JP2001502897A

JP2001502897A - 細胞毒性ペプチド

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Publication number: JP2001502897A
Application number: JP10515072A
Authority: JP
Inventors: アザド，アーメッド; ローウェ，メリンダ; カーテン，シリル; バエル，ジョナサン; マシューズ，バリー; マクレディー，イアン; アルナギリ，チィーニア; リベット，ドン; ノートン，レイモンド; バーナム，ケビン
Original assignee: バイオモレキュラーリサーチインスティテュートリミティド
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1997-09-26
Publication date: 2001-03-06
Also published as: EP0935608A4; AU716098B2; AU4370897A; CA2263134A1; WO1998013377A1; EP0935608A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、Nefタンパク質のＮ末端由来の細胞毒性のミリスチル化ペプチドに関する。そのペプチドは、好ましくは、正味の正電荷を含むドメイン及びα−ヘリックス領域を含む。本発明は、Nefタンパク質の細胞毒性を阻害する化合物に、Nef毒性、HIV感染を防ぐ方法に、及び該化合物を含む医薬組成物にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】細胞毒性ペプチド本発明は、Nefタンパク質のアミノ末端から得られ、細胞溶解又は細胞毒性活性を示すペプチドに関する。特に、それは、疎水性及び／又は塩基性アミノ酸残基に近い部位においてミリスチル化されている配列に関する。本発明は、細胞毒性活性のインヒビターについてのスクリーニングの方法に、及び該インヒビターの合成に関する。発明の背景全ての霊長類のレンチウイルスのゲノムは、３’LTRにオーバーラップする高度に保存された遺伝子であるnefを含む。現在の証拠は、nef遺伝子産物である20 5アミノ酸のミリスチル化タンパク質がAIDS病因に関連することを示唆する。なぜならNefを損失させるHIV−１nefの変異が、HIV−１感染が維持されるのにもかかわらず、病原への進行の欠如と相関するからである（Kirchoffら、1995；Deac onら、1995）。分子的にクローンされたSIVmac nefにおける遺伝子工学的点及び欠失変異もアカゲザルにおけるAIDS病因においてNefに関連する（Kestlerら、19 91）。 Nefが細胞内で種々の範囲の活性に関連することを多くの研究が示している。しかしながら、Nefが細胞外形態で存在するいくつかの証拠があるのにかかわらず、機能の細胞外での態様はほとんど考えられていない。Nefに対する抗体は、H IV−１感染後早期に出現し（Culmannら、1989，1991；Reissら、1989，1991；Ba hraouiら、1990；Koenigら、1990；Gilmourら、1990；Wielandら、19 90；Kienzleら、1991；Hadidaら、1992）、NefのＣ末端はHIV−１が感染した細胞の表面上で観察されている（Fujiiら、1993）。更に、ワクシニア発現系において、Nefは細胞から培地に‘分泌’されると報告されており（Guyら、1990）、イースト発現系においてNefはストレス条件下で細胞から遊離されると報告されている(Macreadieら、1995)。 HIV−１のNefタンパク質は、グリシン２において翻訳後に加えられるＮ−ミリスチル基を有するＮ末端の配列により形質膜へ及び他の細胞膜へ標的化される27 kDa細胞質タンパク質である（Franchiniら、1986，Guyら、1987，Kaminchikら、 1991，Yuら、1992）。それは、nef遺伝子によりコードされ、そのmRNAは全てのウイルスmRNAの75％超の原因である（Schwartzら、1990）。最初は、nefは、HIV −１ LTRの翻訳を阻害し、それによりおそらくウイルスの潜伏の発達又は維持に寄与することによりウイルスの複製にネガティブな抑制効果を与えると考えられていた（Ahmadら1988，Cheng-Mayerら1989，Luciwら1987，Niedermanら1989）。対照的に、後の研究は、ウイルス転写及び活性化Ｔリンパ球の感染へのnefの中立の又は増強する効果のいずれかを記述する（Hammesら1989，Kimら1989）。マカークザルにおけるサル免疫不全ウイルス(SIV)での研究において、nef欠失を含む分子的にクローンされたウイルスが感染した動物において、ウイルス負荷及び病因性の著しい減少が得られた（Kestlerら1991）。AIDS病因におけるnefについてのポジティブな役割についての更なる強力な証拠は、正常なCD４陽性細胞数を有する長期間AIDSを発症しないHIV−１陽性患者のいわゆる“シドニー”コホートでの研究からのものである。これらの患者の全てから単離されたHIV−１株はnefに欠失を有していた（Deaconら、1995）。 Nefは、HIF感染及び病因においていくつかの役割を果たすようである。これらの役割のいくつかは細胞膜相互作用に関連する。NeｆはHIVレセプターCD4(Guy５ 1987)、並びにIL−２mRNA及びIL−２レセプターの表面発現（Luriaら、1991）を下降制御する。Nefは、シグナル変換に関連するタンパク質と（Sakselaら、Le eら1995）及び細胞キナーゼ（Bodeusら1995）と相互作用することも示されている。ここで膜標的化は会合のために本質的であるようである。このような標的化は、所定範囲の他の膜結合タンパク質とのNefの会合のためにも本質的であるようである（Sawaiら、1995）。残基２〜７は、CD４下降制御のために本質的であるようであり（Salghettiら1995）、残基11〜18はセリンキナーゼのための結合部位を供するようである（Bauvら1997）。種々の真核細胞内で発現されるNefは、特にストレス条件下で細胞毒性である。HIV−１感染の間に生産されるNefは、外部の培地に送り出されるという証拠があるので、このような細胞毒性はAIDS病因において観察される傍観する細胞が死ぬ原因であり得ることが示唆される。我々は、Nefのミリスチル化Ｎ末端ペプチドが、ヒト白血球、赤血球、及びイーストのような細胞について細胞溶解性であることを見い出した。その細胞溶解活性は、単にミリスチル鎖の存在の結果だけではなく、配列及び構造特異的であるようである。発明の概要第１の態様において、本発明は、ミリスチル化Nef−アミノ末端配列を含む細胞毒性ペプチドであって、該ミリスチル化の部位が疎水性部位に隣接することを特徴とする細胞毒性ペプチドを供する。好ましくは、ミリスチル化部位は疎水性及び塩基性アミノ酸残基に隣接する。一実施形態において、そのペプチドは溶血性である。好ましくは、Nef−アミノ末端配列は、第１のフレキシブルドメイン及び第２のα−ヘリックスドメインを含む。好ましい実施形態において、ミリスチル化部位は第１のフレキシブルドメイン内にあり、そのペプチドはMyr−Nef２−20，My r−Nef２−22及びMyr−Nef２−26を含む。より好ましくは、細胞毒性ペプチドは、Gly２においてミリスチル化されているフレキシブルドメインNef２−８、及び α−ヘリックスNef９−21を含む。特に好ましい実施形態において、本発明は、ミリスチル化Nef−アミノ末端配列を含む細胞毒性又は細胞溶解性ペプチドであって、該配列が正に荷電されていることを特徴とするペプチドに関する。より好ましくは、Ｎ末端の近隣領域、例えば配列の最初の７つのアミノ酸残基は、正味の正電荷を有し、それに続く残基はα−ヘリックス領域、好ましくはスパニング残基９〜21を形成する。ミリスチル化のフレキシブル部位は、好ましくは、疎水性アミノ酸残基、好ましくはTrp ，Ile又はPhe、最も好ましくはTrp5に隣接する。その正電荷は１又は複数のLys 及び／又はArg残基により供され得る。本発明の好ましいミリスチル化ペプチドは、これらに限らないが、を含む。第１のフレキシブルドメインは、細胞溶解又は細胞毒性活性に関連するようである。これにより、本発明は、悪性腫瘍、癌又は病原性細胞のような不要な細胞に標的化することができる細胞毒性又は細胞溶解性ペプチドを供する。本発明のペプチドは、癌のような病状の治療のため又は腫瘍を減少させもしくは改善するための選択的毒素として投与することができる。これにより、本発明は、選択的細胞死を誘導する方法を供する。 Nef活性の阻害は、これらのドメインの一方又は両方を標的にすることにより達成することができる。膜局在化及び摂動運動を妨害する化合物は、細胞の溶解を阻害するのに用いることができ、第２のドメインと複合体を形成して非両親媒性物となるものを、非フソジェニック(non-fusogenic)構造を作るのに用いることができる。これにより、第２の態様において、本発明は、細胞毒性、細胞溶解性及び／又はフソジェニック活性のインヒビターのためのスクリーニングの方法であって、本発明の細胞毒性ペプチドの、又はそのドメインの活性への１又は複数の予想されるインヒビターの存在の効果を測定するステップを含む方法を供する。第３の態様において、本発明は、HIV又はNefの活性を遮断する新規化合物を供する。これらの化合物は、これらに限らないが、表３，４，５、及び６に列記されるものを含む。好ましくは、その化合物は、表６に列記されるものである。化合物の細胞毒性もしくは細胞溶解活性、又は表に示されるものの誘導体もしくはアナログは、培養した細胞もしくは人工の膜を用いてアッセイすることができる。フソジェニック活性は、人工膜又はリン脂質ベシクルを用いることにより測定することができる。CD４及びIL２−Ｒのようなレセプターの制御に基づく観察も行うことができる。当業者は、用いるべきアッセイの適切な形態を決定することができる。第１のドメインに基づき阻害活性を示す化合物は、好ましくは、結合を増強するため及び細胞膜の負に荷電したリン脂質へのNefの結合を遮断するためにフレキシブルドメインの塩基性アミノ酸残基と塩橋を形成することができる酸性基を含み、好ましくは、トリプトファン残基５のインドール環系と反応することができる芳香族成分のような特異性を与える成分も有する。これらの化合物の活性は、ミリスチル化Nef２−26ペプチド又はその変異体の細胞溶解活性の阻害によりアッセイすることができる。用いることができる化合物は、これらに限らないが、脂溶性、芳香族、陰イオン性もしくは双性イオン性又は極性成分を含み得る。長鎖二酸により連結されたモノインヒビターから作られたビス−インヒビター、又は多重のペプチド配列を含むインヒビターも考慮される。上述の活性を有する化合物の非限定的例は、表３〜６に列記されるもの、好ましくは表６の化合物の１又は複数である。第２のドメインのフソジェニック活性は、このドメインの両親媒性の性質を遮断する化合物で標的化され得る。このような化合物は、それ自体両親媒性であり、ヘリックスの疎水性相に対して相補的であり得る。あるいは、それらは、親水性表面に対して相補的であり得る。両方の場合、特異的相互作用により第２のドメインとの複合体を形成し、ここでその複合体は非両親媒性であり、それゆえ非フソジェニックとなろう。フソジェニック活性の予想されるインヒビターは、これらに限らないが、負電荷のヘリックスペプチド、コイル／コイルインヒビター又はアンチセンスペプチド核酸(PNA)インヒビターを含む。上述のようなフソジェニック活性を阻害する好ましい化合物は、これらに限らないが、表２〜６に記載されるもの、最も好ましくは表６のものを含む。本明細書に記載されるペプチド及び化合物の誘導体又はアナログも本発明により考慮される。当業者は、本明細書に記載されるペプチド及び化合物の配列、構造及び化学的又は生物学的特徴に基いてこのような化合物を得ることができるであろう。 HIV感染の病因におけるNefタンパク質と細胞膜との間の相互作用の役割において、上述の化合物又はインヒビターは、タンパク質−細胞膜相互作用を調節することによりHIV感染の治療又は防止に役立つ。これにより、第４の態様において、本発明は、Nefタンパク質の細胞膜との相互作用を調節する方法であって、Nef タンパク質が膜結合成分と相互作用するのを防ぐために上述の化合物を投与するステップを含む方法を供する。その成分は、好ましくは、情報又はエネルギー伝達体であり、タンパク質、ペプチド、ホルモン、イオン等を含み得る。第５の態様において、本発明は、Nef又は関連配列の細胞毒性を減少させ又は除去する方法であって、上述のインヒビター又は化合物を投与するステップを含む方法を供する。好ましい実施形態において、本化合物はHIV又はその一部、例えばNefタンパク質によるCD４レセプター及びIL−２レセプターの下降制御を示す。より好ましくは、本化合物は、細胞内タンパク質、例えばlck及び／又はセリンキナーゼとのNefの相互作用を阻害する。最も好ましくは、本化合物は、リンパ組織の細胞、特に感染していないリンパ細胞においてNefで誘導される細胞毒性を阻害し、及び／又は傍観細胞をNeｆで誘導して、殺す。第６の態様において、本発明は、HIV感染で治療する方法であって、本発明の化合物を治療の必要な患者に投与するステップを含む方法に関する。本発明は、医薬として許容される担体と一緒に、１又は複数の本発明の化合物を含む医薬組成物にも関する。本発明の組成物は、当業者に周知の方法で製剤され、投与される。例えば、本組成物は、経口、腹腔内、静脈内又は非経口投与のための液体製剤、エアロゾル、微小化粒子、リポソーム、錠剤、カプセル又は粉末形態であり得る。それは、例えば鼻スプレー又は鼻用液滴を用いて粘膜を通して投与することもできる。その投与量及び投与の頻度は、治療するべき条件に従って当業者により容易に決定されるであろう。その生物活性に悪影響を与えることなく本明細書に記載されるペプチド又は化合物に改変を加えることができる。このような改変は、当業者の知識及び判断の範囲内であり、例えば、実質的に分子の活性を改変しない保存性又は非保存性のアミノ酸置換、挿入、欠失又は誘導化を含む。発明の詳細な記載本発明は、以下の非限定的例、及び図面を引用して詳細記載されよう。図１は、ヒト赤血球へのNefペプチドの溶血効果を示す。溶血の程度は、各々の点でのOD540nmを２％Tween 80に露出した細胞のOD540nmで割ることにより計算した。細胞濃度は２％（ｖ／ｖ）であり、各々の点についての細胞溶解剤への露出の時間は５分であった。アッセイは重複して行い、アッセイ内のバリエーションは５％以内であった。図２は、Nefペプチドによるヒト赤血球の細胞溶解の速度を示す。細胞溶解の程度は図１の通り計算した。細胞濃度は２％であり各々のペプチドの濃度はmg／ mlであった。アッセイは重複して行い、アッセイ内のバリエーションは５％以内であった。図３は、Nefペプチドで処理した培養細胞の写真を含む（10×倍率）。CEM細胞を30分、10mgのペプチド又はPBSで処理した。Ａ．PBS，Ｂ．Myr−Nef31−50，Ｃ．Myr−Nef２−22。図４は、Nefで処理したCEM細胞によるLDH遊離を示す。Ａ．細胞を30分、最終濃度12.5mMでペプチドと一緒にインキュベートした。その方法に記載されるように、自発的な遊離を減算した後の最大LDH遊離の割合（％）として計算した。結果は、３つの別個の実験について平均±平均の標準誤差(SEM)を示す。Ｂ．CEM細胞は、30分、12.5〜0.75mMの最終濃度の範囲でMyr−Nef２−26（黒ぬり四角）、 Myr−Nef31−50（中抜き円）、又はNef２−26（黒ぬり円）の一連の希釈物と共にインキュベートした。細胞毒性は、その方法に記載されるように、自発的遊離を引いた後の最大LDH遊離の割合（％）として計算した。結果は、３つの別個の実験についての平均±SEMを示す。図４Ｃは、４時間までの6.25mMの最終濃度においてMyr−Nef２− 26（四角）、Nef２−26（三角）、又はMyr−Nef31−50（円）と共にインキュベートしたCEM細胞からのLDHの遊離の速度を示す。値は、三回重複して行った３つの別個の実験についての平均±SEMを示し、１％Triton Ｘ−100により誘導される最大LDH遊離の割合（％）として表す。図５は、PBS中でのNef２−26(Ser13)(連続曲線)及びMyr−Nef２−26(Ser13)( 点の曲線)についての蛍光放射スペクトルを示す。励起波長は290nm、温度−22℃ であった。各々のペプチドの濃度は５mMであった。図６は、以下のもののStern−Vollmerプロットを示す。Ａ）大きな単層リン脂質ベシクルの存在下での水溶性(“−−−”Tcc)及び脂溶性（ｎ−−−ｎ５NPC，ｔ−−−ｔ 12NPC，ｏ−−−ｏ 16NPC）ニトロオキシド消光剤による非ミリスチル化ペプチドNef２−26(Ser13)のTrp5残基の蛍光の消光；Ｂ）大きな単層リン脂質の存在下での水溶性(“−−−”Tcc)及び脂溶性（ｎ− −−ｎ５NPC，ｔ−−−ｔ 12NPC，ｏ−−−ｏ 16NPC）ニトロオキシド消光剤によるミリスチル化ペプチドMyr−Nef２−26(Ser13)のTrp５残基の蛍光の消光。図７は、イーストコロニー形成へのMyr−Nef２−22の効果を示す。写真は、Ｃ．アルビカンス(C．albicans)及びＣ．グラブラタ(C．glabrata)について１日、Ｋ．ラクチス(K．lactis)及びＳ．セレビシアエ(S．cerevisiae)について２日のペプチド処理、及びペプチド処理なしでのSz．について３日の後に形成されたコロニーを示す。ペプチド処理した全てのプレートは同一で、コロニーは形成されなかった。図８は、イースト死亡率へのNefペプチドのミリスチル化の効果を示す。Ａ．Ｓ．セレビシアエ細胞を１mM濃度のNefペプチド：M yr−Nef31−50、Myr−Nef２−22及びNef２−22で処理した。Ｂ．Myr−Nef２−22 及びNef２−22での30分の処理についての投与量応答。図９は、フローサイトメトリー分析により分析した細胞のヨウ化プロピジウム（PI）の取込みを示す。ペプチドはMyr−Nef31−50（Myr対照）、Myr−Nef２−2 2(My−Nef)、及びNef２−22(Nef)であった。任意的なゲートは、未処理の細胞の５％が染色されて分類されるように設定した。図10は、大腸菌コロニー形成へのペプチドの効果を示す。ペプチドは、水中に懸濁した大腸菌細胞に加えた。30分後に、細胞を固体化した２×YTに広げ、37℃ で一晩、インキュベートした後、プレートを検査した。図11は、ミリスチル化Ｎ末端Nefペプチドへの露出がCEM CD４＋Ｔ細胞において細胞外酸性化の速度を減少させることを示す。（Ａ）CEM細胞の酸性化率応答を、10〜５ＭのMyr−Nef２−26（四角）、Nef２−26（三角）、Myr−Nef31−50 （円）、又は培地のみ（ひし形）で行った。矢印は、ペプチド添加の時間を示し、トレーシングは３つの別個の実験の最少値の代表である。（Ｂ）CEM細胞の酸性化率応答を、培地のみ（ひし形）、又は５×10〜５Ｍ（四角）、１×10〜６Ｍ（三角）、又は５×10〜６Ｍ（円）のMyr−Nef２−26で行った。矢印はペプチド添加の時間を示す。図12は、pH4.5及び281Kにおける90％ H20／10％ 2H2O中でのNef２−26の500MH zにおける２Ｄ１Ｈ TOCSYスペクトルの領域であり、Ala NH−CbH3連結性及びP ro14におけるシス−トランス異性の効果を示す。ピークＡ及びＢはAla26に割り当てられ、ピークＣ及びＤはAla23により、ピークＥはPro14がトランス配置である場合のAla15により、ピークＦはPro14がシス配置である場合のAla1 ５から生ずる。ピークＡ，Ｂ，Ｃ又はＤの特定の配置への割り当ては、スペクトルのオーバーラップがスペクトルの明白な割り当てを防ぐのでできなかった。Pr o25のシス−トランス異性によりAla26について小さな交差ピークも観察されたが、これらのピークは弱すぎてこの図の輪郭レベルで観察できない。図13は、Nef２−26についての化学シフトを示す。全てのランダムコイル化学シフトはWishartら、1995bから得た。Ａ：pH5.5及び281Ｋにおける50 ％H2O／50 ％ TFE中のNef２−26についてのランダムコイル値からのCaH化学シフトのずれ。Ｂ：pH4.5及び281ＫにおけるC2H30H中でのNef２−26についてのランダムコイル値からのCaH化学シフトのずれ。Ｃ：pH4.5及び281ＫにおけるC2H30H中のNef２− 26についてのランダムコイル値からのNH化学シフトのずれ。Ｄ：pH4.8及び281ＫにけるC3H302H中でのNef２−26についてのランダムコイル値からのCa化学シフトのずれ。Ｅ：pH5.1及び298ＫにおけるSDSミセル中でのNef２−26についてのランダムコイル値からのCdH化学シフトのずれ。図14は、pH4.5及び281ＫにおけるC2H30H中でのNef２−26の300−ms混合時間 NOESYスペクトルの領域を示す。Ａ：CaH−NH領域。残基内NH−CaH交差ピークを１つの数字で標識する。連続的NOE交差ピークは標識しないが、連続する残基により交差ピークを連結する線により示す（Ala15及びPro14のCaH化学シフトは極めて近く；結果として、Pro14及びAla15の間のaN連結性はAla15のNH−CaH交差ピークとオーバーラップする）。媒体の範囲の交差ピークは、各々CaH及びNHプロトンに寄与する残基を示す２つの数字で示す。Ｂ：NH−NH領域。NH−NH交差ピークを、相互作用する残基の配列位置を同定する２つの数字で標識する。交差ピークの横の数字は、Ｆ１次元からの寄与する残基を示し、交差ピークの上又は下の数字はＦ２次元からの寄与する残基を示す。図15は、pH4.5及び281ＫにおけるC2H30HにおけるNef２−26についてのNMRデータの概要である。daNの強度、dbN連続性を棒の高さにより強、中又は弱として示す。陰線はPro残基へのdad連結性を示す。アスタリスクは、NOEの存在は、ピークのオーバーラップのため明確に確認できなかった。３JHNCaH＜６Hzの値は￣で示し、８より大きいものは−で示す。これらの残ったブランクはオーバーラップのため測定できなかったが、６〜８Hzの間であり得る。バックボーンNHプロトンの相対交換率を、2H2O交換TOCSY実験における交差ピークの強度に基づき列で示すNHにおいて示す；ゆっくり交換するアミドは黒ぬり円で示し、中抜き円は中間の交換を示す。列に示すaHはCaHの化学シフト指数を示し、ランダムコイルからのCaH偏差がランダムコイル値より0.1ppm超高い場であるなら、−１の値で示し、CaH値がランダムコイル値より0.1ppm超低い場であるなら、１の値で示す。図16は、残基番号の関数としてプロットしたメタノール中でのNef２−26の最終的な20の構造をキャラクタライズするパラメータを示す。Ａ：構造精密化の最後の回に用いた結合距離の上限；媒体域（２＜ｉ−ｊ＜５）、連続及び残基内NO Eを、各々黒、ハッチ及び白い影で示し、１つの長い範囲のNOE（Trp13 C(4)H〜G lu18 NH）は示さない。NOEは、各々の関連するプロトンについて１回、計２回係数する。Ｂ：全体の分子へ重ねた後の骨格重原子（Ｎ，Ca，ｃ）についての平均構造からのRMS偏差。Ｃ−Ｆ：骨格（ｆ及びｙ）及び側鎖（ｃ１及びｃ２）二面角についての角度パラメータ（ｓ）（Hybertsら、1992；Pallaghyら、1993）。ｃ１プロット中のギャップはGly及びAla残基による。ｃ２プロットのギャップは Gly及びAlaに加えて、Ser，Pro、及びVal残基による。図17は、残基９〜22を含む、十分に精密化した９Sf及び分子の(Sy＞0.9)領域の骨格重原子(N，Ca，c)に重ねたメタノール中のNef２−26の最終的な20の構造の立体図である。Ａ：骨格重原子。Ｂ：十分に精密化したｃ１角(Sc１＞0.9)の残基の側鎖を示す直交図を示す。図18は、Nefペプチドで処理したCEM細胞からのカルセインの投与量依存性の遊離を示す。カルセインを充填した細胞を30分、Myr−Nef２−26（四角）、Nef２ −26（円）又はMyr−Nef31−50（三角）の一連の希釈物と共にインキュベートし、カラセイン遊離を、材料及び方法に記載されるように決定した。データは、少くとも３つの別個の実験の代表例である。図19は、CEM細胞中での合成化合物のNef阻害活性及び細胞毒性を示す。合成化合物を、カルセイン充填CEM細胞との1.5時間のインキュベーションの前に37℃で 30分、10：１化合物：Nef Ｎ末端ペプチドのモル比でNef Ｎ末端ペプチドと共に（連続線、％Nef阻害）及びそれなしで（陰線、％細胞毒性）インキュベートした。データは、少くとも２回の別個の実験における平均±SEMを示す。図20は、PBMCにおける合成化合物のNef阻害活性を示す。BRI6209(黒ぬり四角) 、AP13(黒ぬり三角）、DER−AP3（黒ぬり円）又はDER45(白抜き四角)を、1.5時間のカルセイン充填PBMC細胞とのインキュベーション前に、37℃で30分、所定範囲のモル比でNef Ｎ末端ペプチドと共に又はそれなしでインキュベートした。データは、２つの別個のドナーからの結果の代表例である。図21は、メタノール中でのNefペプチドの遠紫外円偏光二色分光スペクトルを示す。図22は、Boston University Biomolecular Engineering Research Center Pro tein Sequence Analysisサーバーで行った別個のステート−スペース理論分析（ Stultzら1993，Whiteら、1994）により計算した異なるNef Ｎ末端ペプチドについてのコンホメーションの可能性を示す。Ａ Nef２−22，Ｂ Nef２−22ａ，Ｃ Nef２−22ｂ，Ｄ Nef２−22ｃ，Ｅ Nef２ −26a，Ｆ（ｉ）Nef２−９，（ii）Nef10−22，Ｇ Nef31−50ａ，Ｈ Nef31−50 各々のフレームにおいて、記号は、の圧力／表面領域等温線を示す。図24は、非ミリスチル化Nef２−22及びNef９−22の存在下での蛍光色素オクタデシル−ロダミンの蛍光の脱消光を示す。これは、膜混合融合の発生を示す。記号：図25は、Nef Ｎ末端ペプチドによるヒツジ赤血球の細胞溶解についての投与量応答線を示す。ペプチドは、３分、20℃で細胞とインキュベートした。記号：図26は、20℃におけるNef Ｎ末端ペプチドによるヒツジ赤血球の細胞溶解の速度を示す。各々のペプチドの濃度は32mMであった。記号：図27は、CD4＋Ｔ細胞についてのペプチド細胞毒性の投与量応答曲線を示す。C EM細胞を２時間、37℃でペプチドとインキュベートし、LDH遊離を材料及び方法に記載されるように定量した。黒ぬり四角、Myr−Nef２−26；黒ぬり円、Myr−N ef２−22；黒ぬり三角、Myr−Nef31−50；白抜き四角、Myr−Nef２−22ａ；白抜き三角、Myr−Nef２ −22ｂ；白抜き円、Myr−Nef２−22ｃ；白抜きひし形、Myr−Nef２−８；十字、 Myr−Nef31−50ａ。図28は、Nef Ｎ末端ペプチドが所定範囲の白血球系においてLDH遊離を誘導することを示す。（Ａ）細胞（２×104／ウェル）を２時間、10μＭ Myr−Nef２− 26ペプチドとインキュベートし、LDH遊離を材料及び方法に記載されるように定量した。（ｂ）細胞（２×104／ウェル）を、２時間、５μＭのMyr−Nef２−26 ペプチドとインキュベートし、LDH遊離を定量した。値は、３回重複して行った３つの別個の実験についての平均±SEMを示し、１％Triton Ｘ−100により誘導された最大LDH遊離の割合（％）として表す。図29は、培養していないPBMCにおけるNef Ｎ末端ペプチドで誘導されたLDH遊離を示す。細胞（１×105／ウェル）を30分、12.5μＭ Myr−Nef２−26、Nef２ −26又はMyr−Nef31−50と共にインキュベートし、LDH遊離を測定した。値は、３回重複して行った３つの別個の実験についての平均±SEMを示し、１％Triton Ｘ−10０により誘導される最大LDH遊離の割合（％）として表す。図30は、扁桃リンパ組織から単層された細胞からのNef Ｎ−末端ペプチドで誘導されたLDH遊離を示す。扁桃の細胞（１×105／ウェル）を30分（連続棒）又は２時間（陰の棒）、10μＭのMyr−Nef２−26、Nef２−26又はMyr−Nef31−50と共にインキュベートし、LDH遊離を測定した。値は、３回重複して行った３つの別個の実験についての平均±SEMを示し、１％Triton Ｘ−100により誘導される最大LDH遊離の割合（％）として表す。一般的方法ペプチド合成 Nefのアミノ末端配列に相当するペプチドを、アミノ酸のα−アミノ基を塩基不安定性９−フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc tems 430Aペプチドシンセサイザーで以前（Lurtainら1994）に記載されるように合成した。HIV−１のpLN4.3株からの配列は次の通りであった。更に、Ile6をValで置換した（LAVla株）21残基ペプチド(Nef２−22(Valll))を調製し、次に位置13においてトリプトファンをセリンで置換したpLN4.3 24残基Ｎ末端ペプチド(Nef２−26(Ser13))を調製した。対照非Ｎ末端20残基ペプチド(Nef31−50)を次の配列に従って合成した：非ミリスチル化ペプチドGKVSRKLEKHGAITSSNTAA-OH Nef31−50ａ（ここでａ＝( Lys32，36)である）並びに非ミリスチル化Nef２−22及びNef９−22も調製した。ペプチドを、セリンを再カップリングするために通常用いるプロトコル（即ち最も長い溶解時間）を用いてミリスチン酸をペプチド／樹脂のＮ末端アミン（即ちFmoc基を除いたもの）に適用することによりシンセサイザーでミリスチル化した。ミリスチル化ペプチドは、Myr−Nef２−22，Myr −Nef２−22a，Myr−Nef２−22b，Myr−Nef２−22c，Myr−Nef２−26，Myr−Nef ２−26a，Myr−Nef２−22(Valll)，Myr Nef２−10，Myr−Nef10−26，Myr−Nef ２−26(Ser13)及びMyr−Nef31−50にコードされている、これらペプチドを、Vyd ac Ｃ18カラムを用いて精製し、それらの純度及び組成を、HPLC、アミノ酸分析及びエレクトロスプレー原素分析により確認した。ペプチドの配列は次の通りである：配列についての解釈我々は以前、Myr−Nef２−22が脂質２重膜中の非層状構造の形成を誘発し得ることを見い出していた（Curtainら1994）ので、Nef２−22及びNef２−26配列を選択した。Nef２−22及びNef２−26ペプチドの膜活性へのミリスチル化の効果を評価するため潜在的な対照配列としてMyr−Nef31−50を選択した。なぜならBost on University Biomolecular Engineering Research Center Protein Sequence Analysisサーバーで行った別個のステートスペース理論分析（Stultzら、1993，Whiteら、1994）は、それが、α−ヘリックスが残基14上からのみと予想され、そのペプチドのＮ末端にかなりのフレキシビリティーを残すと思われるNef２−22及びNef２−26と対照的に、リジッドなα−ヘリックスを形成するであろうことを示したからである。ペプチドの予想される全体のα−ヘリックス含量を、メタノール／水（60／40）中に形成した円偏光二色性測定により確認した。リポソーム調製大きなユニラメラベシクル(LUV)を、緩衝液（５mM Hepes，100mM NaCl，pH7.4 )中に卵黄ホスファチジルコリン(EYPc)の乾燥フィルムを分散させ、その分散物を10回、凍結及び解凍し、そしてHopeら(Hopeら、1985)により記載されるように２つの積み重ねた0.4mm孔サイズポリカーボネートフイルター(Nucleopore，Plea santonCA)を通して10回、押し出すことにより調製した。脂質スピン標識を要求されるモル比で、クロロホルム／メタノール(70／30)中のEYPcに、乾燥フィルムの調製前に加えた。細胞（ｉ）ヒト赤血球及び白血球バフィーコートパック及び期間の満了した赤血球をAustralian Red Cross Blo od Bank，Melbourneから得た。末梢血液単核細胞（PBMC）をficoll−Hypaque密度勾配遠心によりバフィーコートパックから精製した。扁桃細胞を、扁桃摘出の治療の間に外科的に除去した扁桃から単離した。扁桃を250μｇ／mlゼンタマイシンを含むPBS pH7.4中に氷上で保存し、３〜６時間、処理した。上皮層を除去し、その組織を10％（ｖ／ｖ）熱不活性化胎児ウシ血清（GIBCOBRL）を補給したPRMI1640中で200メッシュのふるいにかけることにより機械的に破壊した。死んだ細胞、上皮細胞及びデブリスを、10分、室温で1600×ｇでの等張メトリザミド勾配での遠心により除去した。1.04〜1.065の間の密度の細胞を収集し、使用前に洗った。ヒト白血球細胞系CEM(CD４＋Ｔ細胞)、Jurkat（CD４＋Ｔ細胞）、RPMI8226（B 細胞）、Ｕ266(Ｂ細胞）、THP−１（単球）及びＵ−937(単球、Sundstrom and N ilsson，1976)をAmerican Type Culture Collection，Rockville，Maryland，US Aから得た。RC2ａヒト urne，Australiaから得た。細胞系を、２mMグルタミン、1.5g／１重炭酸ナトリウム、10mM HEPES，１mMピルビン酸ナトリウム、25μｇ／mlゼンタマイシン及び 20（RPMI8226）、又は10％（ｖ／ｖ）熱不活性化胎児ウシ血清(GIBCO−BRL Life Technologies，Auckland，NZ)を補給したRPMI1640内に維持し、週に２回、植えかえた。全ての実験について指数期増殖の間に細胞を収集した。（ii）イースト用いたイースト株は、サッカロマイセス・セレビシアエ（Saccharomyces cere visiae）株DY150(MATa ura3−52 leu２−３，112trpl−１ ade2−１，his3−11 canl−100)、カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）株Ｌ５（Leu）、カンジダ・アルビカンス（Landida albicans）臨床単離体JRW ＃５、クルイベロマイセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）株MW98−８ｃ（MAT−ａ uraＡarg lys ）及びスキゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）(ｈ−ad eura leu １−32)であった。株をYEPD（１％イーストエキス、２％ペプトン、２％グルコース）中で増殖させた。必要な数を700〜1000ml改良緩衝液中に再度懸濁し、溶融アガロースと混合し、必要になるまで39℃で撹拌した。（iii）新鮮な赤血球は、Merino X Border Leicesterヒツジから得た。イースト増殖アッセイペプチドをHPLCにより均一になるまで精製し、次に２mg／mlの濃度で蒸留水に溶かし、そして必要になるまで４℃に保存した。ペプチド溶液のアリコートを、 100mlの水の最終容量に懸濁した細胞に加え、そして１時間又は他の特定時間の後、その混合物を適当な固体化培地にプレートした。プレートを株により、１〜３日間、インキュベートし、そして生存コロニーの数を決定した。イーストの顕微鏡法処理した細胞のヨウ化プロピジウム（PI）取り込みを、懸濁液中の細胞にPIを１mg／mlまで加えた直後に顕微鏡法により検査した。蛍光顕微鏡法は、PI蛍光のための励起キューブ／フィルターＢを備えたOlympus BH２−RFCAを利用した。大腸菌株MC1061（F−araD139 Ｄ(ara−leu)7696 galE15 galK16Ｄ(lac)×74rp sL（Strr）hsdR２（rK−MK＋）mcrＡmcrＢ１）も毒性研究のために用い、２×YT 培地(1.6％トリプトン、１％イーストエキス、0.5％NaCl)にプレートした。イーストのフローサイトメトリー分析て前角及び90°光散乱並びにPI蛍光により分析した。PIを25mg／mlまで加え、染料浸透を、520nmにおける蛍光放射の存在により測定した。ゲートを、“PI染色した”として定義した集団が対照細胞集団の５％を含むように調節した。溶血パックした細胞を３回、洗い、次にリン酸緩衝塩類溶液中の１％又は３％懸濁液に希釈した。そのペプチドをPBS中での音波処理により100mMの最終濃度に分散させた。各々をマイクロピペットにより要求される濃度範囲にわたり（0.05〜20.0mM）その細胞懸濁液１mlに加え、その混合物を30秒、振とう、30秒毎にチューブを静かに反転させながら要求される時間、放置し、1500×ｇで２分、遠心した。その上清の光学密度（OD）540nmを分光光度測定により決定した。３％の細胞のみを含むブランクを対照として用いた。0.5％Ｔween 80を３％細胞に加え、上述の通り混合して遠心することにより 100％溶血を決定した。各々のペプチドについての結果を、対照の値を引いた後に、Tween 80のODの割合（％）として計算した。ヒト細胞の顕微鏡分析 CEM CD４＋Ｔ細胞をPBS，pH7.4中で１回、アッセイ緩衝液10.96mM KH2PO4，5. 28mM Na2HPO4，1.74mM KCl，143mM NaCl，pH7.4)で１回洗い、アッセイ緩衝液中に１×107／mLに再度懸濁した。100mL細胞を10mLペプチド（PBS中１mg／mL）又はPBSに加え、６時間まで、室温でインキュベートした。種々の時間間隔で、細胞懸濁液10mLを除去し、ガラススライド上にプレートし、光学顕微鏡法により検査した。 LDH 遊離アッセイ市販のキット（Cytotoyicity Detection Kit(LDH)，Boehringer Mannheim，Ma nnheim，Germany）を用いて、ヒト細胞に対する細胞毒性活性についてNefペプチドをアッセイした。細胞を上述のように調製し、アッセイ緩衝液中２×105／mL （細胞系）及び１×106／ml（PBMC及び扁桃細胞）に再度懸濁した。その細胞濃度を予備実験において決定し、各々の細胞型についての至適最大値対自発的カルセイル遊離を供した。そのペプチドを1mMの濃度で水に溶かした。100mlの細胞を、マイクロタイタープレート中のアッセイ緩衝液中で要求される濃度まで希釈した100mlペプチドと混合し、30分、37℃で、５％CO₂ 90％湿度でインキュベートした。このインキュベーションの終りに、プレートを10分、250×ｇで遠心して100mLの上清をEIAプレート（Dynatech，Chantilly，Virginia，USA）に移した。乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)活性を、30分、光から保護して100mlの反応混合物を加え、室温でインキュベーションすることにより決定した。EIAプレートリーダー(Dynatech DIAS；D ynatech，Chantilly，Virginia USA；又はNunc，Roskilde，Denmark)でのOD490n mは、63Onmの標準波長を用いる。プレートを緩衝液のみを含むウェル上をブランクにした。全てのアッセイを３回重複して行い、含まれる細胞を、緩衝液のみでインキュベートして自発的LDH遊離を測定した。自発的遊離は全てのアッセイにおいて最大遊離の10％又はそれ未満であった。最大LDH遊離を、100mlの２％Trit on Ｘ−100を100ml細胞に加えることにより決定し、次の通り細胞毒性割合（％）を計算するのに用いた。細胞毒性（％）＝100×（ODペプチド−OD自発）／（OD最大−OD自発）ペプチドのみ及びペプチド＋LDH(0.05Ｕ／mL；Boehringer Mannheim，Mannhei m，Germany)からなる更なる対照を、ペプチド自体がLDH活性を含まず、細胞LDH 活性を示さないことを確かめるために含めた。紫外蛍光研究 Nef２−26(Ser13)及びMyr−Nef２−26(Ser13)中のトリプトファン残基の紫外蛍光スペクトルを、290nmの励起波長を用いてPerkin Elmer MPF３蛍光スペクトロホトメーターで22℃で記録した。蛍光消光データを、要求される濃度範囲にわたってスピンラベルを混合物（１：50モル比）に加えることにより得た。独立した溶液中の蛍光団の動力的（衝突）消光は、Stern−Vollmer等式（Sternら1919 ）に従う。ここで、Ｉ及びＩ₀は、緩衝液可溶性消光剤テンポコリンクロライド(TCC)の存在及び欠如下でのトリプトファン蛍光の強度であり、kqは２分子速度定数であり、〔Ｑ〕ｔはTCCの全体の濃度であり、ｔは蛍光半減期である。脂質相に区分けされるドキシル標識化リン脂質について、〔Ｑ〕の濃度は加えたモル数になるようにとることができる。なぜなら、二層膜関連のスピンラベルリン脂質に基づく電子スピン共鳴分光法研究は、全ての位置でのスピンラベルがほとんど全て脂質層であると確認された（Hubbleら1971）。〔Ｑ〕Ｔなるであろう。消光剤が蛍光団の基底状態との非蛍光平衡複合体を形成するなら、静的な消光もおこるであろうし、これは、Stern−Vollmerプロットの上方への曲率からの証拠となろう。プロットの下方への曲率は、蛍光団が２又はそれ超の環境において消光剤に露出されることを示す。パルミトイル−ステアロイルプローブ紫外蛍光消光研究のために、そのステアロイル鎖の５（５NP）、12（12NP）及び16（16NP）においてドキシルスピンラベルしたパルミトイル−ステアロイルホスファチジルコリンプローブを、Avanti Polar Lipids Inc，Pelham ALから得た。水溶性スピンプローブテオポコリンクロライド(TCC)は、Molecular Probe Inc ，(JunctionCity，OR)から得た。両方のソースからのスピンラベルを純度について、及びGordon及びCurtain(1988)に記載されるように、スピン／Ｍの数が理論値の90％超となるのを確実にするために検査した。卵黄ホスファチジルコリン（ EYPC，Iype XVI−Ｅ）はSigma St Lou is MOから得て、更なる精製なしに用いた。 NMR 分光法 NMRサンプルを、2.4mgの凍結乾燥Nef２−26ペプチドを0.55mlの適切な溶媒に溶かす(最終濃度1.5mM)ことにより調製した；用いた溶媒はC2H3OH，C2H3O2H，90 ％H20／10％2H2O及び2H2Oであった。そのpHを0.5Ｍ NaO2H又は２HClを少し加えて調節した。そのペプチドを、SDSミセル溶液中でも検査した；SDS−2H25の400m M溶液を１mlの90％H2O／10％2H2O中に調製し、次に2.4mgのNef２−26をO.6mlのこの溶液に溶かし、そしてそのpHを5.1に調節した。NMRスペクトルは298Ｋにおいて記録し；より低い温度においてスペクトルを集める試みは溶液からのSDSの結合化を生じた。報告されるpH値は室温で記録し、アイソトープ又は溶媒効果について補正しなかった。１Ｈ化学シフトは、dCH3 3.35ppmにおける残留CH2OH(Wu thrich，1976)又はH2O共鳴（Wsshartら、1995a）の化学シフトを通して０ppmにおける２，２−ジメチル−２−シラペンタン−５− スルホネート(DSS)を基準にした。ーで記録した。他に示さなければ、全てのスペクトルは281Ｋで記録した；プローブ温度はVan Geet（1970）の方法に従って較正した 1983)を用いてフェイズセンシティブモードにおいて記録した。溶媒抑制は、NOE SY実験において緩和遅延の間（典型的には２ｓ）及び混合物時間の間の水シグナルの選択的低出力照射により行った。90％H2O／10％2H2Oで得られたいくつかのスペクトルについては、水抑制を、Sklenarら（1993）のWATER GATE法を用いてパルスフィールド勾配によっても行った。２Ｄ同一核NOESYスペクトル（Anil−Kumarら、1980；Macuraら、1981）を50及び300msの混合時間で記録した。TOCSYスペクトル（Braunschweiler & Ernst，19 83）を、70〜80msのスピンロック時間で、DIPST−２スピン−ロック配列（Rucke r & Shaka，1989）を用いて記録した。DQF−COSY（Ranceら、1983）及びＥ−COS Y（Griesiingerら）スペクトルも記録した。典型的には、400〜600tl増加、増加当り32〜128スピン、及び4096データ点でスペクトルを得た。１Ｈスイープ幅は5 00MH₂で6024.1及び600MH₂で7812.5Hzでた、EXASYO1.3.7（Bartelsら、1995）を用いて分析した。60°〜90゜だけ相シフトしたサイン平方窓関数をフーリエ変換の前に両次元に適用した。Ａ 13C HMQC スペクトル（Baxら、1983）を、600MHzにおいてC2H3O2H（pH4.8，281Ｋ）に溶かしたNef２−26（1.5mM）で得た。13Cスイープ幅は11318Hzであり256スキャン及び400tl増加率を用いた。３JNHCaHカップリング定数を、50OMHzにおいてDQF−COSYスペクトルから測定した。適切な並びをスペクトルから抽出し、逆フーリエ変換し、32Ｋまで０で満たし、ガウス窓関数を乗じてフーリエ変換した。アンチフェーズピーク形状を、社内プログラムCOUPLINGを用いて小さなカップリング定数上の広いライン幅の効果を考慮に入れた。ゆっくりと交換するアミドプロトンを、適切な重水素含有溶媒（C2H3O2又は2H2O）に凍結乾燥したペプチドを溶かし、溶解直後に一連の１Ｄ及びTOCSYスペクトルを記録することにより同定した。構造束縛 C2H3OHにおいて300ms混合時間スペクトルから測定したNOESY交差ピーク体積を用いて結合距離上限を計算した。対角線の上側からのピークを、下側からピークがより優れた分解能である場合を除いて用いた。一対だけの非縮退CbHプロトン(Pro14)はスペクトルのオーバーラップがなかった。結果として、Trp5及びTrp13芳香環からのＣ（６）Ｈ／Ｃ（７）Ｈ交差ピークを用いて体積を較正し（距離2.47Å）；距離を、縮退及び凝似原子について自動的に補正する体積を用いて計算した。交差ピークが信頼できるまで評価できなかった場合、５ Åの結合上限を割り当てた。0.5及び1.0Aの較正を各々骨格プロトンのみ及び少くとも１の側鎖プロトンに関連する距離制限に加えてコンホメーション平均化及び体積一体化における誤差を許容した。最終的な構造計算において、NH，CaH及びCbH原子についても少数の上り結合の下限＞1.8Å(Wilcoxら、1993；Manoleras & Norton，1994)を用いた。これらは、NOE制限リストに供されない＜3.５Åの距離について最初の(DIANA)構造を検査する社内プログラムで得た。この方法で同定した距離を、交差ピークが観察されたことを確認するために実験的なNOESYスペクトルと比較し、それらを供した。交差ピークが明らかにない場合、3.5Ａの結合下限を制限リストに加え；全ての他のNH，CaH及びCbH原子について下限は1.79Ａであった。骨格二面角束縛は、次の通り、３JNHCaH値から推定した。３JNHCaHf ５HZ，ｆ＝−60°±30°；５Hz＜３JNHCaH＜６HZ，ｆ ch，1986)。６Hz＜３JNHCaH＜８Hzであり、正のｆ角の可能性がNOESYスペクトルにより排除される場合、ｆは−120°±60°に制限され；そうでないなら、ｆ角は制限されなかった。非縮退C6H共鳴がC2H3OHにおいてpH4.5及び281Ｋにおいて11の残基について観察された。可能な限り、３JN HCaHカップリング定数を、DQF−COSYスペクトルにおけるＥ−COSYスペクトル又はピークスプリッティングにおける置換として受動的カップリングから測定した。残基内dab及びdNbの相対強度を50ms混合時間NOESYスペクトルにおいて測定した。全てのｃ１角が制限されない結果として３つの不安定なコンホメーション（ｃ１＝−60°，60°、又は180°）（Wagnerら、1987）のいずれについて予想されるものに適合するパターンはなかった。構造計算最初の構造は、カップリング定数データから得られる二面角制限及び両方の化学シフト方向において明確に割り当てられたNOE交差ピークから得られた距離制限を用いて、距離ジオメトリープログラずれの段階でも水素結合制限は用いなかった。可能な限りこれらの開始構造を用いて不明確なNOESY交差ピークアサインメントを解いた。全ての構造において適切なプロトン間距離が＜５Åであり、二者の対の間の距離が＞７Åであるなら、アサインメントは許容された。少数の結合下限＞1.8Åも、最終的な構造計算の前に導入した。制限の最終的なセットを得た後、距離ジオメトリー構造の新しいファミリーを DIANAを用いて作り、そして最も低いペナルティー関ュミレーティドアニーリングにより精密化した。シュミレーティドアニーリングは、1000Ｋで20,000ステップ及び分子を次第に300Ｋまで冷やして10,000ステップを用いて行った。１fsの時間ステップを全体を通して用いた。次に、その100 の構造を更なるシュミレーティドアニーリングにかけ、ここでは、それらを20,0 00ステップで 300から０Ｋに冷やし、次にPowellコンジュゲート勾配最小化の100ステップを用いてエネルギー最小化した。各々の構造について、この手順を10回、行い、全体のエネルギー及びNOEエネルギーに関してこれらの10のうち最良のものを選択した。次にその構造を、全ての顕在化した電荷を中和し（Monksら、1995）、顕在化した水分子のかわりに距離依存性の誘電を用いて経験的なCHARMmフォースフィールド（Brooksら、1983）でエネルギー最小化を行った。これらの立体化学エネルギー（即ち静電項を除く計算したエネルギーへの全ての寄与の合計）及びNOE エネルギーを構造分析のために選んだ。実施例１：ヒト赤血球及びヒト白血球細胞系へのHIV Nefタンパク質のアミノ末端領域の細胞毒性活性 Nef２−22，Nef2−20，Nef２−22(Valll)，Nef２−26(Ser13)、ミリスチル化アナログ、並びに対照ペプチドNef31−50及びMyr−Nef31−50のヒト赤血球培養したCEMリンパ球への効果を上述のように研究した。溶血の投与量応答投与量応答研究は、大きな溶血が、図１に示すように20mMの濃度における非ミリスチル化Ｎ末端ペプチドでのみおこり、0.5mM程度の低い濃度ではミリスチル化ペプチドは活性であることを示した。対照の非Ｎ末端ペプチドMyr−Nef31−50 は0.5〜20mMの濃度範囲では本質的に非溶解性であった。４つのミリスチル化Ｎ末端ペプチドは配列又は長さにかかわらず、ほぼ同じ投与量−応答曲線を供した。溶血の速度ミリスチル化及び非ミリスチル化ペプチドについての溶血の時間経過を図２に示す。対照ミリスチル化ペプチドMyr−Nef31−50は選択された期間（10分）にわたってほとんど不活性であり、４つの活性ペプチドは、極めて似た速度を示した。これらの速度は、最初の４分にわたる溶血の迅速な増加を特徴とした。 CD ４＋Ｔ細胞の顕微鏡分析ミリスチル化Ｎ末端NefペプチドMyr−Nef２−22で処理したCEM細胞の顕微鏡検査は、広範囲の細胞凝集（図３）を示した。凝集は10分後及び、６時間の連続的インキュベーションで明らかであり、そして細胞は次第に溶解するようである。トリプトファンブルー及びヨウ化プロピジウムの取り込みは凝集した細胞において観察され（データは示さない）、このことは、膜一体性の喪失を示す。対照の非Ｎ末端ペプチドMyr−Nef31−50に露出された細胞は、同じ時間で、全く又はほとんど凝集を示さなかった。同様に、非ミリスチル化Ｎ末端ペプチドNef２−22 での細胞の処理は細胞凝集を引きおこさず、これらの細胞もMyr−Nef31−50で処理した細胞も、トリプトファンブルー又はヨウ化プロピジウム、取込みの証拠を示さなかった（データは示さない）。細胞毒性 12.5mM Myr−Nef２−26に露出したCEM細胞は、30分後に、最大に近いLDH遊離（96.4±3.2％細胞毒性）を示した。毒性は、３mM程度の低い濃度で活性が明らかな投与量依存性である（図４Ｂ）。細胞を非ミリスチル化Nef２−26（2.7±2. 7％細胞毒性）、又は対照ペプチドMyr−Nef31−50（9.7±1.9％細胞毒性）で処理した場合、LDH遊離はほとんど又は全く検出されなかった。LDH活性を含む、又はウサギ筋肉由来のLDHの対照調製の活性を阻害するペプチドはなかった。速度論研究は、ミリスチル化Ｎ末端Nefペプチドに露出したCEM細胞からのLDH 遊離はわずか10分後に明らかであり、30分にわたって迅速に増加し、次に２〜４時間の間の安定期に達した（図４Ｃ）。非ミリスチル化Ｎ末端ペプチドは低レベルのLDH遊離のみを引きおこし、それは時間と共に変化しなかった。ミリスチル化、非ミリスチル化Nefペプチドで処理したCEM細胞もLDH遊離の増加を示したが、遊離の速度はミリスチル化Ｎ末端ペプチドのものより遅く、図４Ｃに示すように、29％だけのLDH遊離が４時間後に得られた（この時点でミリスチル化Ｎ末端ペプチドでは78％遊離と比較のこと）。蛍光消光研究蛍光消光研究を、ミリスチル化及び非ミリスチル化ペプチド内の脂質二重層に関連して位置５におけるトリプトファン残基の局在化を決定すると理解された。溶血は遠位の位置トリプトファン13のセリンでの置換がミリスチル化ペプチドMy r−Nef２−26(Ser13)の溶血活性に影響を与えなかったことを示したので、Nef２ −26(Ser13)をこれらの実験に用いた。このストラテジーは、紫外蛍光が、結果の解釈を簡単にする近位のトリプトファンからのみ得られることを意味する。ペプチドの蛍光スペクトルは、最初に、PBS中で決定した（図５）。Myr−Nef ２−26(Ser13)の放射スペクトルのわずかな青色シフト及び強度の増加が、Nef２ −26(Ser13)に関して観察された。これらの効果は、ミリスチル化がトリプトファン残基のインドール環の環境の疎水性を増加させたことを示唆する。ペプチドをLUVに加えた時に、Myr−Nef２−26(Ser13)はリポソーム懸濁液のわずかな濁りの顕著な削減を引きおこしたことが注目されて、これは、Myr−Nef２−22に相当するミリスチル化Ｎ−末端21残基ペプチド(NPc)がより小さなペプチド／脂質アダクトの形成のためSUVの光散乱の著しい減少を引きおこしたという我々の以前の観察結果（Cu rtainら、1994）に従う。 340nmにおける放射のStern−Vollmerプロットを、Myr−Nef２−26(Ser13)及び Nef２−26(Ser13)のための全ての４つの消光剤で決定した（図６Ａ＆Ｂ）。ペプチドNef２−26(Ser13)では（図６Ａ）、緩衝液可溶性TCCでのみ大きな消光が観察され、ここで親油性消光剤での線の傾きは極めて浅い。そのプロットが直線状であることは、単純な衝突消光が単一環境においておこったことを示唆する。他方、Myr−Nef２−26(Ser13)の場合、最も急勾配の傾きは５NPCで見られ、そのプロットは少し下に曲がった（図６Ｂ）。水溶性TCCは同様のプロットを供するが、かなり小さい勾配の傾きである。これらの結果は、ミリスチル化により、近位のトリプトファンのインドール環が、リン脂質消光剤にアクセスできる脂質二重層の上部領域に引き寄せられることを示す。但し、それは、TCCでの消光により示されるように、ヘッドグループ−緩衝液界面において少しの時間をなお費やす。これらの結果は、Nefのミリスチル化末端ペプチドは、ヒト赤血球について細胞溶解性であり、かつ培養したリンパ球細胞に対して毒性であること、及びこれらの活性は単にミリスチル鎖の存在の結果であるばかりでなく、ペプチドの構造にも関連する。これらの発見は、２つの方法において重大である膜標的化及びNe fの相互作用に関して並びにAIDS病因におけるNef及びNefフラグメントの関連の可能性に関して。実施例２：イーストへのHIV Nefタンパク質のアミノ末端領域の細胞毒性効果 Myr−Nef２−22（10mM）及び対照Nef31−50（10mM）を上述の通り５つのイースト株に加えた。全てのイースト種はMyr−Nef２−22と同様に応答した。図７は、Myr−Nef２−22での処理が全細胞集団のコロニー形成の損失を引きおこしたことを示す。上述の株及び多数の他の株で更なる実験を行ったが、以下の結果はＳ．セレビシアエ株に関連するものに制限される。なぜなら、テストした全てのイースト株において一般的な現象として細胞死が観察されたからである。１mM Myr−Nef31−50ペプチドの細胞への添加はコロニー形成の損失を引きおこさず（図８Ａ）、このことは、ミリスチル化自体はペプチド毒性の原因でないことを示す。しかしながら、1mM量のNef２−22での処理は、コロニー形成を80％喪失させたが、同じ濃度のMyr−Nef２−22はコロニー形成の全体の喪失を引きおこした。より定量的な点でMyr−Nef２−22及びNef２−22を比較するために、投与量応答研究を行った。30分間隔で、完全な細胞死のための最も低いMyr−Nef２−22濃度は約１mMであった（図８Ｂ）が、Nef２−22ペプチドは同様の効果を引きおこすために約３倍のレベルを要求した。 Nef ペプチドによる細胞浸透化コロニー形成の喪失を、浸透化が細胞の死の可能性ある原因であるか否かを見るために研究した：イーストはこの種の実験について利点を供する。なぜなら細胞壁は膜が浸透化される場合でさえ完全であり続けるからである。以下のペプチド処理細胞を、ヨウ化プロピジウム（PI）で染色するために検査した。蛍光顕微鏡により、Myr−Nef２−22で処理した細胞を30分のペプチド添加の間にPIで染色し、他方未処理の細胞は染色しなかった。PI染色は、未染色の生存細胞又は完全な膜を有する細胞を、死んだ又は傷ついた膜を有する細胞から区別するのに役立つ(Shapiro，1994)。ペプチド誘導浸透化の定量を、フローサイトメトリーにより研究した。本質的に、Myr−Nef２−22で処理した細胞全てが30分の処理後にPIで染色された。対照的に、Nef２−22は細胞の数３分の１を浸透性にしたが、対照ペプチドMyr−Nef31−50での処理は未処理の細胞と同様に約５％のPI染色であった。これらのデータは、Nef Ｎ末端ペプチドが形質膜及び他の細胞膜を破壊して細胞死を導くことを示す。 Myr−Nef２−22の細胞局在化を決定するために、そのペプチドをFITCで標識した。生じた標識されたペプチドは（フローサイトメトリー及び蛍光顕微鏡により判断して）細胞と会合しておらず、細胞死活性はなかった。このことは、Lys残基が殺傷活性に重要であることを示唆する。細胞局在化を検査するための更なる研究は、他の標識化ストラテジーを要求するであろう。 Nef ペプチドは大腸菌細胞を殺す Nefペプチドが原核微生物細胞を殺すことができるであろうか否かを決定するためにそれらを水中の大腸菌細胞の懸濁液に加えた。Nefペプチドはイーストに相当する様式で大腸菌細胞を殺した（図10）。ペプチド細胞毒性は、細胞を緩衝液(50mM HEPES／２％グルコース）に懸濁することにより遅らせることができた。それは、完全な死が30℃で20時間のインキュベーションまで観察されなかったからである。イーストデータと共に、これらの結果は、真核及び原核細胞についての細胞外Nef誘導毒性が細胞膜への共通の効果を通して発揮されることを示唆する。実施例３：サイトセンサーマイクロフィジオメーターにおける細胞外Nefペプチドの効果サイトセンサーマイクロフィジオメーターシステムは極めてセンシティブなアッセイシステムであり、ヒトCD4＋細胞への細胞外Neｆペプチドの効果を検査するのに用いた。このシステムはこれらのNefペプチドのインヒビターの効果を定量的に評価し比較するためにアッセイを開発するのにも用いられる。サイトセンサーマイクロフィジオメーター（Molecular Devtces Inc.，LA）は試験管内で細胞の代謝速度を間接的に測定するのに用いることができる光を扱う電位差測定センサーベースの装置である(Parceら、1989；Mc Connellら、1992) 。代謝は、マイクロポリュームフローチャンバー内に固定化された細胞からの酸代謝物生産の速度を測定することにより決定される。ヒトCEM細胞を遠心し、低緩衝性無血清／無重炭酸RPMI1640培地(Molecular De vices；以後、改良培地と呼ぶ）。細胞を、細胞カプセルカップ(Molecular Devi ces)のポリカーボネート膜上に30,000〜63,000細胞／カプセルの密度で種つけした。細胞をアガロースエントラップメント媒体(Molecular Devices)を用いて固定化した。種つけしたカプセルカップをpHの変化（及びこれにより細胞の代謝）を検出するシリコンセンサーを含むセンサーチャンバーに移した。この実験のセットに用いたサイトセンサーシステムは、酸性化速度の測定のための４つの別個のチャンバーを含んでいた。改良培地を100〜120μｌ／分の速度で細胞を横切ってくみ上げた。各々の細胞チャンバーを、ソフトウェアコマンドを用いて変えることができる２つのリザーバーのいずれかからの流体として共した。酸性化速度を測定するために、改良培地の流れを周期的に止め、排出された酸代謝物(乳酸及びCO2)の蓄積を許容した。この実験のセットにおいて、流れを30 秒、止め、この時間の間、時間にわたる電圧シグナルの変化に最小二乗法により傾斜を適合させ、（μＶ／ｓとして測定した）酸性化速度を計算した。この速度データを、４つのチャンバーからのシグナルの直接の比較を許容するために（化合物の添加前に４〜５の速度点を用いて）標準化した。酸性化速度の測定は毎２分に行った。チャンバーは37℃に維持した。基底酸性化速度を少くとも20分、（いずれの処理もなしで）モニターした。この時間の後、ペプチドを１時間未満、細胞に露出した。全ての実験において、少くとも１のチャンバーはいずれの化合物にも露出せず、陰性対照とした。結果を図11に示す。 Nef ペプチドへのCEM細胞の応答 105ＭＮ末端ミリスチル化ペプチドMyr−Nef２−26への細胞の連続的な露出は、１時間後に基底代謝速度（ｎ＝４）を33〜75％減少させた（図11Ａ）。同じ時間の後、対照細胞は代謝速度の０〜５％減少を有した。Myr−Nef２−26を最初に細胞に導入し、代謝速度の一時的な増加（５〜10％）が観察された（ｎ＝４）。この代謝速度の増加は、代謝速度の迅速な減少がおこる前に6〜10分、続けた。この代謝速度の最初の増加は対照細胞においては観察されなかった。Nef２−2 6を加え終わり、未処理の培地の流れを再開した後、細胞の代謝速度は回復せず、ほとんどの場合、下降し続けた。これらの結果は、10〜５ＭのMyr−Nef２−26 により誘導された迅速な可逆的細胞毒性（細胞溶解）と一致する。Myr−Nef２− 26により誘導される細胞代謝速度の最初の増加は、ペプチドの膜活性のためであり得る。ミリスチル化NefＮ末端ペプチドの観察された効果は投与量依存であり、図11 Ｂに示すように１μＭのペプチド濃度でまだ明らかであるが、0.1μＭではそうでなかった。 10〜５Ｍの非ミリスチル化ペプチドNef２−26は１時間の連続露出後に細胞の基底代謝速度へのいずれの大きな効果も有さなかった（ｎ＝３）（図11Ａ）。しかしながら、Myr−Nef2−26で観察されるように、Nef２−26は、最初に細胞に導入した時に代謝速度の最初の一時的な増加（６〜12％）を引きおこした（ｎ＝３）。このことは、ペプチドNef２−26も膜活性を有するが、いずれの細胞溶解活性もないことを示唆する。 10〜５Ｍミリスチル化ペプチドMyr−Nef31−50は、１時間の連続露出の後に細胞代謝速度への一時的な効果を示さなかった（図11Ａ）。その代謝速度は露出全体を通して基底速度の−５〜５％で種々であり、速度の最初の増加は一貫して観察されなかった。これらの結果は、ペプチドNef２−26のＮ末端のミリスチル化がペプチドの細胞溶解毒性のために必要であることを示唆する。これらの結果は、Nef２−26アミノ酸配列内の領域はこれらの実験で観察される一時的な膜効果の原因であることも示す。実施例４：HIV Nef タンパク質のアミノ末端の溶液構造 25残基ポリペプチド(Nef２−26)の溶液構造を上述の通り１Ｈ−NMR分光学により研究した。 90％H2O／10％2H2O及び2H2O中のNef２−26の１Ｄ及び２Ｄ１Ｈ NMRスペクトルは、ペプチドは水溶液内で十分に規定された構造を有さないことを示した。これは、NH(Dd0.6PPM)及びCaH(Dd0.9ppm)化学シフトの限られた分散並びにNOESYスペクトル中の残基内及び連続以外の交差ピークの欠如からの証拠であった。ペプチドを2H2Oに溶かした時、アミドプロトンが迅速な重水素化を受けたこと(281Ｋ及びpH4.8で10分以内に完全)は、安定な水素結合の欠如を示す。水溶液中で、Pro14の前のペプチド結合はシス及びトランス配置の両方で同時に存在した。Trp13 CaH及びPro CdH(トランスコンホ 1986）の間の連続的NOEから決定したTrp−Proペプチド結合のコンホメーションはほぼ55％のトランス及び45％のシスであり、これら２つの形態の間の変換速度はいくつかの残基について観察されたピークの別個のセットについて十分にゆっくりであった。この例は、図12に示す。ここでは、６つのAla NH−CbH3交差ピークが、分子内に３つのAla残基しかないにもかかわらず２Ｄ TOCSYスペクトル内で観察された。ピークＡ及びＢはAla26のためであり、Ｃ及びＤはAla23のためであるが、ピークＥ及びＦは各々トランス及びシスコンホメーションにおけるPro14に伴うAla 15のためである。ピークＡ，Ｂ，Ｃ及びＤは１Ｈ化学シフトの限られた分散が高度にオーバーラップしたスペクトルを生じ、２つの配座体についての明確な割り当てを防いだので、特定の配座体に割り当てなかった。残基２〜７について１セットのシグナルのみが観察され、このことはPro14におけるシス−トランス異性に関連するコンホメーションの差がこれらの残基の化学シフトに無視できる効果を有したことを示す。Ser8からAla26において、ほとんどの残基について２セットのシグナルが観察された。スペクトルのオーバーラップがArg19〜Ala26からのピークの個々の配座体への割り当てを妨げたが、Ser8〜Glu18からの２つの形態の連続的割り当てを追跡することができた。いくつかの残基について、２つのコンホメーションの間の化学シフトの差は0.1ppm超であった。最も大きな差は、シス配座における3.30ppm、そのランダムコイル値の1.12ppm上部、及びトランス配座体における対応するシフトの0.93ppm上部において共鳴したPro14CaHについてであった。この大きなより高い場へのシフトは、隣接する水溶液中のNef２−26のNOESYスペクトルにおいて３つの媒体域のNOE交差ピークしか観察されなかった：Ile11 dNN(ｉ，ｉ＋２)，Trp13 daN（ｉ，ｉ＋２）及びdNN（ｉ，ｉ＋２）。これらの交差ピークは全てシス配座におけるPro14を有する配座体に関連しており、このことは、この配座体がトランス配座体よりわずかに安定な構造を有し得ることを示唆する。 Pro25についてもシス−トランス異性が観察されたが、シス形態は少い割合（５％未満で存在するだけであった。シス異性体の存在は、Pro25 Ca Hに対するGlu24 CaHからの弱いNOESY交差ピークの観察により確認された。隣接残基Glu24及びAla26のみがこの配座のためNMR交差ピークを分離させた。このことは、その２つの形態は、Pro14異性によるものと対照的に限られていることを示す。水溶液中のヘリックス構造を安定化するために２，２，２−トリフルオロエタノール(TFE)は広く用いられている（Nelson & Kalle 1994）。TFEをNef２−26の水溶液に（50％まで）滴定した時（4.８から5.5へのp H増加）、骨格NH化学シフトの分散の小さな増加（0.7ppmまで）及びCaH化学シフト分散におけるより大きな増加（1.4ppmまで）があった。Pro14におけるシス− トランス異性の効果は約30％のTFE濃度で顕著でなくなり、TFE濃度が50％に達すると消滅した。CaH共鳴は50％TFEにおいてより大きな化学シフト分散を有するばかりりでなく、いくつかはより高い場へとシフトし（図13Ａ）、これはヘリックス構造の形成と一致する。実際、CaH化学シフト指数のプロフィールは、その構造が以下に議論されるメタノール中でのNef２−26のそれと極めて似ている（図1 3Ｂ）。これらの結果は、Sabatierら（1990）のものと広範囲で一致する。彼らは、内偏光二色性分光分析を用いて、Nefの残基２〜32に相当するペプチドはTFE 内で部分的にヘリックスであるが、水溶液中でβ−シート及びランダム構造の混合物であり、より短いペプチド（残基１〜17）はいずれの溶媒でもヘリックスでなく、実際に、TFE中でβ−シートを形成していたことを見い出した。 1；Brownら、1982；Inagakiら、1989；Ikuraら、1991）及びｄ−ヘモリシン（Le tら、1987，Tappinら、1988）は、メタノール及び脂質ミセル中で極めて類似する構造し、このことは、メタノールは膜様環境においてペプチドの構造を凝似するための適切な溶媒であることを意味する。Nef ２−26をメタノールに溶かした時、１Ｄ及び２Ｄスペクトルはα−ヘリックス構造と一致し（CaH CSIは図13Ｂに示す）、メタノール中のスペクトルと50％Ｈ20 ／TFE中のスペクトルとの間に優れた相関があった（即ち同様の化学シフト及びN OESY交差ピーク）。メタノール中で記録されたスペクトルの全体の質は50％Ｈ20 ／TFE)より優れている（優れたシグナル対ノイズ及び分解能）ので、Nef２−26 の構造を計算するのにメタノールスペクトルを用いた。メタノール中でのNMR共鳴アサインメント C2H3OHに溶かしたペプチドのスピンシステムを281ＫにおけるDQF−COSY及びTO CSYスペクトルの組合せを用いてアサインし、他方 thrich，1986）。図14は、NOESYスペクトルのフィンガープソンド（図14Ａ）及びdNN領域（図14Ｂ）を示し、そのアサインメントは以下の表１に列記され、図1 4に示される。 ^a全てのシフトは、3.35ppmにおけるC²H₃OHのδ_CH3による０rp ランダムコイル値からのCaH及び骨格NHのずれ（Wishartら、1995ｂ）を図13に示す。αプロトンの上方へのシフトはヘリックス構造の形成に適合し、Ｎ末端からＣ末端に行く時のNH共鳴の徐々に上方に行くシフトは、ヘリックス巨大双極子のシールド効果と一致した（Wishartら、1991）。残基７〜24についてのランダムコイル値からのNH化学シフトのバリエーション（図13Ｃ）はα−ヘリックスについて観察される３〜４の反復パターンと一致し（Zhowら、1992 ）、図３Ｄに示されるCa化学シフトは残基13〜21についてのヘリックスコンホメーションと一致した。281Ｋから298Ｋへの温度の増加はスペクトルに有意な影響を与えなかった（残基のCaH共鳴についての化学シフトは281Ｋにおける1.20ppm から298Ｋにおける1.17ppmにわずかだけ減少した）。このことは、ヘリックス構造がこの温度範囲にわたって保持されたことを意味する。アミド交換 Nef２−26をpH4.5及び281ＫにおいてC2H3O2Hに溶かした場合、Ｎ−及びＣ−末端近くの残基のアミドはより迅速に交換し、Gly3，Lys4，Lys7，Ser8，Ser9，Al a26及びＣ末端アミドは３時間以内に消滅し、そしてこれらGly2，Trp5及びSer6 はその後すぐに消滅した。その他のアミドは24時間後になお存在し、Ile11，Val 16，Arg17，Glu18，Arg19，Met20及びArg21は48時間後のTOCSYスペクトルで観察できた（図15）。これらのゆっくりと交換するアミドプロトンはヘリックスの中心からのものであるが、中間の交換速度のアミド(Val10，Arg22，Ala23、及びGl u24)はヘリックスの端からのものであった。ヘリックスの端のものではないが、 Gly12，Trp13及びAla15のアミドは最もゆっくりと交換する基のものではなかった。これはおそらく、ヘリックス中のよじれの部位にあるPro14の近くにあるためである（以下参照）。構造決定図15は、連続及び媒体域NOE連続性、３JNHCaHカップリング定数、及びメタノール中で観察されたゆっくり交換するアミドプロトンを要約する。残基７〜23を含むヘリックス構造の存在は、低い３JNHCaHカップリング定数（＜６Hz）、多数のdaN(ｉ，ｉ＋３)，daN（ｉ，ｉ＋４）及びdab（ｉ，ｉ＋３）NOE連続性及び分子のこの領域におけるゆっくり交換する骨格アミドプロトンの存在により示される。低いカップリング定数は、これらの条件下で、ペプチドは大きなコンホメーション平均化を受けないことを示す。 239の残基内、81の連続及び73の媒体域（１＜１／２ｉ−ｊ１／２＜５）NOEから作ったNOEから予想される392の結合上限を用いて構造を計算した。NOESYスペクトルからのNOEの欠如に基づく６の結合下限も用いた。スピン−スピンカップリング定数に基づく14の骨格二面角制限を用いたが、側鎖制限は用いなかった。最初の構造はDIANAを用いて計算し、Ｘ−PLORにおけるシュミレイティドアニーリングにより精密化し、最後にCHARMmフォースフィールドでＸ−PLORでエネルギー最小化を行った。これらの構造についての幾何学的及びエネルギー的パラメータの概要を以下の表２に示す。 ^a距離ジオメトリーフォースフィールドにおけるエネルギー最小化の後の最も優れた20の構造を、次に、材料及び方法下に記載されるように、距離依存性誘電性及び中性側鎖を用いてCHARMmフォース−フィールドにおいてエネルギー最小化を行った。 ^b制限の数を括弧内に示す。距離違反＞0.5Å又は二面角違反＞５°の構造はなかった。構造分析及び記載最終的な20の構造の角度指数パラメータ（Ｓ）(Hybertsら、1992；Pallaghyら、1993)は、残基10〜23は図16Ｂ及びＣに示すようにｔ及びｙ角の両方についてＳ＞0.9で十分に規定されていることを示す。平均構造からのRMSDを図16Ｂに残基番号の関数としてプロットする。それは、構造が分子の中心部分にわたり十分に規定されていることを示す。この十分に規定された領域について、平均対式（ pairwise）RMSDは骨格重原子Ｃ．Ca及びＮについて0.40±0.11Åであり、全ての重原子について1.43±0.20Åである。全体の分子についての対応する値は各々3. 11±0.80及び3.96±0.84Åである。ｃ角は制限されなかったが、残基のいくつかは十分に規定されたｃ１角を有し、十分に規定されたｃ２角も有する（図16Ｅ，Ｆ）。十分に規定されたｃ１及びｃ２角を有するこれらの残基は分子のヘリックス領域に位置する。ｃ角のいくつかは十分に規定されたが、Arg17，19，21及び2 2によるCaH−CbH交差ピークがＥ−COSYスペクトルにおいてオーバーラップしたので立体特異的アサインメントは行えなかったが、解くことができた交差ピークについては、カップリング定数及び50ms NOESYスペクトルからの強度は予想されるパターンに適合しなかった（Wagnerら、1987）。Trp13は十分に規定されたｃ１角を有するが、この場合、ca−cb結合についてのコンホメーション（ｃ１＝− ｄ126°）は消した。メタノール中でのNef２−26の全体のコンホメーションを図17Ａに示す。ここで20の最も優れた構造（静電項を排除して最も低い全体のエネルギーを有するもの）の骨格原子を残基10〜23（ここで、分子はα−ヘリックスである）上に重ねた。十分に規定された側鎖も示す構造の直交図を図17Ｂに示す。界面活性剤ミセル中での構造メタノール中でのNef２−26の構造は詳細に記述されている。なぜなら、この溶媒中のスペクトルの優れた質により、NMR制限の広範囲のセットが得られたからである。我々は、界面活性剤SDSのミセル中での構造も研究した。水溶液中で明らかであるTrp13−Pro14アミド結合についてのシスートランス異性はSDSミセル中に存在しない。トランス配座体が支配的であると仮定されるが、これは、ピークが水の共鳴と一致したのでTrp13のCaH共鳴をNOEから確認できなかった。ランダムコイルからのCaH化学シフトのずれ（Wishartら、1995ｂ）（図13Ｅ）は、残基13〜23が主にα−ヘリックスであることを示し、これらの残基に関連するいくつかのdNN（ｉ，ｉ＋２）及びdaN（ｉ，ｉ＋３）NOESY交差ピークがこれを支持した。最初の10残基もヘリックスであるという証拠はなかったが、残基７／９及び8／10についてのdNN（ｉ，ｉ＋２）、残基２／４及び５／７についての daN（ｉ，ｉ＋２）、並びに残基１／５についてのdaN（ｉ，ｉ＋４）を含むいくつかの媒体域NOEの観察結果は、Nef２−26のＮ末端が水溶液中よりSDSミセル中でより組織化され得ることを示唆する。Ｎ−及びＣ末端の変化 Nef２−26のＮ−アセチル基をミリスチル基で置換する効果を281Ｋ及びpH4.5 でC2H3O2H中で検査した。Nef２−26のものと比べて３つのＮ末端残基の化学シフトにおいて小さな変化が観察されただけであり、NH及びCaH化学しふとの最も大きな差は、Gly2について観察された（dNH8.48、より高い場への0.12ppmのシフトを示す、dCaH3.92、より低い場への 0.01ppmのシフト）。他のスペクトルは本質的に同一であった。同じ媒体域NOESY 交差ピークも観察した。それゆえ、ミリスチル基はメタノール中でα−ヘリックス構造に効果は有さなかった。Ｎ末端アセチル基をNH３＋に置換し、Ｃ末端アミドをカルボキシレートで置換した場合、大部分Ｎ末端近くのプロトンからスペクトルのいくつかの変化が観察された。残基２〜８についてのNHからCaHの交差ピークは他の残基についてのものと比べて極めて弱く、NHシグナルは１Ｄスペクトルにおいて極めて広がり（³1 8Hz）、このことは、いくつかの中間体交換過程がおこっていることを示唆する。これと一致して、この領域からの分解されたアミド共鳴のライン幅は、温度を 298Ｋに上げるにつれて減少した。これらの残基のアミド化学シフトも、おそらくＮ末端の正電荷の効果のため、0.03（Ser6）から0.14ppm(Lys4)まで、より低い場にシフトした。CaHシフトへの効果はより小さく(0.03〜0.05ppm)、一方向に一貫していなかった。Ｃ末端での効果はあまり劇的でなく、Ala26のNHピークのみが0.18ppmだけより低い場にシフトした。他の残基はＮ−及びＣ−末端における変化により大きく影響を受けなかった。NOESYスペクトルは、α−ヘリックスの特徴であるdaN（ｉ，ｉ＋３）、ｄaN（ｉ，ｉ＋４）、及びdab（ｉ，ｉ＋３） NOEが（メタノール中のNef２−26のNOESYスペクトルと比べて）保存されていることを示し、このことは、メタノール中の構造のα−ヘリックス領域は本質的にＮ−及びＣ−末端の変化により影響を受けなかったことを示唆する。 pH4.5及び281Ｋにおける水中での遊離Ｎ−及びＣ−末端を有するNef２−26のスペクトルはNef２−26のものと極めて似ていた。Ｎ−アセチル基をミリスチレートで置換した場合、pH4.5における水中で記録されたスペクトルは広いラインを示し（例えば、Trp5のインドールNHの半分の高さにおける幅はNe f２−26について５Hzであったが、Myr−Nef2−26について15Hzであった）、２Ｄ NOESY及びTOCSYスペクトルは、極めて少い明白な交差ピークを示した。これにより、ミリスチル化Nef２−26は水溶液中で凝集していると思われる。実施例５：Nef のＮ末端ペプチドと潜在的なコイル−コイル相互作用を有するであろうペプチドのデザインヘリックス領域Nef２−26の疎水性表面は、残基Trp13，Val15，Met20及びAla2 3からなる。これは、ペプチドが、第１のターンのａ及びｄ位置におけるTrp13及びVal15との、ヘリックスの２つのターンにわたる潜在的にコイル−コイル相互作用を形成することを許容し、Val10及びGly12はインターフェースボーダー位置ｅ及びｇを占有する。第２のターンについて、Met20及びAla23はａ及びｄ位置にあるが、ｅ及びｇ位置はArg17及びArg19により占有される。逆平行配置におけるペプチドとのコイル−コイルは、ヘリックスの双極子の好ましいアラインメントを供するであろう。適切なコイル−コイル相互作用は、標準的一文字コードで示されるアミノ酸残基の以下に示すものと似ているであろう。ペプチドAXXLEXEAXXAAXLは、最も有効なコイル−コイル相互作用のペプチドをデザインするための開始位置を示す。このペプチド内のＸで示した残基は、アラニンのようないずれかのヘリックス増強性残基により占有され得る。但し、可溶性及び分光法的理由のため、これらの残基のうちいくつかは本質的により親水性のもの、例えば位置ｆにおいてGln，A sn及びSerであるべきである。ｉ＋４残基離れたところへのGluからLysへのラクタム架橋を形成する能力も、ペプチドのヘリックス特性を増加させるためにこれらの位置に用いることができよう（Houstonら、1996）。このペプチドのバリエーションは、いくつか又は全てのアラニン残基（１，11 ，12）を他の親水性残基、例えばバリン、ロイシン又はイソロイシンで置換して疎水性相互作用を増加させることを含む。位置８の残基は、Nef２−26上でTrp13 と相互作用するであろう。そして、Phe又はTyrのような芳香族残基はより強い相互作用を供することができる。但し、立体制限がこの可能性を排除し得る。他のバリエーションは、ペプチドがNef２−26のLys4及び７と相互作用するようにそのペプチドを伸長させることを含む。これは、ペプチドのＣ末端に１又は複数の Glu残基を加えることにより達成することができ、Gly又はSer残基から作られた可変性の長さのスペーサーが、最も優れた相互作用を達成するために必要とされ得る。実施例６：Nef タンパク質のＮ末端領域と相互作用するインヒビター作られたMarkush構造具現化化合物： Lip−Ar−Pol−AA “Lip”は、Nef末端の疎水性領域と複合体形成するために必要な脂溶性成分である。これは、いくつかの異なる構造により例示される。これらは、コール酸、疎水性トリペプチドIle−Val−Ile、ペプトイド及びポリグリコールを含む。 “Ar”は、芳香環を含むリンクで、コンホメーション制限が影響を与えるために用いることができる点である。包含される成分は、フェニルアラニン誘導体からヘテロ環式化合物までの範囲である。 “Pol”は、極性側鎖を有するリンク、典型的には、アスパラギン酸又はアスパラギンである。 “AA”は、典型的には、小さな側鎖を有する中性アミノ酸、例えば、２−アミノブチル酸、システイン、プロリン又は３−クロロアラニンである。しかしながら、かさ高い基、例えば４−ニトロベンゼンの結合は優れた阻害能力と適合した。また、Nef構造にドッキングしたインヒビターモデルの研究は、Nef構造上のグルタメート残基と相互作用するようにリシンのように側鎖を広げる可能性を示す。デザイン法：最初のリードインヒビターの溶解度を改良することに努力を行ったがそのいくつかは完全に手に負えなかった。いくつかの改良が溶解度を改良することが見い出された： “Lip”（IVIに基づくリード構造）の改良 − エーテル又はポリグリコール鎖のＮ末端イソロイシン残基への結合。 − Ｎ末端アセトアミドの除去。 − Ｎ末端イソロイシン残基のＮ−アルキル化アミノ酸での置換。 − Ｎ末端トリペプチド配列IVIの、疎水性であるがより可溶性の成分、例えばコール酸、又はポリグリコールもしくはトリペプトイド（Ｎ−アルキル化）での置換。 “Ar”（フェニルアラニンに基づくリード構造）の改良 − フェニルアラニンにかわるインドール又はイソキノリンの使用。 “Pol−AA”（Asn−Lys−NH２に基づくリード構造）の改良 − 第１級アミドは頻繁に不溶性化合物を導き、Asn−Cys−NH２の二酸等価物であるAsp−Cysは水溶解性となることが見い出された。 − システインは治療において要求されない。２−アミノブチル酸（Abu）はシステインと等配電子であり得、システインのAbuでの置換も可溶性を改良することが見い出された。例適切なインヒビターの例は以下の組合せを含む。ａ）親油性成分は、ステロイド；エチレンオキシド脂肪酸；多脂肪酸鎖、例えばホスファチジルコリンエステル；分枝脂肪酸；酸末端基を有する分枝ポリマーである。ｂ）芳香族成物：Trp基、例えばナフタレン又はインダン基との相互作用を増加させるために異なる芳香族基を用いることができる。芳香環（例えば（Ｚ）− デヒドロフェニルアラニン、２−アミノインダン−２−カルボキシレート、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシレート、及びインドリン−２−カルボキシレート）の位置及び方向を固定し、そして結合を増加させることができるいくつかのPhe置換もある。芳香族残基の封入のために強力なアフィニティーを有するシクロデキストリンを含むことも可能である。ｃ）陰イオン／双性イオン成分：陰イオン性カルボキシレート、ホスフェート、ホスホネート、スルホネート。インヒビターの細胞溶解効果を減少させるため及びタンパク質との可能な更なるイオン相互作用のために双性イオン基も用いることができる長鎖二酸インヒビターを用いることができ、例えばそのような化合物はほとんど界面活性剤活性を有さず、細胞溶解効果を減少させる可能性を有する。インヒビター又はペプチド配列の多重の提示も利用できる。ｄ）相補性、負電荷の両親媒性ヘリックスペプチド又はコイル／コイルインヒビター抗微生物剤として反復ヘキサマー単位から作られた小さな合成陽イオン性ヘリックスペプチド、特にNefインヒビターとして負電荷の両親媒性ヘリックスペプチドを用いることができる。ｅ）アンチセンスペプチド核酸(PNA)インヒビター： Nef遺伝子の本質的な領域に対するアンチセンスPNAを合成し、このような化合物の抗HIV効果を決定する。最良のインヒビター上述の改良の特定の組合せは、他の組合せに優る優れた阻害活性を導いた。これにより、“AA”としてのAbuは、“Lip”としてIVIと連結して用いた場合に有効であったが、“Lip”がコール酸である場合はそうでなかった。これにより、最良の溶解度を有する最も能力あるインヒビターは例えば次のものであり得る：Ｒ１−Ile−Val−Ile−Ｒ２−Asp−Ｒ３コリル−Ｒ２−Ｒ４−Ｒ５ここで、Ｒ１はアセトアミドキャップ又は上述のような可溶化基であり、Ｒ２はPhe又はその２−ナフチル対応基であり、Ｒ３はＣys（遊離酸）又はAbu（遊離酸）であり、Ｒ４はAsp又はAsnであり、Ｒ５はCys又は（Ｓ−４−ニトロベンジル）Cysであり、末端がアミド化されてもされなくてもよい。実施例７：HIV −１のアミノ末端の細胞毒性活性の予想されるインヒビターの合成及びキャラクタリゼーション並びにこれらの化合物の試験管内アッセイにおける迅速なスクリーニングいくつかの化合物を合成し、CD４＋Ｔ細胞からの蛍光プローブカルセインの遊離に基づく短期間アッセイを用いてNefペプチド誘導細胞膜損傷をブロックする能力についてテストした。一般的な合成法 Nefインヒビターとしてデザインした全ての化合物を、慣用的なペプチド化学カップリング技術を用いてペプチド又はアミド結合形成によりアセンブルした。これは、後のアミンとの反応を伴う酸塩化物、無水物又は活性エステルの発生を通してのカルボン酸基の活性化に関連した。構成単位は天然及び非天然アミノ酸、Ｎ−アルキル化アミノ酸（“ペプトイド”）及び親油性カルボン酸であった。いくつかの単位は市販されていなかったので合成した。必要に応じて、アミノ酸は完全に保護した。全ての場合において、増加的アセンブリーは１Ｈ NMRにより診断的にモニターした。最後のステップにおいて、完全な脱保護により標的分子を作った。HBTUカップリング法を、溶液相ｔ−BOC化学と共に主に用いたが、いずれのペプチドカップリング法及びストラテジーも用いることができる。カルボン酸はエステルとして保護し、ケン化、酸分解又は水素化分解により除去したが、いずれの他の実際的な保護基も用いることができよう。水素化分解の前のカルボン酸エステルの溶解は、ヘキサフルオロプロパノール、トリフルオロエタノール、トリフルオロ酢酸又はDMFのような溶媒を必要とした。そしてそれはしばしば前例のないほどゆっくりであり、完了するために多くの日数の反応を必要とした。これは、基質の機能であり溶媒ではなかった。システインのチオールは、ニトロベンジルもしくはジスルフィド（還元による除去）、アセトアミドメチル（酸化による除去）、又はトリチル（酸溶解による除去）として保護したが、いずれの他の適切な保護基も用いることができよう。アミンは、ｔ−ブチロキシカルバメート（BOC；酸溶解又は熱による除去）、フルオレニルメトキシカルボニル（FMOC；２級アミンによる除去）又はベンジロキシカルバメート（CBZ；酸分解又は水素化分解による除去）として保護したが、いずれの他の適切な保護基も用いることができる。一般的なHBTUカップリング法カルボン酸又はＮ−保護化アミノ酸及びＯ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HBTU；１等量）を撹拌しながら乾燥DMFに溶かし、ジイソプロピルエチルアミン（DtPEA；２等量）のような第３級塩基、次にアミン（１等量）で処理した。90分後、その反応混合物を水に落とした。沈殿した産物は固体であり、これをろ過してとり、エーテルと共に粉砕しながら吸引して乾燥させた。その沈殿した生成物はガム状であり、これを酢酸エチルにとり、その有機相を標準的洗浄プロトコルにかけた。これを以下に概説する。有機相を炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液で２回、次にクエン酸水溶液（10％ｗ／ｖ）で２回、洗い、塩化ナトリウムの飽和水溶液と共に振とうし、次に乾燥させ、真空下でエバポレートして生成物を仕上げた。必要に応じてクロマトグラフィー精製を行った。典型的な合成 Ac−IVIFD−Abu （ａ）TFA.FD（Bn）Abu（Bn） BOC−Asp（β−Bn）（10.3ｇ，32mmol）及びHBTU（12.1ｇ，32mmol）を乾燥DM F（120ml）に溶かし、DIPEA（5.57ml；64mmol）、次に２−アミノ酪酸ベンゾイルエステル（Abu（Bn）；32mmol）で処理した。90分、撹拌した後、その反応混合物を上述の標準プロトコルに従って処理して青白い黄色の油として生成物BOC −Ｄ（Bn）Abu（Bn）(12.8ｇ，95％収率)を供した。これを１：１のTFA：DCM に溶かし、30分、撹拌し、そして真空下で厳密に濃縮してガムとしてトリフルオロ酢酸塩TFA.Ｄ（Bn）Abu(Bn)を供した。DIPEAで中和した後、このジペプチドを DMF（120ml）中BOC−Phe(32mmol)の（上述のような）HBTU活性化溶液に加え、通常の方法で処理して、放置すると固体化するガムとしてBOC−FD（Bn）Abu（Bn） (91％の全体の収率)を仕上げた。これを上述の通りTFAで処理して油としてタイトル化合物を供した。（ｂ）Ac−IVI BOC−Val及びIle(Bn)並びに次にBOC−Ileから始めて、BOC−IVI(Bn)を上述のH BTUカップリング／TFA脱保護プロトコルにより作った。この時点において、AcIV Iは２つの方法により直ちに作ることができた。１つの方法において、BOC基を除去し、生じたTFA.IVI(Bn)を過剰なトリエチルアミンの存在下でDMF中過剰なアセチルクロライド又は無水酢酸でアシル化して水で沈殿させた後に固体としてAc− IVI(Bn)を供し、ろ過し、そして乾燥させた。６時間のトリフルオロエタノール中水素ガス及び10％Pd／Ｃでの水素化分解、次のろ過、エバポレーション、エタノール及びトリエチルアミン水溶液への溶解により、乾燥するまで濃縮しエーテルで粉砕した後、無色の固体としてAc−IVIのトリエチルアミン塩を供した。第２の方法において、BOC−IVI(Bn)をメタノール中のギ酸アンモニウムを用いて接触水素化転移により脱ベンジル化して、濃縮及び水での沈殿の後、放置すると固体にかたまるガムとしてBOC−IVIを供した。BOC基の除去の後、生じたTFA.IVI は、アシル化し、上述のプロトコルにより処理してトリエチルアミン塩としてAc −IVIを供することができた。（ｃ）AcIVIFDAbu AcIVI−.Et3NH＋をTFA.FB（Bn）Abu(Bn)に通常のHBTUプロトコルにより連結して無色固体としてAcIVIFD（Bn）Abu（Bn）を供した。これを５日間、ヘキサフルオロプロパノール中での水素化分解にかけて無色固体としてタイトル化合物を供した。MPEG（5000）Ile−Val−Ile−Phe−Asn−Abu−NH２（BRI6 211）乾燥DMF（２ml）中のスクシニミジルカルボキシメチルポリエチレングリコールモノメチルエーテル（MW5000）[MPEG（5000）ScM]（17.5mg）の溶液を、DMF（２ml）中のIle−Val−Ile−Phe−Asn−Abu−NH2(2.3mg)の溶液に加えた。その溶液を30分、撹拌し、次にトリエチルアミン（２滴）を加え、その混合物を室温で一晩、撹拌した。次にジエチルエーテルを加え、その沈殿した白色固体をろ過により収集し、ジエチルエーテルで洗い、乾燥させて白色粉末（15mg）を供した。グリコールコンジュゲート：ｎ−BuO（CH2CH2O）６Ｃ（＝０）−FDAbu アミン反応性基を組み込むために、モノエーテル保護化ポリグリコールのヒドロキシル基を慣用的にカルボン酸又は活性化カーボネートに官能化した。前者について、ヒドロキシルプロトンを強塩基で除去し、アルキルブロモアセテートでアルキル化し、次にケン化してオキシアセテートを供した。後者について、ヒドロキシル基をスクシミジルカーボネートと反応させて活性カーボネートを供した。これにより、分子ふるいを通した乾燥アセトニトリル中のヘキサ（１，２−ブチレングリコール）モノブチルエーテルをジスクシニミジルカーボネート（1.5 等量）及びトリエチルアミン（1.5等量）で処理して乾燥窒素下で一晩、撹拌した。その溶媒を真空下でエバポレートし、その反応混合物をジクロロメタンと炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液との間で分画した。その有機層を再び炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液で洗い、次に２回、クエン酸水溶液（10％ｗ／ｖ）で洗い、次に、塩化ナトリウムの飽和水溶液と共に振とうし、次に乾燥させて真空下でエバポレートして糖蜜様材料（95％収率）として活性なカーボネートを供した。これを等量のDMF中のTFA.FD（Bn）Abu(B n)及びトリエチルアミンで処理し、その生成物を溶離液としてジクロロメタンを用いるシリカゲルでの精製にかけて、ガム状固体としてｎ−BuO(CH2 CH2O)６Ｃ（＝０）−FD（Bn）Abu（Bn）(40％収率)を供した。標準的水素化分解によりタイトル化合物を供した。コール酸／ペプチドコンジュゲート： CHOLYL-FDC via CHOLYL-FD（Bn）C（OEt）ジスルフィドダイマー水（50ml）中のシステインエチルエステルヒドロクロライド（20ｇ）を1.1等量のH2O2（30％水溶液13ml）でゆっくりと処理し、外から30分、冷やした。その反応混合物を更なる時間、撹拌し、塩基性にし（HCO3−）、そして酢酸エチルで抽出した(４×100ml)。その有機層を乾燥させてエバポレートし、その残留物をジオキサン(200ml)に溶かし、濃HCl（10ml）で酸性化した。冷やした後、その生成物システインジエチルエステルをジヒドロクロライド塩の形態で無色結晶としてろ過して取った。次に、BOC−Ｄ（Bn）及びBOC−Ｆを標準的HBTUカップリング／TFA脱保護手順に用いて最終的に、アセトニトリルから再結晶化し得るジスルフィドダイマーとしてTFA.FD（Bn）C（OEt）を供した。コール酸とのHBTUカップリングによりタイトル化合物を供した。エステルケン化及び２−メルカプトエタノールでのジスルフィド開裂の後、BRI6209を得た。シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーのための有用なシステムは、ｎ−ブタノール： 28％NH３水溶液：水：エタノール（28：８：４：３）を用い、生成物の視覚化をバニリンスプレーにより行った。 CHOLYL-FNC（Ｓ−４−ニトロベンジル）−NH２−CHOLYL−FDC(Ｓ−４NBn）（ａ）コリルPhe−β−ベンジル−Asp−Ｓ−４−ニトロベンジル−Cysエチルエステル（BRI6197）クロロホルム(200ml)中のシステインエチルエステルヒドロクロライド(18.6ｇ，100mmol)及びトリエチルアミン(200mmol)に、ｐ−ニトロベンジルクロライド（17.1ｇ，100mol）を加え、その反応混合物を一晩、撹拌した。その反応混合物を10Ｍ NaClで中和し、飽和NaCl水で３回、洗い、乾燥させて濃縮した。その生成物をその濃縮物から83％収率で針として結晶化した。BOC−Ｄ（β−Bn）のスクシニミジル活性エステル（即ちBOC−Ｄ（α−Succ））（4.20ｇ，10mmol）をD CM（50ml）中のCys（Ｓ−４−Nbn）OEt.HCl（3.21ｇ，10mmol）及びトリエチルアミン（20mmol）で処理した。２時間後、その反応混合物を標準的洗浄プロトコルにかけた。生じたジペプチドを脱BOC化し、BOC−Ｆ（α−Succ）と連結し、そして同じ手順により脱BOC化してTFA塩としてトリペプチドTFA.FD（Bn）C（NBn） (OEt)を供した。乾燥DMF(0.5ml)中のジイソプロピルエチルアミン（82mg；0.63mmol）の溶液を、乾燥DMF（２ml）中のコール酸（130mg；0.32mmol）及びHBTU（120mg；0.32mmo l)の溶液に加えた。その溶液を、乾燥DMF（１ml）中のPhe−β−ベンジル−Asp −Ｓ−４−ニトロベンジル−Cysエチルエステルヒドロクロライド（211mg；0.31 mmol）及びジイソプロピルエチルアミン(41mg；0.32mmol)の溶液を加えた時に室温で５分、撹拌した。その混合物を４時間、撹拌し、次に水（50ml）で希釈して更に30分、激しく撹拌した。分離した白色固体をろ過により収集し、水で洗い、乾燥させて白色粉末（253mg；79％）を供した。その生成物は更なる精製なしで用いたが、逆相HPLC（Ｃ18；55％CH3CN/H2O）により精製した材料と分光学的に同一であった。（ｂ）コリルPhe−Asn−Ｓ−４−ニトロベンジル−Cys−NH２(BRI6199)の調製コリルPhe−β−ベンジル−Asp−Ｓ−４−ニトロベンジル−Cysエチルエステル(205mg)をアンモニアガス（６ml）を飽和させた乾燥メタノールの溶液に溶かし、その黄色がかった溶液を室温で一晩、放置した。次にその溶液を濃縮してゲル様材料を供した。次にその粗生成物を静かに加熱しながらメタノールに溶かし、次にジエチルエーテルを加えて白色粉末を沈殿させてそれをろ過により収集して乾燥させた(145mg)。（ｃ）コリルPhe−Asp−Ｓ−４−ニトロベンジル−Cys−OH(BRt6198)の調製１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（0.04ml；0.04mmol）をメタノール（２ml）中のコリルPhe−β−ベンジル−Asp−Ｓ−４−ニトロベンジル−Cysエチルエステル( 20mg；0.02mmol)の溶液に加え、その溶液を室温で４時間、放置して次に濃縮した。１Ｈ nmr(D20)は、出発材料のエチル及びベンジルエステル基の消失を示した。コリル−FDP及びコリル−FNP−NH２（ａ）コリルPhe−β−ベンジル−Asp−Proベンジルエステル乾燥DMF（１ml）中のジイソプロピルエチルアミン(26mg；0.2mmol)の溶液をDM F（１ml）中のコリルPhe−β−ベンジル−Asp−OH（76mg；0.1mmol）及びHBTU（ 38mg；0.1mmol）の溶液に加えた。その溶液を５分、撹拌し、次にDMF（１ml）中のプロベンジルエステルヒドロクロライド(24mg；0.1mmol)及びジイソプロピルエチルアミン(13mg；0.1mmol)の溶液を加えた。その混合物を室温で３時間、撹拌し、水で希釈し、そしてそのミルク様混合物を酢酸エチルで抽出した。その酢酸エチル抽出液を10％塩化ナトリウム溶液（２×）、水（３×）、及び最後に10 ％塩化ナトリウム溶液で洗い、その後乾燥させて(MgSO₄)、濃縮してろう状の固体（92mg）を供した。（ｂ）コリルPhe−Asp−Pro−OHの調製炭素上の10％パラジウム（50mg）をメタノール（４ml）中のコリルPhe−β− ベンジル−Asp−Proベンジルエステル（55mg）の溶液に加え、その混合物を16時間、水素雰囲気下で撹拌した。次にその混合物をろ過し、そのろ液を濃縮して白色固体を供した。（ｃ）コイルPhe−Asn−Pro−NH２の調製コリルPhe−β−ベンジル−Asp−Proベンジルエステル（23mg）をアンモニアガス（４ml）を飽和させた乾燥メタノールの溶液に溶かし、その溶液を一晩、室温に放置した。次にその溶液を濃縮してガラス質残留物として粗生成物を供した。コンホメーションの制限１−アミノインダン−１−カルボン酸この化合物は、Biochemical Pharmacology，11，p．847の手順に従って作った。要約すると、840mlの１：１ EtoH：H2O中のインダン−２−オン（23ｇ）をNaC N（25ｇ）及び（NH4）203C（210ｇ）と共に55〜60度に加熱した。放置してろ過した後、洗ったフイルターケーキをエタノールから再結晶化して青白い針としてヒダントインを供した（75％）。これを100°で２時間、10M HCl(300ml)中で水素化分解してタイトル化合物を供した。それは、アミノ酸についての通常の手段（例えばトリエチルアミン(120mmol)及び(BOC)20（1.1等量）でiPrOH(20ml)／水 120ml）中20mmol）によりFMOC又はBOC Ｎ−保護化することができる。酸加水分解ステップのための他の慣用的な手順は、24時間の140°での硫酸（70ml）及び水（60ml）中でのヒダントイン（10ｇ）のゆっくりとした溶解、次の冷却及び放置によるろ過及びTHFでの洗浄に関連した。市販のインドリン及びテトラヒドロイソキノリン束縛は、同様にＮ−保護化できる。 FMOC 化学の例 FMOC−DC（Ｓ−トリチル）（ピペロニルエステル） Eto-Ac（20ml）中のFMOC−Cys(Ｓ−Trt)（２mmol）及びピペロニルアルコール（２mmol）及びDCC（2.1mmol）をDMAP（30mg）で処理し、一晩、撹拌し、ろ過し、濃縮し、５時間、１：１ DCM：ジエチルアミン（４ml）中で脱保護化し、そして５％MeOH/CHC 13で溶出するシリカプラグを通して精製して63％収率でCys（Ｓ−Trt）(Pip)を供した。これを、通常の方法によりFMOC−Ｄ（β−ｔ−Bu）に連結してクロマトグラフィー精製後にガムとしてタイトル化合物を供した。ペプトイドペプトイドは、いくつかの方法により慣用的に作ることができ、それらのうちの最も有用な２つを以下に例示する。Ｎ−イソグチリル−Ｎ−イソブチルグリシン化合物：（Me）2CHC（＝０）〔N(CHCH(Me)２）CH2C（＝０）〕３FD Abu THF(20ml)中のエチルボロアセテート(100mmol，11ml)を冷やしながら、ゆっくりと、THF(50ml)中のイソブチルアミン（2.5等量）に加えた。30分後、その生成物をエーテルとHCO₃−水溶液との間に分画し、その有機層を洗い、乾燥させ、そしてエバポレートして定量的収率で油としてＮ−イソブチルグリシンエチルエステルを供した。この油10mmolをTHF(10ml)及びトリエチルアミン（10ml）にとり、THF(10ml)中のイソブチリルクロライド（10mmol）でゆっくり処理した。30分後、その濃縮反応混合物を標準的洗浄プロトコルにかけ、そして生じた生成物の油を一晩、MeOH中の過剰なNaOH水溶液でケン化して、（Me）2CHC（＝０）N（CHC H(Me)２）CH2CO2Hを、95％の全体の収率で供した。このカルボン酸を標準的HBTU 法において１等量のＮ−イソブチルグリシンエチルエステルストックとカップリングして、生じたジペプトイドエステルをケン化し、そしてこれら最後の２つのステップをもう１回、くり返してガムとして（Me）2CHC（＝０）〔N（CHCH(Me) ２）CH2C（＝０）〕30Ｈを仕上げた。通常の方法でのTFA.FD（Bn）Abu(Bn)及び水素化分解でのHBTUカップリングによりタイトル化合物を生成した。 15分後の１，２−ジクロロエタン（60ml）中のHCI.Leu（OMe）(2.9ｇ，20mmol )及びイソブチルアルデヒド（1.44ｇ，20mmol）に、AcOH(1.2ｇ，20mmol)及びNa BH(OAc)３（30mmol）を加えた。一晩撹拌した後、その溶媒をエバポレートし、その生成物をエーテルと１Ｍ HClとの間で分画し、その水性層を分離し、塩基性にし、エーテルで抽出し、そしてそのエーテル層を分離し、乾燥させてエバポレートして油としてＮ−イソブチルロイシンメチルエステルを供した。このメチルエステルとイソブチリルクロライドでアシル化し、上述のようにケン化してガムとしてタイトル化合物を供した。カルセイン遊離アッセイにおける化合物テストヒト細胞中のNefペプチド誘導膜損傷の測定のための蛍光源アッセイシステムを、予想されるNef阻害化合物のスクリーニングのために開発した。プレ充填細胞からの蛍光色素カルセインの遊離に基づいて、Lichtentelsら（1994）により記載される細胞媒介細胞毒性アッセイから方法を開発した。LDはアッセイと同様、このアッセイは、酵素活性の測定によらず、テストすべきサンプル中の同様の活性、又は活性のインヒビターの存在に感受性がない。 CEM細胞又はPBMCを５％FBSを含むPBS中で２回、洗い、PBS／５％FBS中２×10⁶ ／mlの濃度に再度懸濁した。カルセインAM(Molecular Probes，Eugene，OR，USA )を20mMの最終濃度まで加え、その細胞を30分、37℃で暗所でインキュベートした。組み込まれなかった染料を、PBS／５％FBSで１回、及びPBSで１回、洗うことにより除去し、その細胞をNefアッセイ緩衝液中５×105／ml（CEM）又は５×1 06／ml（PBMC）において再度懸濁した。これらの細胞の濃度を予備実験において決定して各々の細胞型について至適最大値対自発的カルセイン遊離を供した。10 0mlの細胞を100mlのNefペプチドと混合し、Nefアッセイ緩衝液中に要求される濃度に希釈し、1.5〜２時間、５％CO2，90％湿度で37℃でインキュベートした。このインキュベーションの終わりに、プレートを10分、250×ｇで遠心し、100mlの上清を白色ポリスチレン96ウェルプレート（Packard，Meriden，Connecticut，USA）に移した。蛍光強度を、減衰フィルター並びに各々485及び538nmの励起及び放射波長を用いて、LS50Bルミネセンススペクトルメーター（Perkin−Elmer，Beaconstield ，Buckinghamshire，UK）で測定した。全てのアッセイを３回重複して行い、プレートをアッセイ緩衝液のみを含むウェルでブランクとした。自発的カルセイン遊離を、緩衝液のみ(100ml)とインキュベートした細胞を用いて測定し、最大遊離を、細胞に２％Triton Ｘ−100（100ml）を加えることにより決定した。細胞毒性の割合は、次式：細胞毒性（％）＝100×（FIペプチド−FI自発）／（FI最大−FI自発）を用いて計算した。 Nefペプチド細胞毒性の予想されるインヒビターを、Ｕ−底マイクロプレート( Disoposable Products，Adelaide，Australia)中で、必要に応じてNefアッセイ緩衝液中に希釈した等量（50μｌ）のMyr−Nef２−22ペプチド及び合成化合物を混合し、そして５％CO2，90％湿度で37℃で30分、インキュベートし、その後に細胞を加えることによりテストした。結果を、Nef Ｎ末端ペプチドのみの存在下での細胞毒性の阻害率として表した。細胞毒性を評価するためにNefペプチドの欠如下でも化合物をテストした。結果表３及び４は、合成した化合物、及び各々、いくつかの代表的な化合物についての診断タンパク質NMRシグナルを列記する。予想されるNEFインヒビターのリスト全てのアミノ酸は他に示されなければ“Ｌ”である。コメントコード（Ａ）水溶性（Ｂ）わずかに水溶性（Ｃ）注記：アミド化されていないＮ末端（Ｄ）注記：カルボン酸のないＣ末端（Ｅ）最も強力なインヒビターのセットに属する（Ｇ）TFA＝トリフルオロ酢酸塩（Ｈ）BOC＝ｔ−ブチロキシカルボニル（Ｉ）Mpr＝３−メトキシプロピオニル（Ｊ）PEG5K＝ポリエチレングリコール；平均m.w．5000；PEG4＝テトラエチレングリコール、モノメチルエーテル；PBG6＝ポリ（１，２−ブチレングリコール（ｎ＝６）、モノブチルエーテル（Ｋ）示されるベンジル及びエチルエステル、モノマー又はジスルフィドダイマー（Ｌ）Clalu−３−クロロアラニン（Ｍ）Ch＝コール酸（Ｎ）Nb＝パラ−ニトロベンジル（Ｓ原子上）（Ｏ）iBu＝イソブチリル；RLeu＝Ｎ−（イソブチル）ロイシン；RGly＝Ｎ− （イソブチル）グリシン（Ｐ）Tic＝“Ｌ”（Ｓ）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３ −カルボン酸；Indo=“Ｌ”−（Ｓ）−インドリン−２−カルボン酸；Inda＝２ −アミノ−インダン−２−カルボン酸；C12F＝３，４−ジクロロフェニルアラニン；１−npAla＝（１−ナフチル）−アラニン；２−npAla＝（２−ナフチル）− アラニンセクション１． − Ｌ−２−アミノ酪酸(Abu；ラセミ体についてdlAbu)のような種々のＣ末端残基を含むヘキサペプチド及び／又は溶解度／活性を増強するための改良されたエンド−キャップ − トランケートされた配列セクション２． − 溶解度／活性エンハンサーとしてのＮ末端トリペプチド改良／置換 − コール酸コンジュゲート − ペプトイド − グリコールセクション３． −溶解度／活性を増強するために特にフェニルアラニン改良によりコンホメーション的に制限されたインヒビター ¹他に示されなければ重水素化DMSO。略号については先の表を参照のこと。 ²診断シグナルは、一般に、同じ構造の特徴の再発に基づき再度記述されない。括弧内は：インテグレーション；TMSに関するppmにおける化学シフト）カルセイン遊離アッセイにおけるNefペプチドの活性中性の非蛍光カルセインアセトキシメチルエステル、カラセインAMは受動的に細胞に入り、細胞のエステラーゼにより水和されて、完全な膜を有する生きている細胞により保持される極性の蛍光化合物を供する。ミリスチル化21残基Ｎ末端 Nefペプチドのカルセイン充填CEM CD４＋Ｔ細胞への添加は図18に示すようにカルセインの投与量依存性の遊離を引きおこした。非ミリスチル化Ｎ末端Nefペプチド及びミリスチル化非Ｎ末端Nefペプチドは同じ条件下でほとんど又は全くカルセイン遊離を引きおこさなかった。これらの応答は、非カルセイン充填CEM細胞を用いてLDH細胞毒性アッセイにおいて観察されたものに似ている。 Nef細胞毒性のインヒビター約120の合成化合物を、ミリスチル化Ｎ末端Nefペプチドにより誘導されるCEM細胞からカルセインを遊離させる能力のためのカルセインアッセイにおいてテストした。10〜20倍モル過剰の合成化合物の最初のスクリーニングは、表５に示すようにこのシステムにおけるNefペプチド細胞毒性の50％又はそれ超の阻害を供するほぼ24の化合物を示した。これらの化合物のうち、更なる研究のために15を選択した。化合物：10：１のNefペプチド化において、AP９，BR1 6199，BRI6203，BRI6209，BRI6211及びDER−AP３は50％超のNef阻害を示し、図1 9に示すように細胞毒性は示さなかった。AP13，DER45及びDER−AP２も少くとも5 0％のNef阻害を示し、25％未満の細胞毒性を供した。これらの化合物の滴定は、約１：１のモル比（化合物：Nefペプチド）のNefペプチド誘導カルセイン遊離の 50％阻害及び２：１のモル比（化合物：Nefペプチド）における90％阻害を表６に示す通り引きおこすBRI6199を示した。次に優れた化合物、DER−AP２，DER−A P３，AP13，DER45，BRI6209は、１〜５：１の化合物Nefペプチドモル比における Nefペプチド細胞毒性の50％阻害及び４〜14：１化合物Nefペプチドモル比における90％阻害を示した。カルセイン充填PBMCを用いる代表的な化合物のテストは、それらが、図20に示すように、主なヒト細胞に対するミリスチル化Nef Ｎ末端ペプチドの細胞毒性活性もブロックすることができることを示す。２つの化合物DE R31及びDER45も、Nefペプチドの10倍モル過剰量を用いて、マイクロフィジオメーターでもテスト、ミリスチル化Nef Ｎ末端ペプチドへの露出後に観察されたCE M CD４＋Ｔ細胞の代謝活性の下降をブロックすることが見い出された（データは示さない）。１．ID50−50％阻害量。合成化合物の滴定から計算。２．ID90−90％阻害量。合成化合物の滴定から計算。３．nd−未測定。実施例８：Nef Ｎ末端の細胞毒性についての構造的要求ペプチドの細胞毒性へのNef Ｎ末端の配列及び二次構造の改変の効果を研究した。新鮮な赤血球及びCD４＋Ｔ−細胞系CEMを上述の通り得た（“一般的方法”を参照のこと）。溶血及びCEM細胞LDH遊離の測定を上述の方法に従って行った（“ 一般的方法”を参照のこと）。円偏光二色性スペクトルメタノール中のペプチドの遠紫外円偏光二色スペクトルを、0.01又は0.05cm経距長直交クオーツセルを用いて309ＫでAVIVスペクトロポラソメーターを用いて2 50nm〜200nmの範囲にわたって測定した。同じ溶液中のペプチド濃度を、定量的アミノ酸分析により測定した。36のスペクトルを平均化し、ベースラインを補正し、Swift．emblheidelberg．de directory/group/andradeの無名のftpから得ることができるK2d Kohonenニューラルネットワークプログラム（Andradeら、1993 ；Mereloら、1994）を用いてα−ヘリックス、β−ストランド及び無秩序な構造の割合（％）について分析した。配列に沿った二次構造の分布は、Boston Unive rsity Biomolecular Engineering Research Centre Protein Sequence Analysis サーバーで行った別個のステート・スペース理論分析（Stultzら、1993Whiteら、1994）により得た(http：//bmerc-www．bu．edu/psa/about．btm # about)。膜融合研究濃度依存性蛍光脱消光（Hoekstraら、1984）を用いて膜融合を測定した。ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC，Sigma，St Louis MO）から作られたSUVを、100mMのエタノール溶液中に染料を加えることにより100の脂質膜に対して１の蛍光色素のモル比でオクタデシル−ロダミン（Ｒ1 8，Molecular Probes Inc，Junction City ORから得た）でラベルした。エタノール及び過剰な染料を５0mM Tris−HCl緩衝駅(pH7.0)中のSephadex Ｇ50によるゲルろ過により除去した。その融合アッセイは、100mgのラベルしたベシクルを２mlの50mM Tris−HCl緩衝液(pH7.0)中の非ラベルSUV １mgに加え、そしてフソジェニック（融合原）(fusogenic)剤を要求されるモル比でこの混合物に加えるにより暗くした部屋の中で行った。その混合物の蛍光を、Perkin Elmer−Hitach i Ｍ35スペクトロフルオリメーターで各々460及び680nmの励起及び放射波長を用いて43℃で追跡した。フソゲンの欠如下での混合物の蛍光強度をベースラインとした。ペプチド及びジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）の単層の界面の挙動 5.3mgのDPPC(Sigama，StLouis MO)を５mlのヘキサン：プロパｒトラフ内に含まれるサブ相(170ml)の表面に滴下して加えた。そのトラフを高い湿度でサーモスタットを備えたキャビネット内にマウントし、温度を30.2℃に調節した。そのフィルムを38mm² Ｓ^-1の 5.9)及び水酸化ナトリウム（ARIでpH7.2に調節した25mM HEPES(Merck)の両方のサブ相上で測定した。 DPPC単層下のペプチドの注入：DPPC単層をHEPESサブ相上に広げた。そのペプチドを10mlの25mM HEPES(pH7.2)中に分散させた。10mlのサブ相を除去し、10ml のペプチド分散物に置換し、そのサブ相内のペプチドの均一な分布を確実にした。10分の平衡化の後、DPPC 単層フィルムを圧縮し、生じた圧力／領域等温線をプロットした。結果ペプチドの二次構造への配列改変の効果配列改変が二次構造にいずれかの効果を有するか否かを決定するために、後者を、CD分光法により及びその配列からのコンピュータ処理により各々のペプチドについて分析した。メタノール中のペプチドのCDスペクトルを図21において比較し、その計算されたα−ヘリックス、β−ストランド及び無秩序の構造の割合を表７に示す。ペプチドNef２−22ａとNef２−22ｃとの間に観察された構造においては小さな差しかなかった。他方、Nef２−22ｂ，Nef２−22ｅ及びNef31−50は、著しいα −ヘリックスの増加及び対応する無秩序構造の減少を示した。21から25残基への鎖長の増加(Nef２−26)は、CDスペクトルにほとんど効果がなかった。二次構造の理論的計算は、Nef2−22b，ｃ及びｅ中のα−ヘリックスの増加のほとんどは残基2〜10でおこり、Nef31−50は、そのCDスペクトルと対照的に、図 22に示すようにその全体の長さにわたるα−ヘリックス及びループの等しい可能性を示した。この配列（Nef31−50ａ）の正電荷の増加はα−ヘリックス性の適当な増加を生じた。 Nef２−22及びNef２−26についてα−ヘリックスについての全体のCD由来の値並びにNef２−22及びNef２−26についてのα−ヘリックス性についての可能性は、Nef２−26についてNMR3から得た構造とよく一致した。 DPPCの単層とのNef２−22ａ及びNef31−50の相互作用リン脂質単層とのペプチドの相互作用の研究は、しばしば、細胞膜でのそれらの挙動のメカニズムの手掛かりを与える。DPPC単層に PC単層は比較的pHセンシティブであるのにその差はHEPESにあると思われる。それゆえ、ペプチドでの実験のためのサブ相において後者を用いることを決定した。各々非ミリスチル化Nef２−22、Nef２−22及びNef31−50を含むサブ相でのDPP Cの等温線は、図23に示すように、Nef２−22及びNef31−50の場合の脂質単層の間の強力な相互作用を示す。これら２つのペプチドは実質的に単層フィルムを広げた。それらの破壊点（50〜52mN m^-1）は、観察された等温線がDPPC分子の機能を保持していることを示した。結果は、両方のペプチドにおいて、大量のアミノ酸側鎖が単層と相互作用していることも示す。膜融合研究我々が以前に観察した非ミリスチル化Nef Ｎ末端ペプチドによるSUVの融合が相対的に不飽和の７のＮ末端残基の存在を要求するか否かを見い出すために、非ミリスチル化Nef２−22及びNef９−22で蛍光融合アッセイを行った。これらのアッセイは、蛍光色素Ｒ18は、高い脂質／蛍光色素（＜１/1000）において脂質二重層中に挿入した時に、重度に自己消光するという事実による。脂質混合の欠如下において、染料は極めてゆっくりとラベルされた二層から非ラベル化ベシクルのそれに移る。脂質混合融合がおこる場合、染料はそのシステムを通して迅速に希釈され、自己消光の軽減は蛍光を増加させる。１／150のモル比でSUVに加えた時、両方のペプチドは図24に示すようにＲ18蛍光を迅速に増加させた。このことは、脂質混合がおこったことを示す。ヒツジ赤血球の溶解図25は、全てのNefペプチドによるヒツジ赤血球の溶解についての投与量−応答曲線を示す。広く、ペプチド(Nef２−22ｂ)の２〜７領域内の正電荷の減少はＣ末端におけるペプチド(Nef２−10)のトランケーションでそうであるように、ペプチドの細胞溶解活性を減少させた。Ｃ末端領域における正電荷の増加(Nef２ −22ｃ)は、細胞溶解活性のわずかな増加を導いた。Ｎ末端における二次構造は、細胞溶解活性を決定するものとして正電荷にかわる２番目のものであるようである。Nef２−26は、Nef２−22ｃ又はNef２−22よりかなり多いα−ヘリックス含量を有するが、溶血活性は同じオーダーを有した。我々が先に示したように、極めて高いα−ヘリックス成分を有するNef31−50はほとんど細胞溶解性でない。他方、２つの正電荷のリシン残基のそのＮ末端領域への付加は、その細胞溶解活性を４倍、増加させた。図26に示す溶血の速度は、添加後の最初の５分にほぼ 100％の溶血に達するＮ末端に正電荷を有するペプチドの同様の傾向を示す。他のペプチドは、Nef31−50を除いて、160分後に50％超の溶血に達したことに注目すべきである。 CEM CD４＋Ｔ細胞における細胞毒性種々の野生型及び変異体NefペプチドがCD４＋Ｔ細胞において膜の摂動を引きおこし、次にLDHを遊離させる能力を、Nef Ｎ末端細胞毒性のための配列及び／又は構造的要求を決定するために検査した。Ｃ末端トランケーション(Myr−Nef ２−10)は、Nef Ｎ末端ペプチドが、図27に示すように、アラニンでの残基４及び７のリシンの置換によるペプチドの２〜７領域の正電荷の減少でそうであるようにCEM細胞において膜の損傷を引きおこす能力を大きく減少させた。この領域の正電荷の増加は、逆に、ペプチド活性にほとんど効果はなかった、Ｎ末端の２次構造はNef ペプチド細胞毒性活性を決定することにおいて正電荷より重要度が低いようであった。高いαヘリックス含量を有するミリスチル化Nef31−50は、CEM細胞からの適度なLDH遊離しか引きおこさなかったが、これは、位置32及び36における２つのリシン残基（正電荷）の添加の後にＮ末端ペプチド(Myr−Nef２−22)のレベルに増加した。 Nef Ｎ末端の最初の８アミノ酸の除去(Myr−Nef10−26)は、LDHアッセイにおいて活性の４倍の減少を引きおこし、このことは細胞毒性のためのこの領域の重要性を確認する。この領域のα−ヘリックス成分の増加は、CEM細胞からのLDH遊離の適度の増加を生じ、このことは、観察された二次構造の欠如がその活性に重大でないことを示唆する。先に観察されたように、ミリスチル化はペプチドの膜標的化のために重要であり、そして非ミリスチル化Nefペプチド(Nef10−26，Nef ２−26a)の存在下でLDH遊離はほとんど又は全く観察されなかった。 # TD50−50％毒性投与量 * データは、３回重複して行った３つの別個の実験分からの平均±SEMを示す。これらのデータは、ミリスチル化Nef Ｎ−末端が溶血及び細胞毒性活性並びにその配列のＮ末端近くの領域及び残基9〜21から広がるαヘリックス領域における正味の正電荷を有することを示す。この領域は非ミリスチル化ペプチドのフソジェニック部分のようであるので、フソジェニシティーに関連する膜摂動の程度は全体の溶血活性に重要であり得る。実際、本願に示すNMRデータは、溶血ペプチドメソチンに対するNef２−26の配列類似性は９〜26領域における構造類似性を広げられることを示す。しかしながら、メリチンと違い、Nef Ｎ末端の残基配列はTrp4を除いて疎水性残基を欠如する。ミリスチル鎖の添加は、この領域の疎水性を増加させ、おそらくNef２−２ｎペプチドをよりメリチン様に挙動させるのであろう。他方、Nef２−22ｄは、α−ヘリックスは残基14あたりまではまだ始まっていないが、なお極めて溶血性である。しかしながら、メリチンのα−ヘリックス性をわずかに減少させる配列変化でさえ非毒性であることに注目すべきである。但し、単純に３〜５残基だけＣ末端においてペプチドを短くしただけではほとんど効果はない（例えばNef２−22とNef２−26とは極めてわずかな活性の差しかない）。速度データは、溶血活性を減少させる配列変化によりもたらされる主な差は改変ペプチドによる溶血の速度にある。160分、赤血球と接触させ続けた場合には全てがかなり細胞溶解性であるが、より正電荷の２〜７領域を有する全長のペプチドはかなりより迅速に赤血球に作用する。これらの観察結果は、部分的に、なぜ改変ペプチドがCEM細胞に対してより細胞毒性であるのかを説明し得る。ここで、ペプチドへの露出は２〜４時間のオーダーである。更に、９−22残基のヘリックス領域はエンドサイト−シス後に細胞に対して内部的に毒性であり得ることが可能である。即ち、形質膜上に作用するばかりでなく、低能度で用いたペプチドによりリンパ球のようなより複雑な細胞の場合には逆に損傷を受ける可能性が少い。Nef31−50は160分後にかなり溶血性であるが、それはCEM細胞に対しては低い毒性であることを示すデータがNef９−22についての内部毒性の役割を支持する。フィルムバランスデータは、膜脂質と相互作用する能力は細胞溶解活性のために十分な条件ではないことを示す。それどころか、細胞溶解性の乏しいMyr−Nef 31−50は細胞溶解性のMyr−Nef２−22よりDPPC単層により強力に反応する。他方、非ミリスチル化Nef２−22はいずれの程度にも単層に浸透しないことに注目すべきである。このことは、ミリスチル化は脂質相を作用のために本質的であることを示す。但し、融合をもたらすためにはSUV膜の十分な相互作用がおこることに注目すべきである。 NefのＮ末端近くとSrcファミリー(Silverman及びResch，1992)のいくつかのミリスチル化タンパク質のそれとの間に著しい対応関係がある。全てはリシン残基の存在による正味の正電荷を有し、そして全ては１又は複数のセリン残基を有する。リシン残基はこれらのミリスチル化タンパク質の膜標的化のために本質的であることが示されている。Nefの場合のように、膜の負電荷の脂質と相互作用することができる正電荷の存在はミリスチル鎖の弱い膜標的化特性を補強するために本質的であると仮定される。更に、Srcタンパク質の場合、Ｎ末端の正電荷の結果として生ずる中和を伴うセリンリン酸化は、これらのタンパク質の膜相互作用を媒介するための“スイッチ”メカニズムを供する(McLaughlin及びAderem 19 95)。Nefはいくつかのキナーゼと相互作用することが知られており（Sawaiら、1 995）、リン酸化セリン残基はＮ末端にあることが見い出されている（Bodeusら、1995）ので、Nefの細胞膜との相互作用を制御し、それにより他の膜関連システムとのその相互作用を調節するために同様のメカニズムが機能することが可能である。このようなスイッチメカニズムでの妨害に注目すべき治療目標であり得よう。実施例19：白血球及びリンパ組織中でのNef Ｎ末端の細胞毒性のの更なる研究 Nef Ｎ末端の膜一体性への効果を、所定範囲の培養した真核細胞系において並びに新しく単離したPBMC及びリンパ組織細胞において研究した。これらの研究に用いたヒト細胞系CEM，Jurkat，RPMI8226，Ｕ266，THP−１及びＵ−937，PBMC及び扁桃リンパ細胞は、“一般的方法”下に上述されるように得た。用いたペプチド及びそれらの細胞毒性は、“一般的方法”下に上述されるように、各々合成し、LDH遊離アッセイにおいて測定した。結果種々の白血球系におけるNef細胞毒性所定範囲の白血球細胞系を、Nef Ｎ末端の細胞毒性活性がCD４＋Ｔ細胞に制限されるか否かを決定するため、LDH遊離アッセイを用いて、ペプチド誘導細胞毒性に対する感受性について検査した。10μＭの濃度において、ミリスチル化Ｎ末端、Nefペプチドは、図28Ａに示すように、Jurket及びCEM細胞系、Ｕ266 Ｂ細胞系及びRC２ａの単球細胞系の両方について極めて細胞毒性であった。２時間後、全ての４つの細胞系において最大に近いLDH遊離が観察された。より低い濃度のペプチド（5μＭ）において、テストした全ての細胞系はNef Ｎ末端細胞毒性に対して感受性であったが、図28Ｂに示すように、LDH遊離の割合においていくらかの差が明らかであった。 PBMCにおけるNef細胞毒性培養した細胞、特に不死化細胞系は外面的にのみもとの細胞と似ているだけなので、新しく単離した未培養のPBMCを、LDH遊離アッセイを用いてNef Ｎ末端ペプチド誘導化細胞毒性に対するそれらの感受性について検査した。わずか30分後に、ミリスチル化Ｎ末端のNefペプチド(Myr−Nef２−26)で処理したPBMCにおいて著しい細胞毒性が観察された。対照的に、非ミリスチル化Ｎ末端のNefペプチド(Nef２−26)及び対照ミリスチル化非Ｎ末端のNefペプチド(Myr−Nef31−50) はほとんど又は全く細胞毒性がない。これらの結果は図４Ａに示すように、CD４＋Ｔ細胞系CEMについてのものに類似しており、主要なヒト白血球（特にリンパ球及び／又は単球／マクロファージ）をNef媒介細胞毒性に対して感受性である。扁桃リンパ球組織細胞におけるNef細胞毒性リンパ球組織はウィルス複製の主要な部位であり、HIVが感染した固体において進行的に破壊される。リンパ組織細胞へのNefペプチドの効果を、ヒト扁桃から新しく単離した細胞を用いて評価した。ミリスチル化Ｎ末端Nefペプチドは未培養の扁桃リンパ細胞について細胞毒性であり、30分後に最大に近いLDH遊離を引きおこした。細胞をミリスチル化非Ｎ末端対照ペプチドに露出した後にいくらかのLDH遊離がおこった時、これは２時間後に明らかになり最大量の25％未満であった。非ミリスチル化Ｎ末端ペプチドは２時間後でさえ実質的にLDHを遊離させなかった。結果を図30に示す。この研究の結果は、 − Nef Ｎ末端の構造は、残基６〜22からのα−ヘリックス、並びに十分に秩序立っていないＣ−及びＮ末端領域における構造を含むことを示す。他の研究は、 − NefのＮ末端が高度に保存されており（残基２〜７）、いくつかの機能、例えばCD４及びIL−２Ｒ下降制御、並びに細胞内タンパク質との相互作用のために重要であること、 − 残基16〜22（両親媒性ヘリックス）の欠如がセリンキナーゼ結合を破壊し、感染性を減少させること、 − 残基４〜７の欠如が感染性を減少させること、 − リンパ組織部位がウィルス複製の主要な部位であること及び組織が進行的に破壊されること − 培養物及び血清中で検出された細胞外NefはＮ末端プロテアーゼ部位を有し、20KDの開裂した分子（HIV PRによる開裂）として主にビリオン中に存在することを示した。本明細書に記載される研究の結果は、HIV Nefペプチドのアミノ末端のシリスチル化は配列をいくつかの細胞型に対して毒性にすることを証明する。観察された利点のためのいずれかの提案されたメカニズムに結びつけるつもりはないが、紫外蛍光研究は、フレキシブルなペプチドセグメント上のNef Ｎ末端における１又は複数の極性残基と共にミリスチル化部位に近いトリプトファンのようなかさ高い親水性残基の存在が、リン脂質の二重層のリン脂質ヘッド基及び上部のアシル鎖領域を妨害するのに十分であり得、膜の分解を導くことができた。NefのＮ末端の重要性は、Nefのアミノ酸残基31−50を含む人工のミリスチル化配列がＮ末端ミリスチル化ペプチドのそれと比べて細胞毒性活性を有さないという事実により強調される。最後に、NefはHIVと関連した一組の膜活性タンパク質に属する。他のものは、膜中に孔を形成することができる領域を有する補助タンパク質Vpr（Macreadieら、1996，Pillerら1996）、及び細胞溶解及び融合に関連するいくつかの膜活性領域を有するgpチノ膜貫通タンパク質（Gallaherら1987，Gawrischら、1993）を含む。例えば、Ｎ末端のgpチノペプチド(519−541)は、赤血球について細胞溶解性で、培養したリンパ球に対して毒性でもある（Mobleyら、1992）。感染の間、細胞膜破壊及び死を増強するであろうこれらの膜活性タンパク質の間の協同作用であり得る。 Myr−Nef２−22をFITCで標識した場合、ペプチドの殺害活性は全体的になくなった。このような処理は、FITCを、露出したアミノ基上に結合させ、ここでそのアミノ基はMyr−Nef２−22の場合、リシン残基であろう。これは、これらの残基がNefペプチドの細胞溶解活性に関連することを示唆する。Myr− Nef２−22のリシン残基も機能のために重大であるという観察結果は、メリチンと比べた時に関心のあることである。 HIV−１の病因との現在の発見の生物学的関連はまだ明らかでない。細胞死はH IV−感染において注目される特徴であり（Levy，1993；Weiら、1995；Hoら、199 5；Finkelら、1996）、このような死は、伝達された因子により媒介され得た。このような因子がNefであり得る可能性は、この研究を全てより関連性あるものにする。生体内でのNefの適切な提示が発見されることが必要である。例えば、N efの特定の分解産物は、本明細書に記載される細胞殺害活性を有すると予想されよう。Myr−Nef２−20及びMyr−Nef２−26を含むいくつかの他のペプチドは、イースト及びヒト細胞においてMyr−Nef２−22と似た効果を作り出す。更に、細胞表面上へのNefのＮ末端の提示は接触により細胞を殺すメカニズムであり得る。あるいは、これらの研究は、Nefの遊離と、及び高Nefレベルを作り出す細胞の殺害との関連性を有し得る。 Nefによる細胞の殺害がAIDS病因と生物学的に関連しているなら、微生物系において効果を再生するのに有利である。細胞を殺すメカニズムが研究されることは別に、それは、このような活性のインヒビターの便利で迅速なスクリーニングのための方法が開発できるようにする。このシステムのために、ヘリックス構造は、メタノール中の構造と一致して、Ｎ末端のペプチド分子のＣ末端部分に存在することがNMRデータから明らかである。しかしながら、そのＮ末端領域はミセル中でより組織化されている（但しヘリックスでない）ことが明らかである。これはおそらく、負電荷の界面活性ヘッド基との位置３及び６のリシン残基の相互作用のためである。生物膜中の負電荷の脂質ヘッド基でも同様の相互作用が可能であり得よう。水溶液中において、Nef２−26ペプチドについて安定な構造は観察されなかった。pH5.3の300mMまでのリン酸緩衝液の添加はＩＤスペクトルを変化させなかった。Nefペプチドは、メリチンより凝集する傾向が小さいようである。これはおそらく、メリチンと比べてより小さな疎水表面のためである。結論として、Nefは多種官能性タンパク質であり、そしてそのＮ末端はこれらの機能のいくつかにとって致命的に重要なものであることを示している。水溶液中で、Ｎ末端は組織化されていないが、タンパク質のこの領域の機能は細胞膜との相互作用に関連し、その環境において、その構造はおそらく水溶液中でのそれとかなり異なる。メタノール中でのNef２−26の構造は、細胞膜と相互作用した時にNefのＮ末端により適合した構造に、より近く似ると予想することができる。本発明は明快さ及び理解の目的のために詳細に記載されているが、本明細書に記載される実施形態及び方法に対する改良及び変化があり、それらは本明細書に開示される本発明概念の範囲から離れないものであり得ることが当業者に明らかであろう。本明細書に言及される引用文献は以下のページに列記され、この引用により本明細書に組み込まれる。引用文献

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年１月１５日（１９９９．１．１５）【補正内容】請求の範囲１．ミリスチル化Nef−アミノ末端配列を含む細胞毒性ペプチドであって、ミリスチル化の部位が疎水性かつ塩基性のアミノ酸残基の近傍にあり、該ペプチドがHIV−１のNefタンパク質の活性の原因であることを特徴とする細胞毒性ペプチド、又は該ペプチドの誘導体もしくはアナログ。２．正味の正電荷を有する第１のフレキシブルドメインと、第２のα−ヘリックスドメインと、を含む請求項１に記載のペプチド。３．Myr−Nef２−22，Myr−Nef２−22ａ，Myr−Nef２−22ｂ，Myr−Nef２−22 ｃ，Myr−Nef２−22ｄ，Myr−Nef２−26，Myr−Nef２−26ａ，Myr−Nef２−10、及びMyr−Nef10−26からなる群から選択される請求項１又は２に記載のペプチド。４．前記第１のフレキシブルドメインが、正味の正電荷を有するアミノ酸残基２〜８を含み、そして残基９〜21がα−ヘリックスドメインを含むことを特徴とする請求項３に記載のペプチド。５．細胞溶解活性を更に有する請求項１〜４のいずれか一に記載のペプチド。６．細胞膜とのフソジェニック活性を更に有する請求項１〜４のいずれか一に記載のペプチド。７．細胞毒性、細胞溶解性、及び／又はフソジェニック活性の推定されるインヒビターをスクリーニングする方法であって、１又は複数の推定されるインヒビターの存在の、請求項１〜６のいずれか一に記載のペプチドの活性への効果を測定するステップを含む方法。８．１又は複数の推定されるインヒビターの存在の、請求項１〜６のいずれか１に記載のペプチドのドメインの活性への効果が測定されることを特徴とする請求項７に記載の方法。９．HIVもしくはNefの、又は請求項１〜６のいずれか一に記載のペプチドの活性を阻害する表３〜６のいずれか一に記載の化合物。 10．表６に記載される請求項９に記載の化合物。 11．Nefタンパク質の細胞膜との相互作用を調節する方法であって、Nefタンパク質が膜結合成分と相互作用するのを防ぐために、請求項９又は10に記載の化合物を投与するステップを含む方法。 12．Nefの細胞毒性を減少させ又は除去する方法であって、請求項９又は10に記載の化合物を投与するステップを含む方法。 13．HIV感染を治療する方法であって、請求項９又は10に記載の化合物を投与するステップを含む方法。 14．医薬として許容される担体と一緒に、請求項９又は10に記載の化合物を含む医薬存在。 15．リンパ組織においてNefで誘導された細胞毒性を阻害する方法であって、請求項９又は10に記載の化合物を投与するステップを含む方法。 16．感染していないリンパ細胞における細胞毒性が阻害されることを特徴とする請求項15に記載の方法。 17．傍観細胞のNefで誘導される殺害を阻害する方法であって、請求項９又は1 0に記載の化合物を投与するステップを含む方法。 18．選択的な細胞死を誘導する方法であって、請求項１〜６のいずれか一に記載のペプチドを投与するステップを含む方法。 19．医薬として許容される担体と一緒に、請求項１〜６のいずれか一に記載のペプチドを含む医薬組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/16 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ローウェ，メリンダオーストラリア国，ビクトリア 3052，パークビル，ロイヤルパレード 343，バイオモレキュラーリサーチインスティテュートリミティド (72)発明者カーテン，シリルオーストラリア国，ビクトリア 3052，パークビル，ロイヤルパレード 343，バイオモレキュラーリサーチインスティテュートリミティド (72)発明者バエル，ジョナサンオーストラリア国，ビクトリア 3052，パークビル，ロイヤルパレード 343，バイオモレキュラーリサーチインスティテュートリミティド (72)発明者マシューズ，バリーオーストラリア国，ビクトリア 3052，パークビル，ロイヤルパレード 343，バイオモレキュラーリサーチインスティテュートリミティド (72)発明者マクレディー，イアンオーストラリア国，ビクトリア 3052，パークビル，ロイヤルパレード 343，バイオモレキュラーリサーチインスティテュートリミティド (72)発明者アルナギリ，チィーニアオーストラリア国，ビクトリア 3052，パークビル，ロイヤルパレード 343，バイオモレキュラーリサーチインスティテュートリミティド (72)発明者リベット，ドンオーストラリア国，ビクトリア 3126，カンタベリー，ハイフィールドロード 13 (72)発明者ノートン，レイモンドオーストラリア国，ビクトリア 3052，パークビル，ロイヤルパレード 343，バイオモレキュラーリサーチインスティテュートリミティド (72)発明者バーナム，ケビンオーストラリア国，ビクトリア 3052，パークビル，ロイヤルパレード 343，バイオモレキュラーリサーチインスティテュートリミティド

Claims

【特許請求の範囲】１．ミリスチル化Nef−アミノ末端配列を含む細胞毒性ペプチドであって、ミリスチル化の部位が疎水性アミノ酸残基の近傍であることを特徴とする細胞毒性ペプチド、その誘導体又はアナログ。２．前記ミリスチル化の部位が疎水性かつ塩基性のアミノ酸残基の近傍であることを特徴とする請求項１に記載の細胞毒性ペプチド、その誘導体又はアナログ。３．正味の正電荷を有する第１のフレキシブルドメインと、第２のα−ヘリックスドメインと、を含む請求項１又は２に記載のペプチド。４．Myr−Nef２−20，Myr−Nef２−22a，Myr−Nef２−22ｂ，Myr−Nef２−22c ，Nef２−22ｄ，Myr−Nef２−26，Myr−Nef２−26ａ，Myr−Nef２−10，Myr−Ne f10−26からなる群から選択される請求項１〜３のいずれか一に記載のペプチド。５．前記第１のフレキシブルドメインが、正味の正電荷を有するアミノ酸残基２〜８を含み、そして残基９〜21がα−ヘリックスドメインを含むことを特徴とする請求項４に記載のペプチド。６．細胞溶解活性を更に有する請求項１〜５のいずれか一に記載のペプチド。７．細胞膜とのフソジェニック活性を更に有する請求項１〜５のいずれか一に記載のペプチド。８．細胞毒性、細胞溶解性、及び／又はフソジェニック活性の推定されるインヒビターをスクリーニングする方法であって、１又は複数の推定されるインヒビターの存在の、請求項１〜７のいずれか一に記載のペプチドの活性への効果を測定するステップを含む方法。９．１又は複数の推定されるインヒビターの存在の、請求項１〜６のいずれか１に記載のペプチドのドメインの活性への効果が測定されることを特徴とする請求項８に記載の方法。 10．HIVもしくはNefの、又は請求項１〜７のいずれか一に記載のペプチドの活性を阻害する表３〜６のいずれか一に記載の化合物。 11．表６に記載される請求項10に記載の化合物。 12．Nefタンパク質の細胞膜との相互作用を調節する方法であって、Nefタンパク質が膜結合成分と相互作用するのを防ぐために、請求項10又は11に記載の化合物を投与するステップを含む方法。 13．Nefの細胞毒性を減少させ又は除去する方法であって、請求項10又は11に記載の化合物を投与するステップを含む方法。 14．HIV感染を治療する方法であって、請求項９又は11に記載の化合物を投与するステップを含む方法。 15．医薬として許容される担体と一緒に、請求項10又は11に記載の化合物を含む医薬存在。 16．リンパ組織においてNefで誘導された細胞毒性を阻害する方法であって、請求項10又は11に記載の化合物を投与するステップを含む方法。 17．感染していないリンパ細胞における細胞毒性が阻害されることを特徴とする請求項16に記載の方法。 18．傍観細胞のNefで誘導される殺害を阻害する方法であって、請求項10又は1 1に記載の化合物を投与するステップを含む方法。 19．選択的な細胞死を誘導する方法であって、請求項１〜７のいずれか一に記載のペプチドを投与するステップを含む方法。 20．医薬として許容される担体と一緒に、請求項１〜７のいずれか一に記載のペプチドを含む医薬組成物。