JP2001299374A

JP2001299374A - 新規ヘテロダイマー性蛋白質の製造方法

Info

Publication number: JP2001299374A
Application number: JP2001093819A
Authority: JP
Inventors: Christie A Kelton; クリスティー・エイ・ケルトン; Noreen P Nugent; ノーリーン・ピー・ヌージェント; Scott C Chappel; スコット・シー・チャペル
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1989-06-20
Filing date: 2001-03-28
Publication date: 2001-10-30
Anticipated expiration: 2021-08-23
Also published as: ES2108688T3; EP0404546A3; ES2203653T3; CA2018676C; DE69031611D1; DE69034104T2; EP0404546A2; DE69031611T2; EP0735139B1; EP0735139A1; JP3814156B2; ATE251216T1; DE69034104D1; ATE159544T1; EP0404546B1; DK0735139T3; JP3402604B2; CA2018676A1; JPH0365194A

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】二量体タンパク質ホルモンの産生を驚異的に
上昇させる新しい発現システムを提供する。【解決手段】下記工程からなるイントロンを含むαサ
ブユニットｃＤＮＡ構築物を使用する、ダイマー性蛋白
質ホルモンの製造方法。ａ）プロモーター、構造遺伝
子、ターミネーター配列を含む第一のべクター。該構造
遺伝子はαサブユニットのコード領域のすぐ５′側に少
なくとも１つのイントロンを含む。ｂ）βサブユニット
の構造遺伝子は、イ）αサブユニットと機能的に連結し
第一のベクター内に存在。または、ロ）プロモーター、
βサブユニットの構造遺伝子、ターミネーター配列を含
む第二のベクター、として構成。ｃ）宿主細胞に形質転
換、ベクターが複数の場合はすべてを形質転換。ｄ）該
形質転換細胞を該蛋白質が生産される条件で培養。イン
トロンは、イントロンを含まない条件下で生産されるよ
りも多量の該蛋白質が生産されるよう、コード領域のＡ
ＴＧに対して間隔をあけて配置。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する分野】本発明は、形質転換された哺乳動
物細胞からヘテロポリマー性タンパク質を産生するため
の発現システムに関するもので、特に二量体の糖タンパ
ク質ホルモン産生の新しい発現システムおよびベクター
に関する。

【０００２】

【従来の技術】αとβサブユニットｃＤＮＡクローンの
培養哺乳動物細胞へのトランスフェクションにより、特
徴的に低いゴナドトロピン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉ
ｎ）の発現レベルが結果として見られた。このことはこ
れらのホルモンの商業的スケールでの産生を深刻に妨げ
ていた。

【０００３】本発明の一つの観点はこのようなホルモン
の産生のために商業上実用的な方法を提供することであ
る。β−グロビン（１，２）や免疫グロブリン遺伝子
（３−５）のようないくつかの遺伝子は、至適ｍＲＮＡ
産生にイントロンを要求するが、一方、チミジンキナー
ゼ（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅ）（６）のよう
な他の遺伝子では要求しない。遺伝子発現のイントロン
依存性上昇は非転写性（例えばグロビン遺伝子）あるい
は転写性（例えば免疫グロブリン遺伝子）メカニズムの
いずれからも結果され得る。

【０００４】ヒトとウシ共通のα、ＦＳＨβ、ＬＨβ、
そしてヒトＴＳＨβサブユニットをコードする遺伝子の
単離が報告されている（８−１４）。ラマバートランら
（Ｒａｍａｂｈａｄｒａｎｅｔａｌ．）ははじめて
ヒトアルファサブユニットｃＤＮＡを用いたマウス（ｍ
ｏｕｓｅ）細胞でのトランスフェクションとそれに続く
発現について述べた。それ以来いくつかのグループが培
養哺乳動物細胞へのトランスフェクションによる二量体
糖タンパク質ホルモン発現の成功を報告している。それ
らのグループのいくつか（１６，１７）はｃＤＮＡクロ
ーンを用い、一方他のグループ（１４，１８，１９）は
イントロン含有ｃＤＮＡまたはゲノム（ｇｅｎｏｍｉ
ｅ）の配列を用いた。

【０００５】米国特許出願第５４８，２２８号と第６９
６，６４７号は培養哺乳動物細胞でのゴナドトロピン産
生のためのｃＤＮＡクローン（イントロンなし）の使用
について述べている。これらの発現システムは生物学的
に活性のある分子を産生する一方、形質転換された哺乳
動物細胞の産生率は述べられたものより一般に低い。

【０００６】より高い産生をもたらすような、ゴナドト
ロピンに有効な改良された発現システムを提供すること
が本発明のもう一つの観点である。マツーク（Ｍａｔｚ
ｕｋ）とボイメ（Ｂｏｉｍｅ）（１８ａ）は、ヒトαサ
ブユニットｃＤＮＡのコーディング領域に挿入されたイ
ントロンは、ｃＤＮＡクローンの使用に比較してより高
い発現をもたらすと述べているがこの主張を、あるいは
彼らの特別な方法の記述を支持するデータは得られてい
ない。最近の発表ではキーツェル（Ｋａｅｔｚｅｌ）と
ニールソン（Ｎｉｌｓｏｎ）（７）がＣＨＯ細胞で比較
的高いレベルのウシＬＨ発現を報告した。彼らのシステ
ムはαとＬＨβサブユニット両者の発現にゲノム配列を
用いた。しかしながらＬＨ発現におけるｃＤＮＡ配列に
対するゲノム配列の効果は彼らの論文中で論じられてい
ない。

【０００７】本発明のもう一つの観点は、現在までの状
況によって起こる混乱を克服することおよび、二量体糖
タンパク質をコードする改良されたベクターを駆使する
ことに必要な、重要な情報とそのようなベクターを用い
た生産方法を提供することである。

【０００８】ウサギβ−グロビン（１，２，２０）、大
腸菌ｇｐｔ（２０）、マウスＤＨＦＲ（２０，２１）な
どの組織培養細胞内でイントロンはｍＲＮＡの蓄積の増
加につながっている。転写を上昇させるエンハンサー要
素（ｅｎｈａｎｃｅｒｅｌｅｍｅｎｔ）を持つイント
ロンを含む遺伝子の例は免疫グロブリン遺伝子（３−
５）、ラットチトクローム（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）ｃ
遺伝子（２２）、ヒトプローα１（Ｉ）コラーゲン遺伝
子などである。イントロンはまた次のような遺伝子：ラ
ット成長ホルモン、マウスメタロチオネイン（ｍｅｔａ
ｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）−Ｉ、およびヒトβ−グロビ
ンなどのトランスジェニック・マウスにおける転写効率
の上昇をもたらすことが示された（２４）。しかしなが
らこれら３つの遺伝子が培養哺乳動物細胞にトランスフ
ェクトされた時にはイントロンはそれらの発現に何ら効
果を持たない。

【０００９】発現レベルは、さまざまな３´非転写性ポ
リアデニレーション領域によって影響され得ることが示
されている（２４，２５）。例えばｇａｌＫマーカー
遺伝子のより高い発現レベルは、転写の終結（ｔｅｒｍ
ｉｎａｔｉｏｎ）にＳＶ４０の初期部位（ｅａｒｌｙ
ｒｅｇｉｏｎ）またはヒトコラーゲンポリアデニレーシ
ョン領域ではなく、ウシ成長ホルモンポリアデニレーシ
ョン領域を用いた場合にもたらされる（２４）。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明の様々な主旨と
観点に従って、αサブユニットゲノム配列、あるいは哺
乳動物細胞において、二量体タンパク質ホルモンの産生
を著しくかつ驚異的に上昇させるイントロンを加えたα
サブユニットｃＤＮＡ構築物を使用する新しい発現シス
テムを提供する。

【００１１】この発見は共通のαサブユニットを持つ二
量体糖タンパク質ホルモンを高収率生産するための工程
の開発を容易にする。それらは絨毛膜性（ｃｈｏｒｉｏ
ｎｉｃ）ゴナドトロピン（ＣＧ）、卵胞（ｆｏｌｌｉｃ
ｌｅ）刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成（ｌｕｔｅｉ
ｎｉｚｉｎｇ）ホルモン（ＬＨ）、そして甲状腺刺激ホ
ルモン（ＴＳＨ）を含む。

【００１２】更にまたＴＳＨのβサブユニット遺伝子の
発現がイントロン依存性であることが期せずして発現さ
れた。ＴＳＨβサブユニットの至適な発現に必要なゲノ
ム領域の特定は、当発明によって二量体ＴＳＨを効率よ
く産生するための工程の開発に関する重要で特別な情報
を提供することにより可能となった。

【００１３】本発明のさまざまな観点および主旨は図面
によりさらに理解されるであろう。

【００１４】

【実施例】実施例１：共通αとＦＳＨβサブユニット発
現のためのプラスミドの構築。Ａ．完全なヒトαサブユニットゲノムクローンは多くの
原材料（ｓｏｕｒｃｅ）からｐＢＲ３２２への１７キロ
塩基対（ｋｂ）ＥｃｏＲＩ挿入部として都合よく得るこ
とが可能である。αプロモーターは組織特異的であるこ
とが示されており、様々な遺伝子発現に共通して用いら
れる培養組織細胞中では効率良く機能しないので、すべ
ての５´側面配列をとり除くステップが入れられた。内
部にあるＥｃｏＲＩ部位は、処理をしたゲノム配列の組
み立てに先がけて、数回のサブクローニング段階を必要
とした。有利に用いられた工学的方法が図１に示されて
いる。２つのｐＵＣ１８サブクローン、１つは８．０ｋ
ｂのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ５´部分（ｐＵＣｂｓ８．
０）を用いて、そして２つめは２．７ｋｂの３´Ｓａｃ
Ｉ−ＥｃｏＲＩ部分（ｐＵＣｓｅ２．７）を用いて、構
築された。我々の発現ベクターにあるＸｈｏＩクローニ
ング部位に合う末端を作るためｐＵＣｓｅ２．７はＥｃ
ｏＲＩで消化され、その端は大腸ＤＮＡポリメラーゼＩ
のクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）断片での処理によって平滑
化されて、その後ＳａｌＩリンカーがライゲーション
（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応で接着された。その反応混合
液を更に続いてＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ分解
し、２．６ｋｂのベクター断片に加えて２．７ｋｂヒト
αＳａｌＩ部分を生成した。この２．７ｋｂヒトαＳａ
ｌＩ部分はゲル精製されｐＵＣ１８（ｐＵＣｓｓ２．
７）のＳａｌＩ部位に再挿入された。２．７ｋｂα断片
をＳａｃＩ部分として単離できるような方向にあるＳａ
ｌＩ挿入部を含むクローンが選択された。これはゲル精
製され、その後ｐＵＣｂｓ８．０のＳａｃＩに挿入され
てｐＵＣ１８における１１ｋｂ挿入部として完全なヒト
α遺伝子のコーディング配列が構築された。その挿入部
は遺伝子の５´末端のｐＵＣ１８ポリリンカーにある既
存のＳａｌＩ部位と、遺伝子の３´末端の変換ＳａｌＩ
部位（ＥｃｏＩ由来）の効果によりＳａｌＩ断片として
切り出すことができた。完成されたゲノムα発現構築物
は、今後“全長ゲノムα”配列と呼ぶが、エクソンＩ
（ｅｘｏｎＩ）の一部（ｍＲＮＡの５´非翻訳領域を含
む最初の３５ヌクレオチド短い）、エクソンＩＩ、ＩＩ
Ｉ、およびＩＶの全てを介在配列（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉ
ｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）と同様に、そして３´側面
配列の約２キロ塩基対（ｋｂ）を含んだ。これは転写が
マウスメタロチオネインＩ（ｍｏｕｓｅｍｅｔａｌｌ
ｏｔｈｉｏｎｅｉｎ−Ｉ、ＭＴ−Ｉ）プロモーターによ
って支配されるように、ＣＬＨ３ＡＸＳＶ２ＤＨＦＲ発
見ベクター（図２）のＸｈｏＩ部位に挿入された。この
発現ベクターはまたマウスのジハイドロフォレート（ｄ
ｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ）還元酵素（ｒｅｄｕｃｔａ
ｓｅ）（ＤＨＦＲ）遺伝子を選択と増幅のマーカーとし
て含んでいた。Ｂ．ヒトαサブユニットｃＤＮＡは、発現のために全長
クローンを開始ＡＴＧに及ぶＮｃｏＩおよびＴＡＡ終止
コドンの２１５塩基対（ｂｐ）下流の３´非翻訳領域で
切断するＨｉｎｄＩＩＩで分解することにより工作され
た。５´ＳａｌＩ部位とコザック（ｋｏｚａｋ）コンセ
ンサス配列（２７）は合成オリゴヌクレオチドにより、
３´ＳａｌＩ部位は上記のようにリンカーを付着するこ
とによって供給された。工作されたαサブユニットｃＤ
ＮＡクローンのＤＮＡ配列は、長さ約６００ｂｐで、表
７に示す。これはＣＬＨ３ＡＸＳＶ２ＤＨＦＲ発現ベク
ターのＸｈｏＩ部位に挿入された（図２）。内因性の５
´非翻訳領域と３´ポリアデニレーションシグナルが工
作過程においてｃＤＮＡクローンから除かれ、それ故に
ＭＴ−Ｉプロモーターとサル（ｓｉｍｉａｎ）ウィルス
４０（ＳＶ４０）初期ポリアデニレーションシグナルが
それぞれベクター配列によって供給された。

【００１５】Ｃ．この研究において使用されたヒトＦＳ
Ｈβ部分ゲノムクローンは２．０ｋｂのＤｄｅＩ−Ｓａ
ｕ３Ａ切片であり、それは開始ＡＴＧ上流の４０ｂｐ配
列に加えたエクソンＩＩのタンパクコーディング領域、
エクソンＩＩＩのタンパクコーディング領域、およびこ
の２つのエクソンを分けている１．６ｋｂのイントロン
を含んでいた（表７）。５´ＤｄｅＩ部位と３´Ｓａｎ
３Ａ部位は前もってそれぞれＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩに
変換されており、それ故現状の発現ベクターとの互換性
はない。ＦＳＨβゲノムクローンの部分はそれ故上記の
ように平滑化したＳａｌＩ末端に商業的に製造されてい
るＳａｌＩリンカーを付着して供給された。ＳａｌＩ部
分はそれからＤＨＦＲコーディング領域がネズミ（ｍｕ
ｒｉｎｅ）オルニチン脱炭酸酵素（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ
ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，ＯＤＣ）のコーディン
グ領域に入れ替わっていること以外は構造的にＣＬＨ３
ＡＸＳＶ２ＤＨＦＲと同様の発現ベクターであるＣＬＨ
３ＡＸＳＶ２０ＤＣ（図２）のＸｈｏＩ部位に挿入され
た。

【００１６】実施例２：安定なトランスフェクションに
おける全長ゲノムαとｃＤＮＡαＣＬＨ３ＡＸＳＶ２Ｄ
ＨＦＲの転写単位の比較。ゲノムαとｃＤＮＡαＣＬＨ
３ＡＸＳＶ２ＤＨＦＲ構造物は、それぞれのα発現プラ
スミドをヒトＦＳＨβＣＬＨ３ＡＸＳＶ２０ＤＣ発現プ
ラスミドとコートランスフェクション（ｃｏｔｒａｎｓ
ｆｅｃｔｉｏｎ）させ、ＦＳＨ二量体産生を測定するこ
とによって比較された。

【００１７】Ａ．トランスフェクションの行われる２４
時間前に１００ｍｍ皿に７×１０⁵のＤＵＫＸＣＨＯ
細胞（ＤＨＦＲ−マイナス）が植えられた。リン酸カル
シウム沈殿は５００マイクロリッター（μｌ）のトラン
スフェクション用バッファー〔１４ミリモル（ｍＭ）Ｎ
ａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、０．７ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、
５．５ｍＭデキストロース，２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐ
Ｈ７．５）〕に浮遊させたプラスミドＤＮＡに３１μｌ
の２モル（Ｍ）ＮａＣｌ₂を加えて得た。用いられたプ
ラスミドＤＮＡの量は、α（ｃＤＮＡ又はゲノム）：１
０μｇ、そしてＦＳＨβ：３０μｇであった。沈殿生成
のため室温で４５分間放置された。培養培地が細胞から
除かれ、ＤＮＡ沈殿物が入れられた。室温で２０分間放
置して細胞を落ちつかせた後、各皿に培養培地５ｍｌが
加えられ、３７℃で４時間インキュベーションを続け
た。細胞はそれから１５％グリセロールにて３７℃で
３．５分間ショックを受けた。培養培地で３７℃４８時
間のインキュベーションの後細胞は１：１０に分けられ
０．０２メトトレキセイト（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔ
ｅ，ＭＴＸ）を含む選択培地が加えられた。使われた選
択培地は、１０％の透析ウシ胎児血清と１％のＬ−グル
タミンを追加した、α−マイナス改良イーグル培地（Ｅ
ａｇｌｅ´ｓｍｅｄｉｕｍ）であった。１０日から１
４日後にフォーカス（ｆｏｃｉ）が可視化したとき２４
溝のプレートに移した。そこから得られた培養培地は、
特異的モノクローナルに基く放射性免疫アッセイ（セロ
ーノダイアグノスティックスＳｅｒｏｎｏＤｉａｇ
ｎｏｓｔｉｃｓ、ランドルフＲａｎｄｏｌｐｈ、マサチ
ューセッツＭＡ）を用いてＦＳＨ二量体発現についてア
ッセイされた。陽性のクローンは、Ｔ−２５フラスコ内
の、濃度を０．１μＭに増加したＭＴＸを含む選択培地
に移された。培養が密集状（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に
なった時培地はＦＳＨ二量体について再びアッセイさ
れ、細胞は１個あたり２４時間の発現レベルのピコグラ
ム数を計算するために数を数えられた。

【００１８】Ｂ．ヒトαゲノム／ＦＳＨβおよびヒトα
ｃＤＮＡ／ＦＳＨβの各コートランスフェクションより
任意に選択された７つのクローンにおいて測定されたヒ
トＦＳＨ二量体分泌レベルが表１に記されている。

【００１９】

【表１】

【００２０】この結果はＦＳＨ二量体発現が全長ゲノム
αサブユニット配列でトランスフェクションされた細胞
において著しく増加することを示している。平均発現レ
ベルは、この特定の実験において見られた驚く程の大幅
な上昇が約３０倍であったことを示している。

【００２１】Ｃ．全長ゲノムα配列の優越性を更に証明
するため、安定な細胞系がヒトαｃＤＮＡかあるいはヒ
トαゲノムクローンのいずれかを含むＣＬＨ３ＡＸＳＶ
２ＤＨＦＲ発現ベクターでトランスフェクションされ
た。フリーのαサブユニット発現の割合が比較された。
ヒトαサブユニットの発現は、高感度のかつ特異的放射
性免疫アッセイで決定され、ｃＤＮＡ含有細胞系につい
てはすべてのケースに０．０５ｐｇ／細胞／２４時間を
上まわることはなかった。表２に詳しく示されている通
り、ゲノムαクローンでトランスフェクションされた細
胞は５−２０倍上昇したタンパク質レベルを表わした。

【００２２】

【表２】

【００２３】実施例３：甲状腺刺激ホルモンの構築。本発明の有効性と幅広い応用性を証明するため、ＣＬＨ
３ＡＸＳＶ２ＤＨＦＲの全長ヒトゲノムα配列をＣＬＨ
３ＡＸＳＶ２０ＤＣの部分ゲノムＴＳＨβ配列とコート
ランスフェクションさせて安定にトランスフェクション
されたＣＨＯ細胞系が調製された。この実験に用いられ
たゲノムの部分ＴＳＨβ断片は、エクソンＩＩとＩＩＩ
のタンパク質コーディング領域および、この２つのエク
ソンを分けている０．５ｋｂのイントロンから成る（表
９）。ＴＳＨβのタンパク質コーディング配列をはさむ
すべての５´と３´領域は、この特定の構築においてと
り除かれた。引き続きこの２つの発現ベクターのコート
ランスフェクションが行われ、安定な細胞系が培養され
て、それらのＴＳＨ発現能について分析が行われた。感
度の高い、かつ特異的な放射性免疫アッセイで決定され
た二量体の発現レベルが表３に挙げられる。ゲノムＴＳ
ＨβクローンとαサブユニットのｃＤＮＡとのコートラ
ンスフェクションについての以前の研究は、発現レベル
が通常、放射性免疫アッセイの感度以下、即ちたいてい
０．０２ｐｇ／細胞／２４時間以下であることを示して
いた。

【００２４】

【表３】

【００２５】つまりＴＳＨ産生はＦＳＨ産生と同様、哺
乳動物細胞のトランスフェクションにおいてαｃＤＮＡ
配列よりむしろ全長ゲノムα配列の使用によって大きく
上昇され得る。この実験におけるＴＳＨ産生上昇範囲は
６から１００倍であった。

【００２６】実施例４：イントロンと発現の上昇ヒトαゲノム構築は、それがイントロンを含むというこ
とのみならず、内因性の５´非翻訳配列、末端ポリアデ
ニレーションシグナル、そして付加的な３´側面配列
（３´ｆｌａｎｋｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むと
いう点においてもヒトαｃＤＮＡ構築とは異なってい
る。それ故に以前のいくつかの実験からはゲノム領域が
発現の上昇に貢献することを推定するのは不可能であっ
た。

【００２７】Ａ．ゲノムα配列内のイントロンがαサブ
ユニットレベルの上昇の原因となっているかどうかを決
定するため我々はヒトαイントロンＡのＸｂａＩ−Ｐｓ
ｔＩ部分２ｋｂをＣＬＨ３ＡＸＳＶ２ＴＰＡベクターの
マウスＭＴ−Ｉ５´非翻訳領域とαｃＤＮＡ配列の間に
挿入した（図２）。短くされたイントロンは内因性のス
プライスアクセプター（ｓｐｌｉｃｅａｃｃｅｐｔｏ
ｒ）を保持していたが、スプライスドナー（ｓｐｌｉｃ
ｅｄｏｎｏｒ）は合成オリゴヌクレオチドにて供給さ
れた。

【００２８】Ｂ．αサブユニット発現における異種（ｈ
ｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）イントロンの効果をテストす
るため、もう１つのプラスミドが構築された。この構築
においてＭＯＰＣ４１免疫グロブリンＫ遺伝子（５）由
来のイントロン１３０ｂｐがマウスＭＴ−Ｉ５´非翻訳
領域とαｃＤＮＡ配列の間に挿入された。この特定の介
在（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ）配列には転写エンハンサ
ーエレメント（ｅｎｈａｎｃｅｒｅｌｅｍｅｎｔ）は
含まれていなかった。

【００２９】Ｃ．これらイントロン含有αｃＤＮＡ構築
物は、プラスミドＤＮＡのＣＯＳ−７細胞への一過性ト
ランスフェクションおよびノザンブロッティング（ｎｏ
ｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）によるｍＲＮＡレベ
ルの解析によって、本来のαｃＤＮＡ構築物および全長
ゲノムα配列と比較された。この実験において組織プラ
スミノーゲンアクチベーター（ｔｉｓｓｕｅｐｌａｓ
ｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｔＰＡ）ｃＤＮ
Ａは内部標準（ｉｎｔｅｒｎａｌｓｔａｎｄａｒｄ）
として用いられ、異なるプラスミド構築物のトランスフ
ェクション効率のばらつきを修正し、すなわち、測定α
サブユニットｍＲＮＡレベルを標準化（ｎｏｒｍａｌｉ
ｚｅ）するのに使用された。トランスフェクションはシ
ードとアルフォ（ＳｅｅｄａｎｄＡｒｕｆｆｏ）の
ＤＥＡＥ−デキストランプロトコール（２８）を使って
二連に（ｉｎｄｕｐｌｉｃａｔｅ）行われた。トランス
フェクション２日後に細胞性全ＲＮＡが細胞から分離さ
れた。このＲＮＡ（５マイクログラム）はフォルムアル
デヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）ゲルで分画され、
標準的なノザンブロッティング技術を用いてナイロン膜
に転写された。膜はそれから³²Ｐ標準ヒトα又は³²Ｐ標
準ｔＰＡプローブのいずれかとハイブリダイズされ、結
果として得られたシグナルはベータスコープ（Ｂｅｔａ
ｓｃｏｐｅ）モデル６０３のブロット分析機（ベータジ
ェン社、ワルサム、マサチューセッツ、Ｂｅｔａｇｅｎ
Ｃｏｒｐ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で定量された。
相対的比較のための標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）α
ｍＲＮＡ値は、αカウント数をｔＰＡカウント数で割
り、二連のサンプルから得られた数字を平均して計算さ
れた。この実験の結果が表４に示されている。

【００３０】

【表４】

【００３１】この結果はαサブユニットｍＲＮＡの蓄積
に関してヒトαイントロン（Ｎｏ．２）又は免疫グロブ
リンイントロン（Ｎｏ．３）のいずれかを含むｃＤＮＡ
構築物は全長ゲノム配列（Ｎｏ．１）のように効率がよ
り良いことを示した。特に標準化αサブユニットｍＲＮ
Ａレベルは、イントロンなしのｃＤＮＡ対象（Ｎｏ．
４）によって産生されたものより７から２１倍高かっ
た。我々はそれ故、αサブユニットタンパク質コーディ
ング配列に隣あわせた５´又は３´領域ではなく、イン
トロンが増加発現レベルに対する第１の原因であり、そ
の効果は少なくとも一部はαサブユニットｍＲＮＡ蓄積
の増加によるものであることを期せずして発見したので
ある。

【００３２】実施例５：増加した転写率によらない、発
現の上昇核ランオフ（ｒｕｎｏｆｆ）転写アッセイは、ゲノム
α誘導性ｍＲＮＡ蓄積の高レベルが増加した転写の割合
によるものであるかどうかを決定するために用いられ
た。αゲノムあるいはαｃＤＮＡ含有ＣＬＨ３ＡＸＳＶ
２ＴＰＡプラスミドによるＣＯＳ−７細胞の、一過性ト
ランスフェクションが実施例４にのべられているように
行われた。核の調製とランオフ転写アッセイには標準的
な方法が用いられた（カレントプロトコールイン
モレキュラーバイオロジー；マウスベル、Ｆ．Ｍ．ら
編；ジョンウィリーアンドサンズ，ニューヨーク，
ニューヨークＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ；Ａｕｓｕｂ
ｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔａｌ．，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆
Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ）。α、ＤＨＦＲ、ｔＰＡ用のＤ
ＮＡプローブはゲル精製された挿入配列で、それぞれの
約０．２５μｇがニトロセルロース膜上で二重スロット
ブロットされた。その膜は、ＤＮＡなし（モックｍｏｃ
ｋ）、ＣＬＨ３ＡＸＳＶ２ＴＰＡの全長ヒトαゲノムク
ローン、あるいはＣＬＨ３ＡＸＳＶ２ＴＰＡのヒトαｃ
ＤＮＡクローンにてトランスフェクションされたＣＯＳ
−７細胞から調製されて、［³²Ｐ−ＵＴＰ］で標識され
た核ランオフＲＮＡにハイブリダイズされた。ハイブリ
ダイゼーションシグナルはベータスコープモデル６０３
ブロット分析機（ベータージェン社，ワルサム，マサチ
ューセッツＢｅｔａｇｅｎ，Ｃｏｒｐ．，Ｗａｌｔｈ
ａｍ，，ＭＡ）で定量された。転写率の標準化された値
（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄｖａｌｕｅ）は平均αカウン
トを平均ｔＰＡカウントで割って得られた。サル（ｍｏ
ｎｋｅｙ）ＤＨＦＲ核ランオフＲＮＡは、この実験で使
われた条件ではマウス（ｍｏｕｓｅ）ＤＨＦＲＤＮＡ
プローブ配列にハイブリダイズしないはずであり、それ
故負の対象として使われている。相対的転写率の結果は
下の表５にまとめられている。

【００３３】

【表５】

【００３４】この特定の実験においてαｃＤＮＡのラン
オフ転写率（０．１２）はゲノムα配列のそれ（０．０
７）と較べ驚く程高かった。増加された転写率はそれ故
より高いαサブユニット発現レベル産生ゲノムα配列に
よる機構ではない。

【００３５】実施例６：ＴＳＨβサブユニット発現はイ
ントロン依存性である。Ａ．全長ゲノムＴＳＨβ遺伝子（１４ａ）が図３Ａに図
解されている。３つのエクソン（Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ）、
２つのイントロン（ａ，ｂ）、開始ＡＴＧ、終止コドン
（ＴＡＡ）の位置が示されている。ＰｖｕＩＩ部位はエ
クソンＩＩとＩＩＩを含む約２ｋｂのＤＮＡ配列によっ
てわけられており、ＴＳＨβの完全なタンパク質コーデ
ィング領域を含有する。この研究において使われたＴＳ
Ｈβ部分ゲノム構築物はこの２ｋｂＰｖｕＩＩ断片に
由来しており図３Ｂに図解されている。ＴＳＨβ０．９
（０．９ｋｂ）は実施例１の安定なトランスフェクショ
ンにおいて使用されたものと同様の構築物で、内因性の
介在（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ）配列によって分けられ
た２つのコーティングエクソンから成り、開始ＡＴＧの
上流とＴＡＡ下流の全配列は除かれている。ＴＳＨβ
１．２（１．２ｋｂ）およびＴＳＨβ２．０（２．０ｋ
ｂ）はさらに加えてイントロンＡの約３００塩基対を含
み、短くなったイントロンをスプライラスさせるための
合成スプライス供給部（ｄｏｎｏｒ）を加えて構築し
た。ＴＳＨβ２．０は末端のポリアデニレーションシグ
ナルと約０．８ｋｂの付加的３´側面配列（ｆｌａｎｋ
ｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ）を保持している。

【００３６】Ｂ．実施例４に述べているプロトコールを
用いてＣＯＳ−７細胞の二連のカルチャー（Ａ，Ｂ）が
以下の部分ゲノム断片のうちの１つを含むＣＬＨ３ＡＸ
ＳＶ２ＤＨＦＲプラスミドでトランスフェクションされ
た：（１）ＴＳＨβ０．９、（２）ＴＳＨβ１．２、ま
たは（３）ＴＳＨβ２．０。遺伝子は転写がＭＴ−Ｉプ
ロモーターで開始されるように、そしてＴＳＨβ０．９
とＴＳＨβ１．２の場合はＳＶ４０初期ポリアデニレー
ションシグナルで終止するようにＸｈｏＩクローニング
部位に挿入された。インキュベーション４８時間後に細
胞性全ＲＮＡが細胞から分離された。ＲＮＡ（９マイク
ログラム）はホルムアルデヒドゲルにて分画され、それ
から標準ノザンブロッティング技術を用いてナイロン膜
に移された。膜は³²Ｐ標識されたマウスＭＴ−Ｉプロー
ブ（約５０塩基対のＭＴ−Ｉ５´非翻訳配列も含むよう
なＴＳＨβｍＲＮＡを検出するため）、または³²Ｐ標識
されたＤＨＦＲプローブ（トランスフェクション効率の
比較のため）のいずれかでハイブリダイズされた。結果
として得られたシグナルはベータスコープ（Ｂｅｔａｓ
ｃｏｐｅ）モデル６０３ブロット分析機（ベータジェン
社，ワルサム，マサチューセッツＢｅｔａｇｅｎ，Ｃｏ
ｒｐ．，Ｗａｌｔｈａｍ，，ＭＡ）で定量された。相対
的比較のために標準化された（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）
ＴＳＨβｍＲＮＡ値はＭＴ−Ｉカウント数をＤＨＦＲカ
ウント数で割って計算された。２つのトランスフェクシ
ョンで得られた標準化された値はそれから平均化されて
ＴＳＨβ０．９について得た数字で割られた。ｍＲＮＡ
の蓄積に関して得られた比較の結果は表６にまとめられ
ている。

【００３７】

【表６】

【００３８】Ｃ．この結果は最初のイントロンの一部を
保持する２つの構築物（ＴＳＨβ１．２とＴＳＨβ２．
０）は最初のイントロン由来の配列をまったく含まない
構築物に較べて５−６０倍高いｍＲＮＡの蓄積を生ずる
ことを示している。それ故ＴＳＨβ遺伝子発現はαサブ
ユニット遺伝子発現と同様イントロン依存性である。す
べての構築物とタンパク質コーディング領域に存在する
イントロンＢが最適な上昇を与えていない、という予想
外の観察結果は興味深い。このことはＴＳＨβ遺伝子の
最初のイントロンにｍＲＮＡの蓄積を増加させるような
特異的な配列が存在するか、あるいはより高い可能性と
しては、イントロンの位置（ｍＲＮＡの５´末端に近
い）が重要な要素であるかのいずれかを示唆している。
イントロン依存性遺伝子発現が転写単位内のイントロン
の配置によって影響され得るということはヒトαｃＤＮ
Ａを用いた予備実験によっても支持されている。κ免疫
グロブリン遺伝子のイントロンをｍＲＮＡの３´非翻訳
領域、即ちαｃＤＮＡとＳＶ４０ポリアデニレーション
領域の間に挿入した場合、変えられていないαｃＤＮＡ
と比較してｍＲＮＡ蓄積の増加は起こらなかった。

【００３９】Ｄ．ＴＳＨβ１．２はＴＳＨβ２．０より
１０倍高いｍＲＮＡ量を生じたことから、ＴＳＨβ２．
０にある末端ポリアデニレーションシグナルと３´側面
配列は効率よいｍＲＮＡ産生に必要ではないということ
はあり得ることで実際不利益なものであるのかもしれな
い。その代わりに、ＴＳＨβ１．２とＴＳＨβ２．０の
間のｍＲＮＡ蓄積の不均等は２つのプラスミド構築物に
おけるＭＴ−ＩプロモーターとＳＶ４０初期プロモータ
ー（ＤＨＦＲを操作する）間の距離の違いに関係してい
るのかもしれない。ＴＳＨβ１．２構築物内でのふたつ
のプロモーターの近接（０．８ｋｂ）がＳＶ４０エンハ
ンサーエレメントおよびＭＩ−プロモーター間の相互関
係を増加させ、それによって後者の転写率が増加するの
であろう。

【００４０】さまざまな哺乳動物の中でαおよびＴＳＨ
β遺伝子構造は類似しているので、ヒトαおよびＴＳＨ
βサブユニットに基づく我々の発見は、ウシ、ウマ、ブ
タ、ヒヒおよびサルのよう他の種にも同様に応用できる
と思われる。同じく、ＬＨβおよびＦＳＨβサブユニッ
ト遺伝子も、至適な発現のためには、同様なゲノムＤＮ
Ａ構造依存性を示すであろうし、このような要求は他の
種間に於ても応用されるべきである。

【００４１】発現ベクターの構築は、イントロンのよう
なｍＲＮＡの蓄積に重要であるゲノム領域に関する知識
や、転写単位内のこのような領域の位置が重要であると
いう知見を応用して、有利に単純化されるであろう。

【００４２】例えばこれらゲノム領域をサブクローン化
又は合成してαとβサブユニットｃＤＮＡ配列を用いた
構築物に含むこともできる。ｃＤＮＡクローンはしばし
ばそれよりはるかに大きなゲノムクローンより入手しや
すく工作しやすい。かくしてこの発見は高レベルのホル
モンを産生する細胞系の開発を単純化し、そして最終的
には低いコストでこれらのタンパク質の大規模な生産を
可能にするだろう。これらや他の観点および本発明の変
法は当業者にとって今や明らかであり、本発明の意図あ
るいは範囲のいずれからも逸脱するものではない。（参考文献）１．ヘイマー（Ｈａｍｅｒ），Ｄ．Ｈ．とリーダー（Ｌ
ｅｄｅｒ），Ｐ．（１９７９）セル（Ｃｅｌｌ）１７，
７３７−７４７２．ヘイマー（Ｈａｍｅｒ），Ｄ．Ｈ．とリーダー（Ｌ
ｅｄｅｒ），Ｐ．（１９７９）セル（Ｃｅｌｌ）１８，
１２９９−１３０２３．バナージ（Ｂａｎｅｒｊｉ），Ｊ．ら（１９８３）
セル（Ｃｅｌｌ）３３，７２９−７４０４．ギリーズ（Ｇｉｌｌｉｅｓ），Ｓ．Ｄ．ら（１９８
３）セル（Ｃｅｌｌ）３３，７１７−７２８５．クイーン（Ｑｕｅｅｎ），Ｃ．とバルチモア（Ｂａ
ｌｔｉｍｏｒｅ），Ｄ．（１９８３）セル（Ｃｅｌｌ）
３３，７４１−７４８６．グロス（Ｇｒｏｓｓ），Ｍ．Ｋ．ら（１９８７）Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，４５７６−４５８１７．カエツェル（Ｋａｅｔｚｅｌ），Ｄ．Ｍ．とニール
ソン（Ｎｉｌｓｏｎ），Ｊ．Ｈ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ，Ｃｈｅｍ，２６３，６３４４−６３５１８．フィデス（Ｆｉｄｄｅｓ），Ｊ．Ｃ．とグットマン
（Ｇｏｏｄｍａｎ），Ｈ．Ｍ．（１９８１）Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１，３−１８９．グッドウィン（Ｇｏｏｄｗｉｎ），Ｒ．Ｇ．ら（１
９８３）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１１，６８７
３−６８８２１０．バージン（Ｖｉｒｇｉｎ），Ｊ．ら（１９８５）
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６０，７０７２−７０７７１１．タルメージ（Ｔａｌｍａｄｇｅ），Ｋ．ら（１９
８４）ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３０７，３７−４
０１２．キム（Ｋｉｍ），Ｋ．Ｅ．ら（１９８８）ＤＮＡ
７，２２７−２３３１３．ワトキンズ（Ｗａｔｋｉｎｓ），Ｐ．Ｃ．ら（１
９８７）ＤＮＡ６，２０５−２１２１４．ワンディスフォード（Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄ），
Ｆ．Ｅ．ら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ，２，３２−
３９１４ａ．ワンディスフォード，Ｆ．Ｅ．ら（１９８８）
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６３，１２５３８−１２５
４２１５．ラマハドラン（Ｒａｍａｂｈａｄｒａｎ），Ｔ．
Ｖ．ら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ８１，６７０１−６７１５１６．レディ（Ｒｅｄｄｙ），Ｖ．Ｂ．ら（１９８５）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２，
３６４４−３６４８１７．ワタナベ（Ｗａｔａｎａｂｅ），Ｓ．ら（１９８
７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ
ｍ，１４９，１１４９−１１５５１８．マツーク（Ｍａｔｚｕｋ），Ｍ．Ｍ．ら（１９８
７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８
４，６３５４−６３５８１８ａ．マツーク，Ｍとボイメ（Ｂｏｉｍｅ），Ｉ．
（１９８８）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１０６，１０４９
−１０５９１９．カエツェル（Ｋａｅｔｚｅｌ），Ｄ．Ｍ．ら（１
９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ８２，７２８０−７２８３２０．バッハマン（Ｂｕｃｈｍａｍ），Ａ．Ｒ．とバー
グ（Ｂｅｒｇ），Ｐ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．８，４３９５−４４０５２１．リー（Ｌｅｅ），Ｆ．ら（１９８１）ネーチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）２９４，２２８−２３２２２．エバンズ（Ｅｖａｎｓ），Ｍ．Ｊ．とスカーピュ
ラ（Ｓｃａｒｐｕｌｌａ），Ｒ．Ｃ．（１９８８）Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，３５−４１２３．ロウソ（Ｒｏｓｓｏｕｗ），Ｃ．Ｍ．Ｓ．ら（１
９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，１５１５１
−１５１５７２４．ブリンスター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ），Ｒ．Ｌ．ら
（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ８５，８３６−８４０２５．プファール（Ｐｆａｒｒ），Ｄ．Ｓ．ら（１９８
６）ＤＮＡ５，１１５−１２２２６．ロス（Ｒｏｓ），Ｊ．とコブズ（Ｋｏｂｓ），
Ｇ．（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８８，５７
９−５９３２７．コザック（Ｋｏｚａｋ），Ｍ．（１９８４）Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１２，８５７−８７２２８．シード（Ｓｅｅｄ）Ｂ．とアルフォ（Ａｒｕｆｆ
ｏ），Ａ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４，３３６５−３３６５２９．ボリバール（Ｂｏｌｉｖａｒ），Ｆ．，ロドリゲ
ス（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ），Ｒ．Ｌ．，グリーン（Ｇｒ
ｅｅｎ），Ｐ．Ｊ．，ベトラック（Ｂｅｔｌａｃｈ），
Ｍ．Ｃ．，ハイネッカー（Ｈｅｙｎｅｃｋｅｒ），Ｈ．
Ｌ．，ボイヤー（Ｂｏｙｅｒ），Ｈ．Ｗ．，クロサ（Ｃ
ｒｏｓａ），Ｇ．Ｆ．とファルコー（Ｆａｌｋｏｗ），
Ｓ．（１９７７）ジーン（Ｇｅｎｅ）２：９５３０．グランビル（Ｇｒａｎｖｉｌｌｅ），Ｎ．，ダー
ナン（Ｄｕｒｎｈａｍ），Ｄ．Ｍ．とパーミター（Ｐａ
ｌｍｉｔｅｒ），Ｒ．Ｄ．（１９８１）ネーチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅ）２９２：２６７−２６９３１．ヘイマー（Ｈａｍｅｒ），Ｄ．Ｈ．とワーリング
（Ｗａｌｌｉｎｇ），Ｍ．（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａ
ｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８３２．ラスキー（Ｌｕｓｋｙ），Ｍ．とボッチャン（Ｂ
ｏｔｃｈａｎ），Ｍ．（１９８１）ネーチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ）２８３：７９−８１３３．レディ（Ｒｅｄｄｙ），Ｖ．Ｂ．，シンマパヤ
（Ｔｈｉｍｍａｐａｙａ），Ｂ．，ダール（Ｄｈａ
ｒ），Ｒ．サブラマニアン（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａ
ｎ），Ｋ．Ｎ．，ツアイン（Ｚａｉｎ），Ｂ．Ｓ．，パ
ン（Ｐａｎ），Ｊ．ゴーシュ（Ｇｈｏｓｈ），Ｐ．
Ｋ．，セルマ（Ｃｅｌｍａ），Ｍ．Ｌ．とワイズマン
（Ｗｅｉｓｓｍａｎ），Ｓ．Ｍ．（１９７８）サイエン
ス（Ｓｃｉｅｎｃ）２００：４９４３４．トーズ（Ｔｏｏｚｅ），Ｊ．（編）ＤＮＡ腫瘍ウ
ィルス（ＴｕｍｏｒＶｉｒｕｓｅｓ）：腫瘍ウィルス
の分子生物学（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ
ｏｆＴｕｍｏｒＶｉｒｕｓｅｓ）；２ｎｄＥ
ｄ．，コールド・スプリング・ハーバーラボラトリー
（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ），ニューヨーク（ＮｅｗＹｏｒｋ）１９
８１３５．チャング（Ｃｈｉａｎｇ）Ｔ．−Ｒ．とマッコン
ログ（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ），Ｌ．（１９８８）Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：７６４−７６９特に述べ
られている以外は使用された操作手順と技術は大体にお
いて従来報告されている通りであり、マニアテス（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ）らによるクローニング・マニュアル（Ｃ
ｌｏｎｉｎｇＭａｎｕａｌ），コールド・スプリング
・ハーバー（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ）
（１９８２）に記載されているような従来通りの技法で
ある。上に列挙されている、あるいは特記された参考文
献のすべては参考として組みこまれている。

【図面の簡単な説明】

【図１】組織培養細胞における、発現のためのヒトα
遺伝子工作に用いた方法を示す。重要な制限エンドヌク
レアーゼ部位を示す。黒ぬりの四角はα遺伝子のエクソ
ン（ｅｘｏｎ）を、太実線はα遺伝子イントロンを、細
実線はｐＢＲ３２２又はｐＵＣ１８ベクター、をそして
ジグザグの線はｐＣＵ１８のポリリンカー領域を表す。

【図２】安定な、あるいは一過性のトランスフェクシ
ョンに用いられる基本的な発現ベクター、ＣＬＨ３ＡＸ
ＳＶ２〔ＤＨＦＲ，ＯＤＣ又はＴＰＡ〕を示す。αまた
はβサブユニットシーケンス挿入に使われたＸｈｏＩ部
位の位置が示されている。二本の実線は哺乳動物細胞で
の発現に必要なシーケンスを表している。プロモータ
ー、ポリアデニレーション、マーカー遺伝子の相対的位
置が示されている。一本の実線は大腸菌における増殖と
選択（アンピシリン抵抗性による）に必要な、ｐＢＲ３
２２由来のｐＭＬ−１領域を表す。

【図３】Ａ部は全ＴＳＨβ遺伝子を示す。3つのエク
ソン〔Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ〕、2つのイントロン（ａ，
ｂ）、開始ＡＴＧ、終止コドン（ＴＡＡ）が図示されて
いる。更に部分構築のもととなるものからの断片の単離
に使われたＰｖｕＩＩ部位も図示されている。影のつい
た四角は非コード（ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ）のエクソンシ
ーケンスを表示している。Ｂ部は過渡的にトランスフェ
クトされたＣＯＳ−７細胞におけるＴＳＨβｍＲＮＡの
蓄積を比較するために用いられた部分ゲノム構築物（ｐ
ａｒｔｉａｌｇｅｎｏｍｉｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉ
ｏｎ）を示している。ＴＳＨβ０．９は、内在性（ｅｎ
ｄｏｇｅｎｏｎｓ）ＩＶＳによって分かれている２つの
コード性（ｃｏｄｉｎｇ）エクソンから成り、開始ＡＴ
Ｇの上流とＴＡＡの下流すべての配列はとり除かれてい
る（配列は表９に示されている）。ＴＳＨβ１．２およ
びＴＳＨβ２．０は更にイントロンＡの約３００塩基対
を含み、先端を切った（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）イントロ
ンのスプライシングができるよう合成スプライスドナー
（）を加えることによって構築された。ＴＳＨβ
２．０は内在性ポリアデニレーションシグナル（）
と約０．８ｋｄの追加３´側面配列を保有する。

【図４】ＣＬＨ３ＡＸＳＶ２ＤＨＦＲを示す。このベ
クターは以下の部分から組み立てられた：（ｉ）ＳＶ４０初期領域（ｅａｒｌｙｒｅｇｉｏｎ）
プロモーター（３３，３４）、マウス（ｍｏｕｓｅ）Ｄ
ＨＦＲ遺伝子（ＲＥＦＳ）、ＳＶ４０小Ｔ（ｓｍａｌｌ
Ｔ）イントロンおよび初期領域ポリアデニレーション
シグナル配列（３３，３４）から成るジハイドロフォレ
ートリダクターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅｒｅ
ｄｕｃｔａｓｅ，ＤＨＦＲ）転写単位図４の核酸番号１
から１９２５）；（ｉｉ）ｐＢＲ３２２ベクター（２９）由来で、ｐＢＲ
３２２から１３７０塩基対欠失させた（３２）細菌用プ
ラスミドベクターｐＭＬの配列（図４の核酸番号２２０
１から４５４２）；そして（ｉｉｉ）マウスメタロチオ
ネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）−１遺伝子
（３０，３１）由来で、そこからイントロンとポリアデ
ニレーションシグナル配列がとり除かれたメタロチオネ
インプロモーター（図４の核酸番号４５４２から７５１
４）；および（ｉｖ）ＳＶ４０初期領域ポリアデニレー
ションシグナル配列（図４で核酸番号７５１４から７７
５１）（３３，３４）。ｔＲＡアナローグがＳａｌＩ断
片のように唯一のＸｈｏＩ部位でベクター内に挿入され
た。挿入部分の、プロモーターとアデニレーション配列
に対する相対的方向性は制限酵素分析によって決定され
た。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年４月２７日（２００１．４．２
７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１５

【補正方法】変更

【補正内容】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ノーリーン・ピー・ヌージェントアメリカ合衆国マサチューセッツ州01701, フレイミンガム，ウエストゲート・ロード 38 (72)発明者スコット・シー・チャペルアメリカ合衆国マサチューセッツ州02114, ボストン，ハンコック・ストリート 39

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の工程からなる、黄体形成ホルモ
ン、濾胞刺激ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、および
甲状腺刺激ホルモンからなる群から選択されるダイマー
性蛋白質ホルモンの製造方法：ａ）プロモーター、上記ダイマー性蛋白質のα−サブユ
ニットをコードする構造遺伝子、およびターミネーター
配列を含む第一のベクターを提供し、該プロモーター、
構造遺伝子およびターミネーター配列は機能可能に連結
されていて、宿主細胞が該ベクターによって適正に形質
転換されたとき該遺伝子の発現を可能にし、該構造遺伝
子はコード領域および少なくとも一つのイントロンを含
み、その一つは該α−サブユニットのコード領域の直ぐ
５’側に存在し、但し該α−サブユニットをコードする
構造遺伝子はウシ黄体形成ホルモンのα−サブユニット
をコードする遺伝子の全ゲノム配列ではなく；ｂ）該ダイマー性蛋白質のβ−サブユニットをコードす
る構造遺伝子を提供し、該β−サブユニット構造遺伝子
は、イ）前記αサブユニットを含む第一のベクター内に
存在し、そして該αサブユニットに機能可能に連結して
いて、宿主細胞が第一のベクターで適当に形質転換され
たときβ−サブユニット構造遺伝子の発現を可能にする
か、または、ロ）プロモーター、β−サブユニット構造
遺伝子およびターミネーター配列を含む第二のベクター
中に存在し、該プロモーター、β−サブユニット構造遺
伝子およびターミネーター配列は機能可能に連結してい
て、宿主細胞が第二のベクターで適当に形質転換された
とき該β−サブユニット構造遺伝子の発現を可能にして
おり；ｃ）宿主細胞を第一のベクターで形質転換し、またはも
しβ−サブユニットをコードする構造遺伝子が第二のベ
クター中に存在する場合は、宿主細胞を第一および第二
のベクターで形質転換し；そして、ｄ）該形質転換細胞をダイマー性蛋白質が生産される条
件で培養する、ここにおいて、α−サブユニットのコー
ド領域の直ぐ５’のイントロンは、イントロンを含まな
いｃＤＮＡであるα−サブユニットをコードする構造遺
伝子を用いて同じ条件下で生産できるよりも多量のダイ
マー性蛋白質が生産されるように、コード領域のＡＴＧ
に対して間隔をあけて配置されている。
【請求項２】 β−サブユニットをコードする構造遺伝
子が、該β−サブユニットをコードする遺伝子のゲノム
配列である、請求項１の方法。
【請求項３】 α−サブユニットをコードする構造遺伝
子が、複数のイントロン、３’および５’側部領域、内
在性の５’非翻訳配列およびポリアデニル化シグナルが
付加された該α−サブユニットをコードするＤＮＡを含
む、請求項１の方法。
【請求項４】ダイマー性蛋白質がヒト濾胞刺激ホルモ
ンであり、第一のベクターが該α−サブユニットをコー
ドする遺伝子のゲノム配列を含む、請求項１の方法。
【請求項５】ダイマー性蛋白質がヒト黄体形成ホルモ
ンであり、第一のベクターが該α−サブユニットをコー
ドする遺伝子のゲノム配列を含む、請求項１の方法。
【請求項６】ダイマー性蛋白質がヒト絨毛性ゴナドト
ロピンホルモンであり、第一のベクターが該α−サブユ
ニットをコードする遺伝子のゲノム配列を含む、請求項
１の方法。
【請求項７】ダイマー性蛋白質が非ヒト絨毛性ゴナド
トロピンホルモンであり、第一のベクターが該α−サブ
ユニットをコードする遺伝子のゲノム配列を含む、請求
項１の方法。
【請求項８】ダイマー性蛋白質が非ヒト濾胞刺激ホル
モンであり、第一のベクターが該α−サブユニットをコ
ードする遺伝子のゲノム配列を含む、請求項１の方法。
【請求項９】 α−サブユニットが下記の配列【化１】を含む請求項１の方法。
【請求項１０】 β−サブユニットが下記の配列【化２】を含む請求項４の方法。
【請求項１１】 α−サブユニットをコードする構造遺
伝子が、該α−サブユニットをコードする遺伝子の全ゲ
ノム配列ではない、請求項１の方法。
【請求項１２】 β−サブユニットをコードする構造遺
伝子が、第二のベクター中に存在する請求項１の方法。
【請求項１３】 β−サブユニットをコードする構造遺
伝子が少なくとも一つのイントロンを含む請求項１の方
法。
【請求項１４】 α−サブユニットをコードする構造遺
伝子においてα−サブユニットのコード領域の直ぐ５’
側に存在するイントロンが、生産すべきダイマー性蛋白
質に相当する天然のダイマー性蛋白質のα−サブユニッ
トをコードする遺伝子のゲノム配列中に天然に存在する
ものである、請求項１の方法。
【請求項１５】ダイマー性蛋白質がヒト甲状腺刺激ホ
ルモン濾胞刺激ホルモンであり、第一のベクターが該α
−サブユニットをコードする遺伝子のゲノム配列を含
む、請求項１の方法。
【請求項１６】構造遺伝子がただ一つのイントロンを
含む、請求項１の方法。