JP2001510029A

JP2001510029A - 核酸ラダー

Info

Publication number: JP2001510029A
Application number: JP2000503094A
Authority: JP
Inventors: ヘザージェイ．ジョーダン，
Original assignee: ライフテクノロジーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1997-07-15
Filing date: 1998-07-15
Publication date: 2001-07-31
Also published as: EP1001963B1; AU8403298A; US20140248705A1; ATE494371T1; US20130075663A1; EP1001963A4; WO1999003872A1; EP1001963A1; WO1999003872A9; US8273863B1; ES2357877T3; DE69842088D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、未知の大きさ（塩基対）および／または質量の核酸分子の大きさおよび／または質量を見積もるための標準として使用され得る核酸組成物またはラダーを提供する。本発明はまた、このような組成物またはラダーを生成するための方法、そのような方法によって生成されたラダーまたは組成物、ならびにこれらの核酸大きさ分けラダーとの比較によって、核酸分子のサイズおよび／または質量を見積もるための方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

（発明の背景）核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）フラグメントを分析するための一般的な
方法は、アガロースまたはポリアクリルアミドゲルマトリクスでの分離による。
このようなマトリクスは、このような種々の大きさおよび形状のフラグメントが
分析され得るような媒体を提供する。電流の存在下で、核酸フラグメントは、こ
のようなゲルマトリクスを通過して、正電極の方向へ移動する。小さく、直線状
の分子は、より大きな分子よりも、より容易にそして迅速にマトリクスの孔を通
って移動するので、このマトリクスは、分子ふるいとして作用し、種々の大きさ
のフラグメントを分離する。より大きな核酸フラグメントは、代表的には低濃度
のアガロースゲルにおいて電気泳動するが、より小さなフラグメントはより高濃
度のアガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲルで分離される。なぜなら、ポ
リアクリルアミドは、アガロースよりもより高い分離能を有するからである。

【０００１】アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動する核酸分子
の検出は、エチジウムブロマイドおよびＳＹＢＲグリーンのような蛍光色素の使
用を含む、種々の技術によって達成され得る。これらの色素は核酸分子に結合し
、そして紫外（ＵＶ）光に曝露される場合、蛍光を発する。あるいは、核酸分子
は、これを放射性標識、蛍光標識または化学発光標識と化学的にカップリングさ
せることによって検出され得る。

【０００２】核酸分子量標準は、核酸サンプルの質、大きさおよび／または量を推定するた
めの有用な手段である。標準は、代表的にはサンプルと同時に（例えば、サンプ
ルと並行して）分画され、そして検出後、比較が、サンプルバンドと標準のバン
ドとの間で行われる。標準の大きさ（塩基対で）を知ることは、未知のフラグメ
ントの大きさを推定することを可能にする。

【０００３】核酸フラグメントの大きさを推定するために使用される一般的な標準には、既
知の大きさの核酸フラグメントの集団を生じる、バクテリオファージ（例えば、
λバクテリオファージ）の天然に存在するゲノムＤＮＡのような核酸分子の制限
消化物が含まれる。これらの型の標準は、一般に「核酸マーカー」（例えば、「
ＤＮＡマーカー」）と称される。

【０００４】別のタイプの核酸標準は、１つ以上の特定の制限エンドヌクレアーゼについて
の制限／切断部位をプラスミドにおいて特定の間隔で含むようにプラスミドを操
作することによって作製される。この特定のエンドヌクレアーゼによるプラスミ
ドの消化によって、特定の既知の大きさの核酸フラグメントが生成される。大き
さの決定の精度のために、そして使用の容易さのために、規則的に等間隔で大き
さが増加するような多数のバンドを有することは有益である。これらの型の標準
は、一般に、「核酸ラダー」（ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｌａｄｄｅｒ）（例
えば、「ＤＮＡラダー」）と称される。好ましくは、消化物から産生した各フラ
グメントは、個別のバンドを形成し、そしてより好ましくは、消化物からのバン
ドは、各バンドの検出を容易にするために染色される場合、強度において等価で
あるかまたは実質的に等価である。

【０００５】市販のＤＮＡラダーはいずれも、１つの核酸標準を使用して、広範な分子量範
囲にわたる目的の核酸フラグメントを大きさで分類するように、１キロベース（
Ｋｂ）以上の高分子量の電気泳動バンドまたは１Ｋｂ以下の低分子量バンド、特
に１００〜５００ｂｐの範囲のバンドがはっきりと分離され、そして強度におい
て同じまたは実質的に同じである、ある範囲の標準的フラグメントの大きさを提
供しない。

【０００６】１ＫｂＤＮＡラダーは、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）から現在入手可能である。このラダー
は、１０１８ｂｐの増分の１２本のバンド、１６３６ｂｐのバンド、５１７ｂｐ
のバンド、および５０６ｂｐから７５ｂｐの大きさの範囲に数本のより小さな大
きさのバンドを含む。しかし、１Ｋｂ未満のフラグメントは、１０１８ｂｐの増
分のバンドよりも低い強度および少ない分離で現れる。また、１，６３６ｂｐの
バンドおよび５１７／５０６ｂｐの二重バンドは、このラダーにおいて他のバン
ドよりもより強く染色される。

【０００７】別の市販されている製品は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ、Ｃ
Ａ）から入手可能な「ＫｂＤＮＡラダー」である。この製品は、正確に１Ｋｂ
増分の１２本のバンド、および１Ｋｂ未満の３本のバンドを含む。２Ｋｂ未満の
バンドの強度は、２Ｋｂ以上のバンドの強度の約半分である。さらに、６Ｋｂを
超えるラダーバンドは、２Ｋｂ〜６Ｋｂのバンドよりも弱い強度で染色される。

【０００８】ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）は、１Ｋ
ｂ〜１０Ｋｂの範囲の１Ｋｂ増分の８本のバンド（このラダーにおいて７Ｋｂの
バンドも９Ｋｂのバンドもない）および１Ｋｂ未満の３本のバンドを有する、１
ＫｂＤＮＡＬａｄｄｅｒを販売している。Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能な１Ｋ
ｂＤＮＡＬａｄｄｅｒの１Ｋｂのバンドおよび３Ｋｂのバンドは、ラダー内
の基準点として役立つように強度が増加（＞２倍）されている。このことに加え
て、８Ｋｂのバンドおよび１０Ｋｂのバンドは、ラダー中の他のバンドよりも有
意に濃く、そして０．２５、０．５および０．７５Ｋｂバンドは、種々の強度の
バンドである。

【０００９】ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
より販売される１ＫｂＤＮＡＬａｄｄｅｒは、これが１Ｋｂ未満に１本のバ
ンド（０．５Ｋｂのバンド）しか含まないことを除いて、Ｐｒｏｍｅｇａの製品
と実質的に同じである。Ｓｉｇｍａより販売されている１ＫｂＤＮＡＬａｄ
ｄｅｒの数本のバンドは、これらの強度が変化しており、そしてこのラダーは、
１Ｋｂ未満に１本のバンドしか含まない。

【００１０】ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）は、上
記に記載され、そしてＳｉｇｍａより販売されるのと同じ製品のようである「Ｋ
ｉｌｏｂａｓｅＤＮＡＭａｒｋｅｒ」と称する製品を販売している。

【００１１】「１ＫｉｌｏｂａｓｅＤＮＡＬａｄｄｅｒ」は、ＢａｙｏｕＢｉｏｌａ
ｂｓ（Ｈａｒａｈａｎ，ＬＡ）によって販売され、これは１０Ｋｂまで１Ｋｂ
増分のバンドを有する。この製品は、１Ｋｂ未満のいかなるバンドも含まない。
ＢａｙｏｕＢｉｏｌａｂｓの製品は、３倍の濃さの５Ｋｂのバンドを有し、そ
して１Ｋｂ未満のいかなるバンドも含まない。

【００１２】ＧｅｎＳｕｒａ（ＤｅｌＭａｒ，ＣＡ）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって販売される、２つの他の市販されているバージョン
の１ＫｂＤＮＡＬａｄｄｅｒは、同じであると考えられる。これらのラダー
は、１Ｋｂから１５Ｋｂまでの１Ｋｂ増加のバンドを有し、ＢａｙｏｕＢｉ
ｏｌａｂｓの製品と同じく、１Ｋｂ未満にバンドを有さず、かつ３倍濃度の５Ｋ
ｂのバンドを有する。

【００１３】それゆえ、上記を考慮すると、広範な長さの範囲にまたがり、そしてゲル上で
分離しそして染色する場合に、明白でありそして可視であり、さらに互いを比較
して比較的同じ強度である別個のバンドを産生するＤＮＡラダーについての必要
性がある。これは、１Ｋｂ未満のバンド長（特に５００ｂｐ以下のバンド）に特
に重要である。

【００１４】（発明の要旨）本発明は、未知の核酸フラグメントの大きさを見積もる際に使用するための、
多くの異なる大きさの核酸フラグメント（２以上）を含む、物質の組成物に関す
る。詳細には、本発明は、広範囲の分子量の大きさにわたる核酸フラグメントの
大きさ（塩基対）を見積もるための核酸ラダーに関する。本発明の核酸組成物お
よびラダーは、ＲＮＡまたはＤＮＡを含み、そして一本鎖または二本鎖であり得
るが、二本鎖ＤＮＡラダーが好ましい。詳細には、本発明は、核酸ラダーまたは
組成物に関し、ここで、すべてもしくは実質的にすべてのバンドが実質的に等価
な強度であるか、および／またはすべてもしくは実質的にすべてのバンドの相対
質量が実質的に等価である。本発明の好ましい局面において、この組成物または
ラダーは、約１ｋｂ（キロ塩基＝１，０００塩基または塩基対）の増分の核酸フ
ラグメント（例えば、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂなど）、ならび
に１ｋｂ未満の１以上の核酸（例えば、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂ
ｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐなど、ま
たはこれらの任意の組合せの増分）からなり；ここで、実質的にすべてのラダー
または組成物のフラグメントは、染色で検出される場合に、実質的に等価な強度
であり、および／または、実質的にすべてのフラグメントの相対質量は、実質的
に等価である。

【００１５】好ましくは、本発明の核酸ラダーおよび組成物は、約２５ｋｂ〜約１００ｂｐ
（またはそれ未満）、好ましくは２０ｋｂ〜１００ｂｐ、より好ましくは１５ｋ
ｂ〜１００ｂｐ、および最も好ましくは１２ｋｂ〜１００ｂｐの範囲の２以上の
バンド（好ましくは、４、５、６、７、８以上のバンド）を有するが、より小さ
な範囲も本発明によって意図される。

【００１６】本発明の核酸ラダーまたは組成物は、好ましくは、異なる長さの核酸フラグメ
ントの混合物を含み、ここで、各フラグメント大きさのコピー数は、各フラグメ
ントの相対質量が実質的に同一であるように、調整される。実質的に同一の相対
質量を有することにより、本発明のラダーまたは組成物のバンドは、ゲル電気泳
動による分離後に染色する場合に実質的に等価な強度を有する。別の局面におい
て、本発明のラダーまたは組成物のフラグメントは、１以上の酵素制限酵素部位
における１以上の核酸分子の切断によって生成される。これらの分子は、プラス
ミド、コスミド、またはファージミドを含む任意のベクターを含み得る。

【００１７】より詳細には、本発明のラダーまたは組成物は、ファージミドから生成され、
１００ｂｐ配列を約９コピー、２００ｂｐ配列を約４コピー、３００ｂｐ配列を
約３コピー、４００ｂｐ配列を約２コピー、５００ｂｐ配列を約２コピー、６５
０ｂｐ配列、８５０ｂｐ配列、および１６５０ｂｐ配列をそれぞれ約１コピー、
ならびに１０００ｂｐ配列を約１２コピー含むように設計される。多くの異なる
大きさのフラグメントは、このプラスミドにおいて複数のコピーで存在し、その
結果、各フラグメントは、適切なエンドヌクレアーゼ消化によって生成される場
合、このラダーまたは組成物における任意の他の異なる大きさのフラグメントと
実質的に同じ相対質量を有する。従って、本発明の組成物またはラダーは、多く
の異なるバンドを含み（各バンドは、異なる大きさのフラグメントを表す）、こ
こで、各バンドは、ゲル電気泳動および染色後に実質的に同一の強度を有する。
本発明の好ましい局面におけるフラグメントは、このプラスミドの制限エンドヌ
クレアーゼを用いて消化し、それにより、１２ｋｂ〜約１００ｂｐの範囲のフラ
グメント（これらは、ゲル電気泳動後に、染色される場合、実質的に等価な強度
の異なるバンドとして現れる）を生成することによって調製される。

【００１８】本発明はまた、異なる長さの核酸フラグメントの混合物を含む本発明の核酸ラ
ダーまたは組成物を提供する。本発明のラダーまたは組成物の各異なる大きさの
フラグメントは、大きさがＸ塩基対（ｂｐ）異なり得、ここで、Ｘは、１０以上
の整数である。好ましくは、各異なる大きさのフラグメントの相対質量は、実質
的に等価であり、その結果、このフラグメントがゲル上で分離され、そして染色
される場合に、実質的に等価な強度の、異なるバンドが生成される。

【００１９】本発明はまた、本発明のラダーまたは組成物を調製するための方法に関する。
このような方法は、各フラグメントの質量が実質的に等価であるように、所望の
大きさの各フラグメントのコピーの充分な数を提供する工程を包含する。一般的
に、より小さなフラグメントは、より大きなフラグメントの質量と等価にするた
めには、より多くのコピーが必要である。本発明のラダーまたは組成物を調製す
るための複数のフラグメントは、別個にまたは予備混合された形態で提供され得
る。いずれにせよ、別個に提供されたフラグメントは、ゲル分離の前に混合され
る。

【００２０】本発明の方法はまた、以下の工程：（ａ）１以上の制限酵素と、１以上の核酸分子（好ましくはプラスミド、コス
ミド、またはファージミド）とを混合する工程；および（ｂ）１以上のこの制限部位での上記核酸分子の切断に有利な条件下でこの混
合物をインキュベートし、従って、本発明のラダーまたは組成物を提供する工程
を包含する。切断は、この核酸分子の設計に依存して、部分的消化、完全な消化
、または両方の組合せであり得る。部分消化は、マルチマー（例えば、モノマー
反復、ダイマー反復、トリマー反復、テトラマー反復など）の集団を生成し、そ
れにより、ラダーを形成するが、完全な消化は、（この制限部位の位置に依存し
て）異なる大きさのバンドを生成する。

【００２１】本発明はまた、核酸分子の大きさを決定するための方法に関し、このような好
ましい方法は、以下の工程：（ａ）本発明核酸のラダーまたは組成物、および大きさ分けされる核酸分子を
、大きさに従って、分離する工程；および（ｂ）この核酸ラダーまたは組成物のフラグメントまたはバンドとの比較によ
って、この核酸分子の大きさを決定する工程、を包含する。

【００２２】本発明はさらに、運搬手段（例えば、箱、カートンなど）を含むキットを提供
し、これは、その中で密接に拘束された状態で１以上の容器手段（例えば、チュ
ーブ、バイアル、アンプル、瓶など）を受けるように区画化されており、ここで
、第一容器手段は、本発明の核酸ラダーまたは組成物を含む。本発明のキットは
、単一の容器（予備混合されている）中にこの組成物またはラダーを含み得るか
、または別個の容器中にこのラダーまたは組成物のフラグメントを含み得、これ
らは後の時間に混合され得る。

【００２３】本発明はまた、本発明のラダーまたは組成物（またはそれらのフラグメント）
を調製するための、核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ，好ましくは二本鎖のＤＮＡ
）に関する。このような分子は、好ましくは、プラスミド、コスミド、またはフ
ァージミドである。好ましいプラスミドはｐＫＢ１８４７である。このような分
子を含む宿主細胞もまた、本発明によって意図される。

【００２４】（発明の詳細な説明）本発明は、核酸分子に関する。この核酸は、大きさによって、好ましくは、ア
ガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって分離された
、二本鎖または一本鎖の直鎖核酸分子の大きさ（塩基対）および／または質量を
見積もるための標準として使用され得る。本発明の核酸分子は、ＤＮＡ分子、Ｒ
ＮＡ分子またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子であり得、そして二本鎖または
一本鎖であり得る。

【００２５】本発明の好ましい実施態様において、この核酸分子（または本発明のラダーま
たは組成物のフラグメント）は、異なる長さのフラグメントのコピーを含むよう
に設計された、１以上のベクター（例えば、プラスミド、コスミド、およびファ
ージミド）から生成される。しかし、任意の核酸分子または分子の組合せを使用
して、本発明のラダーまたは組成物を生成し得る。次いで、各フラグメント長の
相対質量が実質的に等価であるように、異なる大きさのフラグメントが提供され
る（予備混合物としてまたはその後の混合のために別個に）。相対質量は、全て
のフラグメントの総質量に比較した各フラグメントの比と定義される。フラグメ
ントの質量は、各フラグメントの長さの大きさ（塩基対数（ｂｐ））を同じフラ
グメントのコピー数で乗じたものと定義され；例えば、ラダーまたは組成物が３
つの異なる大きさのフラグメント（フラグメント１、１００ｂｐを５０コピー；
フラグメント２、５００ｂｐを１０コピー；およびフラグメント３、１０００ｂ
ｐを５コピー）を有する場合、各フラグメントの質量は、５０００である（例え
ば、５コピーの１０００ｂｐは、５×１０００＝５０００の質量を有する）。従
って、総質量は、１５，０００（５，０００＋５，０００＋５，０００＝１５，
０００）である。相対質量（％）は、特定のフラグメントの質量を、全ての質量
の総質量で除し、１００を乗じることによって計算され得る。従って、核フラグ
メントの相対質量は３３％である。各フラグメントの相対質量が別のフラグメン
トの相対質量の３倍以内であり、好ましくは別のフラグメントの相対質量の２．
５倍以内であり、より好ましくは別のフラグメントの相対質量の２倍以内であり
、さらにより好ましくは別のフラグメントの相対質量の１．５倍以内であり、そ
して最も好ましくは各フラグメントがほぼ同一の相対質量を有せば、相対質量は
実質的に等価である。

【００２６】例えば、本発明の好ましいラダーにおいて、１００ｂｐの相対質量（９コピー
×１００ｂｐ＝９００）を、ラダーにおけるフラグメントの総質量（１９，５５
０ｂｐ（表１を参照のこと））で除し、１００で乗じることによって計算され得
、４．６％の相対質量が得られる。第二の例において、１，６５０ｂｐフラグメ
ント（１，６５０×１コピー＝１，６５０）を、このラダーの全てのフラグメン
トの総質量１９，５５０で除し、１００で乗ずることによって、８．４％の相対
質量が得られる。従って、この１，６５０ｂｐフラグメントの相対質量は、１０
０ｂｐフラグメントの相対質量の３倍未満なので、これらのフラグメントの相対
質量は、本明細書に定義される場合、実質的に等価であるとみなされる。

【００２７】本発明のこの局面に従って、特に好ましい核酸分子は、１ｋｂラダー（約１ｋ
ｂの増分）を生成し、そして１００ｂｐ配列を約９コピー、２００ｂｐ配列を約
４コピー、３００ｂｐ配列を約３コピー、４００ｂｐ配列を約２コピー、５００
ｂｐ配列を約２コピー、６５０ｂｐ配列、８５０ｂｐ配列および１６５０ｂｐ配
列をそれぞれ約１コピー含む。１ｋｂラダーは、約１ｋｂ（１０００ｂｐ）の配
列を１２コピー含むベクターの部分的消化によって生成するが、１ｋｂ未満のフ
ラグメントの複数のコピーは完全な消化によって生成される。より小さな大きさ
のフラグメントの数を増加させることによって、すべてのフラグメントの相対質
量の平衡化が提供され、それによって実質的に等価なバンド強度が可能になる。

【００２８】認められるように、１以上の核酸分子は、本発明の組成物のラダーを調製する
ために使用され得る。つまり、１または多数のフラグメントは、１以上の分子か
ら作製され得，そしてこれらのフラグメントは、単離され得、そして別個に維持
され得るかまたは予備混合され得る。

【００２９】当業者に理解されるように、本発明の核酸大きさ分けラダーまたは組成物を形
成するように使用される核酸分子は、好ましくは、直鎖状または環状ＤＮＡ分子
であり、この分子は，制限酵素によって切断可能である。例えば、この核酸分子
は、染色体、ベクター、コスミド、プラスミド、またはウイルスゲノムに由来し
得る。好ましくは、この核酸分子は、ベクターまたはウイルス分子ならびにそれ
らの誘導体である。このベクターまたはウイルス分子に存在する核酸は、このベ
クターまたはウイルス分子が産生されるように連結された外因性核酸を含み得る
。１つの好ましい実施態様において、この核酸はＤＮＡである。

【００３０】本発明のフラグメントの複数のコピーを調製するために、実施例１に記載した
方法が使用され得る。所望の大きさの複数のフラグメントを、選択した制限部位
に、ヘアピン形成を避けるために頭部から尾部への様式でクローニングし得る。
実質的に等価な相対質量を有するように所望された複数のフラグメントの適切な
数を含むベクターは、大きさに従って選択され得る。複数のフラグメントは、好
ましくは、１以上の独自の制限エンドヌクレアーゼ部位と隣接しており、その結
果、それらは、１つのベクターから取り出され得、そして「カセット」として別
のベクターに挿入され得る。このことにより、本発明のラダーまたは組成物を作
製するための複数フラグメントを含む単一のベクターの調製が可能になる。次い
で、このベクターを、適切な条件下で適切なエンドヌクレアーゼでの消化によっ
て使用して、本発明のラダーまたは組成物を調製し得る。あるいは、異なる大き
さのフラグメント（またはその複数のフラグメント）を、別個のベクターに挿入
し得、そのフラグメントを、単離し得、次いで本発明のラダーまたは組成物を作
製するために予備混合し得るかまたは後の混合のために保存し得る。これらのフ
ラグメントは、適切な量で混合されてラダーまたは組成物を提供し、ここで、こ
のラダーまたは組成物の各フラグメントは、実質的に同一の相対質量を有する。
上記の方法は、任意の大きさの複数のフラグメントのために反復され得、そして
この複数のフラグメントは、所望に応じて合わされ得る。フラグメントの頭部か
ら尾部への連結を可能にする制限部位は、当業者に公知の非対称の制限部位であ
り、これには、例えば、ＡｖａＩおよびＢａｎＩＩが含まれる。

【００３１】本発明のフラグメントの複数のコピーが１以上のベクターに挿入される場合、
フラグメントは、制限部位によって分離され得る反復を生成するように連結され
得る。続いて、これらの反復の１以上は、平滑末端および／または粘着末端制限
エンドヌクレアーゼのような１以上の制限酵素を用いる切断によって分離され得
る。制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子中の特定の塩基配列（通常、４、５
、６塩基対長またはそれより大きい）を認識し、そしてこの配列が現れるところ
でこのＤＮＡ分子を切断する能力を有する酵素である。本発明の実施において、
同一または異なる平滑末端または粘着末端フラグメントを与える制限酵素および
制限部位が選択され得る。本発明の使用のために適切な平滑末端制限酵素および
それらの切断部位の例は、限定することなく、以下を含む：ＡｌｕＩ、ＤｒａＩ、Ｅｘｏ４７ＩＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＦｓｐＩ、ＨｐａＩ、
ＭｓｃＩ、ＮｒｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＲｓａＩ、ＳｃａＩ、ＳｍａＩ、ＳｓｐＩ、
ＳｔｕＩ、ＴｈａＩ、ＤｒａＩ。

【００３２】本発明の使用のために適切な粘着末端制限酵素およびそれらの切断部位の例は
、限定することなく、以下を含む：ＡｖａＩ、ＢａｍＨＩ、ＢａｎＩＩ、ＢｇｌＩＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ、ＨｐａＩＩ、ＫｐｎＩ、ＭｓｅＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、Ｎｏｔ
Ｉ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ，ＳａｃＩ／ＳｓｔＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ。

【００３３】上記に記載された制限酵素、および本発明で等価に使用され得る他のものは、
例えば、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ，ＭＤ）から市販される。制限酵素およびこれらの切断部位の他の例につい
ては、Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７（
補遺）：ｒ３４７−ｒ３８７（１９８９）もまた参照のこと。

【００３４】好ましくは、ラダーのフラグメントまたは組成物を作製するために使用される
核酸分子は、核酸分子が宿主細胞内で自律複製し得るように、複製起点（例えば
、ｏｒｉ）を含む。核酸分子が、選択マーカーまたはスクリーニング可能なマー
カーを含むこともまた、好ましい。複製起点およびマーカーは、同じフラグメン
ト上に存在し得る。本発明の核酸分子を含む宿主細胞は、そして選択マーカーに
対応する選択薬剤を用いて培養および選択され得る。原核生物宿主細胞（グラム
陰性またはグラム陽性）または真核生物宿主細胞は、本発明に従って使用され得
る。好ましい原核生物宿主細胞には、Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓまたはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａの属の細菌が含まれ
る。好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ株が使用される（例えば、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手可能なＥ．
ｃｏｌｉＳＴＢＬ２^TM）。好ましい真核生物宿主には、酵母、植物細胞、哺乳
動物細胞または昆虫細胞が含まれる。

【００３５】本発明に従って、フラグメント配列は、周知の技術を使用して、ベクターに連
結され、次いでこのベクターは宿主細胞へ形質転換され得る。これらの複数コピ
ーが、互いに連結されて、多量体（例えば、二量体、三量体、四量体、五量体、
六量体など）を形成し得る。次いで、宿主細胞は、培養され、溶解され、そして
ベクターが標準的なプロトコルによって単離される。例えば、一般的なクローニ
ング方法については、Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＦｉｔｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ
，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎ
ｕａｌ（１９８２）またはＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（
Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）を参照のこと。次いで、ベクターは制限エ
ンドヌクレアーゼ部位で消化され得、それによって反復物が分離されて、複数コ
ピーの反復フラグメントを得る。あるいは、ベクターの部分的な消化は、種々の
大きさの多量体を提供する。所望の多量体を産生する部分的な消化の条件は、標
準的な方法（例えば、種々の持続時間の間インキュベートされた部分的な消化の
産物を可視化すること）によって決定され得る。このような種々の大きさの多量
体（例えば、単量体、二量体、三量体など）は、本発明に従って、大きさ分類ラ
ダーとして使用され、ラダーの「段」を形成する。このような大きさ分類ラダー
は、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ラダーは、当業者に周知の技術によ
って、二本鎖核酸分子または本発明のラダーから形成され得る。

【００３６】本発明によれば、本発明のオリゴヌクレオチドおよび核酸分子を調製するため
に適切なヌクレオチドまたはそれらの誘導体には、ｄＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ＡＴＰ、ＴＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、７−デア
ザ−ｄＧＴＰ、ａｄＡＴＰ、ａｄＴＴＰ、ａｄＧＴＰ、ａｄＣＴＰ、ｄｄＡＴＰ
、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ、およびｄｄＧＴＰが含まれるが、これらに限定され
ない。本発明の核酸分子の形成における使用のために適切な他のヌクレオチド（
デオキシおよびジデオキシ）およびそれらの誘導体は、当業者に良く知られてい
る。

【００３７】以下の実施例２でより詳細に記載されるように、好ましい核酸ラダーは、最初
にプラスミドをＢｇｌＩＩ制限酵素によって完全に消化して、１００ｂｐ、２０
０ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、および５００ｂｐの複数コピーのフラグメン
ト、ならびに６５０ｂｐ、８５０ｂｐ、および１６５０ｂｐの複数コピーのフラ
グメント、ならびに１２個の１Ｋｂ反復物（図１を参照のこと）を含む１２Ｋｂ
反復の「カセット」を産生することにより、プラスミドｐＫＢ１８４７（図１）
から産生され得る。次いで、このカセットはＢａｍＨＩで部分的に消化され、１
Ｋｂの増分で大きさが増加し、最も大きなフラグメントが１２Ｋｂであるフラグ
メントを産生する。もちろん、完全な消化および部分的な消化の段階は、順序を
逆にし得る。

【００３８】本発明に従って、そのラダーまたは組成物は、位置付けの目的で１つ以上の強
調バンドまたはフラグメントを含み得る。このような強調バンドまたはフラグメ
ントは、他のフラグメントまたはバンドよりも、実質的に大きな相対質量（３倍
より大きく、好ましくは４倍より大きく、そして最も好ましくは５倍より大きい
）を有する。従って、強調フラグメントは、強調バンドまたはフラグメントを本
発明のラダーまたは組成物内の他のバンドまたはフラグメントから区別するため
に、染色の際に明るくされた強度を有する。

【００３９】本発明の大きさ決定用ラダーまたは組成物は、２本鎖核酸（例えば、ＤＮＡま
たはＲＮＡ）フラグメントの大きさ（ｂｐで）を、好ましくは、アガロースゲル
またはポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって推定するために使用され
得る。このラダーはまた、鎖が熱変性または化学変性によって分離される場合、
１本鎖核酸フラグメントの大きさを決定するために使用され得る。特に、本発明
のラダーまたは組成物は、２５ｋｂ〜１０ｂｐの範囲の直鎖状の、２本鎖および
１本鎖核酸フラグメントの大きさ決定のための標準として有用である。本発明の
ラダーまたは組成物はまた、例えば、以下に記載のような放射能標識、蛍光標識
、または化学発光標識で検出可能に標識され得、そして予想されるバンドが使用
される大きさ決定用ラダーの範囲内にある、サザンハイブリダイゼーションまた
はＰＣＲ増幅のような核酸アッセイにおける標準として使用され得る。

【００４０】本発明の核酸マーカーラダーまたは組成物は、１本鎖または２本鎖であり得る
。２本鎖ラダーまたは組成物は、本発明の２本鎖核酸構築物から直接得られる。
１本鎖は、本発明の２本鎖核酸構築物を加熱することによって、またはそれをカ
オトロピック剤もしくはヘリカーゼで処理することによって得ることができる。
あるいは、１本鎖は、ラダーまたは組成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離する場合
に得られる。

【００４１】本発明のラダーまたは組成物は、臭化エチジウムもしくはＳＹＢＲグリーンで
染色することによって、または当該分野で公知の標準的な方法を使用して末端標
識することによって検出可能に標識され得る。本発明の２本鎖ラダーまたは組成
物（例えば、ＤＮＡ）の特別な利点は、制限消化の結果としての、４つ全てのヌ
クレオチドを含む「粘着末端」の存在であり、これはラダーまたは組成物バンド
を検出可能に標識する目的で任意の標識されたヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｔ、Ｇを使
用することを可能にする。従って、本発明の別の局面は、染料または他の検出可
能な標識で検出可能に標識された本発明のラダーまたは組成物に関する。本発明
のラダーまたは組成物を検出可能に標識するために適切な標識には、放射標識（
例えば、³²Ｐ、¹⁴Ｃ、³Ｈなど）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコシアニンなど）、および化学発光標識（例えば、ＬｉｆｅＴｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから市販されている
ＰＨＯＴＯ−ＧＥＮＥもしくはＡＣＥＳ化学発光系を使用して）が含まれるが、
これらに限定されない。

【００４２】別の実施態様において、本発明は、ボックスまたはカートンのような運搬手段
（その中に密接して、バイアル、チューブ、ジャー、アンプルなどのような少な
くとも１つの容器手段を有する）を含む核酸マーカーキットに関する。このよう
なキットは、必要に応じて標識された形態で、本発明の核酸組成物またはラダー
を含み得る。ラダー組成物のフラグメントは、別々の容器にいれて、または予め
混合した形態で提供され得る。そのラダーまたは組成物またはそれらのフラグメ
ントは、約１０ｍＭＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、約１ｍＭＥＤＴＡ、
および必要に応じて約５０ｍＭＮａＣｌのような保存緩衝液に入れて提供され
得る。その核酸ラダーまたは組成物は、約１μＭの濃度で存在し得、そして好ま
しくは、使用するまで約−２０℃で保存される。さらなる容器手段は、本発明の
ラダーを検出可能に標識し得る試薬（例えば、臭化エチジウム、ＳＹＢＲグリー
ン、またはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ）を含み得る。必要に応じて、そのラ
ダーは、グリセロールまたはスクロースまたは染料（例えば、ブロモフェノール
ブルーもしくはキシレンシアノール）を含有する保存緩衝液中に入れることがで
きる。

【００４３】ここまで本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、例示の目的で提供され
、特に断らない限り本発明を限定することを意図しない以下の実施例を参照する
ことにより、より容易に理解される。

【００４４】以下の材料および方法は、以下の実施例において使用された。

【００４５】（実施例）（実施例１）（「ｐＫＢ１８４７」プラスミドの産生）工程１：本発明によるＤＮＡラダーまたは組成物を、９コピーの１００ｂｐ配列、４コ
ピーの２００ｂｐ配列、３コピーの３００ｂｐ配列、２コピーの４００ｂｐ配列
、２コピーの５００ｂｐ配列、各１コピーの６５０ｂｐ、８５０ｂｐ、および１
６５０ｂｐの配列、ならびに１２コピーの１０００ｂｐ配列を含むように設計し
た特別に構築されたプラスミド（「ｐＫＢ１８４７」）から産生する。種々の大
きさのフラグメントは、プラスミド中に複数のコピーが存在し、各フラグメント
の相対質量をつりあうようにする。プラスミドのマップを添付し、そしてこれは
以下の工程によって構築した：プラスミドを、ぴったり１６５０ｂｐの大きさの
フラグメント中にｐＵＣ１９複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含むよう
に設計した。アンピシリン遺伝子を含むフラグメント（９３６ｂｐ）および再配
置の起点を含むフラグメント（６９４ｂｐ）を、制限部位を含む特定のプライマ
ーを用いるＰＣＲ増幅、続いてそのＰＣＲ産物の制限消化および連結、次いでそ
の連結混合物のコンピテントＤＨ５α Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中への形質転換によっ
て調製した。得られるプラスミドを、「ｐＨＢ１０６」と命名した。

【００４６】工程２：次いで、２つの１０００ｂｐフラグメントを、制限酵素部位を含むようにＬａ
ｍｂｄａＤＮＡからＰＣＲ増幅し、これらの酵素で消化した場合に、それらが
互いに連結され、そして「ｐＨＢ１０６」ベクター中のＥｃｏＲＩ制限部位とＨ
ｉｎｄＩＩＩ制限部位との間にクローニングされ得るようにした。

【００４７】工程３：得られたプラスミドは、２つの１Ｋｂフラグメントの間に非対称的なＡｖａＩ
部位（ＣＴＣＧＧＧ）を含有しており、次いでこれは同じ非対称的ＡｖａＩ部位
に隣接する他の１Ｋｂフラグメント中に連結するために使用した。これにより、
１Ｋｂフラグメントがプラスミド中に頭−尾の様式で連結することを確実にした
。１２個の１Ｋｂフラグメントを含むプラスミド（「ｐＫＢ１６０３」）を単離
した。

【００４８】工程４：工程２および３に記載されるように、１００ｂｐフラグメントをＬａｍｂｄａＤＮＡから増幅し、そして複数のコピーをｐＨＢ１０６のＥｃｏＲＩ部位にク
ローン化した。９個の１００ｂｐフラグメントを含むプラスミド（「ｐＫＢ１２
１３」）を単離した。

【００４９】工程５：工程４に記載する手順を繰り返して、４つの２００ｂｐフラグメント（「ｐＫ
Ｂ２１１０」）、３つの３００ｂｐフラグメント（「ｐＫＢ３１０６」）、２つ
の４００ｂｐフラグメント（「ｐＫＢ４１０３」）、および２つの５００ｂｐフ
ラグメント（「ｐＫＢ５００６」）を、ｐＨＢ１０６ベクターにクローン化した
。

【００５０】工程６：３００ｂｐフラグメントのマルチマーを含有するプラスミドｐＫＢ３１０６、
および４００ｂｐフラグメントのマルチマーを含有するプラスミドｐＫＢ４１０
３を共に２つの制限部位で消化し、そして各プラスミド由来のフラグメントを、
ゲル精製し、そして互いに連結した。３００ｂｐマルチマーおよび４００ｂｐマ
ルチマーを頭−尾で含有する新たなプラスミドが形成された。

【００５１】工程７：次いで、１００ｂｐ、２００ｂｐおよび５００ｂｐのマルチマーを、工程６に
記載する方法をさらに３「サイクル」使用して、３００ｂｐおよび４００ｂｐの
マルチマーを含有するプラスミド中にクローニングした。得られるプラスミドは
、１００、２００、３００、４００、および５００ｂｐのフラグメントのマルチ
マの全てを含んでいた。

【００５２】工程８：これらの１００ｂｐから５００ｂｐのフラグメントのマルチマーを含有する「
カセット」を、工程７からのプラスミドから切り出し、そして工程３に記載する
プラスミドｐＫＢ１６０３（これは、１２個の１０００ｂｐフラグメントを含有
する）中に連結した。

【００５３】工程９：共にＬａｍｂｄａＤＮＡからＰＣＲによって生成した１つの６５０ｂｐのフ
ラグメントおよび１つの８５０ｂｐのフラグメントを、工程８に記載するプラス
ミドの単独の制限部位にクローニングした。得られたプラスミドを「ｐＫＢ１８
４７」と命名した。Ｅ．ｃｏｌｉＳＴＢＬ２^TM細胞中に含まれるこのプラスミ
ドを、１９９７年６月２０日にＴｈｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ａｇｌｉｃｕｌ
ｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｎ
ＲＲＬ），１８１５ＮｏｒｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｔｒｅｅｔ，Ｐｅ
ｏｒｉａ，ＩＬ６１６０４ＵＳＡに、受託番号ＮＲＲＬＢ−２１７９１と
して寄託した。

【００５４】（実施例２）（ＤＮＡラダーの産生）ＤＮＡラダーを、まずプラスミドをＢｇｌＩＩ制限酵素で完全に消化すること
によって、プラスミドｐＫＢ１８４７から産生する。これは、上記の１００ｂｐ
、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、および５００ｂｐのフラグメント、な
らびに６５０ｂｐ、８５０ｂｐ、および１６５０ｂｐのフラグメント、および１
２Ｋｂの反復フラグメントの複数のコピーを放出する。次いで、この混合物を、
ＢａｍＨＩ制限酵素で部分的に消化して、大きさが１Ｋｂ増加したフラグメント
、最も大きいフラグメントで１２Ｋｂを生成する（表１を参照のこと）。Ｂａｍ
ＨＩおよびＢｇｌＩＩ制限酵素の両方は、ラダーの各フラグメントにおいて、配
列ＧＡＴＣを有する同一の「粘着末端」を生成する。

【００５５】

【表１】（実施例３）（ゲル電気泳動および臭化エチジウム染色）材料を、匹敵する核酸ラダー製品を有する８つの会社から得、そして以下のよ
うに本発明のＤＮＡラダーまたは組成物で同時に分析した：２５０ｎｇのＤＮＡを、１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含む１％のアガロー
スゲルのウェルに適用した。そのゲルを、電気泳動装置中の１μｇ／ｍｌの臭化
エチジウムを同様に含むＴｒｉｓ−酢酸塩−ＥＤＴＡ緩衝液中に沈めた。

【００５６】そのゲルを１００Ｖで４０分間電気泳動した。

【００５７】そのバンドを、ＵＶ光の曝露の下でそのゲルの写真を撮ることによって分析し
た。

【００５８】図２は、種々のラダーにおけるＤＮＡバンドの強度および数を例示するゲルの
写真である。以下は、ゲル電気泳動によって分析した場合の、本発明と市販の関
連する製品との間の差異を記載する。

【００５９】本発明の生成物は、図２のレーン１に例示される。顕著にも、全てのラダーバ
ンド、特に１ｋｂ長より短いバンドが、臭化エチジウムで相対的に同等な強度で
染まっている。なぜなら、バンドの各々におけるＤＮＡの質量が、相対的に比例
しているからである。

【００６０】図２のレーン２に見られるように、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉ
ｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から市販されている１ＫｂＤＮＡラダー
は、１Ｋｂよりも小さいフラグメントが、１０１８ｂｐ増分バンドよりも強度が
より弱く見える点で、本発明とは異なる。これは、これらのフラグメントの各々
の相対質量（従って、これらのバンドの染まったときの強度）が、その大きさに
比例して減少するからである。また、１、６３６ｂｐのバンドおよび５００ｂｐ
のバンドは、ラダー中の他のバンドよりもより強く染まる。

【００６１】レーン３は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）の「ＫｂＤ
ＮＡラダー」を例示する。２Ｋｂよりも小さいバンドの強度は、２Ｋｂ以上のバ
ンドの強度の約半分である。この特徴は、参照目的のための目印として説明され
る。さらに、６Ｋｂよりも大きいラダーバンドは、２Ｋｂ〜６Ｋｂのバンドより
も弱い強度で染色される。

【００６２】Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から市販される１ＫｂＤＮＡラ
ダー中の１Ｋｂおよび３Ｋｂのバンド（レーン４）は、ラダー内で参照点として
作用するために増大した強度（＞２倍）を有する。これに加えて、８Ｋｂおよび
１０Ｋｂのバンドは、ラダー中の他のバンドよりも有意に強度が大きく、そして
０．２５、０．５、および０．７５Ｋｂのバンドは、種々の強度を有する。

【００６３】Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によって市販される１ＫｂＤＮＡラ
ダー中のバンドのいくつか（レーン５を参照のこと）は、その強度がまちまちで
あり、そしてこのラダーは、１Ｋｂよりも小さいバンドをわずか１つしか含まな
い。

【００６４】Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって市販される１Ｋ
ｂＤＮＡラダー（レーン６）は、Ｓｉｇｍａラダーと同一であり、そして同じ
製品のようである。

【００６５】レーン７のＢａｙｏｕＢｉｏｌａｂｓ（Ｈａｒａｈａｎ，ＬＡ）製品は、３
重強度の５Ｋｂバンドを有し、そして１Ｋｂよりも小さいバンドは全く含まない
。

【００６６】レーン８および９の２つの１ＫｂＤＮＡラダー（ＧｅｎＳｕｒａ（ＤｅｌＭ
ａｒ，ＣＡ）およびＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ））は
、同一の製品であり、より高い強度の５Ｋｂのバンドを有し、１Ｋｂより小さい
バンドは有さない。

【００６７】本明細書中で引用される全ての刊行物、特許出願、および特許は、その全体が
、本明細書中で参考として援用される。

【００６８】（寄託された微生物または他の生物材料に関する表示（ＰＣＴ規則１３規則の
２））

【００６９】

【表２】

【図面の簡単な説明】

本発明のこれらおよび他の特徴、局面および利点は、以下の明細書および添付
の請求の範囲、ならびに添付の図面を参照すれば、より良好に理解される。

【図１】図１は、プラスミドｐＫＢ１８４７の制限地図を示す。

【図２】図２は、存在するＤＮＡ標準に比較した、本発明の異なる特徴を例示する比較
ゲルの写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】異なる長さの核酸フラグメントの混合物を含む組成物または
ラダーであって、各フラグメントの相対質量が実質的に等価である、組成物また
はラダー。
【請求項２】前記異なる長さのフラグメントがゲル電気泳動後にバンドを
生成し、ここで該バンドが実質的に等価な強度を有する、請求項１に記載の組成
物またはラダー。
【請求項３】異なる大きさの核酸フラグメントの混合物を含む組成物また
はラダーであって、該異なる大きさのフラグメントが、ゲル電気泳動および染色
後にバンドを生成し得、該バンドが実質的に等価な強度を有する、組成物または
ラダー。
【請求項４】前記核酸がＤＮＡである、請求項１に記載の組成物またはラ
ダー。
【請求項５】前記フラグメントの各々の長さが、Ｘ塩基対異なり、ここで
、Ｘは１０以上の整数である、請求項１に記載の組成物またはラダー。
【請求項６】前記Ｘが１００以上の整数である、請求項５に記載の組成物
またはラダー。
【請求項７】前記混合物が長さ約１ｋｂの２以上の増分を有するフラグメ
ントを含む、請求項１に記載の組成物またはラダー。
【請求項８】前記フラグメントの大きさが、約２５ｋｂ〜約１ｋｂの範囲
内である、請求項７に記載の組成物またはラダー。
【請求項９】前記フラグメントが約１ｋｂの倍数である、請求項１に記載
の組成物またはラダー。
【請求項１０】前記混合物が、長さ約５０ｂｐ、長さ約１０ｂｐ、長さ約
１００ｂｐ、長さ約５００ｂｐおよび長さ約１０００ｂｐからなる群より選択さ
れる１以上の増分を有するフラグメントを含む、請求項１に記載の組成物または
ラダー。
【請求項１１】長さ約１００ｂｐ、長さ約５００ｂｐ、長さ約５０ｂｐ、
および長さ約１０ｂｐからなる群より選択される１以上の増分を有するフラグメ
ントをさらに含む、請求項７に記載の組成物またはラダー。
【請求項１２】長さ約１００ｂｐ、長さ約５００ｂｐ、長さ約５０ｂｐ、
および長さ約１０ｂｐからなる群より選択される１以上の倍数を有するフラグメ
ントをさらに含む、請求項７に記載の組成物またはラダー。
【請求項１３】ゲル電気泳動および染色後に１以上の強調バンドを生成す
るに充分な相対質量で１以上のフラグメントを含む、請求項１１に記載の組成物
またはラダー。
【請求項１４】ゲル電気泳動および染色後に１以上の強調バンドを生成す
るに充分な相対質量で１以上のフラグメントを含む、請求項１２に記載の組成物
またはラダー。
【請求項１５】前記核酸フラグメントの１以上が一本鎖である、請求項１
に記載の組成物またはラダー。
【請求項１６】前記核酸フラグメントの１以上が二本鎖である、請求項１
に記載の組成物またはラダー。
【請求項１７】前記二本鎖フラグメントが平滑末端である、請求項１６に
記載の組成物またはラダー。
【請求項１８】前記二本鎖フラグメントが各末端において一本鎖のオーバ
ーハングを含む、請求項１６に記載の組成物またはラダー。
【請求項１９】前記一本鎖オーバーハングが、Ｇ、Ａ，ＴおよびＣからな
る群より選択される１以上のヌクレオチドを含む、請求項１８に記載の組成物ま
たはラダー。
【請求項２０】前記オーバーハングが、Ｇ、Ａ，ＴおよびＣを含む、請求
項１９に記載の組成物またはラダー。
【請求項２１】前記各フラグメントの相対質量が、別のフラグメントの相
対質量の約３倍を超えない、請求項１に記載の組成物またはラダー。
【請求項２２】前記各フラグメントの相対質量が、別のフラグメントの相
対質量の約２倍を超えない、請求項１に記載の組成物またはラダー。
【請求項２３】前記各フラグメントの相対質量が、別のフラグメントの相
対質量の約１．５倍を超えない、請求項１に記載の組成物またはラダー。
【請求項２４】前記各フラグメントの相対質量がほぼ同一である、請求項
１に記載の組成物またはラダー。
【請求項２５】前記フラグメントが検出可能に標識されている、請求項１
に記載の組成物またはラダー。
【請求項２６】前記検出可能な標識が、放射性標識、蛍光標識、および化
学発光標識からなる群より選択される、請求項２５に記載の組成物またはラダー
。
【請求項２７】前記ＤＮＡフラグメントの混合物が、１００ｂｐフラグメ
ントを約９コピー、２００ｂｐフラグメントを約４コピー、４００ｂｐフラグメ
ントを約３コピー、５００ｂｐフラグメントを約２コピー、６５０ｂｐフラグメ
ントを約１コピー、８５０ｂｐフラグメントを約１コピー、１０００ｂｐフラグ
メントを約１２コピー、および１６５０ｂｐフラグメントを約１コピー含む、請
求項４に記載の組成物またはラダー。
【請求項２８】請求項１に記載のフラグメントを含む、組換えＤＮＡ分子
。
【請求項２９】前記分子がベクターである、請求項２８に記載の組換えＤ
ＮＡ分子。
【請求項３０】前記ベクターがプラスミドである、請求項２９に記載の組
換えＤＮＡ分子。
【請求項３１】前記プラスミドがｐＫＢ１８４７である、請求項３０に記
載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項３２】請求項２８に記載の組換えＤＮＡ分子を含む宿主細胞。
【請求項３３】請求項２９に記載の組換えＤＮＡ分子を含む宿主細胞。
【請求項３４】請求項３１に記載の組換えＤＮＡ分子を含む宿主細胞。
【請求項３５】請求項２８に記載の組換え分子の酵素消化から得られるラ
ダー。
【請求項３６】請求項２９に記載の組換え分子の酵素消化から得られるラ
ダー。
【請求項３７】請求項３１に記載の組換え分子の酵素消化から得られるラ
ダー。
【請求項３８】１以上の未知の長さの核酸分子を大きさ分けするための方
法であって、以下の工程：（ａ）請求項１に記載の組成物またはラダーのフラグメントを、該核酸分子と
ともに、大きさに従って分離する工程；および（ｂ）該核酸分子の大きさを決定する工程、を包含する、方法。
【請求項３９】請求項１に記載のフラグメントを含む、キット。
【請求項４０】前記フラグメントが単一の容器中に混合されている、請求
項３９に記載のキット。
【請求項４１】前記異なる大きさのフラグメントが、異なる容器中に分離
されている、請求項３９に記載のキット。
【請求項４２】さらに、検出可能な色素をさらに含む、請求項３９に記載
のキット。