５で定義される。動物を脊髄横断面形成後19週間追跡した。手術後最初の8週間（約２日間続く脊髄ショックについての短い初期期間を含む）では、治療群または対照群のいずれにおいても全ての動物が後脚の完全麻痺を示し、運動活性の回復はなかった（すなわち、BBB運動スコア＞５ではない）。 8週間後、対照群（3群および４群）の動物は、その後脚の動きがないか、一つまたは二つの関節がわずかに動くのみであり、BBB運動スコアはほとんど２以下であり、場合によって４であり、５を超えることはなかった。それとは対照的に、単球治療群（１群および2群）中の22匹の動物のうち12匹に有意な回復が見られた（ANOVA、ｐ＜0.001）。回復は、後脚の関節全ての大きな動き、足底の設置、および体重支持(weightbearing)により表される。治療した動物の中の6匹はBB B運動スコアが８であり（すなわち、体重支持のない掃引運動または体重支持のない足底の設置）、そして2匹の治療動物は、BBB運動スコアが９であった（すなわち、体重支持背側足踏みのある足底の設置および足底足踏みのない足底の設置、ならびに閾値の低いコンタクトプレーシング応答。これは皮質集中反射であると考えられる。）。単球とaFGFの両方で治療した12匹の動物（1群）の中の9匹が運動活性の回復を示し、一方単球単独で治療した10匹の動物（2群）の中の３匹が運動回復を示した。aFGFと単球の両方の投与により、改善の程度というよりも回復した動物の割合が上昇するということは明らかであった。しかしながら、aFGFを単独で投与され、単球を投与されていない動物は、運動回復を示さなかった（すなわち、BBB運動スコアは５以下であった）。図１（ＡおよびＢ）は、単球で治療されたラットの脊髄横断面形成後の運動機能の漸進的な回復を示す。その他の実験（データは示さず）は、aFGFについての追加の利益は、動物をより多数の単球で治療した場合あまり目立たないということを示唆するものである。さらなる治療群（示さず）においては、フィブリンにかわを脊髄の切断末端間の間隙に入れて、その後単球およびaFGFをフィブリンに投与した（遠位実質組織には投与しない）。この治療群では回復は見られず、これは回復が、損傷部位および損傷部位の遠位にある部位の横断面形成した神経に接近できる十分な数の単球に依存することを示唆するものである。筋電計測研究により、後脚筋の再支配が単球治療ラットにおいて生じることが確認された。正常なラットにおいては、感覚運動皮質の後脚領域の単極刺激が、（a）後期(late)後脚筋電的応答を誘発し（潜伏時間20〜30ミリ秒、閾応答３〜４mA）、（b）しばしば早期後脚筋電応答を誘発する（潜伏時間８〜20ミリ秒、閾応答８mA）。後期EMG応答は、その伝導特性および低閾値に基づいて、ラットの皮質脊髄路に関連していた。Kalderon & Fuks，1996，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 93:11185-11190。本研究においては、後期EMG応答は、脊髄横断面形成後２週間以内にはどのラット（対照および実験群を含む）にも観察されなかった。横断面形成の12〜14週間後に検査した対照動物においては（ｎ＝30）、大部分の近位筋肉、四頭筋においてさえ後期EMG応答が検出されなかった。それとは対照的に、単球治療ラット( 1群および2群）の筋肉は、種々の程度の後期EMG応答の回復を示した。完全な相関が行動性スコアと筋電的観察結果の間に観察された。自発的運動回復を示した全ての動物は、陽性EMG応答も示した。さらに、運動およびEMGの観察結果は、回復および左右相称性(bilaterality)の程度の点で相関していた。免疫組織化学的研究により、損傷部位を横切って再成長している繊維の存在が確認された。繊維の再成長は、成長関連タンパク質GAP-43に対する抗体を用いて検出した。同一組織の隣接する連続部分を抗ニューロフィラメント抗体（神経繊維を検出するため）と抗GFAP抗体（星状細胞を検出するため）で染色した。図２および３に示したように、組織学的観察結果は電気生理学的結果および行動結果と相関していた。図２（Aa，Ba）に示したように、GFAP染色により損傷部位の輪郭が描かれた。Blaugrundら，1993，J．Comp．Neurol．330:105-112を参照。対照動物においては、損傷部位でニューロフィラメント抗原およびGAP-43が欠けていた。図２(Bb)および図３(Ba，Bb)を参照。それとは対照的に、後脚EMG応答を有する単球治療動物においては、損傷部位（GFAP染色により輪郭が描かれている）は、ニューロフィラメント抗原およびGAP-43に対して強い染色を示した。図２ (Ab)および図３(Aa，Ab)を参照。これらの結果は、生理学的回復が損傷部位を横切る神経繊維の再成長に関連していたということを示すものである。回復を示さなかった単球治療動物においては、損傷部位がニューロフィラメント抗原または GAP-43に対して染色されなかった（示さず）。 7.3 考察本実施例は、脊髄の完全な横断面形成後のラットにおいて単球による治療により機能回復などの軸索再生が生じることを示すものである。回復は、オープンフィールドで得点付けされた自発的後脚運動機能、および筋電計測により検出された皮質誘発後脚筋肉活性により評価した。これらの機能回復を評価する別個の様式の間には優れた相関が存在する。本研究で観察された運動回復（21点オープンフィールド運動試験スケールにおいて８〜９の値）は、５点オープンフィールド試験スケールにおける２〜３の値と一致するものである。Chengら，1996，Scien ce 273:510-513;Young，1996，Science 273:451を参照。単球の投与による有益な効果は、aFGFによる同時治療によって増大するが、aFGFにより追加された利益は、より多数の単球を投与するとあまり目立たなかった。単球をフィブリンにかわに包埋した場合、液体懸濁液状態で投与した場合ほど利益が観察されなかった。例示した態様は本発明の一つの形態を説明することを意図したものであり、本発明の範囲はこれに限定されることはない。実際、本明細書に示し、記載したものに加えて本発明の種々の改変はこれまでの記載と添付の図面から当業者に明らかであろう。そのような改変は添付の請求の範囲の範囲内にあることを意図するものである。本明細書中で引用した全ての刊行物は引用によりその全体を本明細書の一部とする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｋ 37/24 43/00 １１１ 37/66 Ｇ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】 1．哺乳動物の中枢神経系（CNS）における軸索の再生を促進する方法であって、（a）同種単核貪食細胞を、損傷または疾患部位またはその近傍のCNSに投与すること、ならびに（b）少なくとも１種の抗炎症剤を哺乳動物に投与することを含む、前記方法。 2．哺乳動物の中枢神経系（CNS）における軸索の再生を促進する方法であって、（a）同種単核貪食細胞を、損傷または疾患部位またはその近傍のCNSに投与すること、および（b）下記のアジュバント因子：酸性繊維芽細胞増殖因子（aFGF）、トランスフォーミング増殖因子β（TGF-β)、インターロイキン６（IL-6）、神経成長因子（NGF）、神経栄養因子３（NT-3）、神経栄養因子４（NT-4）、神経栄養因子５（NT-5）及び脳由来神経栄養因子（BDNF）の少なくとも１種をCNSに投与することを含む、前記方法。 3．工程(b)がCNSへの酸性繊維芽細胞増殖因子（aFGF）の投与を含む、請求項２に記載の方法。 4．前記aFGFが損傷または疾患部位またはその近傍に投与される、請求項３に記載の方法。 5．少なくとも1種の抗炎症剤を哺乳動物に投与することをさらに含む、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。 6．前記抗炎症剤がステロイド、非ステロイド性抗炎症剤（NSAID）、またはトリペプチドThr-Lys-Proである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。 7．前記同種単核貪食細胞が、刺激された同種単核貪食細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 8．前記刺激された同種単核貪食細胞が、同種単核貪食細胞を皮膚とともにまたは皮膚でコンディショニングした培地とともに培養することにより産生されたものである、請求項７に記載の方法。 9．前記皮膚が自己皮膚である、請求項８に記載の方法。 10．前記刺激された同種単核貪食細胞が、同種単核貪食細胞を、少なくとも１種の神経セグメントとともにまたは少なくとも１種の神経セグメントでコンディショニングした培地とともに培養することにより産生されたものである、請求項７に記載の方法。 11．前記神経セグメントが末梢神経のセグメントである、請求項10に記載の方法。 12．前記神経セグメントが、同種末梢神経のセグメントである、請求項11に記載の方法。 13．前記刺激された同種単核貪食細胞が、同種単核貪食細胞を、β−インターフェロン（IFN-β）、γ−インターフェロン（IFN-γ）、腫瘍壊死因子α（TNF-α ）、インターロイキン２（IL-2）、インターロイキン３（IL-3）、インターロイキン４（IL-4）、インターロイキン10（IL-10）、単球走化性因子（MCAF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、コロニー刺激因子１（CSF-1）、神経栄養因子３（NT-3）、神経成長因子（NGF）、脳由来神経栄養因子（BDNF）、脂質Ａ、トリペプチドfMe t-Leu-Phe、ムラミルジペプチド（MDP）、イオノホアA23187、またはビタミンD3 結合タンパク質を加えた培地中で培養することによって産生されたものである、請求項７に記載の方法。 14．前記刺激された同種単核貪食細胞が、同種単核貪食細胞をIL-4、IL-10、またはIL-4およびIL-10の両方を加えた培地中で培養することにより産生されたものである、請求項13に記載の方法。 15．動物の中枢神経系（CNS）における軸索再生を促進する方法であって、 β−インターフェロン（IFN-β）、γ−インターフェロン（IFN-γ）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターロイキン２（IL-2）、インターロイキン３（IL-3 ）、インターロイキン４（IL-4）、インターロイキン10（IL-10）、単球走化性因子（MCAF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、コロニー刺激因子１（CSF-1）、脂質Ａ、トリペプチドfMet-Leu-Phe、ムラミルジペプチド（MDP）、イオノホアA23187、またはビタミンD3結合タンパク質を加えた培地中で培養した同種単核貪食細胞を、損傷または疾患部位またはその近傍のCNSに投与することを含む、前記方法。 16．前記同種単核貪食細胞が自己単核貪食細胞である、請求項１〜15のいずれか１項に記載の方法。 17．前記単核貪食細胞が単球である、請求項１〜16のいずれか１項に記載の方法。 18．前記単核貪食細胞がマクロファージである、請求項１〜16のいずれか１項に記載の方法。 19．前記単核貪食細胞が、漿膜腔から得られたマクロファージ、肺胞マクロファージ、肝臓、脾臓もしくは胸腺から得られたマクロファージ、または骨髄もしくは血液から得られたマクロファージ前駆体を培養することにより誘導されたマクロファージである、請求項18に記載の方法。 20．前記単核貪食細胞が、小神経膠細胞ではなく、脳由来混合神経膠細胞から培養により誘導されたものでもない、請求項１〜16のいずれか１項に記載の方法。 21．前記単核貪食細胞が樹状細胞である、請求項１〜16のいずれか１項に記載の方法。 22．前記哺乳動物がヒトである、請求項１〜21のいずれか１項に記載の方法。 23．前記同種単核貪食細胞が脊髄に投与される、請求項１〜22のいずれか１項に記載の方法。 24．（a）医薬上許容される担体；ならびに（b）β−インターフェロン（IFN-β）、γ−インターフェロン（IFN-γ）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターロイキン２（IL-2）、インターロイキン３（IL-3）、インターロイキン４（IL-4）、単球走化性因子（MCAF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（G M-CSF）、コロニー刺激因子１（CSF-1）、脂質Ａ、トリペプチドfMet-Leu-Phe、ムラミルジペプチド（MDP）、イオノホアA23187、またはビタミンD3結合タンパク質を加えた培地中で培養した哺乳動物単核貪食細胞を含む、哺乳動物に投与するための医薬組成物。 25．前記哺乳動物単核貪食細胞がヒト単核貪食細胞である、請求項24に記載の医薬組成物。 26．前記単核貪食細胞が単球である、請求項24または25に記載の医薬組成物。 27．前記単核貪食細胞がマクロファージである、請求項24または25に記載の医薬組成物。 28．前記単核貪食細胞が樹状細胞である、請求項24または25に記載の医薬組成物。 29．前記哺乳動物単核貪食細胞が、ヒト単球、マクロファージまたは樹状細胞である、請求項24〜28のいずれか１項に記載の医薬組成物。 30．哺乳動物の中枢神経系（CNS）において軸索再生を促進するための、請求項2 4〜29のいずれか１項に記載の医薬組成物。 31．損傷または疾患部位またはその近傍のCNSに投与するための、請求項30に記載の医薬組成物。 32．（a）単核貪食細胞を、少なくとも１種の組織もしくは少なくとも１種の細胞型とともに、または少なくとも１種の生物活性物質を加えた培地とともに培養すること、ならびに（b）培養工程後、前記単核貪食細胞の酸化窒素産生量または貪食活性と酸化窒素産生量との両方を測定することを含む、刺激活性の検出方法。 33．（a）単核貪食細胞の第１の調製物を、少なくとも１種の組織もしくは少なくとも１種の細胞型とともに、または少なくとも１種の組織もしくは少なくとも１種の細胞型でコンディショニングした培地とともに、または少なくとも１種の生物活性物質を加えた培地とともに培養すること、（b）培養工程後、単核貪食細胞の前記第１の調製物の酸化窒素産生量または貪食活性と酸化窒素産生量との両方を測定することにより、刺激性組織、刺激性細胞型または刺激性生物活性物質を同定すること、ならびに（c）単核貪食細胞の第２の調製物を、前記刺激性組織もしくは刺激性細胞型とともに、前記刺激性組織もしくは刺激性細胞型でコンディショニングした培地とともに、または前記刺激性生物活性物質を加えた培地とともに培養することを含む、刺激された単核貪食細胞の調製方法。 34．請求項33に記載の方法により産生された、刺激された単核貪食細胞の調製物。 35．哺乳動物の中枢神経系（CNS）における軸索再生を促進する方法であって、（a）同種単核貪食細胞の第１の調製物を、少なくとも１種の組織もしくは少なくとも１種の細胞型とともに、または少なくとも１種の組織もしくは少なくとも１種の細胞型でコンディショニングした培地とともに、または少なくとも１種の生物活性物質を加えた培地とともに培養すること、（b）培養工程後、同種単核貪食細胞の前記第１の調製物の酸化窒素産生量または貪食活性と酸化窒素産生量との両方を測定することにより、刺激性組織、刺激性細胞型または刺激性生物活性物質を同定すること、（c）同種単核貪食細胞の第２の調製物を、前記刺激性組織もしくは刺激性細胞型とともに、前記刺激性組織もしくは刺激性細胞型でコンディショニングした培地とともに、または前記刺激性生物活性物質を加えた培地とともに培養することにより、刺激された単核貪食細胞の調製物を産生すること、ならびに（d）前記刺激された単核貪食細胞の調製物の少なくとも一部を、損傷または疾患部位またはその近傍のCNSに投与することを含む、前記方法。