JPH0697999B2 - Ｄｎａの分子量測定用標準マ−カ− - Google Patents
Ｄｎａの分子量測定用標準マ−カ−Info
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- JPH0697999B2 JPH0697999B2 JP61148891A JP14889186A JPH0697999B2 JP H0697999 B2 JPH0697999 B2 JP H0697999B2 JP 61148891 A JP61148891 A JP 61148891A JP 14889186 A JP14889186 A JP 14889186A JP H0697999 B2 JPH0697999 B2 JP H0697999B2
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- dna
- plasmid
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Description
【発明の詳細な説明】 ＜産業上の利用分野＞ 本発明は、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動等によりDNAの分子量を測定する場合に適用され
るDNAの分子量測定用標準マーカーに関するものであ
り、更に詳しくは、高分子量領域から低分子量領域に至
る広い分子量領域にわたって適度に分散分布した泳動バ
ンドをゲル上に明瞭に形成し得るDNAの分子量測定用標
準マーカーに関するものである。
気泳動等によりDNAの分子量を測定する場合に適用され
るDNAの分子量測定用標準マーカーに関するものであ
り、更に詳しくは、高分子量領域から低分子量領域に至
る広い分子量領域にわたって適度に分散分布した泳動バ
ンドをゲル上に明瞭に形成し得るDNAの分子量測定用標
準マーカーに関するものである。
＜従来の技術及びその問題点＞ 従来、アガロースゲル電気泳動、アクリルアミドゲル電
気泳動等に代表されるゲル電気泳動により、DNAの分子
量を測定する場合にスタンダード（参照用標準）として
使用される分子量測定用標準マーカー（以下、分子量マ
ーカーという）が、種々、開発されているが、実際に
は、DNAの分子量領域を広い範囲でカバーする広分子量
領域で使用可能な分子量マーカーは比較的少なく、一般
に、低分子量領域で優れた分散分布特性を示す低分子量
マーカーと、高分子量領域で同様の特性を示す高分子量
マーカー等を、適宜、選択し、利用目的に応じて、各々
組み合わせて使用することが一般的な使用方法となって
いる。
気泳動等に代表されるゲル電気泳動により、DNAの分子
量を測定する場合にスタンダード（参照用標準）として
使用される分子量測定用標準マーカー（以下、分子量マ
ーカーという）が、種々、開発されているが、実際に
は、DNAの分子量領域を広い範囲でカバーする広分子量
領域で使用可能な分子量マーカーは比較的少なく、一般
に、低分子量領域で優れた分散分布特性を示す低分子量
マーカーと、高分子量領域で同様の特性を示す高分子量
マーカー等を、適宜、選択し、利用目的に応じて、各々
組み合わせて使用することが一般的な使用方法となって
いる。
現在、広く普及している分子量マーカーとして、例え
ば、φ×174RFを制限酵素Hae IIIで切断して作製された
ものや、λファージDNAを制限酵素Hind IIIで切断し作
成されたもの等があるが、前者は、低分子量領域におい
て優れた分散分布特性を示すが、アガロースゲル電気泳
動に用いると、泳動バンドが接近していて分別が不明瞭
となる傾向があり、また、後者は、2Kbp以上の高分子量
領域で有効であるが、低分子量領域における分子量マー
カーとしては不適当である。
ば、φ×174RFを制限酵素Hae IIIで切断して作製された
ものや、λファージDNAを制限酵素Hind IIIで切断し作
成されたもの等があるが、前者は、低分子量領域におい
て優れた分散分布特性を示すが、アガロースゲル電気泳
動に用いると、泳動バンドが接近していて分別が不明瞭
となる傾向があり、また、後者は、2Kbp以上の高分子量
領域で有効であるが、低分子量領域における分子量マー
カーとしては不適当である。
このように、相当する分子量領域に応じて、使用可能な
分子量マーカーが限られているために、実際に、適当な
分子量マーカーを選択し、各々、組み合わせて使用する
ことは煩雑且つ困難になる場合が多く、更に、分子量の
測定精度を高める意味からも、より広い分子量領域にわ
たって適用可能な広域分子量マーカーがあれば、その実
用価値は大きなものである。その上、従来の多くの分子
量マーカーは、その製造工程において高度の技術と繊細
なテクニックが必要とされることから、生産コストが極
めて高く、コスト面からも、より経済性の高い製造技術
を開発することが強く要請されている状況にあった。
分子量マーカーが限られているために、実際に、適当な
分子量マーカーを選択し、各々、組み合わせて使用する
ことは煩雑且つ困難になる場合が多く、更に、分子量の
測定精度を高める意味からも、より広い分子量領域にわ
たって適用可能な広域分子量マーカーがあれば、その実
用価値は大きなものである。その上、従来の多くの分子
量マーカーは、その製造工程において高度の技術と繊細
なテクニックが必要とされることから、生産コストが極
めて高く、コスト面からも、より経済性の高い製造技術
を開発することが強く要請されている状況にあった。
分子量マーカーについてのこのような問題点を検討する
と共に、本発明者らは、より広い分子量領域において適
用可能な優れた分子量マーカーを開発すべく鋭意研究開
発を積み重ねた結果、プラスミドpHY300PLK及び当該pHY
300PLK由来のpHY300.2PLKを、各々特定の制限酵素によ
り切断して得られるDNA断片の混合物が、このような分
子量マーカーとして好適であることを見い出して、本発
明を完成するに至った。
と共に、本発明者らは、より広い分子量領域において適
用可能な優れた分子量マーカーを開発すべく鋭意研究開
発を積み重ねた結果、プラスミドpHY300PLK及び当該pHY
300PLK由来のpHY300.2PLKを、各々特定の制限酵素によ
り切断して得られるDNA断片の混合物が、このような分
子量マーカーとして好適であることを見い出して、本発
明を完成するに至った。
＜問題点を解決するための手段＞ すわち、本発明は、アガロースゲル電気泳動等に適用可
能で、より広い分子量領域において使用することのでき
るDNAの分子量測定標準マーカーを提供することを目的
とするものである。
能で、より広い分子量領域において使用することのでき
るDNAの分子量測定標準マーカーを提供することを目的
とするものである。
そして、このような目的を達成するために採用される本
発明の構成は、プラスミドpHY300PLKに対して唯一の
制限酵素切断部位を有する制限酵素によって当該pHY300
PLKを切断して作製される4,870bpのDNA断片と、当該p
HY300PLKを制限酵素Hae IIIによって切断して作製され
る2,016bp、1,360bp、658bp、489bp、267bp及び80bpの
６種類のDNA断片と、当該pHY300PLK由来のプラスミド
pHY300.2PLKをHae IIIによって切断して作製される1,36
0、1,107、926、658、489、267及び80bpの７種類のDNA
断片とを混合して成るものである。
発明の構成は、プラスミドpHY300PLKに対して唯一の
制限酵素切断部位を有する制限酵素によって当該pHY300
PLKを切断して作製される4,870bpのDNA断片と、当該p
HY300PLKを制限酵素Hae IIIによって切断して作製され
る2,016bp、1,360bp、658bp、489bp、267bp及び80bpの
６種類のDNA断片と、当該pHY300PLK由来のプラスミド
pHY300.2PLKをHae IIIによって切断して作製される1,36
0、1,107、926、658、489、267及び80bpの７種類のDNA
断片とを混合して成るものである。
ここで、前記記載のプラスミドpHY300PLKに対して唯
一の制限酵素切断部位を有する制限酵素としては、例え
ば、BalI、BamHI、BanI、BglI、Bgl II、BstE II、EcoR
I、EcoRV、Hind III、HpaI、SalI、SmaI、PvuI、XbaIが
使用可能であり、中でも、Hind IIIが好適に使用されう
る。
一の制限酵素切断部位を有する制限酵素としては、例え
ば、BalI、BamHI、BanI、BglI、Bgl II、BstE II、EcoR
I、EcoRV、Hind III、HpaI、SalI、SmaI、PvuI、XbaIが
使用可能であり、中でも、Hind IIIが好適に使用されう
る。
出発材料として使用するプラスミドpHY300PLKは、公知
・入手可能（微工研条寄第744号として通商産業省工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託済）のものであり、
大腸菌（Escherichia coli）由来のプラスミドpACYC17
7と、ストレプトコッカス・フェカリス（Streptococcus
faecalis）由来のプラスミドpAMα１を組換えて作製さ
れた複合プラスミドpHY460から公知手段により作製され
る（Jpn.J.Genet.60,235-243（1985）参照）。
・入手可能（微工研条寄第744号として通商産業省工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託済）のものであり、
大腸菌（Escherichia coli）由来のプラスミドpACYC17
7と、ストレプトコッカス・フェカリス（Streptococcus
faecalis）由来のプラスミドpAMα１を組換えて作製さ
れた複合プラスミドpHY460から公知手段により作製され
る（Jpn.J.Genet.60,235-243（1985）参照）。
また、前記記載のプラスミドpHY300.2PLKは、以下の
工程により前記pHY300PLKから作製される。すなわち、
プラスミドpHY300PLKを制限酵素Ban I及びEco RVにより
切断して得られる２種類のDNA断片のうちの低分子量の
断片と、前記複合プラスミドpHY460経由で公知手段によ
り作製されたpHY340をBan I及びEco RVにより切断して
得られる２種類のDNA断片のうちの高分子量の断片とを
連結してpHY300.7PLKを作製する工程を経て、次いで、
当該pHY300.7PLKのNco I2切断部位に、２個のXho Iリン
カーを挿入する工程を施すことにより作製される。
工程により前記pHY300PLKから作製される。すなわち、
プラスミドpHY300PLKを制限酵素Ban I及びEco RVにより
切断して得られる２種類のDNA断片のうちの低分子量の
断片と、前記複合プラスミドpHY460経由で公知手段によ
り作製されたpHY340をBan I及びEco RVにより切断して
得られる２種類のDNA断片のうちの高分子量の断片とを
連結してpHY300.7PLKを作製する工程を経て、次いで、
当該pHY300.7PLKのNco I2切断部位に、２個のXho Iリン
カーを挿入する工程を施すことにより作製される。
なお、前記pHY300.7PLKの作製は、従来、公知の手段に
より実施される（Jpn.J.Genet.60,485-498（1985）参
照）。そして、このpHY300.7PLKは、制限酵素Nco Iによ
る切断部位が、pHY340由来のDNA断片中（これをNco I1
とする）と、pHY300PLK由来のDNA断片中（これをNco I
とする）の２ケ所に存在するが、このうち、Nco I2切断
部位に、Xho Iリンカーが２個挿入されたものが、pHY30
0.2PLK（4,877bp）である。
より実施される（Jpn.J.Genet.60,485-498（1985）参
照）。そして、このpHY300.7PLKは、制限酵素Nco Iによ
る切断部位が、pHY340由来のDNA断片中（これをNco I1
とする）と、pHY300PLK由来のDNA断片中（これをNco I
とする）の２ケ所に存在するが、このうち、Nco I2切断
部位に、Xho Iリンカーが２個挿入されたものが、pHY30
0.2PLK（4,877bp）である。
このpHY300.2PLKは、挿入された２個のXho Iリンカーに
より、新たにXho I切断部位及びHae III切断部位が形成
されると共に、Nco I2切断部位を消失するが、テトラサ
イクリン耐性遺伝子中のNco I1は残存しているので、当
該pHY300.2PLKによる形質転換体は、テトラサイクリン
耐性を示す。
より、新たにXho I切断部位及びHae III切断部位が形成
されると共に、Nco I2切断部位を消失するが、テトラサ
イクリン耐性遺伝子中のNco I1は残存しているので、当
該pHY300.2PLKによる形質転換体は、テトラサイクリン
耐性を示す。
pHY300.2PLKの製作工程及びpHY300.2PLKの制御酵素地図
を、各々、第２図及び第３図に示す。
を、各々、第２図及び第３図に示す。
前記工程〜におけるpHY300PLK及びpHY300.2PLKの制
限酵素による切断は、常法により実施され、これにより
得られたDNA断片を、適宜の割合で混合することによ
り、目的の分子量マーカーが製作される。
限酵素による切断は、常法により実施され、これにより
得られたDNA断片を、適宜の割合で混合することによ
り、目的の分子量マーカーが製作される。
そして、例えば、前記、及び記載のDNA断片を、
1:2:10の割合で混合して作製した分子量マーカーを１％
アガロースゲル電気泳動により泳動テストした結果（第
４図Ａ、レーン２参照）から確認されるように、本発明
の分子量マーカーは、5000bpの高分子量領域から、80bp
の低分子量領域にわたって、適度に分散分布した９本の
明瞭なバンドの形成が可能であるという従来製品にみら
れない顕著な効果を有することが判明した。
1:2:10の割合で混合して作製した分子量マーカーを１％
アガロースゲル電気泳動により泳動テストした結果（第
４図Ａ、レーン２参照）から確認されるように、本発明
の分子量マーカーは、5000bpの高分子量領域から、80bp
の低分子量領域にわたって、適度に分散分布した９本の
明瞭なバンドの形成が可能であるという従来製品にみら
れない顕著な効果を有することが判明した。
また、DNA断片作製のための出発材料としてのpHY300PLK
及びpHK300.2PLKは、大腸菌（E.coil）によるマルチコ
ピーベクターとして、簡潔な処理により、きわめて高収
率の生産が可能であることから、生産コストの面に関し
てもそのコスト低減効果は絶大である。
及びpHK300.2PLKは、大腸菌（E.coil）によるマルチコ
ピーベクターとして、簡潔な処理により、きわめて高収
率の生産が可能であることから、生産コストの面に関し
てもそのコスト低減効果は絶大である。
本発明の分子量マーカーの構成要素であるpHY300PLK及
びpHY300.2PLKの各切断Ａ〜Ｉと、相当する分子量との
関係を表１に示す。
びpHY300.2PLKの各切断Ａ〜Ｉと、相当する分子量との
関係を表１に示す。
＜実施例＞ 以下に、実施例を記載して、更に、本発明について具体
的に説明するが、本発明は、いうまでもなく当該実施例
の範囲に限定されるものではない。
的に説明するが、本発明は、いうまでもなく当該実施例
の範囲に限定されるものではない。
（１） pHY300.7PLKのNco I切断部部位の削除及びXho
Iリンカーの挿入（pHY300.2PLKの作製） 53μｌのpHY300.7PLK DNA（100μg/ml）（J.Genet.60,4
85−498（1985）参照）に、5.7μｌの10倍濃度緩衝液
（1M Tris-HCl（pH7.6）、70mM MgCl2、70mM β−メ
ルカプトエタノール、500mM NaCl）を加えた後、Nco I
（3.5u/μｌ）を２μｌ添加し、37℃、30分間反応させ
た。70℃で５分間加熱することにより反応を停止させた
後、１％低融点アガロースゲル（BRL社製、１μg/mlエ
チジウムブロマイド含有）電気泳動を行い、Nco Iによ
り１ヶ所が切断された分子量約3.0Mdのバンドを切り出
した。
Iリンカーの挿入（pHY300.2PLKの作製） 53μｌのpHY300.7PLK DNA（100μg/ml）（J.Genet.60,4
85−498（1985）参照）に、5.7μｌの10倍濃度緩衝液
（1M Tris-HCl（pH7.6）、70mM MgCl2、70mM β−メ
ルカプトエタノール、500mM NaCl）を加えた後、Nco I
（3.5u/μｌ）を２μｌ添加し、37℃、30分間反応させ
た。70℃で５分間加熱することにより反応を停止させた
後、１％低融点アガロースゲル（BRL社製、１μg/mlエ
チジウムブロマイド含有）電気泳動を行い、Nco Iによ
り１ヶ所が切断された分子量約3.0Mdのバンドを切り出
した。
次いで、これに２倍量の緩衝液（40mM Tris-HCl、20mM
酢酸ナトリウム、1mM 2Na−EDTA（pH8.0））を加
え、65℃の湯浴中で溶かした後、室温までさまし、等量
のフェノールを加えてよく振とうした。次に、室温で15
000rpm、３分間の遠心分離処理を施した後、DNAを含む
水層を採取し、再び等量のフェノールを加え、前記処理
を繰返し、DNAを含む水層を採取した。続いて、これに2
00μｌの緩衝液（50mM Tris、10mM EDTA、100mM NaCl
（pH8.0））を加え、更に全量の２倍量の−20℃の冷エ
タノールを加え、−20℃、30分間冷却した。これに０
℃、15000rpm、５分間の遠心分離を施し、DNA沈澱物を
再び−20℃エタノールで洗浄した後、再度、０℃、1500
0rpm、２分間の遠心処理を施し、上澄のエタノールを捨
て、沈澱物中に残っているエタノールを完全に蒸発させ
た。ここで、得られたDNAに、５μｌの滅菌水を加えてD
NAを溶解し、10倍濃度のT4DNAポリラーゼ緩衝液（670mM
Tris-HCl（pH8.0）、67mM MgCl2、70mM β−メルカ
プトエタノール）２μｌ、滅菌水８μｌ、2.5mM dNTPs
（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）0.8μｌを加え、更に、4u/
μｌのT4DNAポリメラーゼを0.5μｌ加え、37℃で15分
間、反応させた。更に、200μｌの50mM Tris-HCl（pH
8.0）−10mM EDTA−1M NaClを加えた後、フェノール
を加えて酵素を失活させた。次いで、前述の冷エタノー
ル沈澱法よりDNAを回収した。
酢酸ナトリウム、1mM 2Na−EDTA（pH8.0））を加
え、65℃の湯浴中で溶かした後、室温までさまし、等量
のフェノールを加えてよく振とうした。次に、室温で15
000rpm、３分間の遠心分離処理を施した後、DNAを含む
水層を採取し、再び等量のフェノールを加え、前記処理
を繰返し、DNAを含む水層を採取した。続いて、これに2
00μｌの緩衝液（50mM Tris、10mM EDTA、100mM NaCl
（pH8.0））を加え、更に全量の２倍量の−20℃の冷エ
タノールを加え、−20℃、30分間冷却した。これに０
℃、15000rpm、５分間の遠心分離を施し、DNA沈澱物を
再び−20℃エタノールで洗浄した後、再度、０℃、1500
0rpm、２分間の遠心処理を施し、上澄のエタノールを捨
て、沈澱物中に残っているエタノールを完全に蒸発させ
た。ここで、得られたDNAに、５μｌの滅菌水を加えてD
NAを溶解し、10倍濃度のT4DNAポリラーゼ緩衝液（670mM
Tris-HCl（pH8.0）、67mM MgCl2、70mM β−メルカ
プトエタノール）２μｌ、滅菌水８μｌ、2.5mM dNTPs
（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）0.8μｌを加え、更に、4u/
μｌのT4DNAポリメラーゼを0.5μｌ加え、37℃で15分
間、反応させた。更に、200μｌの50mM Tris-HCl（pH
8.0）−10mM EDTA−1M NaClを加えた後、フェノール
を加えて酵素を失活させた。次いで、前述の冷エタノー
ル沈澱法よりDNAを回収した。
ここで、得られたDNAに2.0μｌの滅菌水を加えて溶解さ
せ、Xho Iリンカー［ｄ（pCCTCGAGG）／宝酒造（株）
製、0.01 OD/ml］を１μｌ加え、３μｌの10mM ATP、
３μｌの100mMジチオスレイトール、３μｌの660mM Tr
is−HCl（pH7.6）−66mM MgCl2加え、更に、3u/μ１の
T4DNAリガーゼを１μｌ加えた。15℃で３時間の反応を
行わせた後、120μｌの滅菌水を加え全量を150μｌとし
た。
せ、Xho Iリンカー［ｄ（pCCTCGAGG）／宝酒造（株）
製、0.01 OD/ml］を１μｌ加え、３μｌの10mM ATP、
３μｌの100mMジチオスレイトール、３μｌの660mM Tr
is−HCl（pH7.6）−66mM MgCl2加え、更に、3u/μ１の
T4DNAリガーゼを１μｌ加えた。15℃で３時間の反応を
行わせた後、120μｌの滅菌水を加え全量を150μｌとし
た。
（２） 大腸菌の形質転換 前記（１）記載の処理で得られたプラスミドDNA 150μ
ｌ（約0.5μｇ）に、150μｌの大腸菌（E.coli K12 C60
0株、Jpn.J.Genet.60、235-243（1985）参照）のコンピ
テント細胞を加え、０℃、10分間放置した後、0.7mlのL
-ブロスを加えて、37℃、１時間培養した。次いで、こ
の培養液をL-ブロスに1.5％の寒天と20μg/mlのテトラ
サイクリンを添加して成る寒天培地の表面に塗布して、
37℃で一夜培養した。この寒天培地上にコロニーを形成
した12株の形質転換体について、保有プラスミドの大き
さを調べた。
ｌ（約0.5μｇ）に、150μｌの大腸菌（E.coli K12 C60
0株、Jpn.J.Genet.60、235-243（1985）参照）のコンピ
テント細胞を加え、０℃、10分間放置した後、0.7mlのL
-ブロスを加えて、37℃、１時間培養した。次いで、こ
の培養液をL-ブロスに1.5％の寒天と20μg/mlのテトラ
サイクリンを添加して成る寒天培地の表面に塗布して、
37℃で一夜培養した。この寒天培地上にコロニーを形成
した12株の形質転換体について、保有プラスミドの大き
さを調べた。
（３） プラスミドの抽出の分子量の測定及びXho I、N
co I切断部位の確認 pHY300.7PLKのNco I切断部位は、テトラサイクリン耐性
遺伝子Tc中に位置していることから、前記（１）記載の
処理でNco I1切断部位を削除すると、テトラサイクリン
感受性になることから、テトラサイクリンを添加したL-
ブロス寒天培地上では、形質転換体の成育は見られな
い。そこで、Nco I切断部位が残存していてテトラサイ
クリン耐性を示す形質転換体からプラスミドを抽出し、
新たにXho I切断部位が形成されたプラスミドを選択し
た。
co I切断部位の確認 pHY300.7PLKのNco I切断部位は、テトラサイクリン耐性
遺伝子Tc中に位置していることから、前記（１）記載の
処理でNco I1切断部位を削除すると、テトラサイクリン
感受性になることから、テトラサイクリンを添加したL-
ブロス寒天培地上では、形質転換体の成育は見られな
い。そこで、Nco I切断部位が残存していてテトラサイ
クリン耐性を示す形質転換体からプラスミドを抽出し、
新たにXho I切断部位が形成されたプラスミドを選択し
た。
すなわち、前記（２）記載の処理で得られた形質転換体
を5mlのL-ブロスで一夜培養後、遠心分離処理により集
菌し、2mlの20mM Tris-10mM EDTA（pH8.0）に懸濁し、
0.2mlの0.2mg/mlリゾチーム−0.05m/ml RNaseを加えて
室温で５分間の反応を行った後、0.2mlの0.2％SDS溶液
を加え室温で２分間反応させ、０℃、10分間放置後、こ
の溶液に20,000rpm、０℃、10分間の遠心分離処理を施
した。分離された上澄に緩衝液で飽和したフェノールを
等量加え、よく振とうした。更に、これを15,000rpm、
室温、３分間の遠心分離処理を施し、DNAを含む水層を
採取し、15μｌづつ0.8％アガロースゲル電気泳動にか
けて、その分子量を測定した。その結果、12株の形質転
換体の保有するプラスミドは、全て約3.0Mdであった。
を5mlのL-ブロスで一夜培養後、遠心分離処理により集
菌し、2mlの20mM Tris-10mM EDTA（pH8.0）に懸濁し、
0.2mlの0.2mg/mlリゾチーム−0.05m/ml RNaseを加えて
室温で５分間の反応を行った後、0.2mlの0.2％SDS溶液
を加え室温で２分間反応させ、０℃、10分間放置後、こ
の溶液に20,000rpm、０℃、10分間の遠心分離処理を施
した。分離された上澄に緩衝液で飽和したフェノールを
等量加え、よく振とうした。更に、これを15,000rpm、
室温、３分間の遠心分離処理を施し、DNAを含む水層を
採取し、15μｌづつ0.8％アガロースゲル電気泳動にか
けて、その分子量を測定した。その結果、12株の形質転
換体の保有するプラスミドは、全て約3.0Mdであった。
次に、この12株の形質転換体の保有するプラスミドのう
ち、目的どうりXho I切断部位が形成されたものをさが
すために、泳動に使用された残りの、DNAを含む水層か
ら冷エタノール法によりDNAを回収し、このDNAに、100
μｌの10mM Tris-0.1mM EDTA（pH7.4）を加えて溶解し
た。
ち、目的どうりXho I切断部位が形成されたものをさが
すために、泳動に使用された残りの、DNAを含む水層か
ら冷エタノール法によりDNAを回収し、このDNAに、100
μｌの10mM Tris-0.1mM EDTA（pH7.4）を加えて溶解し
た。
このプラスミドDNA10μｌに、２培濃度緩衝液（20mM Tr
is-HCl（pH7.6）、14mM MgCl2、14mM β−メルカプト
エタノール、100mM NaCl）を10μｌ加えた後、更に、12
u/μｌのXho Iを１μｌ添加し、これを37℃で60分間反
応させた。そして、70℃、５分間の加熱処理により、こ
の反応を停止させ、全量を0.8％アガロースゲルで泳動
させた。その結果、Xho Iで切断されたプラスミドDNAが
１種類採取された。
is-HCl（pH7.6）、14mM MgCl2、14mM β−メルカプト
エタノール、100mM NaCl）を10μｌ加えた後、更に、12
u/μｌのXho Iを１μｌ添加し、これを37℃で60分間反
応させた。そして、70℃、５分間の加熱処理により、こ
の反応を停止させ、全量を0.8％アガロースゲルで泳動
させた。その結果、Xho Iで切断されたプラスミドDNAが
１種類採取された。
続いて、この採取されたプラスミドDNA10μｌに２倍濃
度緩衝液（20mM Tris-HCI（pH7.6）、14mM MgCl2、14m
M β−メルカプトエタノール、100mM NaCl）を10μｌ
加え、そこに3.5u/μｌのNco Iと12u/μｌのXho Iを、
各々１μｌ単独又は混合添加し、これを37℃、60分間反
応された後、70℃、５分間の加熱処理により、この反応
を停止させ、全量を0.8％アガロースゲルで電気泳動さ
せた。その結果、目的どおり、Nco I切断部位が削除さ
れ、新たにXho I切断部位の形成されたプラスミドが１
種類得られたことを確認した。そして、これをpHY300.2
PLKと命名した。
度緩衝液（20mM Tris-HCI（pH7.6）、14mM MgCl2、14m
M β−メルカプトエタノール、100mM NaCl）を10μｌ
加え、そこに3.5u/μｌのNco Iと12u/μｌのXho Iを、
各々１μｌ単独又は混合添加し、これを37℃、60分間反
応された後、70℃、５分間の加熱処理により、この反応
を停止させ、全量を0.8％アガロースゲルで電気泳動さ
せた。その結果、目的どおり、Nco I切断部位が削除さ
れ、新たにXho I切断部位の形成されたプラスミドが１
種類得られたことを確認した。そして、これをpHY300.2
PLKと命名した。
なお、前述の処理でNco I2切断部位にXho Iリンカーを
挿入する際、Xho Iリンカーが単一で挿入される場合
と、複数個連結して挿入される場合とが考えられる。借
りに、Xho Iリンカーが２個挿入されていると、連結し
た２個のXho Iリンカーの間に、新しいHae III切断部位
が形成されることになる。
挿入する際、Xho Iリンカーが単一で挿入される場合
と、複数個連結して挿入される場合とが考えられる。借
りに、Xho Iリンカーが２個挿入されていると、連結し
た２個のXho Iリンカーの間に、新しいHae III切断部位
が形成されることになる。
pHY300.7PLKのHae III切断部位は、全部で６個あるが、
pHY300.2PLKのDNAをHae IIIで切断して得られたDNA断片
に関しては、その個数及び各々の分子量をアガロースゲ
ル電気泳動により測定した結果、７個の断片が確認され
た。このことは、新たに形成されたXho I切断部位にHae
III切断部位が形成されていることを意味するものであ
る。すなわち、pHY300.2PLKは、pHY300.7PLKのNco I部
位に２個のKho Iリンカーが挿入されたものであり、そ
の結果、新たにHae III切断部位が形成されたものであ
る（第２図、第３図参照）。
pHY300.2PLKのDNAをHae IIIで切断して得られたDNA断片
に関しては、その個数及び各々の分子量をアガロースゲ
ル電気泳動により測定した結果、７個の断片が確認され
た。このことは、新たに形成されたXho I切断部位にHae
III切断部位が形成されていることを意味するものであ
る。すなわち、pHY300.2PLKは、pHY300.7PLKのNco I部
位に２個のKho Iリンカーが挿入されたものであり、そ
の結果、新たにHae III切断部位が形成されたものであ
る（第２図、第３図参照）。
（４） pHY300PLK及びpHY300.2PLKの各断片の混合によ
るDNA分子量マーカーの作製 前記（３）記載の処理で得られたpHY300.2PLKを常法に
よりHae IIIで切断して得られた７個の切断片（第４図
Ｂ、レーン１）と、pHY300PLK（Jpn.J.Genet.60,235-24
3（1985）参照）を常法により、Hae III及びHind IIIで
各々切断して得られた６個の切断片（第４図Ｂ、レーン
２）及び１個の切断片（第４図Ｂ、レーン３）とを、各
々、10:2:1の混合割合で混合して、目的の分子量マーカ
ーを得た。
るDNA分子量マーカーの作製 前記（３）記載の処理で得られたpHY300.2PLKを常法に
よりHae IIIで切断して得られた７個の切断片（第４図
Ｂ、レーン１）と、pHY300PLK（Jpn.J.Genet.60,235-24
3（1985）参照）を常法により、Hae III及びHind IIIで
各々切断して得られた６個の切断片（第４図Ｂ、レーン
２）及び１個の切断片（第４図Ｂ、レーン３）とを、各
々、10:2:1の混合割合で混合して、目的の分子量マーカ
ーを得た。
アガロースゲル（１％）電液泳動の泳動バンド（第４図
A,レーン２のＡ〜Ｉ）から明らかなように、本発明の分
子量マーカーは、約5,000bpの高分子量領域から80bpの
低分子量領域にわたる広分子量領域に適度に分散分布し
たDNA断片による明瞭なバンドを形成し得る優れた特性
を有するものであることが確認された。
A,レーン２のＡ〜Ｉ）から明らかなように、本発明の分
子量マーカーは、約5,000bpの高分子量領域から80bpの
低分子量領域にわたる広分子量領域に適度に分散分布し
たDNA断片による明瞭なバンドを形成し得る優れた特性
を有するものであることが確認された。
比較対象として、従来の分子量マーカーのφX174PFのHa
e III断片及びλファージDNAのHind III切断片のアガロ
ースゲル（１％）電気泳動による泳動バンドを参照して
みると、φX 174RF分子量マーカーは、低分子量領域で
優れているものの、アガロースゲル（１％）電気泳動で
は、バンドｅ、ｆ、ｇ、ｈ等が接近しているので、その
分別が不明瞭且つ困難であり（第４図Ａ、レーン１、ａ
〜ｈ）、また、λファージDNA分子量マーカーは、高分
子量領域にて限定的に有効なものである（第４図Ａ、レ
ーン３）ことからも、本発明の分子量マーカーは、その
分散分布領域の広さという点で優れたものであることが
明らかである。
e III断片及びλファージDNAのHind III切断片のアガロ
ースゲル（１％）電気泳動による泳動バンドを参照して
みると、φX 174RF分子量マーカーは、低分子量領域で
優れているものの、アガロースゲル（１％）電気泳動で
は、バンドｅ、ｆ、ｇ、ｈ等が接近しているので、その
分別が不明瞭且つ困難であり（第４図Ａ、レーン１、ａ
〜ｈ）、また、λファージDNA分子量マーカーは、高分
子量領域にて限定的に有効なものである（第４図Ａ、レ
ーン３）ことからも、本発明の分子量マーカーは、その
分散分布領域の広さという点で優れたものであることが
明らかである。
更に、本発明の分子量マーカーの作製材料であるpHY300
PLK及びpHY300.2PLKは、大腸菌（E.coli K12 C600株）
を宿主として大量生産が容易であることから、生産コス
トの面でも極めて優れた効果を奏することが確認され
た。
PLK及びpHY300.2PLKは、大腸菌（E.coli K12 C600株）
を宿主として大量生産が容易であることから、生産コス
トの面でも極めて優れた効果を奏することが確認され
た。
第１図は、プラスミドpHY300PLKの制限酵素地図を表わ
す。 第２図は、プラスミドpHY300.2PLKの作製工程を表わ
す。 第３図は、プラスミドpHY300.2PLKの制限酵素地図を表
わす。 第４図は、アガロースゲル（１％）電気泳動による泳動
結果としてのバンドを模写した説明図であり、同図のＡ
において、レーン１は、φX 174RFのHae III切断片（ａ
〜ｈ）を、レーン２は、本発明の分子量マーカー（Ａ〜
Ｉ）を、レーン３は、λファージDNAのHind IIIの切断
片を、そして、同図Ｂにおいて、レーン１は、pHY300.2
PLKのHae III切断片を、レーン２は、pHY300PLKのHae I
II切断片を、レーン３は、pHY300PLKのHind III切断片
を、各々表わす。
す。 第２図は、プラスミドpHY300.2PLKの作製工程を表わ
す。 第３図は、プラスミドpHY300.2PLKの制限酵素地図を表
わす。 第４図は、アガロースゲル（１％）電気泳動による泳動
結果としてのバンドを模写した説明図であり、同図のＡ
において、レーン１は、φX 174RFのHae III切断片（ａ
〜ｈ）を、レーン２は、本発明の分子量マーカー（Ａ〜
Ｉ）を、レーン３は、λファージDNAのHind IIIの切断
片を、そして、同図Ｂにおいて、レーン１は、pHY300.2
PLKのHae III切断片を、レーン２は、pHY300PLKのHae I
II切断片を、レーン３は、pHY300PLKのHind III切断片
を、各々表わす。
Claims (2)
- 【請求項１】下記Ｉの制限酵素地図で示されるプラスミ
ドpHY300PLKに対して唯一の制限酵素切断部位を有する
制限酵素によって当該pHY300PLKを切断して得られる4,8
70bpのDNA断片と、当該pHY300PLKを制限酵素Hae IIIに
よって切断して得られる2,016bp、1,360bp、658bp、489
bp、267bp及び80bpの６種類のDNA断片と、当該pHY300PL
K由来の下記IIの制限酵素地図で示されるプラスミドpHY
300.2PLKを制限酵素Hae IIIによって切断して得られる
1,360bp、1,107bp、926bp、658bp、489bp、267bp及び80
bpの７種類のDNA断片とを、混合して成るDNAの分子量測
定用標準マーカー。 - 【請求項２】プラスミドpHY300PLKに対して唯一の制限
酵素切断部位を有する制限酵素が、Hind IIIである特許
請求の範囲第１項記載のDNAの分子量測定用標準マーカ
ー。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61148891A JPH0697999B2 (ja) | 1986-06-25 | 1986-06-25 | Ｄｎａの分子量測定用標準マ−カ− |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61148891A JPH0697999B2 (ja) | 1986-06-25 | 1986-06-25 | Ｄｎａの分子量測定用標準マ−カ− |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63113359A JPS63113359A (ja) | 1988-05-18 |
| JPH0697999B2 true JPH0697999B2 (ja) | 1994-12-07 |
Family
ID=15463007
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61148891A Expired - Fee Related JPH0697999B2 (ja) | 1986-06-25 | 1986-06-25 | Ｄｎａの分子量測定用標準マ−カ− |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0697999B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5316908A (en) * | 1990-07-13 | 1994-05-31 | Life Technologies, Inc. | Size markers for electrophoretic analysis of DNA |
| US5302510A (en) * | 1992-07-27 | 1994-04-12 | Life Technologies, Inc. | DNA sizing control standards for electrophoretic analyses |
| DE69842088D1 (de) | 1997-07-15 | 2011-02-17 | Life Technologies Inc | Nukleinsäureleitern |
-
1986
- 1986-06-25 JP JP61148891A patent/JPH0697999B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63113359A (ja) | 1988-05-18 |
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |