JP2001299344A - 純度の高いポリａ＋ｒｎａの精製方法 - Google Patents
純度の高いポリａ＋ｒｎａの精製方法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】細胞等の核酸を含有する試料から、高純度のポ
リＡ+ＲＮＡを簡便でかつ安全に精製する方法並びにそ
のために用いる試薬の提供。 【解決手段】以下の工程（ａ）〜（ｋ）を含んでなるポ
リＡ+ＲＮＡの精製方法。（ａ）核酸を含有する試料を
タンパク質変性剤を含む溶液により溶解する工程、
（ｂ）必要に応じて緩衝液を添加して、ポリＡ+ＲＮＡ
を担体に結合させる工程、（ｃ）担体−ポリＡ+ＲＮＡ
複合体を液相より分離する工程、（ｄ）該複合体を洗浄
する工程、（ｅ）ポリＡ+ＲＮＡを該複合体から解離さ
せる工程、（ｆ）該ポリＡ+ＲＮＡ溶液に混入するＤＮ
ＡをＤＮａｓｅで処理する工程、（ｇ）該ＤＮａｓｅ処
理液をタンパク質変性剤を含む溶液と混合する工程、
（ｈ）ポリＡ+ＲＮＡを担体に結合させる工程、（ｉ）
担体−ポリＡ+ＲＮＡ複合体を液相より分離する工程、
（ｊ）該複合体を洗浄する工程、（ｋ）ポリＡ+ＲＮＡ
を該複合体から解離させる工程
リＡ+ＲＮＡを簡便でかつ安全に精製する方法並びにそ
のために用いる試薬の提供。 【解決手段】以下の工程（ａ）〜（ｋ）を含んでなるポ
リＡ+ＲＮＡの精製方法。（ａ）核酸を含有する試料を
タンパク質変性剤を含む溶液により溶解する工程、
（ｂ）必要に応じて緩衝液を添加して、ポリＡ+ＲＮＡ
を担体に結合させる工程、（ｃ）担体−ポリＡ+ＲＮＡ
複合体を液相より分離する工程、（ｄ）該複合体を洗浄
する工程、（ｅ）ポリＡ+ＲＮＡを該複合体から解離さ
せる工程、（ｆ）該ポリＡ+ＲＮＡ溶液に混入するＤＮ
ＡをＤＮａｓｅで処理する工程、（ｇ）該ＤＮａｓｅ処
理液をタンパク質変性剤を含む溶液と混合する工程、
（ｈ）ポリＡ+ＲＮＡを担体に結合させる工程、（ｉ）
担体−ポリＡ+ＲＮＡ複合体を液相より分離する工程、
（ｊ）該複合体を洗浄する工程、（ｋ）ポリＡ+ＲＮＡ
を該複合体から解離させる工程
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は高純度なポリＡ+Ｒ
ＮＡの精製方法及びそのための試薬に関する。さらに詳
しくは、ポリＡ+ＲＮＡを含有する試料からオリゴｄＴ
固定化担体及びＤＮａｓｅを用いて、簡便に高純度なポ
リＡ+ＲＮＡを精製する方法ならびにそのための試薬に
関する。
ＮＡの精製方法及びそのための試薬に関する。さらに詳
しくは、ポリＡ+ＲＮＡを含有する試料からオリゴｄＴ
固定化担体及びＤＮａｓｅを用いて、簡便に高純度なポ
リＡ+ＲＮＡを精製する方法ならびにそのための試薬に
関する。
【０００２】
【従来の技術】近年種々の生物において、全ゲノムデオ
キシリボ核酸（ＤＮＡ）塩基配列が解明されつつある。
例えば、ヒトに関しては、２０００年末にはドラフトシ
ーケンスが明らかになり、そこに存在する遺伝子数は１
０万を越えるであろうといわれている。しかしながら、
ゲノムＤＮＡ全てが生命現象を担っているわけではな
く、生命現象の主たる担い手タンパク質のアミノ酸配列
情報を含む領域、このタンパク質の合成を触媒するリボ
核酸（ＲＮＡ）、すなわち、トランスファーＲＮＡ（ｔ
ＲＮＡ）及びリボゾーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の塩基配
列情報を含む領域の他、生命現象には必要とされない領
域が存在する。また、タンパク質のアミノ酸配列情報を
含む領域も、必ずしも一つのタンパク質に対し一つの連
続した領域からなるものではない。つまり、タンパク質
の合成の前にまずＲＮＡに転写されるが、この際その間
に挟まれたアミノ酸配列情報を含まない領域（イントロ
ン）も合わせて転写され、スプライシングと呼ばれる過
程でこの領域が切除され、アミノ酸配列情報を含む領域
が残ったメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が生成する
のである。また、真核生物ではこのｍＲＮＡの３’末端
がポリアデニル化されているのが特徴であり、ポリＡ+
ＲＮＡと呼ばれる。
キシリボ核酸（ＤＮＡ）塩基配列が解明されつつある。
例えば、ヒトに関しては、２０００年末にはドラフトシ
ーケンスが明らかになり、そこに存在する遺伝子数は１
０万を越えるであろうといわれている。しかしながら、
ゲノムＤＮＡ全てが生命現象を担っているわけではな
く、生命現象の主たる担い手タンパク質のアミノ酸配列
情報を含む領域、このタンパク質の合成を触媒するリボ
核酸（ＲＮＡ）、すなわち、トランスファーＲＮＡ（ｔ
ＲＮＡ）及びリボゾーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の塩基配
列情報を含む領域の他、生命現象には必要とされない領
域が存在する。また、タンパク質のアミノ酸配列情報を
含む領域も、必ずしも一つのタンパク質に対し一つの連
続した領域からなるものではない。つまり、タンパク質
の合成の前にまずＲＮＡに転写されるが、この際その間
に挟まれたアミノ酸配列情報を含まない領域（イントロ
ン）も合わせて転写され、スプライシングと呼ばれる過
程でこの領域が切除され、アミノ酸配列情報を含む領域
が残ったメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が生成する
のである。また、真核生物ではこのｍＲＮＡの３’末端
がポリアデニル化されているのが特徴であり、ポリＡ+
ＲＮＡと呼ばれる。
【０００３】このポリＡ+ＲＮＡの解析により、生命現
象を解明する上で非常に重要な情報が提供される。ポリ
Ａ+ＲＮＡの解析において、しばしばｔＲＮＡ、ｒＲＮ
Ａ、ｍＲＮＡ（ポリＡ+ＲＮＡ）等の混合物であるTotal
ＲＮＡを用いて行われるが、このTotal ＲＮＡに占め
るポリＡ+ＲＮＡは５％以下であり、特にコピー数の少
ないポリＡ+ＲＮＡの解析は困難である。そのため、生
体材料からポリＡ+ＲＮＡを単離することは、これらの
解析において非常に有意義である。これらの分野で頻繁
に使用されるｃＤＮＡライブラリーの調製、ｃＤＮＡク
ローニング、ノザンブロット解析、逆転写ポリメラーゼ
チェインリアクション（ＲＴ−ＰＣＲ）などの解析法に
おいて良好な結果を得るためには、可能な限り高純度の
ポリＡ+ＲＮＡを使用することが望ましい。
象を解明する上で非常に重要な情報が提供される。ポリ
Ａ+ＲＮＡの解析において、しばしばｔＲＮＡ、ｒＲＮ
Ａ、ｍＲＮＡ（ポリＡ+ＲＮＡ）等の混合物であるTotal
ＲＮＡを用いて行われるが、このTotal ＲＮＡに占め
るポリＡ+ＲＮＡは５％以下であり、特にコピー数の少
ないポリＡ+ＲＮＡの解析は困難である。そのため、生
体材料からポリＡ+ＲＮＡを単離することは、これらの
解析において非常に有意義である。これらの分野で頻繁
に使用されるｃＤＮＡライブラリーの調製、ｃＤＮＡク
ローニング、ノザンブロット解析、逆転写ポリメラーゼ
チェインリアクション（ＲＴ−ＰＣＲ）などの解析法に
おいて良好な結果を得るためには、可能な限り高純度の
ポリＡ+ＲＮＡを使用することが望ましい。
【０００４】一般に、ポリＡ+ＲＮＡを精製するには、
生体試料より、ＡＧＰＣ法 [Analytical Biochemistry
162, 156-159(1987)]、リチウム沈殿法（Molecular Clo
ning,1.4, (1989)）、あるいはＢｏｏｍらにより考案さ
れたシリカ粒子を用いた方法[J. Clin. Microbiol. 28
(3), 495-501] によりTotal ＲＮＡを抽出し、このTota
l ＲＮＡのうちポリＡ+ＲＮＡをオリゴｄＴセファロー
ス等のオリゴｄＴ固定化担体に特異的に吸着させ、ポリ
Ａ+ＲＮＡを精製する方法が用いられてきた。しかしな
がら、これらの方法では操作工程が長く、煩雑となるた
め、一度に多サンプルを処理する場合には向かない。そ
の上操作工程が長いため、ＲＮＡ分解酵素によるＲＮＡ
の分解の危険性も増大する。
生体試料より、ＡＧＰＣ法 [Analytical Biochemistry
162, 156-159(1987)]、リチウム沈殿法（Molecular Clo
ning,1.4, (1989)）、あるいはＢｏｏｍらにより考案さ
れたシリカ粒子を用いた方法[J. Clin. Microbiol. 28
(3), 495-501] によりTotal ＲＮＡを抽出し、このTota
l ＲＮＡのうちポリＡ+ＲＮＡをオリゴｄＴセファロー
ス等のオリゴｄＴ固定化担体に特異的に吸着させ、ポリ
Ａ+ＲＮＡを精製する方法が用いられてきた。しかしな
がら、これらの方法では操作工程が長く、煩雑となるた
め、一度に多サンプルを処理する場合には向かない。そ
の上操作工程が長いため、ＲＮＡ分解酵素によるＲＮＡ
の分解の危険性も増大する。
【０００５】一方、簡便なポリＡ+ＲＮＡの単離方法と
して、カオトロピック剤存在下で生体試料を溶解し、ポ
リＡ+ＲＮＡをオリゴｄＴセルロース等のオリゴｄＴ固
定化担体に吸着させ、精製する方法が考案されている。
しかしながら、この方法においては、オープンカラムの
操作ではＲＮＡ分解酵素の混入の危険性が高く、またバ
ッチ法における閉鎖系では液相と担体−ポリＡ+ＲＮＡ
複合体を分離するのに遠心操作が必要とされ、一度に多
サンプルを処理する場合には煩雑となる。
して、カオトロピック剤存在下で生体試料を溶解し、ポ
リＡ+ＲＮＡをオリゴｄＴセルロース等のオリゴｄＴ固
定化担体に吸着させ、精製する方法が考案されている。
しかしながら、この方法においては、オープンカラムの
操作ではＲＮＡ分解酵素の混入の危険性が高く、またバ
ッチ法における閉鎖系では液相と担体−ポリＡ+ＲＮＡ
複合体を分離するのに遠心操作が必要とされ、一度に多
サンプルを処理する場合には煩雑となる。
【０００６】オリゴｄＴ固定化担体を使用するポリＡ+
ＲＮＡの単離方法としては、ビオチン化オリゴｄＴをス
トレプトアビジン固定化磁性ビーズに吸着させ、このオ
リゴｄＴ−ストレプトアビジン磁性ビーズにポリＡ+Ｒ
ＮＡを特異的に吸着する方法が考案され、磁石を用いて
担体−ポリＡ+ＲＮＡ複合体を分離でき、遠心操作を必
要としない。しかしながら、この方法においても担体へ
の吸着が多段階であるため効率が悪い。
ＲＮＡの単離方法としては、ビオチン化オリゴｄＴをス
トレプトアビジン固定化磁性ビーズに吸着させ、このオ
リゴｄＴ−ストレプトアビジン磁性ビーズにポリＡ+Ｒ
ＮＡを特異的に吸着する方法が考案され、磁石を用いて
担体−ポリＡ+ＲＮＡ複合体を分離でき、遠心操作を必
要としない。しかしながら、この方法においても担体へ
の吸着が多段階であるため効率が悪い。
【０００７】しかしながら、これらいずれの手法におい
てもｒＲＮＡやゲノムＤＮＡを一度の精製では完全に除
くことが出来ないため、純度の高いポリＡ+ＲＮＡを得
るには精製操作を２回以上繰り返すことが必要である。
また、ゲノムＤＮＡ上には遺伝子の他に類似の配列を持
つが、遺伝子としての機能を失った領域（偽遺伝子）が
存在し、しばしば研究の妨げとなっており、これを防ぐ
には混入ＤＮＡを完全に除くことが必要である。その方
法として、ＤＮａｓｅによるゲノムＤＮＡの切断という
手段が採られるが、その後ＤＮａｓｅを変性、除去する
ためにはフェノール−クロロホルム抽出のような有機溶
媒を用いなければならず、危険な操作である。そこで、
これらの問題点を克服した方法が必要とされている。
てもｒＲＮＡやゲノムＤＮＡを一度の精製では完全に除
くことが出来ないため、純度の高いポリＡ+ＲＮＡを得
るには精製操作を２回以上繰り返すことが必要である。
また、ゲノムＤＮＡ上には遺伝子の他に類似の配列を持
つが、遺伝子としての機能を失った領域（偽遺伝子）が
存在し、しばしば研究の妨げとなっており、これを防ぐ
には混入ＤＮＡを完全に除くことが必要である。その方
法として、ＤＮａｓｅによるゲノムＤＮＡの切断という
手段が採られるが、その後ＤＮａｓｅを変性、除去する
ためにはフェノール−クロロホルム抽出のような有機溶
媒を用いなければならず、危険な操作である。そこで、
これらの問題点を克服した方法が必要とされている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、細胞
等の核酸を含有する試料から、高純度のポリＡ+ＲＮＡ
を簡便でかつ安全に精製する方法ならびにそのために用
いる試薬を提供することにある。
等の核酸を含有する試料から、高純度のポリＡ+ＲＮＡ
を簡便でかつ安全に精製する方法ならびにそのために用
いる試薬を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ポリＡ+
ＲＮＡ中のｒＲＮＡの混入を極力抑えるために精製工程
を複数回繰り返すこと、及びゲノムＤＮＡの混入を抑え
るためにＤＮａｓｅで処理することに着目し、種々検討
を重ねた結果、タンパク質変性剤を含む溶液にて細胞等
の生体材料を溶解して、ポリＡ+ＲＮＡを単離し、ＤＮ
ａｓｅで処理後、処理液にそのままタンパク質変性剤を
含む溶液を加え、再度ポリＡ+ＲＮＡを精製することに
より危険な有機溶媒による操作を必要とせず、安全でし
かも簡便なポリＡ+ＲＮＡの精製が可能であることを見
出し、本発明を完成させるに至った。
ＲＮＡ中のｒＲＮＡの混入を極力抑えるために精製工程
を複数回繰り返すこと、及びゲノムＤＮＡの混入を抑え
るためにＤＮａｓｅで処理することに着目し、種々検討
を重ねた結果、タンパク質変性剤を含む溶液にて細胞等
の生体材料を溶解して、ポリＡ+ＲＮＡを単離し、ＤＮ
ａｓｅで処理後、処理液にそのままタンパク質変性剤を
含む溶液を加え、再度ポリＡ+ＲＮＡを精製することに
より危険な有機溶媒による操作を必要とせず、安全でし
かも簡便なポリＡ+ＲＮＡの精製が可能であることを見
出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】すなわち、本発明は以下のような構成から
なる。 （１）以下の工程（ａ）〜（ｋ）を含んでなることを特
徴とするポリＡ+ＲＮＡの精製方法。 （ａ）核酸を含有する試料をタンパク質変性剤を含む溶
液により溶解する工程、（ｂ）ポリＡ+ＲＮＡをオリゴ
ｄＴが共有結合もしくは非共有結合により固定化された
担体に特異的に吸着させるか、又はポリＡ+ＲＮＡを担
体に特異的に結合可能な官能基を有するオリゴｄＴに結
合させ、さらに該官能基に特異的に結合可能な部分を有
する担体に結合させる工程、（ｃ）担体−ポリＡ+ＲＮ
Ａ複合体を液相より分離する工程、（ｄ）該複合体を洗
浄する工程、（ｅ）ポリＡ+ＲＮＡを該複合体から解離
させる工程、（ｆ）該ポリＡ+ＲＮＡ溶液に混入するＤ
ＮＡをＤＮａｓｅで処理する工程、（ｇ）該ＤＮａｓｅ
処理液をタンパク質変性剤を含む溶液と混合する工程、
（ｈ）ポリＡ+ＲＮＡをオリゴｄＴが共有結合もしくは
非共有結合により固定化された担体に特異的に吸着させ
るか、又はポリＡ+ＲＮＡを担体に特異的に結合可能な
官能基を有するオリゴｄＴに結合させ、さらに該官能基
に特異的に結合可能な部分を有する担体に結合させる工
程、（ｉ）担体−ポリＡ+ＲＮＡ複合体を液相より分離
する工程、（ｊ）該複合体を洗浄する工程、（ｋ）ポリ
Ａ+ＲＮＡを該複合体から解離させる工程 （２）工程（ｂ）及び／又は工程（ｈ）を行う前に、緩
衝液の添加を行う（１）のポリＡ+ＲＮＡの精製方法。 （３）タンパク質変性剤がカオトロピック剤及び／又は
界面活性剤である（１）又は（２）の方法。 （４）カオトロピック剤がグアニジニウム塩、尿素、ヨ
ウ化物及び（イソ）チオシアン酸塩からなる群より選択
される少なくとも１種の化合物である（３）の方法。 （５）界面活性剤がラウリル硫酸ナトリウム、アルキル
硫酸アルカリ金属塩、Ｎ−ラウロイルサルコシン、ノニ
デットＰ−４０、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イ
ソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソル
ビタンモノラウレートからなる群より選択される少なく
とも１種の化合物である（３）の方法。 （６）工程（ｂ）及び／又は工程（ｈ）を行う前に用い
られる緩衝液が２００ｍＭ以下のナトリウム塩もしくは
リチウム塩を含む（２）の方法。 （７）洗浄液が２５〜１００ｍＭのナトリウム塩もしく
はリチウム塩を含む（１）〜（５）のいずれかの方法。 （８）ＤＮａｓｅにＲＮａｓｅ阻害剤を共存させる
（１）〜（６）のいずれかの方法。 （９）（ａ）タンパク質変性剤を含有する溶解液、
（ｂ）オリゴｄＴが共有結合もしくは非共有結合により
固定化された担体又は担体に特異的に結合可能な官能基
を有するオリゴｄＴ及び該官能基に特異的に結合可能な
部分を有する担体、（ｃ）洗浄液、（ｄ）溶出液、及び
（ｅ）ＤＮａｓｅを含むことを特徴とするポリＡ+ＲＮ
Ａ精製用試薬。 （１０）（ｆ）ＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む（９）の
ポリＡ+ＲＮＡ精製用試薬。 （１１）（ｇ）溶解工程後に添加する緩衝液をさらに含
む（９）のポリＡ+ＲＮＡ精製用試薬。 （１２）（ｆ）ＲＮａｓｅ阻害剤及び（ｇ）溶解工程後
に添加する緩衝液をさらに含む（９）のポリＡ+ＲＮＡ
精製用試薬。 （１３）（ｃ）洗浄液が２５〜１００ｍＭのナトリウム
塩もしくはリチウム塩を含む（９）〜（１２）のいずれ
かの試薬。 （１４）（ｇ）溶解工程後に添加する緩衝液が２００ｍ
Ｍ以下のナトリウム塩もしくはリチウム塩を含む（１
１）又は（１２）の試薬。
なる。 （１）以下の工程（ａ）〜（ｋ）を含んでなることを特
徴とするポリＡ+ＲＮＡの精製方法。 （ａ）核酸を含有する試料をタンパク質変性剤を含む溶
液により溶解する工程、（ｂ）ポリＡ+ＲＮＡをオリゴ
ｄＴが共有結合もしくは非共有結合により固定化された
担体に特異的に吸着させるか、又はポリＡ+ＲＮＡを担
体に特異的に結合可能な官能基を有するオリゴｄＴに結
合させ、さらに該官能基に特異的に結合可能な部分を有
する担体に結合させる工程、（ｃ）担体−ポリＡ+ＲＮ
Ａ複合体を液相より分離する工程、（ｄ）該複合体を洗
浄する工程、（ｅ）ポリＡ+ＲＮＡを該複合体から解離
させる工程、（ｆ）該ポリＡ+ＲＮＡ溶液に混入するＤ
ＮＡをＤＮａｓｅで処理する工程、（ｇ）該ＤＮａｓｅ
処理液をタンパク質変性剤を含む溶液と混合する工程、
（ｈ）ポリＡ+ＲＮＡをオリゴｄＴが共有結合もしくは
非共有結合により固定化された担体に特異的に吸着させ
るか、又はポリＡ+ＲＮＡを担体に特異的に結合可能な
官能基を有するオリゴｄＴに結合させ、さらに該官能基
に特異的に結合可能な部分を有する担体に結合させる工
程、（ｉ）担体−ポリＡ+ＲＮＡ複合体を液相より分離
する工程、（ｊ）該複合体を洗浄する工程、（ｋ）ポリ
Ａ+ＲＮＡを該複合体から解離させる工程 （２）工程（ｂ）及び／又は工程（ｈ）を行う前に、緩
衝液の添加を行う（１）のポリＡ+ＲＮＡの精製方法。 （３）タンパク質変性剤がカオトロピック剤及び／又は
界面活性剤である（１）又は（２）の方法。 （４）カオトロピック剤がグアニジニウム塩、尿素、ヨ
ウ化物及び（イソ）チオシアン酸塩からなる群より選択
される少なくとも１種の化合物である（３）の方法。 （５）界面活性剤がラウリル硫酸ナトリウム、アルキル
硫酸アルカリ金属塩、Ｎ−ラウロイルサルコシン、ノニ
デットＰ−４０、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イ
ソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソル
ビタンモノラウレートからなる群より選択される少なく
とも１種の化合物である（３）の方法。 （６）工程（ｂ）及び／又は工程（ｈ）を行う前に用い
られる緩衝液が２００ｍＭ以下のナトリウム塩もしくは
リチウム塩を含む（２）の方法。 （７）洗浄液が２５〜１００ｍＭのナトリウム塩もしく
はリチウム塩を含む（１）〜（５）のいずれかの方法。 （８）ＤＮａｓｅにＲＮａｓｅ阻害剤を共存させる
（１）〜（６）のいずれかの方法。 （９）（ａ）タンパク質変性剤を含有する溶解液、
（ｂ）オリゴｄＴが共有結合もしくは非共有結合により
固定化された担体又は担体に特異的に結合可能な官能基
を有するオリゴｄＴ及び該官能基に特異的に結合可能な
部分を有する担体、（ｃ）洗浄液、（ｄ）溶出液、及び
（ｅ）ＤＮａｓｅを含むことを特徴とするポリＡ+ＲＮ
Ａ精製用試薬。 （１０）（ｆ）ＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む（９）の
ポリＡ+ＲＮＡ精製用試薬。 （１１）（ｇ）溶解工程後に添加する緩衝液をさらに含
む（９）のポリＡ+ＲＮＡ精製用試薬。 （１２）（ｆ）ＲＮａｓｅ阻害剤及び（ｇ）溶解工程後
に添加する緩衝液をさらに含む（９）のポリＡ+ＲＮＡ
精製用試薬。 （１３）（ｃ）洗浄液が２５〜１００ｍＭのナトリウム
塩もしくはリチウム塩を含む（９）〜（１２）のいずれ
かの試薬。 （１４）（ｇ）溶解工程後に添加する緩衝液が２００ｍ
Ｍ以下のナトリウム塩もしくはリチウム塩を含む（１
１）又は（１２）の試薬。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明においてポリＡ+ＲＮＡを
含有する試料とは、特に限定されるものではないが、例
えば、血清、血液、髄液、組織、尿、糞便、唾液、精液
等の生体材料から分離した細胞及び培養細胞などの生体
試料が挙げられる。
含有する試料とは、特に限定されるものではないが、例
えば、血清、血液、髄液、組織、尿、糞便、唾液、精液
等の生体材料から分離した細胞及び培養細胞などの生体
試料が挙げられる。
【００１２】本発明においては、まず核酸を含有する試
料をタンパク質変性剤を含む溶液により溶解し、必要に
応じて、ｐＨが５〜１０のＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、Ｈｅ
ｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ、クエン
酸ナトリウム緩衝液等の緩衝液を添加し、ポリＡ+ＲＮ
ＡをオリゴｄＴが共有結合もしくは非共有結合により固
定化された担体に特異的に吸着させるか、あるいはポリ
Ａ+ＲＮＡを担体に特異的に結合可能な官能基を有する
オリゴｄＴに結合させ、さらに該官能基に特異的に結合
可能な部分を有する担体に結合させる。タンパク質変性
剤を含む溶液とは溶解液をいうものである。また、 本
発明に使用するタンパク質変性剤とはカオトロピック剤
及び／又は界面活性剤である。
料をタンパク質変性剤を含む溶液により溶解し、必要に
応じて、ｐＨが５〜１０のＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、Ｈｅ
ｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ、クエン
酸ナトリウム緩衝液等の緩衝液を添加し、ポリＡ+ＲＮ
ＡをオリゴｄＴが共有結合もしくは非共有結合により固
定化された担体に特異的に吸着させるか、あるいはポリ
Ａ+ＲＮＡを担体に特異的に結合可能な官能基を有する
オリゴｄＴに結合させ、さらに該官能基に特異的に結合
可能な部分を有する担体に結合させる。タンパク質変性
剤を含む溶液とは溶解液をいうものである。また、 本
発明に使用するタンパク質変性剤とはカオトロピック剤
及び／又は界面活性剤である。
【００１３】カオトロピック剤とは、タンパク質及び核
酸の一次構造に影響を及ぼすことなく、二次、三次また
は四次構造を変えることが可能である物質をいうもので
ある。具体的には、グアニジニウム塩、尿素、ヨウ化
物、及び（イソ）チオシアン酸塩等が挙げられる。該カ
オトロピック剤の濃度は、それぞれの化合物によっても
異なるが、通常は１〜２０Ｍである。グアニジニウム塩
としては、グアニジン無機塩またはグアニジン有機塩が
あり、例えば、塩酸グアニジニウム、酢酸グアニジニウ
ム、リン酸グアニジニウム、（イソ）チオシアン酸グア
ニジニウム、硫酸グアニジニウム、炭酸グアニジニウム
などが例示されるが、一般にタンパク質の変性に使用さ
れるグアニジンの塩であれば、特に限定されない。ま
た、それらを組み合わせて用いても良く、グアニジニウ
ム塩の濃度は２Ｍ以上の高濃度にて使用するのが望まし
い。一方、ヨウ化物としては、ヨウ化ナトリウムまたは
ヨウ化カリウムなどがあり、（イソ）チオシアン酸塩と
しては、（イソ）チオシアン酸ナトリウム、（イソ）チ
オシアン酸カリウムまたは（イソ）チオシアン酸アンモ
ニウムなどがある。
酸の一次構造に影響を及ぼすことなく、二次、三次また
は四次構造を変えることが可能である物質をいうもので
ある。具体的には、グアニジニウム塩、尿素、ヨウ化
物、及び（イソ）チオシアン酸塩等が挙げられる。該カ
オトロピック剤の濃度は、それぞれの化合物によっても
異なるが、通常は１〜２０Ｍである。グアニジニウム塩
としては、グアニジン無機塩またはグアニジン有機塩が
あり、例えば、塩酸グアニジニウム、酢酸グアニジニウ
ム、リン酸グアニジニウム、（イソ）チオシアン酸グア
ニジニウム、硫酸グアニジニウム、炭酸グアニジニウム
などが例示されるが、一般にタンパク質の変性に使用さ
れるグアニジンの塩であれば、特に限定されない。ま
た、それらを組み合わせて用いても良く、グアニジニウ
ム塩の濃度は２Ｍ以上の高濃度にて使用するのが望まし
い。一方、ヨウ化物としては、ヨウ化ナトリウムまたは
ヨウ化カリウムなどがあり、（イソ）チオシアン酸塩と
しては、（イソ）チオシアン酸ナトリウム、（イソ）チ
オシアン酸カリウムまたは（イソ）チオシアン酸アンモ
ニウムなどがある。
【００１４】さらに、溶解液においては、細胞膜の破壊
あるいは細胞に含まれるタンパク質を可溶化させる界面
活性剤を単独で使用するか、あるいはカオトロピック剤
と併用させても良い。カオトロピック剤と併用しない場
合は、一般に細胞等から核酸抽出されるものであれば特
に限定されないが、特表平１１−５０１５０４号公報に
開示されているようなドデシル硫酸ナトリウムやアルキ
ル硫酸アルカリ金属塩あるいはサルコシンが望ましい。
しかしながら、カオトロピック剤と併用する場合、前者
２つの界面活性剤は不溶化するために用いることができ
ない。トリトン系界面活性剤、及びツイーン系界面活性
剤などの非イオン性界面活性剤、Ｎ−ラウロイルサルコ
シン酸ナトリウムなどの陰イオン性界面活性剤であれば
特に限定されない。本発明においては、特にＲＮＡ分解
酵素活性が高い試料において、カオトロピック剤との併
用で０．０１〜２．０％の陰イオン性界面活性剤を使用
することが好ましい。
あるいは細胞に含まれるタンパク質を可溶化させる界面
活性剤を単独で使用するか、あるいはカオトロピック剤
と併用させても良い。カオトロピック剤と併用しない場
合は、一般に細胞等から核酸抽出されるものであれば特
に限定されないが、特表平１１−５０１５０４号公報に
開示されているようなドデシル硫酸ナトリウムやアルキ
ル硫酸アルカリ金属塩あるいはサルコシンが望ましい。
しかしながら、カオトロピック剤と併用する場合、前者
２つの界面活性剤は不溶化するために用いることができ
ない。トリトン系界面活性剤、及びツイーン系界面活性
剤などの非イオン性界面活性剤、Ｎ−ラウロイルサルコ
シン酸ナトリウムなどの陰イオン性界面活性剤であれば
特に限定されない。本発明においては、特にＲＮＡ分解
酵素活性が高い試料において、カオトロピック剤との併
用で０．０１〜２．０％の陰イオン性界面活性剤を使用
することが好ましい。
【００１５】本発明において、特にカオトロピック剤を
含有する溶解液で試料を溶解した場合、溶液の粘性が非
常に高まり、担体あるいはオリゴｄＴへの特異的な結合
を妨げてしまう。そのため、ｐＨが５〜１０のＴｒｉｓ
−塩酸緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液、Ｈｅｐｅｓ
−ＮａＯＨ、クエン酸ナトリウム緩衝液等の緩衝液、特
に０〜２００ｍＭのリチウム塩もしくはナトリウム塩が
含まれるこれらの緩衝液を２倍量程度加えて希釈し、粘
性を下げることが好ましい。さらに、溶解された試料を
２０〜２５Ｇの注射針を装着したシリンジに繰り返し通
すことで、ゲノムＤＮＡを切断して粘性を下げてもよ
い。
含有する溶解液で試料を溶解した場合、溶液の粘性が非
常に高まり、担体あるいはオリゴｄＴへの特異的な結合
を妨げてしまう。そのため、ｐＨが５〜１０のＴｒｉｓ
−塩酸緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液、Ｈｅｐｅｓ
−ＮａＯＨ、クエン酸ナトリウム緩衝液等の緩衝液、特
に０〜２００ｍＭのリチウム塩もしくはナトリウム塩が
含まれるこれらの緩衝液を２倍量程度加えて希釈し、粘
性を下げることが好ましい。さらに、溶解された試料を
２０〜２５Ｇの注射針を装着したシリンジに繰り返し通
すことで、ゲノムＤＮＡを切断して粘性を下げてもよ
い。
【００１６】本発明で使用するオリゴｄＴが共有結合も
しくは非共有結合で固定化された担体とは、ポリＡ+Ｒ
ＮＡの３’末端ポリアデニル化領域（ポリＡテール）に
実質的に相補的な配列を固定化したものである。また、
本発明において使用する担体に特異的に結合可能な官能
基を有するオリゴｄＴとは、ポリＡ+ＲＮＡのポリＡテ
ールに実質的に相補的な約２０〜５０塩基からなる配列
で担体に特異的に結合可能な官能基が付加されたもので
あり、担体との組み合わせにおいて具体的にはビオチン
付加オリゴｄＴとストレプトアビジン付加担体、ジゴキ
シゲニン付加オリゴｄＴと抗ジゴキシゲニン抗体付加担
体などが挙げられる。これら担体の形態としては、粒
子、フィルター、及び反応器具等が具体的挙げられるが
特に限定はされない。これらのうち、吸着と溶出の効率
を考慮すると粒子の形態のものが好ましい。さらには、
磁性シリカ粒子を用いるのがより好ましい。
しくは非共有結合で固定化された担体とは、ポリＡ+Ｒ
ＮＡの３’末端ポリアデニル化領域（ポリＡテール）に
実質的に相補的な配列を固定化したものである。また、
本発明において使用する担体に特異的に結合可能な官能
基を有するオリゴｄＴとは、ポリＡ+ＲＮＡのポリＡテ
ールに実質的に相補的な約２０〜５０塩基からなる配列
で担体に特異的に結合可能な官能基が付加されたもので
あり、担体との組み合わせにおいて具体的にはビオチン
付加オリゴｄＴとストレプトアビジン付加担体、ジゴキ
シゲニン付加オリゴｄＴと抗ジゴキシゲニン抗体付加担
体などが挙げられる。これら担体の形態としては、粒
子、フィルター、及び反応器具等が具体的挙げられるが
特に限定はされない。これらのうち、吸着と溶出の効率
を考慮すると粒子の形態のものが好ましい。さらには、
磁性シリカ粒子を用いるのがより好ましい。
【００１７】上記工程により得られた担体−ポリＡ+Ｒ
ＮＡ複合体を液相より分離する工程では、例えば、遠心
分離及び上清の除去、又は担体として磁性粒子を使用す
る場合は磁界を利用して液相から担体−ポリＡ+ＲＮＡ
複合体を分離するのが好ましい。また、フィルター及び
反応容器等の場合は、液を排出もしくは除去するのみで
もよい。
ＮＡ複合体を液相より分離する工程では、例えば、遠心
分離及び上清の除去、又は担体として磁性粒子を使用す
る場合は磁界を利用して液相から担体−ポリＡ+ＲＮＡ
複合体を分離するのが好ましい。また、フィルター及び
反応容器等の場合は、液を排出もしくは除去するのみで
もよい。
【００１８】上記工程により得られた担体−ポリＡ+Ｒ
ＮＡを洗浄する工程において、該複合体を適当な洗浄液
により、例えばボルテックスミキサーなどを用いて懸濁
し、再び液相より分離し、上清を除去するのが好まし
い。該複合体の分離は、遠心分離、濾過およびカラム操
作が好ましく、さらに磁性粒子を使用すれば、磁石等を
用いた簡便な磁気分離法が可能となるのでより好適であ
る。
ＮＡを洗浄する工程において、該複合体を適当な洗浄液
により、例えばボルテックスミキサーなどを用いて懸濁
し、再び液相より分離し、上清を除去するのが好まし
い。該複合体の分離は、遠心分離、濾過およびカラム操
作が好ましく、さらに磁性粒子を使用すれば、磁石等を
用いた簡便な磁気分離法が可能となるのでより好適であ
る。
【００１９】本発明においてしようする洗浄液は、ポリ
Ａ+ＲＮＡとオリゴｄＴの特異的な結合を解離させない
程度の低濃度の塩を含むｐＨが５〜１０の例えばＴｒｉ
ｓ−塩酸緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液、Ｈｅｐｅ
ｓ−ＮａＯＨ、クエン酸ナトリウム緩衝液等の緩衝液で
あり、オリゴｄＴの塩基数にも依存するが、２５〜１０
０ｍＭのリチウム塩またはナトリウム塩を含むのがより
好ましい。塩濃度が高いと担体に非特異的に吸着してい
るｒＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ等を十分に除けず、純度の高
いポリＡ+ＲＮＡを得ることができない。また、カオト
ロピック剤、界面活性剤等を含んでいてもよいが、後に
ＤＮａｓｅ等の酵素反応を行う場合には、さらに界面活
性剤、カオトロピック剤を含まない低塩濃度の緩衝液に
て洗浄することが必要である。
Ａ+ＲＮＡとオリゴｄＴの特異的な結合を解離させない
程度の低濃度の塩を含むｐＨが５〜１０の例えばＴｒｉ
ｓ−塩酸緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液、Ｈｅｐｅ
ｓ−ＮａＯＨ、クエン酸ナトリウム緩衝液等の緩衝液で
あり、オリゴｄＴの塩基数にも依存するが、２５〜１０
０ｍＭのリチウム塩またはナトリウム塩を含むのがより
好ましい。塩濃度が高いと担体に非特異的に吸着してい
るｒＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ等を十分に除けず、純度の高
いポリＡ+ＲＮＡを得ることができない。また、カオト
ロピック剤、界面活性剤等を含んでいてもよいが、後に
ＤＮａｓｅ等の酵素反応を行う場合には、さらに界面活
性剤、カオトロピック剤を含まない低塩濃度の緩衝液に
て洗浄することが必要である。
【００２０】核酸の溶出工程においては、ポリＡ+ＲＮ
Ａを担体に固定化されたオリゴｄＴより解離させる。こ
の場合に用いられる溶出液としては、オリゴｄＴからの
核酸の溶離を促進するものであれば特に限定されない。
具体的には、ＲＮＡ分解酵素の混入がない水、トリス緩
衝液 [１０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．０〜８．０]が
好ましい。また、加熱により解離を促進させてもよい。
加熱温度はオリゴｄＴの塩基数にもよるが、ポリＡ+Ｒ
ＮＡに悪影響を及ぼさない程度の条件であれば特に限定
されないが、具体的には６０〜６５℃が好ましい。
Ａを担体に固定化されたオリゴｄＴより解離させる。こ
の場合に用いられる溶出液としては、オリゴｄＴからの
核酸の溶離を促進するものであれば特に限定されない。
具体的には、ＲＮＡ分解酵素の混入がない水、トリス緩
衝液 [１０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．０〜８．０]が
好ましい。また、加熱により解離を促進させてもよい。
加熱温度はオリゴｄＴの塩基数にもよるが、ポリＡ+Ｒ
ＮＡに悪影響を及ぼさない程度の条件であれば特に限定
されないが、具体的には６０〜６５℃が好ましい。
【００２１】本発明においては、上記工程にて得られた
ポリＡ+ＲＮＡ溶液に混入するＤＮＡをＤＮａｓｅによ
り処理する。本発明で用いるＤＮａｓｅとしては、ＤＮ
ａｓｅＩ、エキソヌクレアーゼIII，ＡＴＰ依存型デオ
キシリボヌクレアーゼ、MungBeanヌクレアーゼ、Ｓ１ヌ
クレアーゼ等が挙げられるが、特に限定はされない。本
発明においては、ＲＮａｓｅの混入のないＤＮａｓｅＩ
が好ましい。さらに、ＤＮａｓｅがＲＮＡに作用しない
ように過剰量の酵素を加えない、氷上などの低温で酵素
反応を行うことの他、ＤＮａｓｅ中のＲＮａｓｅの混入
が懸念されるため、ＲＮａｓｅ阻害剤を共存させること
が望ましい。該ＲＮａｓｅ阻害剤としては、ヒトあるい
はブタ胎盤由来のＲＮａｓｅ Inhibitor等が挙げられる
が、特に限定されない。
ポリＡ+ＲＮＡ溶液に混入するＤＮＡをＤＮａｓｅによ
り処理する。本発明で用いるＤＮａｓｅとしては、ＤＮ
ａｓｅＩ、エキソヌクレアーゼIII，ＡＴＰ依存型デオ
キシリボヌクレアーゼ、MungBeanヌクレアーゼ、Ｓ１ヌ
クレアーゼ等が挙げられるが、特に限定はされない。本
発明においては、ＲＮａｓｅの混入のないＤＮａｓｅＩ
が好ましい。さらに、ＤＮａｓｅがＲＮＡに作用しない
ように過剰量の酵素を加えない、氷上などの低温で酵素
反応を行うことの他、ＤＮａｓｅ中のＲＮａｓｅの混入
が懸念されるため、ＲＮａｓｅ阻害剤を共存させること
が望ましい。該ＲＮａｓｅ阻害剤としては、ヒトあるい
はブタ胎盤由来のＲＮａｓｅ Inhibitor等が挙げられる
が、特に限定されない。
【００２２】本発明においては、上記処理液をタンパク
質変性剤を含む溶液と混合し、必要に応じて緩衝液を添
加し、ポリＡ+ＲＮＡをオリゴｄＴが共有結合もしくは
非共有結合により固定化された担体に特異的に吸着させ
るか、又はポリＡ+ＲＮＡを担体に特異的に結合可能な
官能基を有するオリゴｄＴに結合させ、さらに該官能基
に特異的に結合可能な部分を有する担体に結合させる。
続いて、担体−ポリＡ +ＲＮＡ複合体を液相より分離
し、必要に応じて該複合体を洗浄し、ポリＡ+ＲＮＡを
該複合体から解離させる。
質変性剤を含む溶液と混合し、必要に応じて緩衝液を添
加し、ポリＡ+ＲＮＡをオリゴｄＴが共有結合もしくは
非共有結合により固定化された担体に特異的に吸着させ
るか、又はポリＡ+ＲＮＡを担体に特異的に結合可能な
官能基を有するオリゴｄＴに結合させ、さらに該官能基
に特異的に結合可能な部分を有する担体に結合させる。
続いて、担体−ポリＡ +ＲＮＡ複合体を液相より分離
し、必要に応じて該複合体を洗浄し、ポリＡ+ＲＮＡを
該複合体から解離させる。
【００２３】一般にＲＮＡ溶液をＤＮａｓｅで処理した
場合、ＤＮａｓｅを変性失活・除去するために有害なフ
ェノールとクロロホルムの混合液を用いて抽出操作を行
うため危険である。本発明においては、処理液をタンパ
ク質変性剤を含む溶液と混合し、ＤＮａｓｅを変性さ
せ、かつポリＡ+ＲＮＡを吸着分離することにより、Ｄ
Ｎａｓｅが除去されるため、有害な有機溶媒を使う必要
がない。また、このポリＡ+ＲＮＡの吸着分離の操作に
より同時に混入したｒＲＮＡも除去されるため、さらに
純度の高いポリＡ+ＲＮＡを得ることができる。ＤＮａ
ｓｅ処理後に使用するタンパク質変性剤を含む溶液、緩
衝液、オリゴｄＴ固定化担体または担体に特異的に結合
可能な官能基を有するオリゴｄＴとその担体、洗浄液、
溶出液等は、先の工程において用いたものと異なるもの
を使用してもよいが、作業効率等を考慮すれば特に異な
るものを使用する必要はなく、同じものを使用すること
が好ましい。
場合、ＤＮａｓｅを変性失活・除去するために有害なフ
ェノールとクロロホルムの混合液を用いて抽出操作を行
うため危険である。本発明においては、処理液をタンパ
ク質変性剤を含む溶液と混合し、ＤＮａｓｅを変性さ
せ、かつポリＡ+ＲＮＡを吸着分離することにより、Ｄ
Ｎａｓｅが除去されるため、有害な有機溶媒を使う必要
がない。また、このポリＡ+ＲＮＡの吸着分離の操作に
より同時に混入したｒＲＮＡも除去されるため、さらに
純度の高いポリＡ+ＲＮＡを得ることができる。ＤＮａ
ｓｅ処理後に使用するタンパク質変性剤を含む溶液、緩
衝液、オリゴｄＴ固定化担体または担体に特異的に結合
可能な官能基を有するオリゴｄＴとその担体、洗浄液、
溶出液等は、先の工程において用いたものと異なるもの
を使用してもよいが、作業効率等を考慮すれば特に異な
るものを使用する必要はなく、同じものを使用すること
が好ましい。
【００２４】本発明によるポリＡ+ＲＮＡの精製方法
は、危険な溶媒等を使用することなく、簡便な操作で極
めて高純度なポリＡ+ＲＮＡを生体成分より分離するこ
とが可能であるため、ポリＡ+ＲＮＡの精製キットや、
固相の分離操作や試薬の分注を自動化した核酸抽出装置
への応用が可能であることが明らかである。また、本発
明の方法により得られたポリＡ+ＲＮＡは、ノザンブロ
ット解析、ＲＴ−ＰＣＲ解析、ｃＤＮＡライブラリーの
調製、ｃＤＮＡクローニングの鋳型などとして使用可能
であり、不純物の混入が少ないため、上述のような解析
操作の負担を軽減することができる。
は、危険な溶媒等を使用することなく、簡便な操作で極
めて高純度なポリＡ+ＲＮＡを生体成分より分離するこ
とが可能であるため、ポリＡ+ＲＮＡの精製キットや、
固相の分離操作や試薬の分注を自動化した核酸抽出装置
への応用が可能であることが明らかである。また、本発
明の方法により得られたポリＡ+ＲＮＡは、ノザンブロ
ット解析、ＲＴ−ＰＣＲ解析、ｃＤＮＡライブラリーの
調製、ｃＤＮＡクローニングの鋳型などとして使用可能
であり、不純物の混入が少ないため、上述のような解析
操作の負担を軽減することができる。
【００２５】本発明におけるポリＡ+ＲＮＡの精製方法
の一実施態様としては、次の工程を含むものである。 （ａ）核酸を含有する試料をタンパク質変性剤を含む溶
液により溶解する工程、（ｂ）ポリＡ+ＲＮＡをオリゴ
ｄＴが共有結合もしくは非共有結合により固定化された
担体に特異的に吸着させるか、又はポリＡ+ＲＮＡを担
体に特異的に結合可能な官能基を有するオリゴｄＴに結
合させ、さらに該官能基に特異的に結合可能な部分を有
する担体に結合させる工程、（ｃ）担体−ポリＡ+ＲＮ
Ａ複合体を液相より分離する工程、（ｄ）該複合体を洗
浄する工程、（ｅ）ポリＡ+ＲＮＡを該複合体から解離
させる工程、（ｆ）該ポリＡ+ＲＮＡ溶液に混入するＤ
ＮＡをＤＮａｓｅで処理する工程、（ｇ）該ＤＮａｓｅ
処理液をタンパク質変性剤を含む溶液と混合する工程、
（ｈ）ポリＡ+ＲＮＡをオリゴｄＴが共有結合もしくは
非共有結合により固定化された担体に特異的に吸着させ
るか、又はポリＡ+ＲＮＡを担体に特異的に結合可能な
官能基を有するオリゴｄＴに結合させ、さらに該官能基
に特異的に結合可能な部分を有する担体に結合させる工
程、（ｉ）担体−ポリＡ+ＲＮＡ複合体を液相より分離
する工程、（ｊ）該複合体を洗浄する工程、（ｋ）ポリ
Ａ+ＲＮＡを該複合体から解離させる工程工程（ｂ）及
び／又は工程（ｈ）を行う前に、緩衝液の添加を行うこ
とがより好ましい。
の一実施態様としては、次の工程を含むものである。 （ａ）核酸を含有する試料をタンパク質変性剤を含む溶
液により溶解する工程、（ｂ）ポリＡ+ＲＮＡをオリゴ
ｄＴが共有結合もしくは非共有結合により固定化された
担体に特異的に吸着させるか、又はポリＡ+ＲＮＡを担
体に特異的に結合可能な官能基を有するオリゴｄＴに結
合させ、さらに該官能基に特異的に結合可能な部分を有
する担体に結合させる工程、（ｃ）担体−ポリＡ+ＲＮ
Ａ複合体を液相より分離する工程、（ｄ）該複合体を洗
浄する工程、（ｅ）ポリＡ+ＲＮＡを該複合体から解離
させる工程、（ｆ）該ポリＡ+ＲＮＡ溶液に混入するＤ
ＮＡをＤＮａｓｅで処理する工程、（ｇ）該ＤＮａｓｅ
処理液をタンパク質変性剤を含む溶液と混合する工程、
（ｈ）ポリＡ+ＲＮＡをオリゴｄＴが共有結合もしくは
非共有結合により固定化された担体に特異的に吸着させ
るか、又はポリＡ+ＲＮＡを担体に特異的に結合可能な
官能基を有するオリゴｄＴに結合させ、さらに該官能基
に特異的に結合可能な部分を有する担体に結合させる工
程、（ｉ）担体−ポリＡ+ＲＮＡ複合体を液相より分離
する工程、（ｊ）該複合体を洗浄する工程、（ｋ）ポリ
Ａ+ＲＮＡを該複合体から解離させる工程工程（ｂ）及
び／又は工程（ｈ）を行う前に、緩衝液の添加を行うこ
とがより好ましい。
【００２６】また、本発明におけるポリＡ+ＲＮＡ精製
用試薬の一実施態様として、（ａ）タンパク質変性剤を
含有する溶解液、（ｂ）オリゴｄＴが共有結合もしくは
非共有結合により固定化された担体又は担体に特異的に
結合可能な官能基を有するオリゴｄＴ及び該官能基に特
異的に結合可能な部分を有する担体、（ｃ）洗浄液、
（ｄ）溶出液、及び（ｅ）ＤＮａｓｅを含むことを特徴
とする。さらに、（ｆ）ＲＮａｓｅ阻害剤及び／又は
（ｇ）溶解工程後に添加する緩衝液を含むことがより好
ましい。（ｃ）洗浄液が２５〜１００ｍＭのナトリウム
塩もしくはリチウム塩を含むことが好ましい。また、
（ｇ）溶解工程後に添加する緩衝液が２００ｍＭ以下の
ナトリウム塩もしくはリチウム塩を含むことが好まし
い。
用試薬の一実施態様として、（ａ）タンパク質変性剤を
含有する溶解液、（ｂ）オリゴｄＴが共有結合もしくは
非共有結合により固定化された担体又は担体に特異的に
結合可能な官能基を有するオリゴｄＴ及び該官能基に特
異的に結合可能な部分を有する担体、（ｃ）洗浄液、
（ｄ）溶出液、及び（ｅ）ＤＮａｓｅを含むことを特徴
とする。さらに、（ｆ）ＲＮａｓｅ阻害剤及び／又は
（ｇ）溶解工程後に添加する緩衝液を含むことがより好
ましい。（ｃ）洗浄液が２５〜１００ｍＭのナトリウム
塩もしくはリチウム塩を含むことが好ましい。また、
（ｇ）溶解工程後に添加する緩衝液が２００ｍＭ以下の
ナトリウム塩もしくはリチウム塩を含むことが好まし
い。
【００２７】
【実施例】以下に、本発明の実施例を例示することによ
って、本発明の効果をより一層明確なものとする。
って、本発明の効果をより一層明確なものとする。
【００２８】実施例１ 培養細胞からのポリＡ+ＲＮＡ
の精製 （１）ポリＡ+ＲＮＡの精製 培養されたＨｅＬａＳ３細胞５×１０6cellに４００μ
ｌの溶解液 [４Ｍグアニジンチオシアン酸塩、０．５％
ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、０．１Ｍトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、５ｍＭジチオトレイトー
ル] を加え、よく溶解した。次に８００μｌの緩衝液
[０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２００
ｍＭ塩化リチウム、２０ｍＭ ＥＤＴＡ] と混合し、２
５Ｇ注射針を装着したシリンジに約１０回通し、粘性を
低下させた。新しいマイクロチューブに１０ｍｇ／ｍｌ
のオリゴｄＴ固定化磁性粒子（Genovision社）を１２５
μｌ分取し、磁性スタンド（Magical Trapper；東洋紡
績製）に静置し、磁性粒子を回収し、上清を除去した。
この磁性粒子に上記試料溶液を加え、ボルテックスミキ
サーでよく懸濁した後、室温で１０分間放置した。
の精製 （１）ポリＡ+ＲＮＡの精製 培養されたＨｅＬａＳ３細胞５×１０6cellに４００μ
ｌの溶解液 [４Ｍグアニジンチオシアン酸塩、０．５％
ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、０．１Ｍトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、５ｍＭジチオトレイトー
ル] を加え、よく溶解した。次に８００μｌの緩衝液
[０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２００
ｍＭ塩化リチウム、２０ｍＭ ＥＤＴＡ] と混合し、２
５Ｇ注射針を装着したシリンジに約１０回通し、粘性を
低下させた。新しいマイクロチューブに１０ｍｇ／ｍｌ
のオリゴｄＴ固定化磁性粒子（Genovision社）を１２５
μｌ分取し、磁性スタンド（Magical Trapper；東洋紡
績製）に静置し、磁性粒子を回収し、上清を除去した。
この磁性粒子に上記試料溶液を加え、ボルテックスミキ
サーでよく懸濁した後、室温で１０分間放置した。
【００２９】次に、このマイクロチューブを磁性スタン
ドに静置し、磁性粒子を回収し、上清をピペットで除去
した。次に４条件の洗浄液 [１０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、７５、５０、２
５及び０ｍＭ塩化リチウム]を１ｍｌ加え、ボルテック
スミキサーでよく懸濁し、磁性粒子を回収し、上清を除
去した。この洗浄操作を３回繰り返し、上清を完全に除
去した。９０μｌのＲＮＡ分解酵素を含まない水を加
え、粒子を懸濁して、６５℃、２分間加熱後、再度磁性
スタンドに静置し、上清を回収した。この際、 回収液
より９μｌ抜き取り、１回精製サンプルとした。このポ
リＡ+ＲＮＡを含む回収液に１０×ＤＮａｓｅＩ Buffe
r [１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２
０ｍＭ塩化マグネシウム] を１０μｌ、１Ｕ／μｌに調
製したＤＮａｓｅＩ（宝酒造製）を１μｌ、１０Ｕ／μ
ｌに調製したＲＮａｓｅ Inhibitor（東洋紡績製）を１
μｌ加えて、氷上に１０分間放置してＤＮＡを処理し
た。この処理液にそのまま溶解液４００μｌを加えてよ
く混和した後、緩衝液で希釈した。
ドに静置し、磁性粒子を回収し、上清をピペットで除去
した。次に４条件の洗浄液 [１０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、７５、５０、２
５及び０ｍＭ塩化リチウム]を１ｍｌ加え、ボルテック
スミキサーでよく懸濁し、磁性粒子を回収し、上清を除
去した。この洗浄操作を３回繰り返し、上清を完全に除
去した。９０μｌのＲＮＡ分解酵素を含まない水を加
え、粒子を懸濁して、６５℃、２分間加熱後、再度磁性
スタンドに静置し、上清を回収した。この際、 回収液
より９μｌ抜き取り、１回精製サンプルとした。このポ
リＡ+ＲＮＡを含む回収液に１０×ＤＮａｓｅＩ Buffe
r [１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２
０ｍＭ塩化マグネシウム] を１０μｌ、１Ｕ／μｌに調
製したＤＮａｓｅＩ（宝酒造製）を１μｌ、１０Ｕ／μ
ｌに調製したＲＮａｓｅ Inhibitor（東洋紡績製）を１
μｌ加えて、氷上に１０分間放置してＤＮＡを処理し
た。この処理液にそのまま溶解液４００μｌを加えてよ
く混和した後、緩衝液で希釈した。
【００３０】新しいマイクロチューブに１０ｍｇ／ｍｌ
のオリゴｄＴ固定化磁性粒子を１２５μｌ分取して、磁
性スタンドに静置し、磁性粒子を回収し、上清を除去し
た。この磁性粒子に上記希釈済み溶液を加えて、ボルテ
ックスミキサーでよく懸濁した後、室温で１０分間放置
した。次に、このマイクロチューブを磁性スタンドに静
置し、磁性粒子を回収し、上清をピペットで除去した。
次に４条件の洗浄液を１ｍｌ加えて、ボルテックスミキ
サーでよく懸濁し、磁性粒子を回収し、上清を除去し
た。この洗浄操作を３回繰り返し、上清を完全に除去し
た。３０μｌのＲＮＡ分解酵素を含まない水を加え、粒
子を懸濁して、６５℃、２分間加熱後、再度磁性スタン
ドに静置し、上清を回収した。
のオリゴｄＴ固定化磁性粒子を１２５μｌ分取して、磁
性スタンドに静置し、磁性粒子を回収し、上清を除去し
た。この磁性粒子に上記希釈済み溶液を加えて、ボルテ
ックスミキサーでよく懸濁した後、室温で１０分間放置
した。次に、このマイクロチューブを磁性スタンドに静
置し、磁性粒子を回収し、上清をピペットで除去した。
次に４条件の洗浄液を１ｍｌ加えて、ボルテックスミキ
サーでよく懸濁し、磁性粒子を回収し、上清を除去し
た。この洗浄操作を３回繰り返し、上清を完全に除去し
た。３０μｌのＲＮＡ分解酵素を含まない水を加え、粒
子を懸濁して、６５℃、２分間加熱後、再度磁性スタン
ドに静置し、上清を回収した。
【００３１】（２）アガロース電気泳動によるポリＡ+
ＲＮＡの解析 本発明の方法により培養細胞から得られたポリＡ+ＲＮ
Ａ溶液３μｌ及び途中で分取した１回精製サンプル９μ
ｌをそれぞれ等量の色素液（０．２５％ブロモフェノー
ルブルー、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ホルムアミド）と混合
し、６５℃、１０分間加熱した後、１％アガロースゲル
に全量をスロットした。電気泳動装置はGelMate（東洋
紡績製）を用い、１×ＭＯＰＳ緩衝液（２０ｍＭ ＭＯ
ＰＳ、５ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で
１００Ｖ、４０分間泳動を行った。電気泳動終了後、ゲ
ルをエチジウムブロマイド溶液で３０分間浸せきし、水
道水にて軽く洗浄後、ＵＶ照射下で核酸の蛍光を撮影し
た。その結果を図１に示す。図１において、レーン１、
５は洗浄液中塩化リチウム濃度が７５ｍＭ、レーン２、
６は洗浄液中塩化リチウムが５０ｍＭ、レーン３、７は
洗浄液中塩化リチウムが２５ｍＭ、レーン４、８は洗浄
液中塩化リチウムが０ｍＭ、レーン１〜４は１回精製サ
ンプル、レーン５〜８は本発明の方法により得られたポ
リＡ+ＲＮＡの泳動パターンを示す。いずれの洗浄条件
においても１回の精製ではゲノムＤＮＡやｒＲＮＡの混
入が見られる。しかし、本発明のＤＮａｓｅＩ処理と再
精製を行うことで、特に洗浄液中の塩化リチウムを５０
ｍＭとした場合に高純度のポリＡ +ＲＮＡが得られた。
ＲＮＡの解析 本発明の方法により培養細胞から得られたポリＡ+ＲＮ
Ａ溶液３μｌ及び途中で分取した１回精製サンプル９μ
ｌをそれぞれ等量の色素液（０．２５％ブロモフェノー
ルブルー、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ホルムアミド）と混合
し、６５℃、１０分間加熱した後、１％アガロースゲル
に全量をスロットした。電気泳動装置はGelMate（東洋
紡績製）を用い、１×ＭＯＰＳ緩衝液（２０ｍＭ ＭＯ
ＰＳ、５ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で
１００Ｖ、４０分間泳動を行った。電気泳動終了後、ゲ
ルをエチジウムブロマイド溶液で３０分間浸せきし、水
道水にて軽く洗浄後、ＵＶ照射下で核酸の蛍光を撮影し
た。その結果を図１に示す。図１において、レーン１、
５は洗浄液中塩化リチウム濃度が７５ｍＭ、レーン２、
６は洗浄液中塩化リチウムが５０ｍＭ、レーン３、７は
洗浄液中塩化リチウムが２５ｍＭ、レーン４、８は洗浄
液中塩化リチウムが０ｍＭ、レーン１〜４は１回精製サ
ンプル、レーン５〜８は本発明の方法により得られたポ
リＡ+ＲＮＡの泳動パターンを示す。いずれの洗浄条件
においても１回の精製ではゲノムＤＮＡやｒＲＮＡの混
入が見られる。しかし、本発明のＤＮａｓｅＩ処理と再
精製を行うことで、特に洗浄液中の塩化リチウムを５０
ｍＭとした場合に高純度のポリＡ +ＲＮＡが得られた。
【００３２】
【発明の効果】上述したように、本発明により、様々な
生体材料から簡便でかつ高純度にポリＡ+ＲＮＡを精製
することが可能となった。この方法により得られたポリ
Ａ+ＲＮＡは、ノザンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲ解
析、ｃＤＮＡライブラリーの調製、ｃＤＮＡクローニン
グなどの鋳型として利用でき、かつ不純物の混入が少な
いため、上述したような解析操作の負担を大きく軽減す
ることが可能である。
生体材料から簡便でかつ高純度にポリＡ+ＲＮＡを精製
することが可能となった。この方法により得られたポリ
Ａ+ＲＮＡは、ノザンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲ解
析、ｃＤＮＡライブラリーの調製、ｃＤＮＡクローニン
グなどの鋳型として利用でき、かつ不純物の混入が少な
いため、上述したような解析操作の負担を大きく軽減す
ることが可能である。
【図１】本発明の方法により、培養細胞より精製された
ポリＡ+ＲＮＡの電気泳動による解析結果を示す。
ポリＡ+ＲＮＡの電気泳動による解析結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 川上 文清 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内 (72)発明者 川村 良久 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA11 HA11 HA19
Claims (14)
- 【請求項１】 以下の工程（ａ）〜（ｋ）を含んでなる
ことを特徴とするポリＡ+ＲＮＡの精製方法。 （ａ）核酸を含有する試料をタンパク質変性剤を含む溶
液により溶解する工程、（ｂ）ポリＡ+ＲＮＡをオリゴ
ｄＴが共有結合もしくは非共有結合により固定化された
担体に特異的に吸着させるか、又はポリＡ+ＲＮＡを担
体に特異的に結合可能な官能基を有するオリゴｄＴに結
合させ、さらに該官能基に特異的に結合可能な部分を有
する担体に結合させる工程、（ｃ）担体−ポリＡ+ＲＮ
Ａ複合体を液相より分離する工程、（ｄ）該複合体を洗
浄する工程、（ｅ）ポリＡ+ＲＮＡを該複合体から解離
させる工程、（ｆ）該ポリＡ+ＲＮＡ溶液に混入するＤ
ＮＡをＤＮａｓｅで処理する工程、（ｇ）該ＤＮａｓｅ
処理液をタンパク質変性剤を含む溶液と混合する工程、
（ｈ）ポリＡ+ＲＮＡをオリゴｄＴが共有結合もしくは
非共有結合により固定化された担体に特異的に吸着させ
るか、又はポリＡ+ＲＮＡを担体に特異的に結合可能な
官能基を有するオリゴｄＴに結合させ、さらに該官能基
に特異的に結合可能な部分を有する担体に結合させる工
程、（ｉ）担体−ポリＡ+ＲＮＡ複合体を液相より分離
する工程、（ｊ）該複合体を洗浄する工程、（ｋ）ポリ
Ａ+ＲＮＡを該複合体から解離させる工程 - 【請求項２】 工程（ｂ）及び／又は工程（ｈ）を行う
前に、緩衝液の添加を行う請求項１記載のポリＡ+ＲＮ
Ａの精製方法。 - 【請求項３】 タンパク質変性剤がカオトロピック剤及
び／又は界面活性剤である請求項１又は２に記載の方
法。 - 【請求項４】 カオトロピック剤がグアニジニウム塩、
尿素、ヨウ化物及び（イソ）チオシアン酸塩からなる群
より選択される少なくとも１種の化合物である請求項３
記載の方法。 - 【請求項５】 界面活性剤がラウリル硫酸ナトリウム、
アルキル硫酸アルカリ金属塩、Ｎ−ラウロイルサルコシ
ン、ノニデットＰ−４０、ポリエチレングリコールモノ
−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチ
レンソルビタンモノラウレートからなる群より選択され
る少なくとも１種の化合物である請求項３記載の方法。 - 【請求項６】 工程（ｂ）及び／又は工程（ｈ）を行う
前に用いられる緩衝液が２００ｍＭ以下のナトリウム塩
もしくはリチウム塩を含む請求項２記載の方法。 - 【請求項７】 洗浄液が２５〜１００ｍＭのナトリウム
塩もしくはリチウム塩を含む請求項１〜５のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項８】 ＤＮａｓｅにＲＮａｓｅ阻害剤を共存さ
せる請求項１〜６のいずれかに記載の方法。 - 【請求項９】 （ａ）タンパク質変性剤を含有する溶解
液、（ｂ）オリゴｄＴが共有結合もしくは非共有結合に
より固定化された担体又は担体に特異的に結合可能な官
能基を有するオリゴｄＴ及び該官能基に特異的に結合可
能な部分を有する担体、（ｃ）洗浄液、（ｄ）溶出液、
及び（ｅ）ＤＮａｓｅを含むことを特徴とするポリＡ+
ＲＮＡ精製用試薬。 - 【請求項１０】 （ｆ）ＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む
請求項９記載のポリＡ+ＲＮＡ精製用試薬。 - 【請求項１１】 （ｇ）溶解工程後に添加する緩衝液を
さらに含む請求項９記載のポリＡ+ＲＮＡ精製用試薬。 - 【請求項１２】 （ｆ）ＲＮａｓｅ阻害剤及び（ｇ）溶
解工程後に添加する緩衝液をさらに含む請求項９記載の
ポリＡ+ＲＮＡ精製用試薬。 - 【請求項１３】 （ｃ）洗浄液が２５〜１００ｍＭのナ
トリウム塩もしくはリチウム塩を含む請求項９〜１２の
いずれかに記載の試薬。 - 【請求項１４】 （ｇ）溶解工程後に添加する緩衝液が
２００ｍＭ以下のナトリウム塩もしくはリチウム塩を含
む請求項１１又は１２に記載の試薬。
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|---|---|---|---|
| JP2000116845A JP3922419B2 (ja) | 2000-04-18 | 2000-04-18 | 純度の高いポリａ＋ｒｎａの精製方法 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000116845A JP3922419B2 (ja) | 2000-04-18 | 2000-04-18 | 純度の高いポリａ＋ｒｎａの精製方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001299344A true JP2001299344A (ja) | 2001-10-30 |
| JP3922419B2 JP3922419B2 (ja) | 2007-05-30 |
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|---|---|---|---|
| JP2000116845A Expired - Fee Related JP3922419B2 (ja) | 2000-04-18 | 2000-04-18 | 純度の高いポリａ＋ｒｎａの精製方法 |
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| JP (1) | JP3922419B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005093052A1 (en) * | 2004-03-26 | 2005-10-06 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Method for selectively separating and purifying rna and method for separating and purifying nucleic acid |
| JP2005532824A (ja) * | 2002-05-10 | 2005-11-04 | ザユニバーシティー オブ マイアミ | 細胞および組織のｒｎａおよび形態の保存 |
| WO2007097119A1 (ja) * | 2006-02-21 | 2007-08-30 | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | ｍＲＮＡ捕捉用担体及びｍＲＮＡの精製方法 |
| JP2008531028A (ja) * | 2005-03-02 | 2008-08-14 | モルジム ゲーエムベーハー ウント コンパニー カーゲー | カオトロピック剤および／または界面活性剤の存在下で核酸を分解するためのヌクレアーゼの使用 |
-
2000
- 2000-04-18 JP JP2000116845A patent/JP3922419B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005532824A (ja) * | 2002-05-10 | 2005-11-04 | ザユニバーシティー オブ マイアミ | 細胞および組織のｒｎａおよび形態の保存 |
| WO2005093052A1 (en) * | 2004-03-26 | 2005-10-06 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Method for selectively separating and purifying rna and method for separating and purifying nucleic acid |
| US7824855B2 (en) | 2004-03-26 | 2010-11-02 | Fujifilm Corporation | Method for selectively separating and purifying RNA and method for separating and purifying nucleic acid |
| JP2008531028A (ja) * | 2005-03-02 | 2008-08-14 | モルジム ゲーエムベーハー ウント コンパニー カーゲー | カオトロピック剤および／または界面活性剤の存在下で核酸を分解するためのヌクレアーゼの使用 |
| WO2007097119A1 (ja) * | 2006-02-21 | 2007-08-30 | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | ｍＲＮＡ捕捉用担体及びｍＲＮＡの精製方法 |
| JP5262708B2 (ja) * | 2006-02-21 | 2013-08-14 | 住友ベークライト株式会社 | ｍＲＮＡ捕捉用担体及びｍＲＮＡの精製方法 |
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| Publication number | Publication date |
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| JP3922419B2 (ja) | 2007-05-30 |
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