JP2001512482A - レプチン受容体リガンドの拍動性送達 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は，このような処置を必要とする哺乳動物にレプチン受容体リガンドを投与する至適方法を提供する．さらに詳しくは本発明はこのような処置を必要とする哺乳動物にレプチン受容体リガンドを送達する改良方法において，肥満症，高グルココルチコイド血症，妊孕性もしくは思春期遅延症，または成長ホルモン欠損症の処置のためにレプチン受容体リガンドを拍動送達またはピーク送達することからなる方法を提供する．

Description

【発明の詳細な説明】 レプチン受容体リガンドの拍動性送達 発明の背景 １．発明の分野 本発明は一般に，そのような処置を必要とする哺乳動物への，レプチン受容体 リガンドの投与を至適化する方法に関する．さらに詳しくは，本発明は肥満症， および高グルココルチコイド血症（hyper glucocorticoidemia），妊孕性もしく は思春期遅発症および／または成長ホルモン欠乏を包含する関連状態を処置する ため，レプチン受容体リガンドを拍動性またはピーク送達することからなる，そ のような処置を必要とする哺乳動物へのレプチン受容体リガンドの送達の改良方 法に関する． ２．関連技術の説明 痩身または肥満患者のいずれかにおいて，レプチンレベルにほぼ深夜から早朝 時間にかけてピークをもつ日周リズム（diurnal rhythm）が証明された．最近， レプチンレベルに約32パルス／24時間周期の拍動性が存在することが報告されて いる（Licino Jら，Periodicity and pulsatility of circulating leptin leve ls in men．1996,投稿中）．この拍動性は，その調和の機構は不明ではあるが， 脂肪組織の貯蔵部において，ある種の調和を受けたレプチンの合成と放出がある ことを示唆するものである．長期間の過食によってレプチンが増加すると，脂肪 の保存に変化を起こすことがある（Kolaczynski，JWら，Response of leptin to short term and prolonged overfeeding in humans．J Clin Endo Metab 1996 ，投稿中）．その結果として，レプチンのレベルは数種の重複した生物学的リズ ムによって変化する．これらのバイオリズムは，他のホルモンたとえばＬＨＲＨ と同様，至適レプチン作用の鍵となるものと考えられ，この場合，連続的な刺激 は拍動性刺激に対して逆の作用を生じる． 受容体アゴニストの高レベルの慢性投与は脱感作を導くことができるので，レ プチンに対する抵抗性は慢性高レプチン血症により徐々に発生させることが可能 である．発明の概要 したがって本発明の主要な目的は，肥満症および高グルココルチコイド血症， 妊孕性もしくは思春期遅発症または成長ホルモン欠乏を処置するため，レプチン 受容体リガンドを拍動性またはピーク送達することからなる，そのような処置を 必要とする哺乳動物への，レプチン受容体リガンドの送達の改良方法を提供する ことにある． さらに詳しくは，本発明はレプチンの放出の正常な日周リズムのピークに一致 させるため，レプチン投与のピークのタイミングをとることからなる改良された レプチン療法を提供する．本発明はまた，ほぼ生理学的頻度でのレプチンの拍動 性投与からなるレプチン療法の改良方法を提供する． 以下に明らかにされる本発明の上述のおよび他の目的，利点および特徴ととも に，本発明の本質は，以下の発明の好ましい実施態様の詳細な説明，および添付 された請求の範囲を参考にすればより明確に理解できるものと確信する． 発明の好ましい実施態様の詳細な説明 本発明は，レプチン療法の従来利用されていた方法を改良しようという本発明 者らの希望によって生じたものである．さらに詳しくは，本発明者らは，肥満症 および関連疾患の改良された処置，とくにそのような処置を必要とする哺乳動物 に，レプチン抵抗性の発生を防止または阻害する処置を提供することを追求した ものである． 血漿レプチンレベルはヒトではほぼ真夜中に近い夜間にピークに達し，１時間 未満の頻度の拍動性を示すことから，至適なレプチンの送達はほぼそれとタイミ ングの合った投与を要求する．すなわち，レプチンまたはレプチン類似体の正常 な真夜中のピークにおいて，正常な生理学的状態で見出されるのと類似の頻度で の拍動性送達による投与は，肥満症の処置に至適な効果を生じる． 本発明者らは，レプチン受容体リガンド，とくにレプチン受容体アゴニストの タイミングのよいおよび／または拍動性投与は，レプチン受容体リガンドの従来 の投与方法に代えて有利に使用できることを見出したのである．ヒトでは，血漿 レプチンレベルは夜間，ほぼ真夜中にピークに達し，１時間未満の頻度の拍動性 を示すので，至適なレプチン送達はそれにほぼタイミングの合った投与を要求す る．すなわち，レプチンまたはレプチン類似体の正常な真夜中のピーク時におけ る正常な生理学的状態で見出されるのと類似の頻度での拍動性送達による投与は 肥満症の処置に至適な効果を生じる． 本明細書に用いられる「受容体リガンド」，「受容体アゴニスト」および「受 容体アンタゴニスト」の語は，薬理学的に活性な化合物およびその塩を意味する ものと理解すべきである．本発明における使用が好ましいレプチン受容体アゴニ ストには，内因性レプチン（すなわち，内因性ＯＢタンパク質−肥満遺伝子から イントロンの転写および翻訳ならびに欠失後に，たとえば成熟タンパク質のＮ- 末端バリン-プロリンからＣ末端システインまでが除去された分泌シグナルペプ チドをもつ成熟タンパク質へのタンパク質翻訳およびプロセッシングにより生じ たタンパク質）を包含する．マウスＯＢタンパク質およびヒトＯＢタンパク質は Zhangら，Nature 372:425-432，1994に報告されている．ラットＯＢタンパク質 はMurakamiら，Biochem Biophys Res Com 209:994-995，1995に報告されている ．ブタおよびウシＯＢ遺伝子およびタンパク質は，ＥＰ0 743 321に開示されて いる．これらの内容は引用により本明細書に導入される．各種霊長類のＯＢ遺伝 子およびタンパク質は米国特許出願一連番号08/710,483号に開示されている（こ の内容は引用により本明細書に導入される）．レプチン同族体も本発明における 使用に好ましく，１もしくは２以上のアミノ酸置換を有するレプチン類縁体が好 ましく，５個未満のアミノ酸置換がさらに好ましく，３個未満の置換が最も好ま しい．本発明に用いられるとくに好ましいレプチン類縁体はBasinskiらによりＷ Ｏ96/23515およびＷＯ96/23517（これらの内容は引用により本明細書に導入され る）に開示された式（１）：（式中，位置28におけるXaaはGlnであるか存在しない． 上記タンパク質は以下の少なくとも１種の置換を有する： 位置４におけるGlnはGluに置換され， 位置７におけるGlnはGluに置換され， 位置22におけるAsnはGlnまたはAspに置換され， 位置27におけるThrはAlaに置換され， 位置28におけるXaaはGluに置換され， 位置34におけるGlnはGluに置換され， 位置54におけるMetはメチオニンスルホキシド，Leu，Ile，Val，AlaまたはGly に置換され， 位置56におけるGlnはGluに置換され， 位置62におけるGlnはGluに置換され， 位置63におけるGlnはGluに置換され， 位置68におけるMetはメチオニンスルホキシド，Leu，Ile，Val，AlaまたはGly に置換され， 位置72におけるAsnはGln，GluまたはAspに置換され， 位置75におけるGlnはGluに置換され， 位置77におけるSerはAlaに置換され， 位置78におけるAsnはGlnまたはAspに置換され， 位置82におけるAsnはGlnまたはAspに置換され， 位置97におけるHisはGln，Asn，Ala，Gly，SerまたはProに置換され， 位置100におけるTrpはAla，Glu，Asp，Asn，Met，Ile，Phe，Tyr，Ser，Thr， Gly，Gln，ValまたはLeuに置換され， 位置101におけるAlaはSer，Asn，Gly，His，Pro，ThrまたはValに置換され， 位置102におけるSerはArgに置換され， 位置103におけるGlyはAlaに置換され， 位置105におけるGluはGlnに置換され， 位置106におけるThrはLysまたはSerに置換され， 位置107におけるLeuはProに置換され， 位置108におけるAspはGluに置換され， 位置111におけるGlyはAspに置換され， 位置118におけるGlyはLeuに置換され， 位置130におけるGlnはGluに置換され， 位置134におけるGlnはGluに置換され， 位置136におけるMetはメチオニンスルホキシド，Leu，Ile，Val，AlaまたはGl yに置換され， 位置138におけるTrpはAla，Glu，Asp，Asn，Met，Ile，Phe，Tyr，Ser，Thr， Gly，Gln，ValまたはLeuに置換され，または 位置139におけるGlnはGluに置換される）で表されるタンパク質，またはその 医薬的に許容される塩が包含される． さらに，本発明において使用される化合物は官能基で場合により置換されてい てもよい．その化合物のレプチン受容体に結合する能力を消失させないかまたは 有意に低下させない本技術分野で認められた任意の官能基が意図され，それらに より限定されるものではないが，エステル，アミド，酸，アミン，アルコール， エーテル，チオエーテル等が包含される．化合物の溶媒和化合物，たとえば水和 物も本発明の方法に有用であり，本発明の範囲内に包含される．このような溶媒 和化合物を製造する溶媒和の方法は一般的に本技術分野で周知の通りである． 各種経路による投与に適したレプチン受容体アゴニストおよびアンタゴニスト の医薬的に許容される塩は本技術分野において周知であり，ここに詳細を述べる 必要はないものと考える．本発明による化合物およびそれらの誘導体の医薬的に 許容される塩の例にはたとえば適当な塩基から誘導される塩基塩が包含される． 酸基またはアミノ基の医薬的に許容される塩には，それらに限定されるものでは ないが，有機カルボン酸，たとえば酢酸，乳酸，酒石酸，リンゴ酸，イソチオン 酸およびラクトビオン酸；有機スルホン酸たとえばメタンスルホン酸，エタンス ルホン酸，ベンゼンスルホン酸およびp−トルエンスルホン酸；無機酸たとえば 塩酸，硫酸，リン酸およびスルファミン酸の塩が包含される．ヒドロキシ基をも つ化合物の医薬的に許容される塩は，それらに限定されるものではないが，化合 物の陰イオンと適当な陽イオンたとえばNa⁺との組合せがある． 本発明のさらに他の実施態様は，そのような処置を必要とする哺乳動物への， 内因性レプチンに対する抗体のピークまたは拍動性投与による内因性レプチンの 作用の阻害方法からなる．このような抗体はレプチン受容体アゴニストに対する モノクローナルもしくはポリクローナル抗体またはそれらの抗原性部分である． レプチン受容体アンタゴニストに対するポリクローナルおよびモノクローナル 抗体は，純粋なレプチン受容体アゴニスト，精製組換えレプチン受容体アゴニス ト，これらのタンパク質のフラグメント，またはレプチン受容体アゴニストの他 のタンパク質との精製融合タンパク質による動物の免疫処置によって得られる． モノクローナル抗体の場合は部分精製タンパク質またはフラグメントも免疫原と して有効である．両種類の抗体を得る方法は本技術分野において周知であり，抗 体生成の優れたプロトコールがHarlowら，Antibodies:A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，726 pp.，1988に知 られている． ポリクローナル血清は適当な実験動物に有効量の精製レプチン受容体アゴニス トまたはその部分を注射し，動物から血清を収集し，任意の既知の免疫吸着法で 特異的血清を単離することによって，比較的容易に製造される．モノクローナル 抗体は，それらが大量に高度の均一性をもって製造できるので，とくに有用であ る．モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系は，不死化細胞系を免 疫原性プレパレーションに対して感作したリンパ球と本技術分野の熟練者には周 知の方法により融合させて製造される（たとえば，Douilland IY & HoffmanT”B asic Facts About Hybridomas”in Compendium of Immunology，vol．II，L.Sch wartz(Ed.)，1981;Kohler G & Milstein C，Nature 256:495-497，1975；Europe an Journal of Immunology 6:511-519，1976;Harlowら；Koprowskiら，米国特許 第4,172,124号，Koprowskiら，米国特許第4,196,265号およびWands，米国特許第 4,271,145号参照）．これらの教示は，引用により本明細書に導入される． 本発明のさらに他の部分は，上述のレプチン受容体アゴニストまたはアンタゴ ニスト少なくとも１種，それらの混合物および／または医薬的に許容されるその 担体からなる，ピークまたは拍動性投与に適当な医薬組成物である．このような 組成物は，医薬的に許容される操作によりたとえばRmington's PharmaceuticalS ciences，17th edition，ed．Alfonso R Gennaro，Mack Publishing Company，E aston，PA，1985に記載されたようにして製造される． 本発明の方法における治療的使用のためには，レプチン受容体アゴニストもし くはアンタゴニストまたはその塩は，１種またはそれ以上のレプチン受容体アゴ ニストもしくはアンタゴニストまたはその塩と，その医薬的に許容される担体を 含有する医薬組成物の形態で慣用的に投与することができる．適当な担体は，本 技術分野において周知であり，医薬組成物の所望の投与形態および様式によって 変動する．たとえば，それらには希釈剤または賦形剤たとえば充填剤，結合剤， 湿潤剤，崩壊剤，界面活性剤，滑沢剤等が包含される．通常，担体は固体，液体 もしくは蒸発可能な担体，またはそれらの組合せである．一つの好ましい実施態 様においては，組成物は治療用組成物であり，担体は医薬的に許容される担体で ある． 本発明の方法に使用される化合物は，担体とともに所望の単位剤形に処方する ことができる．通常の単位剤形には，錠剤，丸剤，散剤，溶液剤，懸濁剤，乳化 剤，顆粒剤，カプセル剤，坐剤が包含され，注射用溶液および懸濁液がとくに好 ましい． それぞれの担体は，処方中の他の成分と適合性であり，患者に対して有害でな いという意味において「許容性」でなければならない．担体は生物学的に許容さ れかつ不活性でなければならず，すなわちそれは，本発明の化合物がその阻害活 性を発揮できるように細胞がその代謝性反応を行うことを許すものでなければな らない． 処方には，経口，経直腸，経鼻，局所（経頬および舌下を含む），経膣および 非経口（皮下，筋肉内，静脈内，皮内および経皮を含む）投与に適当な処方を包 含し，局所用軟膏処方および経日投与に適当な処方が好ましい． レプチン受容体リガンドのタイミングの合ったピーク送達のためには，ピーク 作用を送達できるデバイスたとえばペン，シリンジ，肺または早期作用経口送達 システムが好ましい．レプチン受容体リガンドの拍動性送達には，拍動の送達が 可能なデバイスたとえばポンプ，操作細胞系，長時間放出経口または肺投与処方 が好ましい． たとえば注射に適当な製剤の調製には，溶液および懸濁液を滅菌し，好ましく は血液と等張性にする．注射可能な製剤の調製には，この分野で慣用される担体 たとえば水，エチルアルコール，プロピレングルコール，エトキシル化イソステ アリルアルコール，ポリオキシル化イソステアリルアルコール，ポリオキシエチ レンソルビトールおよびソルビテートエステルを使用することもできる．これら の場合，適当量の等張性調整剤，たとえば食塩，グルコースまたはグリセリンを 製剤を等張性にするため添加することができる．水性滅菌注射溶液にはさらに， 抗酸化剤，緩衝剤，静菌剤および非経口製剤に適当な類似の添加物を含有させる ことができる． 組成物は単位剤形として提供するのが便利であり，製薬技術において周知な任 意の方法によって調製できる．このような方法は活性成分を１種または２種以上 の補助成分を包む担体と混合する工程を包含する．一般的に，組成物は活性成分 を液体担体もしくは微分化固体またはその両者と均一かつ緊密に混合し，ついで 必要に応じてそれを製品の形状とすることによって調製される．様々な単位用量 および多重用量容器，たとえば密閉アンプルおよびバイアルを本技術分野で周知 のように使用することができる． とくに挙げた成分のほかに，本発明の組成物には，この種類の医薬製剤に本技 術分野で慣用される他の物質を含有させることができる． 本発明に使用される化合物は広範な割合の担体中に存在させることができる． たとえば，化合物は0.01〜99.9重量％の量，さらに好ましくは0.1〜99重量％の 量で存在させることができる．さらに好ましくは，化合物は組成物の約１〜70重 量％の量で存在させることができる． 本発明によって患者に投与されるレプチン受容体アゴニストもしくはアンタゴ ニスト，その医薬的に許容される塩またはその混合物の投与量は，数種の因子に より，それらに限定されるものではないが，たとえば患者の年齢，体重および種 類，患者の一般的健康状態，症状の重症度，組成物が単独でまたは他の治療剤と の組合せで投与されるか，副作用の発現頻度等によって変動することになる． 一般に本発明の方法の適用に適した用量は１日あたり約0.001〜100mg/kg体重/ 用量，好ましくは約0.01〜60mg/kg体重/用量，さらに好ましくは約0.1〜40mg/kg 体重/用量である．所望の用量は１日を通して１〜６回またはそれ以上のサブ用 量で適当な間隔を置いて投与することができる．本発明の化合物は月ないし年の 期間にわたり反復して投与可能であり，またそれは患者に徐々に注入することが できる．より高用量または低用量を投与することもできる． １日投与量は，たとえば上述の各種パラメーターを考慮して調整することがで きる．通常本発明の組成物は約0.001〜100mg/kg体重/日の量で投与される．しか しながら，他の量も投与することができる． 良好な血漿濃度を達成するためには，活性化合物はたとえば，至適には，活性 成分の約0.1〜1％食塩水溶液が静脈内注射されるか，または丸剤として，経口投 与される． 治療のためには，活性成分は任意の適当な経路で，たとえば局所的，経口的， 経直腸的，経鼻的，経膣的および非経口的（腹腔内，皮下，筋肉内，静脈内，皮 内，および経皮を包含する）経路で投与される．好ましい経路は，患者の状態お よび年齢，疾患の本質および他の治療薬剤を含めて選択された活性成分によって 変動することを理解すべきである．好ましいのは経口経路である．同じく非経口 経路も好ましい．しかしながら，患者の状態，および処置をどのくらい長く継続 するかによって他の経路も利用できる． 活性成分を単独で投与することも可能であるが，それは医薬製剤として提供す ることが好ましい．本発明の製剤は，上述のように少なくとも１種の活性成分と その１種または２種以上の許容される担体，および所望により他の治療剤とから なる． 上述の方法は，本発明の化合物をそれ自体単独で，または他の活性成分と組合 せて，医薬組成物中に他の治療剤を包含させて投与することにより実行できる． この場合使用に適当な他の治療剤としては，意図された目的で同一のもしくは異 なる機構によって効果のある任意の適合性薬剤，または本薬剤の作用を補充する 薬剤とすることができる．これらには，ヒトにおける肥満症および／または関連 疾患の処置に有効な薬剤が包含される． 併用療法に使用できる化合物は，同時に別個のもしくは併用製剤として投与さ れるか，または本発明の化合物とは異なる時間にたとえば併用効果が達成される ように連続して投与される．投与の量および基準は，好ましくは最初はそれらの 標準用量より低く始め，次に得られた結果を考慮して担当医により調整される． 本発明の治療方法は，本発明の治療方法は，担当医の決定に従い他の治療と同時 に使用できる． 以上，本発明を一般的に説明したが，ある種の特異的実施例を参照すれば，本 発明の理解はよりよくなるものと考えられる．実施例は例示の目的のみで本明細 書に包含されるものであり，とくにその旨特定されない限り，本発明またはその 実施態様を制限する意図ではない． 実施例１：ヒトにおけるレプチン分泌の超概日性振動（ultradianoscillation s） 本実験においては，ヒトにおける約４時間の頻度でのレプチンの分泌パターン を明らかにする． 材料および方法 ヒト対象 計36名のヒト対象を本研究に参加させた．肥満は国際健康コンセンサス部門の パネルに従い，男性についてはボディーマス指数（ＢＭＩ）＞27.3kg/m²，女性 については＞27.8kg/m²と定義した（Ann Intern Med 103:1073-77，1995）．糖 尿病は国際データグループに従い，経口耐糖能試験により分類した（Diabetes23 :1039-1056，1979）．すべての患者は，肥満，糖尿病および軽度の高血圧症以外 に他の疾患はなかった．糖尿病患者を除いては積極的な体重減量プログラムを行 っている者はなく，また，炭水化物代謝を変化させることが知られた薬剤は服用 していない．この研究には２つのプロトコールを使用した． 第一のプロトコールの実験設計 このプロトコール６例の痩身者，11例の肥満者および５例の肥満糖尿病患者を 包含する．一夜絶食後，患者は臨床研究ユニットにＡＭ 7:00に入院させた．内 在性IVカテーテルを留置した．絶食時血液サンプルをＡＭ 8:00（０時間）に採 取し，以後血液サンプルを30分（食事直後），60分（食間），または120分（睡 眠時）に翌日のＡＭ 7:30まで採取した．各患者はＡＭ 8:00に朝食，ＰＭ 12:00 に昼食，ＰＭ 5:00にタ食，およびＰＭ 3:00に軽食を摂った．各患者には50%炭 水化物，35％脂肪および15％タンパク質からなる等カロリーの食餌を与えた．食 餌の炭水化物部分には複雑な炭水化物と単純な糖が包含された．１日に消費され た総カロリーは20％が朝食，30％が昼食，40％がタ食，10％が軽食に分配された ．患者はＰＭ 10:30に就寝し，深夜はテレビセットは消した．血液サンプルから 血清を分離し，インスリン，グルコースおよびレプチンレベルのアッセイまで− 80℃に凍結保存した．この試験において，このプロトコールで発生したデータを 用いて，本発明者らは前に，痩身者，肥満者および非インスリン依存性糖尿病で のレプチン分泌の夜間の上昇を報告した（Sinha MKら，J Clin Invest 97:1344- 1347，1996）． 第二のプロトコールの実験設計 計10名の正常健康者（ＢＭＩ：35.87±2.00kg/m²）を臨床研究ユニットに入院 させた．一夜絶食させたのち，静脈サンプルカテーテルを一方の手の背面静脈に 導入し，もう一つのカテーテルを逆の手に導入した．サンプルカテーテルを導入 した手は，静脈サンプルの動脈血化を保証するために加温毛布内に維持した．被 検者は試験の間を通じて横臥状態のままにした．食事はさせなかったが，水の摂 取は自由にした．０時間絶食血液サンプルをＡＭ 8:00に採取したのち，振動グ ルコース注入を開始し，以後血液サンプルを15分毎に12時間にわたって採取した ．血漿を分離し，インスリン，グルコースおよびレプチンレベルのアッセイまで −80℃に凍結保存した．振動グルコース注入のインスリン分泌に対する結果は以 前に報告されている（Byrne MMら，Am J Physiol 270:E572-579，1996）． アッセイ 血清レプチンレベルは，以前に記載されたように（Sinha MKら，前出）ラジオ イムノアッセイによって測定した．組換えヒトｏｂタンパク質（ＲＨレプチン） を用い，標準，放射性標識リガンドおよび抗体産生の原料として大腸菌発現系に おいて合成し均一に精製した（Stephens TWら，Nature 377:530-532，1995）． 組換えヒトレプチンを¹²⁵ヨウ素でBolton-Hunter法（Bolton AF & Hunter WM,Bi ochem J 133:529-532，1973）により標識し，ついでSephdex G-25カラム上ゲル ろ過に付した．100μｌの血清または組換えヒトレプチン（ｒｈレプチン，標準0 〜100ng/ml）を1.0％Triton Ｘ-100，0.1％ＢＳＡおよび0.01％ナトリウムアジ ド含有50ｍＭリン酸緩衝食塩溶液，ｐＨ7.4中，抗-ｒｈレプチンウサギ血清（1: 8000希釈）と最終容量400μｌにおいて４℃で16時間インキュベートした．つい で¹²⁵Ｉ-ｒｈレプチン（約30,000cpm；約30μCi/μｇ比活性）を４℃で24時間加 えた．ついで結合したレプチンを100μｌのヒツジ抗-ウサギＩｇＧ血清（1:1希 釈；Antibodies Inc.，Davis，CA），100μｌの正常ウサギ血清（1:50希釈：Gib co BRL，Gaithersburg，MD）および100μｌの10％ポチエチレングルコール（Ｐ ＥＧ 8000，Fisher Scientific Co.）で免疫沈降させた．22℃で20分インキュベ ートしたのち，１mlのアッセイ緩衝液を加え，試験管を20分間，3400 rpmで遠心 分離し，ペレットをPackard 5000ガンマカウンター中でカウントした．アッセイ 条件を至適化するためには，レプチン標準曲 線を痩身者対象からの活性炭ストリップ血清により構築した．５％濃度（w/v） の活性炭（Ｃ-5260;Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO）は，血清と４℃で16時 間インキュベートした場合，内因性レプチンは効果的に除去された．血清レプチ ン濃度は非加重４パラメーターのロジスティックモデルを用いて計算された．本 発明のラジオイムノアッセイの特徴は以下の通りであった：（ａ）アッセイ内変 動係数（ＣＶ）：5.2ng/mlにおいて8.93（ｎ＝12），17.8ng/mlにおいて3.31（ ｎ＝13），31.7ng/mlにおいて4.29（ｎ＝13），47.1ng/mlにおいて5.78（ｎ＝24 ）；（ｂ）アッセイ間ＣＶ：3.31ng/mlにおいて15.9（ｎ＝7），12.7ng/mlにお いて7.4（ｎ＝8），ＥＤ₅₀2.84±0.18（ｎ＝8），ＥＤ₅₀8.02±0.41（ｎ＝8）お よびＥＤ₆₀23.75±2.85（ｎ＝8）ならびに検出限界0.39ng/ml（ｎ＝8）．用量反 応曲線は1.56〜50ng/ml濃度で直線性を示した．同一患者からの血清サンプルは すべて，同じ遠心分離工程を含む同一のアッセイで三重に測定した．高レプチン レベルを有する患者ではすべての血清サンプルを50μｌサンプルを用い，すなわ ち1/2希釈でアッセイした．インスリンレベルは二重抗体ラジオイムノアッセイ により測定し（Morgan CR & Lazarow A，Diabetes 12:115-116，1963），血漿グ ルコースレベルはグルコースアナライザー（Yellow Spring Instrument Co.，Ye llow Spring，OH）で測定した． 超概日振動分析 有意なピークを同定するためには，各レプチンプロファイルを拍動検出のため のコンピュータープログラム，Ultra（Sturis Jら，Am Physiol 260:E801-809,1 991）に付した．そのアルゴリスムの一般的原理は上昇または低下が測定エラー に関連するある閾値を越えないように血漿濃度におけるピークをすべて除去する ことである．拍動検出の閾値は変動係数（ＣＶ）の２倍の保存値にセットした． 本発明者らは各プロファイルに中間ＣＶを用いた．各プロファイルについて拍動 検出の閾値は2(ＣＶ)/∫２であった．絶対ピーク振幅は前の谷の差として評価し た．相対ピーク振幅は絶対ピーク振幅を前の谷の値によって除した値として定義 した． クロス-相関分析 すべてのグルコースおよびレプチンプロファイルについて線型トレンドを除去 した．グルコースおよびレプチンプロファイルの各対について，ついで，総クロ ス-相関をグルコースおよびレプチン間で０，±15，±30等，±150までの位相の ずれで計算した．異なる試験からのクロス-相関プロファイルをFisherのＺ値を 用いてプールした．この操作はクロス-相関の最大係数ならびにそれが起こると 計算される位相のずれを可能にした． 統計分析 結果はすべて平均±ＳＥＭで表す．統計的有意はマッキントッシュコンピュー ター上Statviewプログラムを用いる単純な回帰分析によって決定した． 結果 第一のプロトコール 第一のプロトコールにおいては，本発明者らは６名の痩身者，11名の肥満者， および５名の肥満ＮＩＤＤＭ対象からの血液サンプルを彼らの正常な日常のルー チン時に採取した．血液サンプリングの頻度は，食事直後の30分と夜間の２時間 間隔を除いて１時間間隔とした．表１には，レクチンレベルは検出されなかった ２例の痩身者を除き，すべてのレプチン分泌の拍動性パターンのデータをまとめ る．20名のＮＩＤＤＭをもつまたはもたない痩身もしくは肥満対象からの24時間 レプチンプロファイルをULTRAを用いて拍動分析に付すと，24時間の間に１〜７ の振動が検出された．振動の平均数は24時間に3.25±0.36（平均±ＳＥＭ）であ った．周期性は10.01±1.47時間であった．絶対平均振幅は11.26±2.06ng/ml， 相対平均振幅は0.52±0.06であった．期待されたように，試験された対象中のＢ ＭＩと絶食時（0800時）の循環レプチンレベルの間には正の相関（ｒ＝0.48，ｐ ＜0.05）が観察された．ＢＭＩおよびレプチンレベルも，拍動の平均絶対振幅（ ｒ＝0.44，ｐ＜0.05およびｒ＝0.96，ｐ＜0.01）と有意に相関した．しかしなが ら，これらの実験条件では，ＢＭＩと拍動数，拍動周期および相対振幅の間には いずれも有意な相関は認められなかった．20名のＮＩＤＤＭをもつまたはもたな い痩身もしくは肥満対象における循環レプチンレベルの24時間プロファイルから ，レプチンが振動様式で分泌されることが明らかである． 第二のプロトコール より低い頻度でサンプリングした24時間プロファイルから，レプチンの拍動性 分泌の指示があったので，本発明者らは，一夜絶食後に10例の正常肥満対象に与 えたグルコースの振動注入により，前に報告した試験からの15分毎に採取したサ ンプル中の血漿レプチンレベルをアッセイした．12時間にわたり15分間隔でサン プリングした10例の対象でのレプチンの分泌と拍動分析のデータを表２にまとめ る．第二のプロトコールに用いた10例の試験対象中，ＢＭＩと絶食血清レプチン レベルの間に有意な正の相関（ｒ＝0.71，ｐ＜0.025）が観察された．12時間に わたる15分間隔でのサンプリングプロトコールにおいて，２〜７回のレプチン拍 動が観察され，平均して4.20±0.59の振動数であった．これらの振動の周期は平 均3.44±0.49であった．平均絶対振幅および平均相対振幅はそれぞれ8.74±1.69 ng/mlおよび0.28±0.03ng/mlであった．12時間の周期の間の振動の数はＢＭＩ（ ｒ＝0.94，ｐ＜0.01）および絶食レプチンレベル（ｒ＝0.94，ｐ＜0.01）と有意 に相関した．さらに，振動の数は平均絶対振幅と正の相関を示した（ｒ＝0.85， ｐ＜0.005）．これらの結果は，これらの実験条件下にはすなわち振動グルコー ス注入時に15分間隔での血液サンプリングでは，ヒトにおける拍動性レプチン分 泌と一致するものである．図１には，代表的プロファイルとして，10名の対象中 ２名の概日振動を示す．グルコースとレプチンの振動の間のクロス-相関分析に よれば，位相のずれ＋45分（レプチン45分を招くグルコースに相当）でクロス- 相関の弱い係数を示した（ｒ＝0.21，ｐ＜0.05）．これは正常時に存在するが， これらの実験で増幅された概日グルコース振動は以後の循環レプチンレベルに直 接または間接的に影響することはできないことを示唆する． 考察 日周および／または超概日振動は，大部分の内分泌ホルモン，たとえば，視床 下部-下垂体系，グルコース調節，ステロイドホルモン，副甲状腺系およびレニ ン-アンギオテンシン系，ならびに神経伝達物質の必須な生理学的特徴である（V an Cauter E & Honicky E，Exp Brain Res 12(suppl.):41-60，1985）．最近， 本発明者らは，睡眠時の食欲抑制に関係すると思われるヒトでのレプチン分泌の 夜間の上昇を明らかにした（Sinha MKら，J Clin Invest 97:1344-1347，1996） ．本例では，本発明者らは，レプチンの日周リズムに加えて，ヒトにおけるレプ チン分泌の概日振動を証明する．至適な血液サンプリングプロトコール以 下でも，レプチンの拍動は24時間の期間内に検出された（拍動数：3.25±0.36， 平均相対振幅：0.52±0.06，ｎ＝20）．続いて，本発明者らは，一夜絶食後に振 動グルコース注入時の12時間にわたり15分間隔で得られた血液サンプルを使用し た（Byrne MMら，Am J Physiol 270:E572-579，1996）．15分間隔の血液サンプ リングプロトコールでは，ヒトにおけるレプチン分泌の拍動性本質について，よ り明瞭な証拠が明らかである．24時間の間のレプチン拍動数は4.2±0.59であり ，3.44±0.49の周期性および0.280±0.03の平均相対振幅を示した．ＢＭＩおよ び絶食時レプチンレベルは拍動数と正の相関を示し，拍動数と平均絶対振幅の間 にも正の相関が観察された．クロス-相関分析の結果は，レプチン分泌のある種 のグルコース調節が示唆される．しかしながら，本発明者らは以前に，24時間正 常ルーチンにおいてレプチン分泌に対して食事の影響はないことを証明した．食 事時間または循環インスリンもしくはグルコースレベルのいずれかとレプチンレ ベルには有意な相関はなかった（Sinha MKら，J Clin Invest 97:1344-1347，19 96）．異なる生理学的条件下には，多様なホルモンの概日振動は１〜４時間の範 囲にある（Sturis J，Am J Physiol 260:E801-809，1991；Van Cauter E，Exp B rain Res 12(suppl.):41-60，1985）．レプチン分泌の周期性は他の内分泌ホル モンについて先に報告し分泌に類似している．拍動性または振動性ホルモン放出 の振幅および／または振動数を修飾する多くの機構が同定されている（Van Caut er E，前出）．最も重要な修飾の一つには，末梢ホルモンのフィードバックによ る修飾および中枢神経系からのシグナルによる修飾が包含される．さらに，ホル モンの代謝回転，すなわち合成および分解速度もまた，ホルモン分泌の拍動性パ ターンに対して寄与する．拍動性分泌パターンについては，内分泌腺はペースメ ーカーとの類似性が示唆される（同）．調和様式によるフィードバック機構を介 し別々に再調整される他の内分泌腺とは異なり，多様なサイズおよび解剖学的位 置をもつ異なる脂肪貯蔵部のため，脂肪組織を内分泌腺と理解するのは現時点で は困難である（同）．他の内分泌腺と異なり，脂肪貯蔵部は単一の優先的な制御 機構の影響下にはない．循環レプチンレベルは，肥満度，多分総脂肪重量，絶食 ，食事，慢性高インスリン血症，高コルチゾール血症等により影響される（MacD ougald，OAら，Proc Natl Acad Sci（USA）92:9034-9037，1995; Considine RVら，New Eng J Med 334:292-295，1996;Maffei Mら，Nature Medic ine 1:1155-1161，1995;Kolaczynski JWら，Diabetes 43(Supp.1):Abstract）． しかしながら，概日振動の本発明者の本観察を説明できる循環レプチンレベルの 急性調整はまだ明らかではない．本観察は振動グルコース注入によって得られる が，１日の正常なルーチンと24時間時のグルコースおよび／またはインスリンな らびにレプチンレベルと食事摂取のの間に有意な相関は認められないことから， グルコース自体がもっぱら振動性レプチン分泌の原因とは考え難い（Sinha MKら ，J Clin Invest 97:1344-1347，1996）．本発明者らはまた，ヒトにおいて，グ ルコースはレプチンの独立の修飾物質ではないことを示した（Considine RVら， New Eng J Med 334:292-295，1996）． 以上，本発明を様々の材料，操作およよび例を参照しながら本明細書に説明し 例示したが，本発明は特定の材料，材料の組合せ，およびその目的のために選択 された操作に限定されるものではないことを理解すべきである．このような細部 の多くの変更を含むことが可能であり，それは本技術分野の熟練者によって理解 できる通りである．

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 5/24 Ａ６１Ｐ 5/42 5/42 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 カロ，ジョセ，エフ. アメリカ合衆国，インディアナ，カーメル ヘザーストーン プレース 12414

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. 以下のような処置を必要とする哺乳動物にレプチン受容体リガンドを送達 する改良方法において，肥満症，高グルココルチコイド血症，妊孕性もしくは思 春期遅延症または成長ホルモン欠損症の処置のために，レプチン受容体リガンド を拍動送達することからなる方法． 2. 以下のような処置を必要とする哺乳動物にレプチン受容体リガンドを送達 する改良方法において，肥満症，高グルココルチコイド血症，妊孕性もしくは思 春期遅延症または成長ホルモン欠損症の処置のために，レプチン受容体リガンド をピーク送達することからなる方法． 3. 受容体リガンド投与のピークを正常なレプチン放出の日周ピークに一致さ せる請求項２に記載の方法． 4. 哺乳動物はヒトでありさらにレプチン受容体リガンド投与のピークは、ほ ぼ深夜とする請求項３に記載の方法． 5. レプチン受容体リガンドの拍動送達はほぼ生理学的な頻度で行う請求項１ に記載の方法． 6. レプチン受容体リガンドは１日あたり１〜14拍動において投与される請求 項１に記載の方法． 7. レプチン受容体リガンドは１日あたり４〜７拍動において投与される請求 項６に記載の方法． 8. 拍動間の間隔は約１〜約12時間とする請求項１に記載の方法． 9. 拍動間の間隔は約３〜約10時間とする請求項８に記載の方法． 10．拍動間の間隔は約４時間とする請求項８に記載の方法． 11．レプチン受容体リガンドはレプチン受容体アゴニストである請求項１に記 載の方法． 12．上記レプチン受容体アゴニストはヒトレプチンである請求項11に記載の方 法． 13．上記レプチン受容体アゴニストは，配列番号：１のアミノ酸配列を有する 請求項11に記載の方法． 14．レプチン受容体リガンドはレプチン受容体アンタゴニストである請求項１ に記載の方法． 15．レプチン受容体リガンドは約0.001〜100mg/kg体重/用量の量で投与される 請求項１に記載の方法． 16．レプチン受容体リガンドは経口的，静脈内，皮下，局所，経皮，筋肉内， または腹腔内に投与される請求項１に記載の方法． 17．レプチン受容体リガンドは経口的に投与される請求項１に記載の方法． 18．組成物は静脈内に投与される請求項１に記載の方法． 19．レプチン受容体リガンドは，さらに医薬的に許容される担体からなる医薬 組成物の形態で投与される請求項１に記載の方法．