JP2001504530A

JP2001504530A - メチリデンマロン酸ナノ粒子の調製法、場合により一つ又は複数の生理活性分子を含有するナノ粒子及びそれを含有する医薬組成物

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Publication number: JP2001504530A
Application number: JP52010798A
Authority: JP
Inventors: ニコル・ブリュ・マニエズ; グザヴィエ・ギヨン; パスカル・ブルトン; パトリック・クヴロール; フランスワ・レスキュール; クロード・ロック・カルメス; ジェラール・リエス
Original assignee: ヴィルソル
Priority date: 1996-10-25
Filing date: 1997-10-24
Publication date: 2001-04-03
Also published as: ATE245171T1; US6211273B1; NZ335094A; RU2214421C2; KR20000052813A; PL332957A1; SK55599A3; FR2755136A1; HUP9904359A2; NO991942L; FR2755136B1; CA2269783C; US6420468B2; EP0934059B1; IL129355A0; US20010006989A1; HUP9904359A3; AU736097B2; NO991942D0; TW503109B

Abstract

(57)【要約】本発明は、式（Ｉ） −Ａはの基、又は、の基を表し；−Ｒ₁及びＲ₂は同一若しくは異なって、直鎖状又は分岐状の炭素数１〜６のアルキル基を表し；−ｎは１、２、３、４又は５である；で表される少なくとも一つのの化合物のランダム重合体から形成されるナノ粒子の調製法であって、単量体が、重合前に、得られる重合体の非溶媒性混合物を重合溶媒とともに構成する水混和性非プロトン有機溶媒中に溶解されていることを特徴とする調製法に関する。本発明は、場合によっては一つ又は複数の生理活性分子を含有するナノ粒子、そして、そのナノ粒子をも含有する医薬組成物にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】メチリデンマロン酸ナノ粒子の調製法、場合により一つ又は複数の生理活性分子を含有するナノ粒子及びそれを含有する医薬組成物本発明は、メチリデンマロン酸（ｍａｌｏｎａｔｅｍｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ）重合化合物から形成されるナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）の新規調製法、場合により一つ又は複数の生理活性分子を含有する上記ナノ粒子、及び、それらを含有する医薬組成物に関するものである。「ナノ粒子」は、粒径約５００ナノメートル未満のミクロン以下の粒子を意味するものである。アルキルシアノアクリレートの乳化重合により製造されるナノ粒子はＥＰ特許０００７８９５に記載されている。このアルキルシアノアクリレート粒子の調製に用いられる方法は、自発的に水性溶媒中で生じる単量体の（アニオン）重合によるものである。同原理（アニオン乳化重合）に従ったメチリデンマロン酸重合体で構成されるナノ粒子の製造法は、特にＦ．ＬｅｓｃｕｒｅらのＰｈａｒｍ．Ｒｅｓ.，１９９４．１１１２７０−１２７６に記載されている。上記単量体は、その調製法がＥＰ特許０２８３３６４に記載されており、シアノアクリレートに類似した構造を有するものであるが、シアノアクリレート中のニトリル基はエステル基、又は、エステル−エステル基に置換されている。シアノアクリレートと同様、上記単量体は低温の水性媒体中で重合されるものであり、生分解されうる。しかしながら、このようにして得られるメチリデンマロン酸ナノ粒子には必然的な欠点がある。実際に、メチリデンマロン酸を乳化重合してナノ粒子にすると、弱酸性ｐＨの水層では主に三量体型や四量体型のオリゴマーを形成するが、それらは非常に生分解されやすい。これらの分子種は部分的に水溶性であるため、これらのナノ粒子は水性溶媒での分散により可溶化され、粒子構造は急速に損なわれる（Ｐ．Ｂｒｅｔｏｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，１９９６，４２，９５−１０３）。生理活性分子がメチリデンマロン酸ナノ粒子と会合している場合、該分子は投与後非常に早く解離されるので、循環系において、粒子マトリックスを形成するオリゴマーが急速に溶解化され、最終的に活性元素の活性部位に至る前に希釈が生じる可能性がある。ある実験により、塩基性ｐＨでの重合においては、ナノ粒子の大きさを維持しつつ、高分子量の重合体の形成が可能であることが示されている。しかしながら、そのような合成は、 −個々のナノ粒子を構成している、Ｍｗ１００００未満の重合体、ましてやＭｗ８０００未満の重合体を、凝集させず、かつ、影響力のあるオリゴマー種を生成させずに得ることは不可能であり、 −これらの調製物の血管内への投与を不可能にするような凝集形成を避けることなく、Ｍｗ２００００をこえる重合体、ましてやそれより高分子量の重合体を、高ｐＨ値（ｐＨ＞７）において構成するのは不可能である。「Ｍｗ」はＭｗ＝Σｎｉ．Ｍｉ²／Σｎｉ．Ｍｉと定義される体積平均分子量（又は平均分子量）を意味し、Ｍｐは量的に多数を占める種の分子量を意味するものである。以後の記述において、分子量はポリスチレン当量（Ｅｐ）で示す。この調製法は、それゆえ、 −平均分子量約５０００〜１００００の、特に約８０００の重合体 −凝集が生じてない平均分子量２００００をこえる重合体からなるメチリデンマロン酸のナノ粒子の調製が望まれる場合、適さない。本発明は、それゆえ、粒径５００ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍ〜５００ｎｍであって、広範囲の分子量（Ｍｗ約２０００〜８００００）を有する同質の分子種から構成されたメチリデンマロン酸ナノ粒子の調製にある。その原理は、水混和性非プロトン有機層中に単量体を溶解させることにあるが、上記有機層は、上記ナノ粒子調製法の条件下では、生成する重合体の非溶媒性混合物を水性重合溶媒とともに構成するものである。「非プロトン有機層」又は「非プロトン有機溶媒」はアニオンを生じさせることができ、かつ、化学変化を起こしやすいプロトンを有しない有機層又は有機溶媒を意味するものである。本発明の調製法の利点は、数多くあり、； −重合溶媒において単量体のより均一な分散が可能となり、 −揮発性である故、蒸発しやすい非塩素化溶媒を使用でき、 −重合体の凝集形成を防ぐことができ、 −高重合率となり、 −粒径５００ｎｍ未満のナノ粒子を形成する際、同質で広範囲な分子量（Ｍｗ約２０００〜１０００００、特に約２０００〜８００００）の重合体による構成が可能である。さらに、本調製法では非イオン界面活性剤やコロイド保護重合体等、柔軟性のある界面を有する粒子をもたらす分散剤の使用が可能である。その上、本発明によるナノ粒子を構成するオリゴマー／ポリマーの分子量は以下の調製条件； −有機層の単量体濃度 −重合溶媒のｐＨ及びモル濃度 −分散剤の性質と濃度 −水層（重合溶媒）／有機層の体積比 −水層における有機混合物の導入方法を調製することにより、完全に達成される。本発明は、第一に、式（Ｉ） −Ａはの基、又は、の基を表し； -Ｒ₁及びＲ₂は同一若しくは異なって、直鎖状又は分岐状の炭素数１〜６のアルキル基を表し； −ｎは１、２、３、４又は５である；で表される少なくとも一つの化合物のランダム重合体から形成されるナノ粒子の調製法であって、上記単量体が、重合前に、得られる上記重合体の非溶媒性混合物を重合溶媒とともに構成している水混和性非プロトン有機溶媒中に溶解されていることを特徴とする調製法に関する。本発明は、好ましくは、式（Ｉ） −Ａはの基、又は、の基を表し； −Ｒ₁及びＲ₂は同一若しくは異なって、直鎖状又は分岐状の炭素数１〜６のアルキル基を表し； −ｎは１、２、３、４又は５である；で表される化合物の重合体から形成されるナノ粒子の調製法であって、重合前に、上記単量体が、得られる重合体の非溶媒性混合物を、重合溶媒とともに構成している水混和性非プロトン有機溶媒に溶解されていることを特徴とする調製法である。本発明による方法は、更に好ましくは、粒径５００ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍ〜５００ｎｍであり、平均分子量（Ｍｗ）が約１０００〜１０００００、好ましくは約１０００〜８００００、より好ましくは約２０００〜８００００、更に好ましくは約８０００〜８００００であるナノ粒子の調製を可能にするものである。特に、本発明による調製法は −水混和性非プロトン有機溶媒中で、少なくとも一つの式（Ｉ）の化合物の溶液を調製して、 −攪拌しながら、ｐＨ４．５〜１０の水性重合溶媒へ上記有機層を加え、 −混合物を均一化した後、このようにして得られたナノ粒子を回収し、有機溶媒を真空除去する、工程からなるものである。水性重合溶媒は予め溶解させた単量体を含有する有機層へ加えることもできる。また別に、本発明による調製法は、 −少なくとも一つの式（Ｉ）の化合物の溶液を水混和性非プロトン有機溶媒中で調製して、 −攪拌しながら、ｐＨ４．５〜１０の水性重合溶媒を上記有機層へ加え、 −混合物を均一化した後、このようにして得られたナノ粒子を回収し、有機溶媒を真空除去する工程からなるものである。後に実施例で示すように、重合溶媒のｐＨは、調製したい重合体の分子量に応じて選択される。好ましくは、有機層と水性溶媒の混合物は約３０分間攪拌し続けて均一にし、そして、場合により、蒸留水で調製を終了させる。重合溶媒中に沈殿物を形成させた重合体は、例えば濾過により回収することが可能である。このようにして得られたナノ粒子の上澄液は、条件を調節して真空乾燥することができる。単量体を分散するために用いる非プロトン有機溶媒は、水とも混和する上記単量体用の溶媒でなければならない。この溶媒は、好ましくは、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、テトラヒドロフランより選ばれるが、特にアセトンが好ましい。上記方法において、好ましくは； −有機溶媒中の式（Ｉ）の単量体濃度は３０ｍｇ／ｍｌ〜１５０ｍｇ／ｍｌの範囲にあり； −重合溶媒のモル濃度は１／３０Ｍ〜１／３Ｍの範囲であり； −有機層に対する水層の体積の割合は３／１〜２０／１、好ましくは、３／１〜１５／１である；ことである。重合溶媒は、一つ又は複数の界面活性剤やコロイド保護剤を含有することが好ましい。上記界面活性剤は、例えば、イオン性又は非イオン性の界面活性剤が挙げられる。上記非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンの共重合体、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）やポリソルベートから選択されるものが好ましく用いられる。コロイド保護剤としては、デキストラン、水溶性セルロース誘導体；ポリエチレングリコール；ポリ（ビニルアルコール）等の多糖類の誘導体が好ましく用いられる。好ましくは、本発明の方法によるナノ粒子を形成させるため重合させる化合物は、Ａが、の基を表し、ｎは１であり、Ｒ₁及びＲ₂はエチル基である式（Ｉ）の化合物である。好ましくは、また本発明の方法によるナノ粒子を形成させるため重合させる化合物は、Ａが、の基を表し、Ｒ₁及びＲ₂はプロピル基である式（Ｉ）の化合物でもある。好ましくは、Ａが、の基、又は、の基である上記定義した式（Ｉ）の化合物の混合物が、ランダムに重合されたものである。本発明は、第２に、上記方法によって得ることのできるものであって、粒径５００ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍ〜５００ｎｍであり、平均分子量（Ｍｗ）が約１０００〜１０００００、好ましくは約１０００〜８００００、より好ましくは約２０００〜８００００、更に好ましくは約８０００〜８００００であり、少なくとも１つの式（Ｉ）のメチリデンマロン酸化合物のランダム重合体より形成されるナノ粒子に関する。特に、上記方法で得られるナノ粒子は、粒径５００ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍ〜５００ｎｍであり、Ｍｗが約１０００〜８００００、好ましくは約２０００〜８００００、より好ましくは約８０００〜８００００であり、式（Ｉ）の化合物の重合体より形成されるものである。好ましくは、本発明は、粒径５００ｎｍ未満、好ましくは、１００ｎｍ〜５００ｎｍであり、平均分子量（Ｍｗ）が約８０００〜１０００００、好ましくは約８０００〜８００００であり、少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物のランダム重合体より形成されるナノ粒子に関する。特に、本発明は、粒径５００ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍ〜５００ｎｍであり、平均分子量（Ｍｗ）は約８０００〜８００００であり、式（Ｉ）の化合物の重合体より形成されるナノ粒子に関する。好ましくは、上記ナノ粒子は、Ａが、の基を表し、ｎは１であり、Ｒ₁及びＲ₂はエチル基である式（Ｉ）の化合物から形成されるものである。他に好ましくは、上記ナノ粒子は、Ａが、の基を表し、Ｒ₁及びＲ₂はプロピル基である式（Ｉ）の化合物から形成されるものである。好ましくは、上記ナノ粒子は、Ａは上記定義したの基、又はの基を表す式（Ｉ）の化合物の混合物のランダム重合体から構成されるものである。更に本発明によれば、上記ナノ粒子は、その重合体ネットワーク中に、一つ又は複数の上述したような生理活性分子を有する。実際に、本発明による方法の有利な点は、有機層（水に不溶性である生理活性分子の場合）又は重合溶媒が、一つ又はそれ以上の生理活性分子を含有できることにある。「生理活性分子」としては限定されず、試験管内又は生体内で、予防薬や治療薬的な生理活性を有する分子や巨大分子、好ましくは抗感染剤、特に殺菌剤、抗生物質、抗ウイルス剤、抗寄生虫剤、有糸分裂阻害剤、特に抗ガン剤などを意味するものである。用いられることのできる抗生物質や殺菌剤としては、例えば、リファンピシンやコリスチンである。抗ウイルス剤としては、特に限定されず、ディダノシン（ｄｉｄａｎｏｓｉｎ）、リブァヴィリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）、ジトブジン（ｚｉｄｏｖｕｄｉｎ）、アシクロビア（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）、ガンシクロビア（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）、フォスカーネット（ｆｏｓｃａｒｎｅｔ）、ビダラビン（ｖｉｄａｒａｂｉｎ）、ザルシタビン（ｚａｌｃｉｔａｂｉｎ）が挙げられる。例えば、Ｃｉｓ−プラスチン、５−フルオロウラシル、又は、タキソール（ｔａｘｏｌ）が抗ガン剤として用いられる。他に好ましい抗腫瘍剤としてＥＰ出願０６１４３６６にその活性が記載されているクレアチンリン酸が挙げられる。本発明は、また薬学的に許容される賦形剤と一つ又は複数の生理活性分子とを有するナノ粒子を含有する医薬組成物に関する。本発明の組成物は、例えば、経口投与、舌下投与、皮下投与、筋肉投与、静脈投与、経皮投与、局所投与、直腸投与、肺や鼻を経由させて投与することができる組成物である。好ましい投与形態としては、錠剤、ゼラチンカプセル、粉薬、糖衣錠、経口用溶液や経口用懸濁液等の経口型、皮下投与型や筋肉投与型と同様、舌下投与型や口内投与型、静脈投与型、鼻孔内投与型、眼球投与型、直腸投与型がある。以下実施例により本発明を示すが、実施例中、ナノ粒子の調製は室温（約２１ ℃）にて行った。ナノ粒子の大きさや粒径はレーザー分散計数器（ｃｏｕｌｔｅｒＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＩｎｃ．、米国）で測定した。重合体分子量はゲル濾過クロマトグラフィーで決定した。実施例１予め３時間２５ミリバールで二酸化硫黄を脱着させた、５００ｍｇの１−エトキシカルボニル−１−エトキシカルボニルメチレンオキシカルボニルエテン（ラボラトリーズＵＰＳＡ／ＣＡＲＰＩＢＥＭ，フランス）をアセトン５．５５ｍｌに溶解させた。そしてその溶液を、マグネティックスターラーで攪拌しながら５００ｍｇのデキストラン７０（ＦＲＵＫＡＣＨＥＭＩＥ、スイス）を含有した５０ｍｌのｐＨ８の緩衝水溶液（Ｎａ₂ＨＰＯ₄／ＫＨ₂ＰＯ₄、１／15Ｍ）へ徐々に混合した。重合がほぼ瞬時に進み、直ちにコロイド溶液のチンダル効果特性を有する濁った混合液が確認された。有機層を全て加えてから、３０分間攪拌を続けた。続いて、２．５ｇのグルコース又はトレハロース（コロイド保護剤及び凍結防止剤）を含む蒸留水５０ｍｌをナノ粒子懸濁液に加え、その混合液を真空乾燥してアセトンを除去し５０ｍｌの水性懸濁液とした。濾紙（孔径５−１５μ ｍ）に通して濾過を行い、調製物を真空乾燥した。レーザー分散により測定したところ、濾液に含まれる粒子の粒径は２８８ｎｍであった。粒子の重合体マトリックスを構成するメチリデンマロン酸の平均分子量（Ｍｗ）は、ゲル濾過クロマトグラフィーによると６７０００であった。実施例２：ｐＨ変化の実験実施例１と同様の手法を用いて実験を行ったが、リン酸緩衝液のｐＨを変更した。結果を下記表１に示した。表中、Ｍｐは主要な分子種の分子量であり、Ｍｗは重合体の平均分子量である。表１この結果より、ナノ粒子を構成する重合体の平均分子量は、通常、重合溶媒のｐＨとともに増加する。図１で示したゲル濾過クロマトグラフィーはｐＨ５．５（濃度９０ｍｇ／ｍｌ）で調製した重合体の分子量の分布を示す。１に見られる幅広いピークは平均分子量（Ｍｗ）の高い分子種に対応し、２に見られる狭いピークはマイナーオリゴマー（主にトリマーやテトラマー）に対応する。点線はクロマトグラムで測定できる箇所を定めている。ピークＦは内部標準としてトルエンを用いたものであり、負のピークは水の跡形に相当するものである。実施例３単量体濃度の変化についての実験実施例１と同様の手法を用いて実験を行ったが、アセトン中の単量体濃度だけを変更した。結果を下記表２に示した。表２表中、主要な分子種の分子量（Ｍｐ）は、ナノ粒子を構成する重合体の平均分子量（Ｍｗ）と同様、通常有機層中の単量体の濃度とともに増加する。実施例４実施例１〜３と同様に実験を行ったが、コロイド保護剤であるデキストラン７０を非イオン界面活性剤であるプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ６８（ＢＡＳＦＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，アメリカ）に変えた。結果を下記表３に示した。表３＊アセトン中の単量体の濃度＝９０ｍｇ／ｍｌこの結果は、ｐＨが等しい場合、 −コロイド保護剤が存在する場合に比べて界面活性剤が存在する場合、主要な分子種の分子量（Ｍｐ）とナノ粒子を構成する重合体の平均分子量（Ｍｗ）は増加し、 −コロイド保護剤が存在する場合に比べて界面活性剤が存在する場合、同種類のナノ粒子の大きさは減少することを示す。実施例５重合溶媒のモル濃度についての実験実施例１と同様に実験を行ったが、１６．６ｍｌアセトンに溶解させた５００ｍｇの単量体を、モル濃度を増加させ更にプルロニックＦ６８を０．５％含有させたリン酸緩衝水溶液（Ｎａ₂ＨＰＯ₄／ＫＨ₂ＰＯ₄）へ加えた。結果を下記表４に示した。表４この結果より、溶媒のモル濃度増加に比例して、ナノ粒子を構成する重合体の平均分子量（Ｍｗ）は減少することが示された。実施例６実施例１から３と同様に調製したナノ粒子と、ＬｅｓｃｕｒｅらのＰｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１９９４．１１，１２７０−１２７６に記載されている方法に従い調製したナノ粒子を比較した。そのために、１００ｍｇの単量体を、攪拌しながらｐＨ５〜８のリン酸緩衝水溶液（Ｎａ₂ＨＰＯ₄／ＫＨ₂ＰＯ₄、１／15Ｍ）１０ｍｌへ混合した。結果は下記表５で示すが、分子量９２０以下の分子種のいずれもをオリゴマーと定義している。表５＊凝集の存在＊＊アセトン中のモノマー濃度=９０ｍｇ／ｍｌ結果は、同一のｐＨ条件下の場合、 −Ｌｅｓｃｕｒｅらの方法に従い調製したナノ粒子を構成する重合体の平均分子量（Ｍｗ）は、本発明の方法によって得られる重合体の平均分子量（Ｍｗ）よりも小さく； −重合体を構成するオリゴマー（トリマー−テトラマー）の含有率は本発明の方法に従い調製を行ったナノ粒子の方が非常に低い； −ナノ粒子の重合率は、Ｌｅｓｃｕｒｅらの方法に従い調製したナノ粒子に比して、本発明に従い調製を行ったナノ粒子の方が高い（Ｌｅｓｃｕｒｅらの方法では塩基性ｐＨにおいて凝集が生じ、低収率となった）。図２で示したゲル濾過クロマトグラフィーにおいて、一方（線Ａ）は本発明の方法に従ったものであり、もう一方（線Ｂ）はＬｅｓｃｕｒｅらの方法に従ったものであり、ｐＨ７．５で調製した重合体の分子量の分布を示す。トルエンに対応するピーク３とは別に、線Ａでは、大部分の分子種（Ｍｐ＝４０２７８）に相当する単一ピーク１が確認され、線Ｂでは、オリゴマー（トリマーとテトラマー）に相当する有意なピーク２も観察される。実施例７プルロニックＦ６８（ＢＡＳＦＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，アメリカ）を０．５％含有するｐＨ５；６．５又は８の緩衝水溶液（Ｎａ₂ＨＰＯ₄／ＫＨ₂ＰＯ₄ 、１／15Ｍ）５０ｍｌを、予め３時間２５ミリバールで二酸化硫黄を脱着させた５００ｍｇの１−エトキシカルボニル−１−エトキシカルボニルメチレンオキシカルボニルエテン単量体（ラボラトリーズＵＰＳＡ／ＣＡＲＰＩＢＥＭ，フランス）のアセトン溶液５．５５ｍｌへ、マグネティックスターラーでかき混ぜながら徐々に混合した。有機層を完全に加えてから、ｐＨ５と６．５では１６時間攪拌を行い、ｐＨ８では３０分間攪拌を行った。続いて、２．５ｇのグルコース又はトレハロース（コロイド保護剤及び凍結防止剤）を含む５０ｍｌ蒸留水をナノ粒子懸濁液に加え、その混合液を真空乾燥してアセトンを除去し、５０ｍｌの水性懸濁液とした。濾紙（孔径５−１５μｍ）に通して濾過を行い、調製物を真空乾燥した。濾液中に含有された粒子の粒径はレーザー分散により測定した。粒子の重合体マトリックスを構成するメチリデンマロン酸の平均分子量（Ｍｗ）はゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した。結果を下記表６で示す。表中、Ｍｐは主要な分子種の分子量であり、Ｍｗは重合体の平均分子量である。収率は、反応溶媒へ加えた単量体の量とナノ粒子を構成する重合体の量との比で決定した。表６実施例８異なる溶媒を用いた実験実施例１と同様の方法で実験を行ったが、単量体の溶媒としてアセトン、アセトニトリル又はテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を用いた。結果は下記表７に示す。表７実施例９水／溶媒の体積比を変化させた実験実施例１と同様の方法で実験を行ったが、水／アセトンの体積比を変えた。結果は下記表８に示す。表８実施例１０ｐＨ１０での方法を実行させた実験界面活性剤又はコロイド保護剤と界面活性剤の存在下において、実施例１又は実施例７に従った方法を用いて、ｐＨ＝１０の水性溶媒中で試験を行った。１）試験例１１００ｍｇの１−エトキシカルボニル−１−エトキシカルボニルメチレンオキシカルボニルエテン単量体を１ｍｌアセトンに溶解した。この溶液を、マグネティックスターラーでかき混ぜながら、１００ｍｇのデキストラン７０を含有したｐＨ＝１０の水性溶媒１０ｍｌへ、徐々に混合した。重合は瞬時に生じた。有機層を完全に添加した後、３０分間攪拌を行った。続いて、１０ｍｌ蒸留水をナノ粒子懸濁液に加え、その混合液を真空乾燥してアセトンを除去した。溶媒を遠心分離した（ｖ＝１００００ｒｐｍ，１０分間、４℃ ）。２）試験例２デキストラン７０をプルロニックＦ６８に変えたこと以外は試験例１と同様の実験を行った。３）試験例３１００ｍｇのデキストラン７０を含有したｐＨ＝１０の水性溶媒１０ｍｌを、マグネティックスターラーで攪拌しながら、１００ｍｇ単量体と１ｍｌアセトンからなる有機層へ、徐々に混合した。重合は瞬時に生じた。水層を完全に添加した後、３０分間攪拌を行った。続いて、１０ｍｌ蒸留水をナノ粒子懸濁液に加え、その混合液を真空乾燥してアセトンを除去した。溶媒を遠心分離した（ｖ＝１００００ｒｐｍ，１０分間、４℃）。４）試験例４試験例３と同様の実験を行ったが、デキストラン７０をプルロニックＦ６８に変更した。遠心分離後、沈殿したナノ粒子を排除クロマトグラフィーで分析を行い、平均分子量（Ｍｗ）を求めた。結果は下記表９に示す。表９実施例１１実施例１に従った重合法で実験を行ったが、以下ＭＭ３．３と示した１，１− プロポキシカルボニルエテン（ラボラトリーズＵＰＳＡ／ＣＡＲＰＩＢＥＭ，フランス）を単独で、又は、以下ＭＭ２．１．２と示した１−エトキシカルボニル −１−エトキシカルボニルメチレンオキシカルボニルエテン単量体（ラボラトリーズＵＰＳＡ／ＣＡＲＰＩＢＥＭ，フランス）と混合したものを用いた。結果は下記表１０に示したが、表中、Ｍｐは主要な分子種の分子量であり、Ｍｗは重合体の平均分子量である。表１０実施例１２；リファンピシンを含むナノ粒子の調製５ｍｇのリファンピシン塩基（シグマ）を、予め３時間２５ミリバールで二酸化硫黄を脱着させた９０ｍｇの１−エトキシカルボニル−１−エトキシカルボニルメチレンオキシ−カルボニルエテン単量体（ラボラトリーズＵＰＳＡ／ＣＡＲＰＩＢＥＭ，フランス）のアセトン溶液１ｍｌに溶解させた。この溶液を、一定に攪拌（７５０ｒｐｍ）しながら、９０ｍｇのデキストラン７０（１％ｗ／ｖ）を含有するｐＨ＝６．０のリン酸緩衝液（Ｎａ₂ＨＰＯ₄／ＫＨ₂ＰＯ₄、０．０６６Ｍ）９ｍｌへ、ガラスピペットを用いて徐々に混合した。２０℃１８時間の重合後、５％Ｄ−グルコースを含む蒸留水９ｍｌを攪拌しながらナノ粒子懸濁液に加えて、その混合液をロータベーパー（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ）（２０℃、２５ｍｂａｒｓ）で真空乾燥してアセトンを除去し、９ｍｌ水性懸濁液とした。その調製物を−３０℃でおいて凍結を行い、２０℃で３６時間、圧力０．０５ｍｂａｒで昇華させ、真空乾燥した。ナノ粒子の大きさとリファンピシンの濃度を真空乾燥前後で測定した。大きさはレーザー分散で測定した。リファンピシンの測定は吸光光度計と一体となった高速液体クロマトグラフィーで行った。移動層はメタノール／0.05M酢酸アンモニウム（６５：３５）の混合液であり、そのｐＨは７．３に調製し、流速は１ｍｌ／ｍｉｎに一定させ、吸収は２５４ｎｍについて測定した。ナノ粒子に結合していないリファンピシン濃度はナノ粒子懸濁液の超遠心分離（８００００ｇ、１時間、４℃）で得られる上澄液で測定した。ナノ粒子に結合したリファンピシン濃度は、直接リファンピシン量を確定する前にＴＨＦに溶解させた沈殿の分画に相当する。以下の結果が得られた。 −リファンピシンを含有するナノ粒子の大きさ：真空乾燥前２６６±６３ｎｍ、真空乾燥後２８２±５４ｎｍ −リファンピシン結合率：真空乾燥前後８．５±０．５％実施例１３コリスチンを含有するナノ粒子の調製実施例１２に従った重合法で実験を行ったが、有機層を加える前、水溶性の活性成分を０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で重合溶媒に加えた。レーザー分散で測定したコリスチンを含有するナノ粒子の大きさは、真空乾燥後２８２±６５ｎｍであり、４℃４日間の保存後の大きさは２８３±２６ｎｍである。ゲル分散法（Ｓ．Ｐ．Ｇｏｔｏｆｆｅｔ．ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．ＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ，１９６２，１０７−１１３）に従って測定したコリスチン濃度は、ナノ粒子懸濁液の超遠心分離（８００００ｇ、１時間、４℃）で得られる上澄液中、１５μｇ／ｍｌであり：ナノ粒子の結合していない分画は、加えたコリスチン総量に対して、３％であった。実施例１４；アジドチミジン（ＡＺＴ）（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈＣｈｉｍｉｅ、フランス）を含むナノ粒子の調製予め３時間２５ミリバールで二酸化硫黄を脱着させた２４０ｍｇの１−エトキシカルボニル−１−エトキシカルボニルメチレンオキシカルボニルエテン単量体（ラボラトリーズＵＰＳＡ／ＣＡＲＰＩＢＥＭ，フランス）を、アセトン２．５ｍｌに溶解させた。この溶液を、常に攪拌しながら、０．５３ｍｇ／ｍｌの濃度の水溶性活性成分及び２２５ｍｇのデキストラン７０（１％ｗ／ｖ）を含有したｐＨ＝８．０のリン酸緩衝水溶液（Ｎａ₂ＨＰＯ₄／ＫＨ₂ＰＯ₄、０．０６６Ｍ）２２．５ｍｌへ、ガラスピペットで徐々に混合した。２０℃１８時間の重合後、５％Ｄ−グルコースを含有する脱イオン水２２．５ｍｌを、攪拌しながらナノ粒子懸濁液に加えて、その混合液をロータベーパー（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ）（２０℃、２５ｍｂａｒｓ）で真空乾燥してアセトンを除去し、３９．０ｍｌの水性懸濁液とした。その調製物を−３０℃でおいて凍結を行い、２０℃で３６時間、０．０５ｍｂａｒｓの圧力で昇華させ、真空乾燥した。レーザー分散で測定されたＡＺＴを含有するナノ粒子の大きさは、真空乾燥前２５５±６３ｎｍであった。ナノ粒子懸濁液の遠心分離（１２０００ｇ、１時間、４℃）で得られる上澄液中のＡＺＴの濃度はＵＶ吸光度計での２６６ｎｍの値により決定された。濃度は９８μｇ／ｍｌであった。ナノ粒子に結合していない分画は、加えられたＡＺＴの総量に対して３１．９％であった。従って、ナノ粒子が結合したＡＺＴの分画は６８．１％であった。実施例１５クレアチンリン酸（ベーリンガーマンハイム）を含有するナノ粒子の調製クレアチンリン酸のカプセル化を実施例１４に従った重合法で行った。レーザー分散で測定されたクレアチンリン酸を含有するナノ粒子の大きさは、真空乾燥前２７５±２６０ｎｍであった。クレアチンリン酸の測定は吸光光度計と一体となった高速液体クロマトグラフィーで行った。移動層は、ｐＨを３．３に調節したリン酸緩衝液（ＫＨ₂ＰＯ₄、０．０５Ｍ）である。流速は２ｍｌ／ｍｉｎに一定させ、吸光は２００ｎｍについて測定した。ナノ粒子に結合していないクレアチンリン酸の濃度は、ナノ粒子懸濁液の遠心分離（１２０００ｇ、１時間、４℃）で得られる上澄液で測定した。クレアチンリン酸の濃度は、上澄み液中で４６３μｇ／ｍｌであった。ナノ粒子に結合していない分画は、加えたクレアチンリン酸の総量に対して８１％であった。従って、ナノ粒子に結合したクレアチンリン酸の分画は１９％であった。実施例１６５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を含有するナノ粒子の調製５−ＦＵ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈＣｈｉｍｉｅ，フランス）のカプセル化を、実施例１４に従った重合法で行った。レーザー分散で測定された５−ＦＵを含有するナノ粒子の大きさは、真空乾燥前５１６±８８ｎｍであった。ＵＶ吸光計での２６６ｎｍの値を測定して得られた５−ＦＵの濃度は、ナノ粒子懸濁液の遠心分離（１２０００ｇ、１時間、４℃）で得られる上澄液中、７０μｇ／ｍｌであった。ナノ粒子を結合していない分画は加えた５−ＦＵの総量に対して２３．３％であった。故に、ナノ粒子に結合した５−ＦＵ分画は７６．７％であった。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年１１月２８日（１９９８．１１．２８）【補正内容】重合溶媒中に沈殿物を形成させた重合体は、例えば濾過により回収することが可能である。このようにして得られたナノ粒子の上澄液は、条件を調節して凍結乾燥することができる。単量体を分散するために用いる非プロトン有機溶媒は、水とも混和する上記単量体溶媒でなければならない。この溶媒は、好ましくは、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、テトラヒドロフランより選ばれるが、特にアセトンが好ましい。上記方法において、好ましくは； −有機溶媒中の式（Ｉ）の単量体濃度は３０ｍｇ／ｍｌ〜１５０ｍｇ／ｍｌの範囲にあり； −重合溶媒のモル濃度は１／３０Ｍ〜１／３Ｍの範囲であり； −有機層に対する水層の体積の割合は３／１〜２０／１、好ましくは、３／１〜１５／１である；ことである。重合溶媒は、一つ又は複数の界面活性剤やコロイド保護剤を含有することが好ましい。上記界面活性剤は、例えば、イオン性又は非イオン性の界面活性剤が挙げられる。上記非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンの共重合体、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）やポリソルベートから選択されるものが好ましく用いられる。コロイド保護剤としては、デキストラン、水溶性セルロース誘導体；ポリエチレングリコール；ポリ（ビニルアルコール）等の多糖類の誘導体が好ましく用いられる。好ましくは、本発明の方法によるナノ粒子を形成させるため重合させる化合物は、Ａが、の基を表し、請求の範囲１．式（Ｉ） −Ａはの基、又は、の基を表し； −Ｒ₁及びＲ₂は同一若しくは異なって、直鎖状又は分岐状の炭素数１〜６のアルキル基を表し；ｎは１、２、３、４又は５である；で表される少なくとも一つの化合物のランダム重合体から形成されるナノ粒子の調製法であって、前記単量体が、重合前に、得られる前記重合体の非溶媒性混合物を重合溶媒とともに構成する水混和性非プロトン有機溶媒中に溶解されていることを特徴とする調製法。２．式（Ｉ） −Ａはの基、又は、の基を表し； −Ｒ₁及びＲ₂は同一若しくは異なって、直鎖状又は分岐状の炭素数１〜６のアルキル基を表し； −ｎは１、２、３、４又は５である；で表される重合体から形成されるナノ粒子の調製法であって、重合前に、前記単量体が、得られる前記重合体の非溶媒性混合物を重合溶媒とともに構成する水混和性非プロトン有機溶媒に溶解されていることを特徴とする請求項１記載の調製法。３．粒径５００ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍ〜５００ｎｍであり、平均分子量（Ｍｗ）が約１０００〜１０００００、好ましくは約１０００〜８００００、より好ましくは約２０００〜８００００、更に好ましくは約８０００〜８００００である請求項１又は２のいずれか記載のナノ粒子の調製法。４．一少なくとも一つの式（Ｉ）の化合物の溶液を水混和性非プロトン有機溶媒中で調製して、 −ｐＨ４．５〜１０の水性重合溶媒へ、攪拌しながら前記有機層を加え、 −混合物を均一化した後、このようにして得られたナノ粒子を回収し、有機溶媒を真空除去する工程からなる請求項１〜３のいずれか記載の方法。５．−少なくとも一つの式（Ｉ）の化合物の溶液を水混和性非プロトン有機溶媒中で調製して、 −ｐＨ４．５〜１０の水性重合溶媒を、前記有機層へ攪拌しながら加え、 −混合物を均一化した後、このようにして得られたナノ粒子を回収し、有機溶媒を真空除去する工程からなる、請求項１〜３のいずれか記載の方法。６．非プロトン有機溶媒は、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン及びテトラヒドロフランより選択されるものである請求項１〜５のいずれか記載の方法。７．有機溶媒中の式（Ｉ）の化合物濃度は、３０ｍｇ／ｍｌ〜１５０ｍｇ／ｍｌの範囲である請求項１〜６のいずれか記載の方法。８．重合溶媒のモル濃度は、１／３０Ｍ〜１／３Ｍの範囲である請求項１〜７のいずれか記載の方法。９．重合溶媒は、一つ若しくは複数の界面活性剤又はコロイド保護剤を含有するものである請求項１〜８のいずれか記載の方法。１０．界面活性剤は、ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンの共重合体、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒｓ）及びポリソルベートから選択される非イオン性界面活性剤である請求項９記載の方法。１１．コロイド保護剤は、デキストラン、水溶性セルロース誘導体、ポリエチレングリコール及びポリ（ビニルアルコール）から選択されるものである請求項９又は１０記載の方法。１２．有機層又は重合溶媒が一つ若しくは複数の生理活性分子を有する請求項１〜１１のいずれか記載の方法。１３．重合した化合物は、Ａがの基を表し、ｎは１であり、Ｒ₁及びＲ₂はエチル基を表す式（Ｉ）の化合物である請求項１〜１２のいずれか記載の方法。１４．重合した化合物は、Ａがの基を表し、Ｒ₁及びＲ₂はプロピル基を表す式（Ｉ）の化合物である請求項１〜１２のいずれか記載の方法。１５．請求項１で定義した、Ａが、の基、又は、の基である式（Ｉ）の化合物の混合物は、ランダムに重合されているものである請求項１〜１２のいずれか記載の製造法。１６．式（Ｉ） −Ａはの基、又は、の基を表し； −Ｒ₁及びＲ₂は同一若しくは異なって、直鎖状又は分岐状の炭素数１〜６のアルキル基を表し； −ｎは１、２、３、４又は５である；で表される少なくとも一つのメチリデンマロン酸化合物のランダム重合体から形成されるナノ粒子であって、粒径は５００ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍ〜５００ｎｍであり、平均分子量（Ｍｗ）は約１０００〜１０００００、好ましくは約１０００〜８００００、より好ましくは約２０００〜８００００、更に好ましくは約８０００〜８００００であり、前記ナノ粒子は同質の分子種から形成されるものであり、請求項１〜１５のいずれか記載の方法により得ることができるナノ粒子。１７．式（Ｉ） −Ａはの基、又は、の基を表し； −Ｒ₁及びＲ₂は同一若しくは異なって、直鎖状又は分岐状の炭素数１〜６のアルキル基を表し； −ｎは１、２、３、４又は５である；で表されるメチリデンマロン酸化合物の重合体から形成されるナノ粒子であって、粒径は５００ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍから５００ｎｍであり、平均分予量（Ｍｗ）は１０００〜８００００、好ましくは約２０００〜８００００、より好ましくは約８０００〜８００００であり、前記ナノ粒子は同質の分子種から形成されるものであり、請求項１〜１５のいずれか記載の方法により得ることができるナノ粒子。１８．式（Ｉ） −Ａはの基、又は、の基を表し； −Ｒ₁及びＲ₂は同一若しくは異なって、直鎖状又は分岐状の炭素数１〜６のアルキル基を表し； −ｎは１、２、３、４又は５である；で表される少なくとも１つの化合物のランダム重合体から形成されるナノ粒子であって、粒径は５００ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍ〜５００ｎｍであり、平均分子量（Ｍｗ）は約８０００〜１０００００、好ましくは約８０００〜８００００であり、前記ナノ粒子は同質の分子種から形成されるものであるナノ粒子。１９．式（Ｉ） −Ａはの基、又は、の基を表し； −Ｒ₁及びＲ₂は同一若しくは異なっていて、直鎖状又は分岐状の炭素数１〜６のアルキル基を表し； −ｎは１、２、３、４又は５である；で表される化合物の重合体から形成されるナノ粒子であって、粒径は５００ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍ〜５００ｎｍであり、平均分子量（Ｍｗ）は約８０００〜８００００であり、前記ナノ粒子は同質の分子種から形成されるものであるナノ粒子。２０．Ａは、の基を表し、ｎは１であり、Ｒ₁及びＲ₂はエチル基である式（Ｉ）の化合物の重合体から形成される請求項１８又は１９記載のナノ粒子。２１．Ａは、の基を表し、Ｒ₁及びＲ₂はプロピル基である式（Ｉ）の化合物の重合体から形成される請求項１８又は１９記載のナノ粒子。２２．一つ又は複数の生理活性分子を含有する請求項１６〜２１のいずれか記載のナノ粒子。２３．薬学的に許容される賦形剤と活性成分として請求項２２記載のナノ粒子とを含有する医薬組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 31/496 Ａ６１Ｋ 31/496 31/513 31/513 31/7072 31/7072 38/00 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者パトリック・クヴロールフランス国 91140 ヴィルボンシュールイヴェト１ビスリュドュラクレマン (72)発明者フランスワ・レスキュールフランス国 31320 ペシェビュスク 19, グランリュドラマリ (72)発明者クロード・ロック・カルメスフランス国 25000 ブザンソン３，シュマンドラバールオシェボー (72)発明者ジェラール・リエスフランス国 68200 ミュルーズ 31，リュドュムーニエ

Claims

【特許請求の範囲】１．式（Ｉ） −Ａはの基、又は、の基を表し； −Ｒ₁及びＲ₂は同一若しくは異なって、直鎖状又は分岐状の炭素数１〜６のアルキル基を表し；ｎは１、２、３、４又は５である；で表される少なくとも一つの化合物のランダム重合体から形成されるナノ粒子の調製法であって、前記単量体が、重合前に、得られる前記重合体の非溶媒性混合物を重合溶媒とともに構成する水混和性非プロトン有機溶媒中に溶解されていることを特徴とする調製法。２．式（Ｉ） −Ａはの基、又は、の基を表し； −Ｒ₁及びＲ₂は同一若しくは異なって、直鎖状又は分岐状の炭素数１〜６のアルキル基を表し； −ｎは１、２、３、４又は５である；で表される重合体から形成されるナノ粒子の調製法であって、重合前に、前記単量体が、得られる前記重合体の非溶媒性混合物を重合溶媒とともに構成する水混和性非プロトン有機溶媒に溶解されていることを特徴とする請求項１記載の調製法。３．粒径５００ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍ〜５００ｎｍであり、平均分子量（Ｍｗ）が約１０００〜１０００００、好ましくは約１０００〜８００００、より好ましくは約２０００〜８００００、更に好ましくは約８０００〜８００００である請求項１又は２のいずれか記載のナノ粒子の調製法。４．−少なくとも一つの式（Ｉ）の化合物の溶液を水混和性非プロトン有機溶媒中で調製して、 −ｐＨ４．５〜１０の水性重合溶媒を、攪拌しながら前記有機層へ加え、 −混合物を均一化した後、このようにして得られたナノ粒子を回収し、有機溶媒を真空除去する工程からなる請求項１〜３のいずれか記載の方法。５．−少なくとも一つの式（Ｉ）の化合物の溶液を水混和性非プロトン有機溶媒中で調製して、 −ｐＨ４．５〜１０の水性重合溶媒を、攪拌しながら前記有機層へ加え、 −混合物を均一化した後、このようにして得られたナノ粒子を回収し、有機溶媒を真空除去する工程からなる、請求項１〜３のいずれか記載の方法。６．非プロトン有機溶媒は、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン及びテトラヒドロフランより選択されるものである請求項１〜５のいずれか記載の方法。７．有機溶媒中の式（Ｉ）の化合物濃度は、３０ｍｇ／ｍｌ〜１５０ｍｇ／ｍｌの範囲である請求項１〜６のいずれか記載の方法。８．重合溶媒のモル濃度は、１／３０Ｍ〜１／３Ｍの範囲である請求項１〜７のいずれか記載の方法。９．重合溶媒は、一つ若しくは複数の界面活性剤又はコロイド保護剤を含有するものである請求項１〜８のいずれか記載の方法。１０．界面活性剤は、ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンの共重合体、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒｓ）及びポリソルベートから選択される非イオン性界面活性剤である請求項９記載の方法。１１．コロイド保護剤は、デキストラン、水溶性セルロース誘導体、ポリエチレングリコール及びポリ（ビニルアルコール）から選択されるものである請求項９又は１０記載の方法。１２．有機層又は重合溶媒が一つ若しくは複数の生理活性分子を有する請求項１〜１１のいずれか記載の方法。１３．重合した化合物は、Ａがの基を表し、ｎは１であり、Ｒ₁及びＲ₂はエチル基を表す式（Ｉ）の化合物である請求項１〜１２のいずれか記載の方法。１４．重合した化合物は、Ａがの基を表し、Ｒ₁及びＲ₂はプロピル基を表す式（Ｉ）の化合物である請求項１〜１２のいずれか記載の方法。１５．請求項１で定義した、Ａが、の基、又は、の基である式（Ｉ）の化合物の混合物は、ランダムに重合されているものである請求項１〜１２のいずれか記載の製造法。１６．式（Ｉ） −Ａはの基、又は、の基を表し； −Ｒ₁及びＲ₂は同一若しくは異なって、直鎖状又は分岐状の炭素数１〜６のアルキル基を表し； −ｎは１、２、３、４又は５である；で表される少なくとも一つのメチリデンマロン酸化合物のランダム重合体から形成されるナノ粒子であって、粒径は５００ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍ〜５００ｎｍであり、平均分子量（Ｍｗ）は約１０００〜１０００００、好ましくは約１０００〜８００００、より好ましくは約２０００〜８００００、更に好ましくは約８０００〜８００００である請求項１〜１５のいずれか記載の方法により得ることができるナノ粒子。１７．式（Ｉ） −Ａはの基、又は、の基を表し； −Ｒ₁及びＲ₂は同一若しくは異なって、直鎖状又は分岐状の炭素数１〜６のアルキル基を表し； −ｎは１、２、３、４又は５である；で表されるメチリデンマロン酸化合物の重合体から形成されるナノ粒子であって、粒径は５００ｎｍ末満、好ましくは１００ｎｍから５００ｎｍであり、平均分子量（Ｍｗ）は１０００〜８００００、好ましくは約２０００〜８００００、より好ましくは約８０００〜８００００である請求項１〜１５のいずれか記載の方法により得ることができるナノ粒子。１８．式（Ｉ） −Ａはの基、又は、の基を表し； −Ｒ₁及びＲ₂は同一若しくは異なって、直鎖状又は分岐状の炭素数１〜６のアルキル基を表し； −ｎは１、２、３、４又は５である；で表される少なくとも１つの化合物のランダム重合体から形成されるナノ粒子であって、粒径は５００ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍ〜５００ｎｍであり、平均分子量（Ｍｗ）は約８０００〜１０００００、好ましくは約８０００〜８００００であるナノ粒子。１９．式（Ｉ） −Ａはの基、又は、の基を表し； −Ｒ₁及びＲ₂は同一若しくは異なっていて、直鎖状又は分岐状の炭素数１〜６のアルキル基を表し； −ｎは１、２、３、４又は５である；で表される化合物の重合体から形成されるナノ粒子であって、粒径は５００ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍ〜５００ｎｍであり、平均分子量（Ｍｗ）は約８０００〜８００００であるナノ粒子。２０．Ａは、の基を表し、ｎは１であり、Ｒ₁及びＲ₂はエチル基である式（Ｉ）の化合物の重合体から形成される請求項１８又は１９記載のナノ粒子。２１．Ａは、の基を表し、Ｒ₁及びＲ₂はプロピル基である式（Ｉ）の化合物の重合体から形成される請求項１８又は１９記載のナノ粒子。２２．一つ又は複数の生理活性分子を含有する請求項１６〜２１のいずれか記載のナノ粒子。２３．薬学的に許容される賦形剤と活性成分として請求項２２記載のナノ粒子とを含有する医薬組成物。