JP2001311734A - 癌細胞の増殖能力を検査する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は新規の癌の検査方法及び新規の抗癌
剤のスクリーニング方法の提供を目的とする。 【解決手段】 本発明はヒトパルブリン１４（以下「ｈ
Ｐａｒ１４」）を検出することにより、癌細胞の増殖能
力を検査する方法、更には抗癌剤をスクリーニングする
方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はヒトパルブリン１４
（以下「ｈＰａｒ１４」）を検出することにより、癌細
胞の増殖能力を検査する方法、更には抗癌剤をスクリー
ニングする方法に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】現在、
細胞周期を調節する可能性のある新しいタイプの酵素が
大いに注目されている（実験医学 Ｖｏｌ．１７ Ｎ
ｏ．５（増刊），１０３−１０５（１９９９））。それ
は、リン酸化されたセリン／スレオニン残基とその隣の
プロリン残基との間のペプチド結合を１８０度回転させ
る新しいタイプのペプチジルプロリルシス／トランスイ
ソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅ）である（Ｈｕｎｔｅｒ，
Ｔ．らＣｅｌｌ，９２，１４１−１４３（１９９
５））。ＰＰＩａｓｅ活性をもつ酵素は、すでに１０年
以上前に発見されているが、ＰＰＩａｓｅそのものの生
理学的な機能よりも、それと結合するラパマイシン、サ
イクロスポリンＡなどの免疫抑制剤の方が注目され、そ
の作用機構にかかわる分子としてのみＰＰＩａｓｅは認
知されていた。しかし、これらの薬剤のＰＰＩａｓｅ阻
害活性と免疫抑制活性とに直接的な関連が認められなか
ったこともあって、これらの分子の生理学的な活性につ
いてはまだ謎が多い。ＰＰＩａｓｅ酵素群の生理学的機
能は多岐にわたっているので、その阻害剤にも、予測で
きない薬効があらわれることが期待できる。

【０００３】ｈＰａｒ１４は我々が発見した分子量１
３，６７６Ｄａのタンパク質であり、生体内での基質は
不明であるが、一部の合成ペプチドに対して弱いＰＰＩ
ａｓｅ活性を示した（Ｕｃｈｉｄａ，Ｔ．ら、（１９９
９）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４４６，２７８−２８２，１
９９９年３月発行）。そのアミノ酸配列及びそのコード
核酸配列（配列番号１）を図１に示す。ｈＰａｒ１４は
ＰＰＩａｓｅのなかでも最も注目されている第３のＰＰ
Ｉａｓｅファミリーに属するパルブリンというグループ
に属する。パルブリンは最初、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で発見されたが（Ｒａｈｆｅｌ
ｄ，Ｊ．Ｕ．ら（１９９４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４
３，６５−６９）、９２のアミノ酸からなるタンパク質
で、ラテン語の非常に小さいという意味であるｐａｒｖ
ｕｌｕｓからパルブリンと命名された。パルブリンはバ
チルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ）のＰｒｓＡ、大腸菌のＳｕｒＡ、ラクトコッカス
・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｌａｃｔｉｓ）
のＰｒｔＭ、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＥｓｓ
１、ショウジョウバエ（Ｄｏｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のｄ
ｏｄｏ、そしてヒトのＰｉｎ１（Ｌｕ Ｋ．Ｐ．ら（１
９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０，５４４−５４７）と相
同性がある。しかし、サッカロマイセス・セレビシエの
Ｅｓｓ１、ショウジョウバエのｄｏｄｏ、ヒトのＰｉｎ
１はパルブリンと相同性がある領域だけでなく、そのＮ
末端にＷＷドメインという別のドメインがあるので、正
確には大腸菌のパルブリンの相同分子とは言えない。ｈ
Ｐａｒ１４は大きさからも構造からも、大腸菌のパルブ
リン相同分子と言える。

【０００４】パルブリンは生体内でタンパク質のフォー
ルディングや活性化に関与している。例えば、ＳｕｒＡ
は大腸菌のペリプラズマに存在して、外膜にあるタンパ
ク質の成熟化に必須であり、ＳｕｒＡが変異をおこすと
ペリプラズマ内でのタンパク質のミスフォールディング
が引き起こされることが知られている。従って、ヒトの
パルブリンであるｈＰａｒ１４もヒト細胞膜で何らかの
機能を担っている可能性がある。また、ヒトのパルブリ
ングループとして最初に発見されたＰｉｎ１は細胞周期
Ｍ期への進行に必須であることがわかっているので、ｈ
Ｐａｒ１４も細胞周期の進行、すなわち細胞増殖や分化
に関与している可能性があるが、実際にどのようにして
関与しているかは不明であった。

【０００５】我々はこれらの仮説に基づき、鋭意研究の
結果、ｈＰａｒ１４が細胞増殖に関与していることを解
明した。そして驚くべきことに、本発明者は、ｈＰａｒ
１４をコードする核酸配列の発現を阻害するアンチセン
スオリゴヌクレオチドで細胞を処理し、ｈＰａｒ１４の
発現を阻害すると、その癌細胞増殖が阻害されることを
見出し、従って、ｈＰａｒ１４が癌細胞の増殖に必要で
あることがわかった。そして、本発明者はこのような発
見に基づき、癌細胞のｈＰａｒ１４の検出が様々な臨床
学的意義を有することに着目した。

【０００６】更に、我々は癌細胞に抗癌剤を作用させる
とｈＰａｒ１４の発現が増強され、ｈＰａｒ１４の発現
が癌細胞の抗癌剤耐性化に関与していることを見い出し
た。そして、癌細胞が抗癌剤に対して耐性化すると、耐
性化前の癌細胞と比べ、ｈＰａｒ１４の発現が有意に増
強することが確認できた。その結果、癌細胞のｈＰａｒ
１４の検出が、癌細胞の抗癌剤耐性化の検査にも役立つ
ことが見い出された。

【０００７】

【課題を解決するための手段】第一の観点に従うと、本
発明は癌細胞のｈＰａｒ１４を検出することにより、癌
細胞の増殖能力を検査する方法を提供する。

【０００８】一般に、腫瘍細胞は良性腫瘍細胞と悪性腫
瘍細胞とに分類され、前者は異型性に乏しく、増殖は緩
慢で膨張性であり、転移を起こさず、全身への影響は少
ない。それに対し、悪性腫瘍は一般に癌と称され、異型
性が強く、増殖は早く、周囲組織に破壊性に浸潤し、転
移をおこし、宿主を死に至らしめる。従って、腫瘍細胞
が良性であるか又は癌細胞、即ち、強い増殖能力を有す
る腫瘍細胞であるかの判定は、癌の検査、癌の進行状況
の検査、癌治療後の患者の予後追跡等、臨床学的見地に
おいて極めて重要である。一般にかかる判定は腫瘍の形
態学的構造、発育形式、発育速度、転移性、遺伝子変異
の程度、全身への影響等を基準に行われているが、その
正確な区別は通常困難であり、また時間及び労力を要す
る。

【０００９】従って、当業界においては、腫瘍細胞が良
性腫瘍細胞であるか癌細胞であるか、即ち、強い増殖能
力を有する癌細胞であるか否かを判定する簡単且つ正確
な判断手法のニーズがある。そして、本発明はかかるニ
ーズを満足せしめる方法を提供する。

【００１０】第二の観点に従うと、本発明は、癌細胞が
抗癌剤耐性化するとｈＰａｒ１４の発現が増強されると
いう発見から、癌細胞のｈＰａｒ１４を検出することに
より、癌細胞の抗癌剤耐性化を検査する方法を提供す
る。かかる方法は、被検癌細胞のｈＰａｒ１４を検出
し、それを好ましくは抗癌剤耐性でない癌細胞のｈＰａ
ｒ１４の発現性と比較することで、かかる被検癌細胞の
抗癌剤耐性化を判定することを含んで成る。

【００１１】更に、本発明者は、ｈＰａｒ１４が癌細胞
の増殖に必要であるという発見から、ｈＰａｒ１４の発
現を阻害する物質が癌細胞の増殖を阻害する、換言すれ
ば「抗癌剤」となり得ることに着目した。従って、別の
観点において、本発明は抗癌剤をスクリーニングする方
法を提供する。かかるスクリーニング方法は、抗癌剤の
候補となる物質を癌細胞に作用させ、かかる癌細胞のｈ
Ｐａｒ１４の検出を介して当該候補物質の癌細胞の増殖
を阻害する能力を同定することを特徴とする。その結
果、本発明は抗癌剤を簡単且つ正確にスクリーニングす
る方法を提供する。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明の第一の態様はｈＰａｒ１
４を検出することにより、癌細胞の増殖能力を検査する
方法を提供する。好適な態様において、かかる検出はｈ
Ｐａｒ１４に対して特異的な抗体を使用する免疫学的測
定方法である。かかる抗体は、ポリクローナル抗体であ
っても、モノクローナル抗体であってもよい。

【００１３】免疫学的測定法は当業者に周知である。か
かる免疫学的測定法の一例としてウェスタンブロット法
が挙げられる。ウェスタンブロット法による場合、本発
明に従い、ｈＰａｒ１４の検出は、限定することなく下
記の工程を含んで成る方法により実施できる： １）ｈＰａｒ１４に対して特異的な抗体を適当な標識手
段で標識する； ２）それとは別に、被検細胞の細胞抽出物等を例えば適
当な電気泳動媒体、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ルで電気泳動し、電気泳動させた細胞抽出物を適当なフ
ィルター、例えばニトロセルロース膜に転移させる；そ
して、 ３）前述の標識抗体をかかるフィルターに作用させるこ
とで細胞抽出物に含まれるとするなら存在するｈＰａｒ
１４に特異的に結合させ、次いでそのフィルターを適当
な洗浄液で洗浄して非特異的に結合した標識抗体を除去
し、しかる後ｈＰａｒ１４に特異的に結合した標識抗体
の標識を検出する。その結果、ｈＰａｒ１４が検出され
ない又はその検出量が減少しているならかかる細胞の増
殖能力は消失又は衰弱しているものと判定され、ｈＰａ
ｒ１４が検出されたらその細胞には増殖能力が備わって
いるものと判定される。

【００１４】好ましくは、かかる免疫学的測定法におい
ては、癌細胞のｈＰａｒ１４の検出を定量的又は少なく
とも半定量的に実施するため、コントロール細胞のｈＰ
ａｒ１４を検出するコントロール試験も併せて実施す
る。コントロール細胞としては、好ましくは被検細胞と
同系の細胞であって、細胞増殖能力の失ったもしくは抑
制されたもの（即ち、陰性コントロール細胞）、又は細
胞増殖能力を保持するもの（即ち、陽性コントロール細
胞）を使用する。コントロール細胞のｈＰａｒ１４の検
出は、被検細胞のｈＰａｒ１４の検出と同時に実施して
も、又はその前後に実施してもよい。コントロール試験
においては陽性コントロール細胞又は陰性コントロール
細胞のいずれか一方を使用する場合であっても、両方を
使用してもよい。

【００１５】その他の免疫学的測定法としては、例えば
放射性物質を利用するＲＩＡ法、酵素を使用するＥＩＡ
法、抗体と抗原との反応で生ずる濁りの吸光度変化から
抗原量を測定する免疫比濁法、抗原と抗体感作ラッテク
ス粒子もしくは抗体感作赤血球との反応によって起きる
凝集反応の度合いから抗原量を測定するラテックス凝集
法や血球凝集法等、様々な方法が挙げられる。そのアッ
セイ方式には、競合法やサンドイッチ法が挙げられる。

【００１６】被検細胞は身体を構成する様々な組織、体
液、例えば血液、尿、リンパ液等、様々な起源に由来し
得る。標識手段としては、例えば放射性物質又は酵素、
例えばアルカリホスファターゼもしくは西洋ワサビペル
オキシダーゼ等が挙げられる。放射性物質を使用する場
合、その標識は例えばシンチレーションカウンター等の
放射線検出器を利用することで検出し得る。酵素を使用
する場合、その酵素の特異的基質を作用させ、酵素作用
による基質の発色や蛍光を吸光度計や蛍光測定器等で測
定することで検出される。

【００１７】本発明に従って増殖能力の判定される癌細
胞には様々な癌細胞が挙げられる。かかる癌細胞は好ま
しくはヒト癌細胞であるが、その他の哺乳動物細胞であ
ってもよい。このような細胞には哺乳動物、特にヒトの
身体を構成する様々な細胞、例えば組織細胞、血液細
胞、リンパ球細胞の癌細胞が挙げられる。特に、このよ
うな癌細胞はヒト子宮頸癌、膵臓癌、大腸癌等に由来す
る癌細胞である。

【００１８】前述の通り、本発明において使用できる抗
体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル
抗体であってもよい。ポリクローナル抗体は、例えばヒ
ト細胞から単離抽出した天然の、又は化学合成もしくは
遺伝子組み換えにより製造したｈＰａｒ１４抗原を適当
な動物に投与して免疫した後、抗血清を採取し、そのま
ま使用するか、好適には当該抗血清からｈＰａｒ１４に
対して特異的な抗体を例えばアフィニティークロマトグ
ラフィー等の各種精製手段により精製単離することで調
製できる。かかる抗原は、全長ｈＰａｒ１４であって
も、ｈＰａｒ１４を特異的に認識する抗体が作成される
限りにおいて、ｈＰａｒ１４の断片であってもよい。免
疫に使用される動物には、一般的にウサギ、ヤギ、ニワ
トリ、マウス、ラット、等が使用されるが、それらに限
定されない。免疫方法は一般的な手法に従って行うこと
ができる。例えば、ｈＰａｒ１４抗原を通常の緩衝液や
生理食塩水に溶解もしくは懸濁させたもの、又はフロイ
ントインコンプリートアジュバント及び／もしくはフロ
イントコンプリートアジュバント等の補液との混合物
を、動物の皮下、皮内、腹腔等に投与して刺激後、必要
に応じて同様の操作を繰り返し行う。抗原の投与量は投
与ルート、動物種等に応じて適宜決定されるが、１回当
たり１０μｇ〜１０ｍｇ程度とするのが適当であろう。

【００１９】モノクローナル抗体の作成も、通常の方法
に従って実施できる。一般には、前述のｈＰａｒ１４抗
原をポリクローナル抗体の作成と同様にして適当な動
物、例えばマウス、ラットに投与して免疫した後、抗体
生産細胞として好適な脾臓細胞を取り出す。かかる抗体
生産細胞を例えばミエローマ細胞の如き不死化細胞と細
胞融合させ、モノクローナル抗体を生産するハイブリド
ーマを得る。細胞融合はポリエチレングリコール、セン
ダイウィルス等を使用する通常の方法で実施することが
できる。ハイブリドーマの選択は、例えばＨＡＴ培地等
を使用する慣用の方法で実施できる。

【００２０】ｈＰａｒ１４の検出方法は、他にｈＰａｒ
１４をコードする核酸配列の増幅により実施してもよ
い。かかる方法においては、癌細胞のＲＮＡを抽出し、
それからｃＤＮＡを合成し、適当なプライマーを用いて
増幅させることを包含する。かかる細胞においてｈＰａ
ｒ１４をコードする核酸配列が有効に存在していればそ
れは増幅され、検出し得る。増幅工程はポリメラーゼ連
鎖反応法（ＰＣＲ法）が好ましいが、リガーゼ連鎖反応
法でもよい。好ましくは、ｈＰａｒ１４の定量又は判定
量的分析のため、ｈＰａｒ１４を発現する及び発現しな
いコントロール細胞で同様の増幅工程を実施する。

【００２１】本発明は更に、癌細胞の抗癌剤耐性を検査
する方法を提供する。かかる方法は、被検癌細胞のｈＰ
ａｒ１４を、上述のいずれかのｈＰａｒ１４を検出する
方法、例えば免疫学的測定方法又はｈＰａｒ１４をコー
ドする核酸配列の増幅方法により検出し、同一条件で検
出する抗癌剤耐性でないことが既知な癌細胞のｈＰａｒ
１４の発現性と比較することを含んで成る。その結果、
被検癌細胞のｈＰａｒ１４の発現性が抗癌剤耐性ではな
い癌細胞と比べて増強されているなら、かかる被検癌細
胞が抗癌剤耐性となっているものと判定でき得る。

【００２２】検査できるかかる抗癌剤耐性癌細胞には、
様々な抗癌剤に対して耐性を示す癌細胞が挙げられる。
抗癌剤の例としては、アルキル化剤、代謝拮抗物質、植
物アルカロイド、ポルフィリン類、その他の合成又は天
然の抗癌剤が挙げられる。かかる抗癌剤耐性癌細胞は一
つの抗癌剤に対して耐性である場合でも、多数の抗癌剤
に対して耐性であってもよい。抗癌剤の好ましい例とし
ては、モファロテロン（Ｍｏｆａｒｏｔｅｎｅ）やエク
テイナスシジン（Ｅｃｔｅｉｎａｓｃｉｄｉｎ）が挙げ
られる。

【００２３】本発明は更に、抗癌剤をスクリーニングす
る方法であって、抗癌剤の候補となる物質を癌細胞に作
用させ、ｈＰａｒ１４を検出することを介して当該物質
が癌細胞増殖を阻害するか否かを同定することを特徴と
する方法を提供する。かかるスクリーニング方法により
抗癌剤として同定される物質は、ｈＰａｒ１４の発現を
阻害するものであればどのようなものであってもよく、
有機系及び／または無機系の様々な化合物、例えばタン
パク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ホルモン、脂質、
糖類、各種薬剤、等であり得る。かかる抗癌剤は、例え
ばｈＰａｒ１４をコードする核酸配列の転写、翻訳、修
飾、等の機構を阻害する物質であり得る。

【００２４】かかるスクリーニング方法は、例えば下記
の通りに実施できる： １）抗癌剤の候補となる物質を選定し； ２）かかる物質を癌細胞に作用させ； ３）この癌細胞のｈＰａｒ１４の検出を上述のいずれか
の方法により実施し；その結果 ４）ｈＰａｒ１４が検出されない又はその検出量が減少
している場合は当該物質に癌細胞増殖阻害活性が備わっ
ており、ｈＰａｒ１４が検出される場合は当該物質に癌
細胞増殖阻害活性が備わっていないものと判定される。

【００２５】かかる判定において、抗癌剤の癌細胞増殖
阻害活性を定量的又は半定量的に分析するため、適当な
コントロール物質を上記の方法と同様に癌細胞に作用さ
せてｈＰａｒ１４を検出するコントロール試験を実施す
ることが好ましい。コントロール物質には、ｈＰａｒ１
４の発現を阻害する陽性コントロール及びｈＰａｒ１４
の発現を阻害しない陰性コントロールが使用できる。前
者の例はｈＰａｒ１４をコードする核酸配列に対して特
異的にハイブリダイズしてｈＰａｒ１４の発現を阻害す
ることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであ
り、後者の例はｈＰａｒ１４をコードする核酸配列に対
して特異的にハイブリダイズできない無関係なオリゴヌ
クレオチドである。コントロール試験においては陽性コ
ントロール又は陰性コントロールのいずれか一方を使用
する場合であっても、両方を使用してもよい。かかるコ
ントロール試験は、スクリーニング手順と同時に、又は
その前後に実施してよい。

【００２６】かかるスクリーニングの結果、抗癌剤とし
て同定された化合物は、癌細胞の増殖を阻害する医薬組
成物として使用できる。抗癌剤は単独で用いてもよい
が、適当な医薬的に許容される担体と組み合わせるのが
好ましい。更に、標的細胞に確実に導入し、生体内にお
ける分解を防ぐため、正電荷を有する高分子、リポソー
ム、マイクロスフィア等の医薬的に許容される担体と組
み合わせた組成物として使用することもできる。

【００２７】本発明を以下の実施例により更に詳細に説
明する。

【００２８】

【実施例】実施例１ ｈＰａｒ１４と子宮頸癌細胞株Ｈ
ｅＬａ細胞の増殖との関係 アンチセンスオリゴＤＮＡ Ｎｏ．１，２，３を合成し
た。Ｎｏ．１，２はｈＰａｒ１４に対するアンチセンス
オリゴＤＮＡであり、Ｎｏ．３はコントロールＤＮＡ配
列である。各々の配列は順に： Ｎｏ．１： ５’−ＧＣＴＴＧＴＴＧＴＴＧＡＡＣＧＣＴＧＡＡＣＣ
−３’（配列番号２）； Ｎｏ．２： ５’−ＧＧＣＴＴＴＡＴＣＴＴＣＡＣＴＡＴＡＣＴＧＴ
ＧＣ−３’（配列番号３）； Ｎｏ．３： ５’−ＣＣＡＡＧＴＣＧＣＡＡＧＴＴＧＴＴＧＴＴＣＧ
−３’（配列番号４） とした。ＨｅＬａ細胞を９６穴プレートに５，０００細
胞／穴の密度でまいた。一晩培養した後、培地を無血清
のダルベッコモディファイドイーグル培地（ＤＭＥＭ）
に変えた。終濃度１μＭから５μＭのオリゴＤＮＡ Ｎ
ｏ．１，２，３となるように、２μｌのプラス試薬（ラ
イフテクノロジー社）と２５μｌの無血清ＤＭＥＭを加
えて混合し、２５℃に１５分間おいた。あらかじめ１μ
ｌのリポフェクタミンと２５μｌの無血清のＤＭＥＭ液
を加えて２５℃に１５分間放置したものを用意してお
き、両者を混ぜ合わせて２５℃に更に１５分間おいた。
これを無血清状態の細胞に添加して、３時間培養した。
２０％の血清を含むＤＭＥＭを等量加えて（最終血清濃
度１０％）、一晩培養した。培地を新しい培地（１０％
の血清を含むＤＭＥＭ）に変えて、４日間培養したの
ち、生存している細胞数をＸＴＴ（ナトリウム ３’−
〔１−（フェニルアミノ−カルボニル）−３，４−テト
ラゾリウム〕−ビス（４−メトキシ−６−ニトロ）ベン
ゼンスルホン酸水和物；シグマ社）呈色アッセイで定量
的に計数した。即ち、培養液１００μｌに５０μｌの
０．３ｍｇ／ｍｌのＸＴＴを加えて６時間３７℃で培養
し、４９０ｎｍの吸収をマイクロプレートリーダー（Ｂ
ｉｏｒａｄ社）で測定した。

【００２９】添付の図２（ａ）（ｂ）に示すようにアン
チセンスオリゴＤＮＡでｈＰａｒ１４の発現を阻害する
と、癌細胞の増殖が抑制されることが見出された。従っ
て、癌細胞の増殖にはｈＰａｒ１４が関与し、且つ必要
であることが示された。その結果、癌細胞のｈＰａｒ１
４を検出することで、かかる癌細胞が増殖能力を有する
か否かを決定することができることがわかった。

【００３０】実施例２ ｈＰａｒ１４と大腸癌細胞株Ｈ
ＣＴ１１６及びＳＷ４８０細胞の増殖との関係 実施例１とは別の株、大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６及びＳ
Ｗ４８０細胞を実施例１で示したアンチセンスオリゴＤ
ＮＡ Ｎｏ．１及び２で処理した。図３に示すように、
実施例１と同様、アンチセンスオリゴＤＮＡで処理する
ことによってＨＣＴ１１６及びＳＷ４８０細胞の増殖も
阻害されるようになった。従って、細胞の起源や細胞株
に関係なく、癌細胞のｈＰａｒ１４を測定することで、
かかる癌細胞が増殖能力を有するか否かを決定すること
ができることがわかった。

【００３１】実施例３ ｈＰａｒ１４に対するウサギポ
リクローナル抗体の作成 ｈＰａｒ１４塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＢ０
０９６９０）より、ｈＰａｒ１４タンパク質の翻訳開始
コドンから停止コドンまでをコードする領域を抽出し、
これに対するＰＣＲプライマーを設計した。ＰＣＲプラ
イマーの末端にはタンパク質発現ベクターへ組み込むた
めの制限酵素配列も合わせて付加してある。その配列は
それぞれ順に、ｈＰａｒ１４−１：５’−ＴＴＴ ＧＧ
Ａ ＴＣＣ ＡＴＧ ＣＣＧ ＣＣＣ ＡＡＡ ＧＧＡ
ＡＡＡ ＡＧＴ ＧＧＴ ＴＣＴ ＧＧ−３’（配列
番号５）及びｈＰａｒ１４−６：５’−ＴＴＴ ＧＡＡ
ＴＴＣ ＴＣＡ ＴＴＡ ＴＴＴ ＴＣＴ ＴＣＣ Ｔ
ＴＣ ＧＡＣ ＣＡＴＡＡＴ ＡＡＴ ＡＴＧ ＡＴＡ
ＴＣＣ−３’（配列番号６）である。ＰＣＲは各々の
プライマーを終濃度５０ｐｍｏｌ，ＭｇＣｌ₂ 濃度を２
ｍＭ、ｄＮＴＰ濃度を２００μＭ、鋳型ＤＮＡとしてＧ
ｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＢ００９６９０ｃＤＮＡを１０
０ｎｇ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社）を
２．５ユニット、ＫＯＤバッファー＃１は終濃度１倍液
になるように加え、滅菌水で１００μｌとして以下の条
件で行った。ＰＣＲ条件：９８℃の熱変性１分の後、３
０サイクルのＰＣＲ反応（９８℃の熱変性１５秒、６５
℃のアニーリング１５秒、７４℃の伸長反応３０秒）を
行い、最終伸長反応を７４℃で１０分間行った（パーキ
ンエルマー社、ＧｅｎｅＡｍｐ ｓｙｓｔｅｍ ９６０
０）。以上のＰＣＲを遂行することで得られた増幅ＤＮ
Ａを制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ（タカラ社）とで
消化し、あらかじめ同様の酵素で消化し、５’末端の脱
リン酸化処理をしたｐＧＥＸ−４Ｔ−１（ファルマシア
バイオテック社）とのライゲーション反応によりＤＮＡ
を環状化した（ｐＧＥＸ−ｈＰＡＲ１４）。このプラス
ミドをＤＨ５α、大腸菌宿主菌に形質転換させ、以下の
タンパク質の発現を行った。

【００３２】ｐＧＥＸ−ｈＰＡＲ１４が導入されたＤＨ
５αを２ｘＹＴ培地（１６ｇ／ｌのペプトン、１０ｇ／
ｌの酵母エキス、５ｇ／ｌのＮａＣｌ）にて１６時間培
養した菌体を別の２ｘＹＴ、１ｌに対し２０ｍｌ植菌
し、Ａ₂₆₀ ＝０．８になるまで２２０ｒｐｍ、３７℃で
培養した。菌体は４℃にて５，０００ｘｇ、５分の遠心
分離により回収した。回収した菌体はＳＴＥバッファー
（１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）で２回洗浄し、その
後ＰＢＳ−Ｔバッファー（１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの
ＰＭＳＦ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、ＰＢＳ）に
て溶解した。溶解菌体は超音波破砕機（トミー社、ＵＤ
−２０１）のハイレベル設定で５分処理し、可溶化画分
を３０，０００ｘｇ、３０分間の遠心分離をすることで
回収した。回収した可溶化画分にあらかじめＰＢＳ洗浄
を行った５０％スラリーのグルタチオン−セファロース
４Ｂ（ファルマシアバイオテック社）を６００μｇ／１
ｌ培養となるように加え、４℃にて１６時間ローテーシ
ョンしながら結合させた。ＧＳＴフュージョンｈＰａｒ
１４タンパク質と結合したグルタチオン−セファロース
４Ｂは５０ｍｌのＰＢＳ−Ｔバッファーで１０回洗浄
し、トロンビン（ファルマシアバイオテック社）をＧＳ
ＴフュージョンｈＰａｒ１４タンパク質１０μｇ当たり
１ユニット使用して、２２℃で１６時間消化した。この
ようにしてトロンビン切断したｈＰａｒ１４タンパク質
を抗原液として用いた。

【００３３】抗体の作成には抗原としてｈＰａｒ１４タ
ンパク質をウサギ１匹あたり２ｍｇもちいて免疫した。
初回免疫はフロイントインコンプリートアジュバントと
抗原を１．５ｍｇ背部皮下注射し、１４日後にフロイン
トコンプリートアジュバントと抗原を２．６７ｍｇ背部
皮下注射した。初回免役後２８日目、４２日目にもフロ
イントコンプリートアジュバントと抗原を２．６７ｍｇ
背部皮下注射した。初回免役後４９日目に１．０ｍｇの
抗原液を耳介注射し初回免疫後５６日目にも１ｍｇの耳
介注射を行った。初回免疫から６５日目に全採血を行い
血清を得た。

【００３４】実施例４ ｈＰａｒ１４に対するウサギポ
リクローナル抗体を含む抗血清によるｈＰａｒ１４の同
定 実施例３で得られた血清を用いて、ＨｅＬａ細胞抽出液
のウェスタンブロットを行ったところ、ｈＰａｒ１４が
特異的に染色されることが確認された（図３）。

【００３５】実施例５ 抗癌剤処理された癌細胞のｈＰ
ａｒ１４の発現の増強 抗癌剤モファロテン処理によって、膵臓癌細胞株ＡｓＰ
Ｃ−１の増殖が抑制されること（Ｕｃｈｉｄａら Ｉｎ
ｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８，８９１−９８７（１９９
４））、細胞周期をＧ１で停止させていることが報告さ
れている（Ｋａｗａら Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７
２，９０６−９２２（１９９７））。我々は、抗癌剤が
効かなくなっている機構にｈＰａｒ１４の発現が関与し
ている可能性を考えて、検討した。ＡｓＰＣ−１（ＡＴ
ＣＣより購入）を、１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ
−１６４０培地（ライフテクノロジー社）で、５％ＣＯ
₂環境下で培養した。集密になった細胞をＲＰＭＩ−１
６４０培地で２回洗浄して、トリプシン処理し、２４穴
プレートに２×１０³ になるようにまいた。１８時間
後、抗癌剤モファロテンを１０^-6Ｍになるように培地に
添加して、５日間培養した。細胞からＲＮＡを調製し
て、ｃＤＮＡを合成した。次にプライマーとして、５’
−ＧＡＧＴＧＡＣＡＧＴＧＣＴＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＣ
−３’（配列番号７）と５’−ＡＣＣＧＧＴＧＧＧＴＣ
ＴＧＴＡＡＡＣＡＣＡＧＧＡ−３’（配列番号８）を用
いたＰＣＲによってｈＰａｒ１４を増幅させて検出し
た。

【００３６】添付の図５に示すように、モファロテン処
理したＡｓＰＣ−１細胞で、ｈＰａｒ１４の発現が増強
した。従って、ｈＰａｒ１４が癌細胞の抗癌剤耐性に関
与している可能性が確認された。

【００３７】実施例６ 薬剤耐性細胞におけるｈＰａｒ
１４の発現 大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６及びＳＷ４８０細胞をそれぞ
れアルキル化剤エクテイナスシジン７４３で継続的に処
理して、耐性細胞株ＥＲ５及びＳＷ４８０−５ｎを樹立
した（Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉ Ｙら）。ｈＰａｒ１４
の発現レベルを親株とかかる薬剤耐性細胞とで比較し
た。発現レベルは実施例５に示したＲＴＰＣＲ法で行っ
た。図６に示すように薬剤耐性細胞で親株よりも高いｈ
Ｐａｒ１４の発現レベルが認められた。即ち、癌細胞が
薬剤耐性化すると、ｈＰａｒ１４の発現レベルが高まる
ことがわかった。従って、ｈＰａｒ１４を検出すること
で、癌細胞が薬剤耐性化しているか否かを検査すること
ができる。

【００３８】

【発明の効果】本発明に従うと、癌細胞のｈＰａｒ１４
を検出するだけで癌細胞の増殖能力を検査することがで
きる簡単な方法が提供される。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Yuichi Mori <120> Cell Growth Inhibitor <130> 1003606 <160> 6 <210> 1 <211> 1034 <212> DNA <213> human <223> Nucleotide sequence of human parvulin (hPar14) <400> 1 gcggttcagc gttcaacaac aagcttccaa gatgccgccc aaaggaaaaa gtggttctgg 60 aaaagcgggg aaagggggag cagcctctgg gagtgacagt gctgacaaga aggctcaagg 120 tcccaaaggt ggtggcaatg cagtaaaggt cagacacatt ctatgtgaaa aacatggcaa 180 aatcatggaa gccatggaaa agttaaagtc tgggatgaga ttcaatgaag tggccgcaca 240 gtatagtgaa gataaagcca ggcaaggggg tgacttgggt tggatgacca gagggtccat 300 ggtgggacca tttcaagaag cagcatttgc cttgcctgta agtgggatgg ataagcctgt 360 gtttacagac ccaccggtta agacaaaatt tggatatcat attatgatgg tcgaaggaag 420 aaaataaaat catatgaaag actgaataag ttttatacat tttgtttctt taaaaggtat 480 tacatattct tttgagctgg agctgcaagg aaatacaaaa atttttaaaa agaaaagata 540 ttggatgctc cttgtattcg ttgaaagctc taagattggg tttgtaggtg taagagaggg 600 tggggctaag tgaatgtcaa ctgtagtagg tattcagtca gtctttctca aagagaagtc 660 aagcagactc cctttaacct gtattctctt tcctcccaga actatttcta gctctcagtc 720 tgtcccataa attaattcag aaaccatctt caggggaagc agatatcaac tcacactatt 780 cacacaactg aaaatattgg gcatcaaata gattagtgtg tgagaatcat aaaataagtt 840 cctagacaac atttgtttta catgttagtc aactgtgatc ttccaggaca ggtggattta 900 gctccactgt cttaacatag aacgtggcac gttatgcctt tcagtgttaa ctcctttctt 960 tttaaataaa tgtttattgg aggaaaaaag caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020 aaaaaaaaaa aaaa 1034 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Antisense Oligonucleotide <400> 2 gcttgttgtt gaacgctgaa cc 22 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Antisense Oligonucleotide <400> 3 ggctttatct tcactatact gtgc 24 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Control Oligonucleotide <400> 4 ccaagtcgca agttgttgtt cg 22 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Primer DNA <400> 5 tttggatcca tgccgcccaa aggaaaaagt ggttctgg 38 <210> 6 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Primer DNA <400> 6 tttgaattct cattattttc ttccttcgac cataataata tgatatcc 48 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Primer DNA <400> 7 gagtgacagt gctgacaaga aggc 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Primer DNA <400> 8 accggtgggt ctgtaaacac agga 24

【図面の簡単な説明】

【図１】ｈＰａｒ１４のアミノ酸配列及びそれをコード
する核酸配列。

【図２】ｈＰａｒ１４とＨｅＬａ細胞の増殖との関係を
示すグラフ図。

【図３】ｈＰａｒ１４とＨＣＴ１１６及びＳＷ４８０細
胞の増殖ＨｅＬａ細胞の増殖との関係を示すグラフ図。

【図４】ｈＰａｒ１４に対するウサギポリクローナル抗
体を含む抗血清をもちいたウェスタンブロットによるｈ
Ｐａｒ１４の同定。

【図５】コントロールＡｓＰＣ−１細胞との対比におけ
る、抗癌剤モファロテンにより処理されたＡｓＰＣ−１
細胞のｈＰａｒ１４の発現。

【図６】薬剤耐性細胞及び親株のｈＰａｒ１４の発現レ
ベルの比較。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 癌細胞のヒトパルブリン１４（ｈＰａｒ
   １４）を検出することにより、癌細胞の増殖能力を検査
   する方法。
2. 【請求項２】 前記検出が、ｈＰａｒ１４に特異的な抗
   体を利用する免疫学的測定方法であることを特徴とす
   る、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 癌細胞のｈＰａｒ１４を検出することに
   より、癌細胞の薬剤耐性を検査する方法。
4. 【請求項４】 抗癌剤をスクリーニングする方法であっ
   て、抗癌剤の候補となる物質を癌細胞に作用させ、かか
   る癌細胞のｈＰａｒ１４の検出を介して、当該候補物質
   の癌細胞の増殖を阻害する能力を同定することを特徴と
   する方法。