JP2001278896A

JP2001278896A - ハタ類のウイルス性神経壊死症原因ウイルスの組換え外被タンパク質

Info

Publication number: JP2001278896A
Application number: JP2000086963A
Authority: JP
Inventors: Koichiro Mori; 広一郎森; Toshihiro Nakai; 敏博中井
Original assignee: FISHERIES AGENCY
Current assignee: FISHERIES AGENCY
Priority date: 2000-03-27
Filing date: 2000-03-27
Publication date: 2001-10-10

Abstract

(57)【要約】【解決手段】ハタ類のウイルス性神経壊死症原因ウイ
ルスの組換え外被タンパク質およびこれを含有するワク
チン。【効果】本発明によれば、魚類に病原性を有するウイ
ルス性神経壊死症原因ウイルスの4つの異なる遺伝子型
のウイルスうち、RGタイプについての組換え外被タンパ
ク質が得られた。さらに、本タンパク質はハタ類に感染
するRGタイプのウイルスに対する感染防止用ワクチンと
して有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ハタ類のウイルス
性神経壊死症の原因ウイルスの組換え外被タンパク質及
びこれを用いるワクチンに関する。

【０００２】

【従来の技術】現在我が国では、放流による資源の維持
あるいは回復を目的とした栽培漁業、あるいは水産物の
計画的かつ安定した生産供給が可能である養殖業などの
「つくり育てる漁業」の振興に力が注がれているが、病
害問題も深刻化しつつある。海産魚のウイルス性神経壊
死症(Viral nervous necrosis: VNN)は、イシダイで最
初に報告され、その後キジハタやシマアジなどでも発生
が確認され、多くの海産魚に大きな被害をもたらす疾病
となっている。また諸外国においてもVNNに類似した疾
病（encephalomyelitis，encephalopathyあるいはencep
halitisなど）がオーストラリア、タヒチやインドネシ
ア、フィリピン、マレーシアおよびシンガポールといっ
た東南アジア各国のバラマンディー、ノルウェーのター
ボット、ハリバット、フランスのスズキ、シンガポール
のヒトミハタ、およびタイのチャイロマルハタで報告さ
れている。本病は、主として仔稚魚期に発生し、外見的
には殆ど症状は認められないが、病魚は旋回、回転、横
転、転覆等の遊泳異常を示す。また組織学的には、中枢
神経系および網膜の神経細胞の壊死崩壊に伴う大型の空
胞形成を特徴としている。原因ウイルスは小型のssRNA
ウイルスで、ノダウイルス科に分類されている。

【０００３】この数種海産魚で報告されているVNNの感
染経路については不明な点が多く、適切な防除方法が確
立されていない。ただし、孵化直後に本病が発生するシ
マアジについては、親魚生殖腺から高率にウイルスが検
出さることから、親魚からの垂直感染が主要な感染経路
であることが明らかにされており、親魚生殖腺における
ウイルスの有無をポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase c
hain reaction:PCR）によって調べ、陰性親魚だけを産
卵に用いることによりVNNの発生率を低下させることに
成功している。このようにシマアジのVNNにおいては、
垂直感染が主要な感染経路であり、ウイルスフリーの親
魚から種苗を得る対策が有効と考えられる。

【０００４】しかし他魚種においては、稚魚や成魚にお
いても感染死亡があり、親魚からの垂直感染を遮断する
対策のみでは不十分と考えられる。特にハタ類では、海
面生け簀での育成課程で本病が発生していることから、
育成環境に混入したウイルスによる水平感染を遮断する
対策も必要不可欠と考えられる。またハタ類のVNN防除
については、ハタ類の魚価が高いこと、我が国のみなら
ず東南アジアでの被害も多発していることから、産業的
要望は非常に大きい。以上の様な背景から、ハタ類VNN
の水平感染を遮断する対策の開発が望まれていた。

【０００５】ところで、VNNの原因ウイルスには４つの
異なる遺伝子型が存在する。すなわち、シマアジに感染
するSJタイプ(SJNNV)、トラフグに感染するＴＰタイプ
(TPNNV)、マツカワに感染するBFタイプ(BFNNV)およびハ
タ類に感染するＲＧタイプ(RGNNV)が存在する。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ウイルス病のワクチン
による予防は、最小の費用で最大の効果が期待される理
想的なウイルス病対策である。ワクチンには、不活化ワ
クチン、弱毒生ワクチンおよび成分ワクチンなどがある
が、本疾病への応用を考えると安全性および大量調整が
可能であることから、遺伝子組換えによる成分ワクチン
の開発が適している。従って本発明は、ハタ類のVNNの
原因ウイルスであるウイルスの組換え外被タンパク質及
びこれを用いたワクチンを提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、RG
タイプのウイルスの遺伝子配列を解析し、クローニング
したウイルス外被タンパク質遺伝子を用いて大腸菌で組
換え外被タンパク質を発現させ、更に得られたタンパク
質がワクチンとして有用であることを確認し、本発明を
完成するに至った。すなわち、本発明は、ハタ類のVNN
原因ウイルスの組換え外被タンパク質を提供するもので
ある。また、本発明は、当該組換え外被タンパク質を含
有するハタ類のVNN用ワクチンを提供するものである。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明の組換え外被タンパク質
は、ハタ類のVNN原因ウイルス、すなわち、RGタイプの
神経壊死症ウイルス(RGNNV)がハタ類の細胞内で産生す
る外被タンパク質である。ここで、ハタ類には、キジハ
タ、マハタ、クエ等が含まれる。

【０００９】本発明の組換え外被タンパク質は、例えば
次の如くして作製できる。

【００１０】まず、RGタイプの基準種であるキジハタ由
来株のウイルス外被タンパク質遺伝子を決定する。その
結果、明らかになったウイルスの外被タンパク質遺伝子
リーディングフレームの両側に存在する配列を利用し、
RGタイプのウイルス外被タンパク質遺伝子がクローニン
グ可能なプライマーを設計する。ここで外被タンパク質
遺伝子の決定は、抽出したウイルスRNAにポリ(A)を付加
した後、クローニングベクターを調製し、次いでcDNAを
合成し、得られたcDNAクローンから組換えcDNAクローン
をスクリーニングした後、得られたクローンの塩基配列
を決定すればよい。判明した塩基配列からPCR用プライ
マーを常法に従い設定する。

【００１１】次いで、得られたPCR用プライマーを用い
て遺伝子の増幅を行い、全長の外被タンパク質遺伝子cD
NAのクローニングを行う。具体的には、作製したプライ
マーを用いPCRで増幅しcDNAの合成を行った後、発現用
プラスミドベクター、例えばpET-16b(Novagen)で組換え
体を作製し、タンパク質発現用の宿主細胞、例えば大腸
菌BL21(DE3)細胞に導入して行えばよい。なお、実際に
は、得られた組換え体（例えば大腸菌）について電気泳
動解析およびウエスタンブロット解析を行い、用いたす
べての株で、ウイルス外被タンパク質と同じ分子量のタ
ンパク質の発現を確認した。また、これらの組換えタン
パク質は、前述のシマアジに感染するSJタイプのウイル
スに対する抗体である抗SJNNVウサギ抗体と反応したこ
とから発現したウイルス外被タンパク質であることが確
認された。

【００１２】免疫抗原の調製のために、作製した組換え
体（例えば大腸菌）を大量培養し、発現誘導をおこなっ
た後、菌体を超音波処理によりを完全に破壊する。発現
した組み換え外被タンパク質は大腸菌中で高度凝集物で
ある封入体として不溶性画分に現れたことから、界面活
性剤中で遠心洗浄することで、容易に純度の高い組み換
え外被タンパク質の精製品を得ることができる。後述の
実施例では、大腸菌培養液1mLから約5mgの組換え外被タ
ンパク質を得ることができた。

【００１３】かくして得られる本発明の組換え外被タン
パク質としては、配列番号２記載のアミノ酸配列、又は
該アミノ酸配列に対して１個若しくは複数個のアミノ酸
が置換、欠失又は付加されているアミノ酸配列を有する
ものが挙げられる。かかる置換、欠失又は付加の程度
は、配列番号２記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
と同様のワクチン活性を有する範囲であれば特に制限さ
れない。

【００１４】本発明の組換え外被タンパク質を接種した
ハタ類は、その後RGNNVによるウイルス攻撃を行っても
非接種群に比べて有意に死亡率が低下することから、本
発明の組換え外被タンパク質はRGNNVに対するワクチン
として有用である。

【００１５】本発明組換え外被タンパク質をワクチンと
して投与できる対象魚としては、ハタ類であれば特に限
定されず、キジハタ、マハタ、クエ等が挙げられる。ま
た本発明ワクチンの投与形態は、注射剤が好ましく、そ
の形態は液剤でも、また用時溶解して投与する粉体状製
剤でもよい。これらの製剤を製造するに際しては、本発
明組換え外被タンパク質以外に、注射用蒸留水、安定化
剤、界面活性剤などを適宜添加することができる。

【００１６】本発明ワクチンの投与量は、特に制限され
ないが、本発明組換え外被タンパク質として１μg〜１m
g／尾が好ましい。また投与回数は２回〜５回が好まし
い。

【００１７】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００１８】実施例1 1. 外被タンパク質遺伝子クローニング用のPCRプライ
マーの設計 1）ウイルス核酸の調製ウイルス株は、RGタイプのウイルスとして、1991年のキ
ジハタ病魚（徳島株）を用いた。感染魚から、核酸抽出
液としてアイソジェン（ニッポンジーン）を用い附属の
プロトコールに従い核酸（RNA）を抽出し、ウイルスRNA
として以下の実験に供した。

【００１９】2）外被タンパク質遺伝子クローニング a）RNA 3'末端のポリ(A)鎖付加ウイルスRNAをポリ(A)ポリメラーゼ（宝酒造）とメーカ
ーが推奨する反応条件下で37℃、4時間反応させた後、
フェノール／クロロホルム抽出、Bio-spinカラム(Bio-R
ad)によるゲルろ過およびエタノール沈殿を行い適当な
濃度になるように２次蒸留水（DDW）に溶解した。

【００２０】b）クローニングベクタークローニングには、pBluescripts SK-(あるいはKS-)（S
tratagene）ベクターを用いクローニングに用いた。プ
ラスミドはクローニングに用いる制限酵素EcoRIの付属
反応用緩衝液中で希釈し、EcoRIの存在下で37℃、3時間
から一晩制限酵素処理した。さらに環状化あるいはプラ
スミド同士の結合を避けるため、この反応液中に牛小腸
由来アルカリホスファターゼ（宝酒造）を加え、50℃、
30分間反応させ脱リン酸化し、フェノール／クロロホル
ム抽出、およびガラスビーズ法（Geneclean kit;BIO 10
1 Inc.）でプラスミドを回収しTE緩衝液に溶解した。

【００２１】c）cDNAの合成とクローニング cDNAの合成とクローニングは、TimeSaver^TM cDNA Synth
esis kit（Pharmacia）を用い付属のプロトコールに従
い行った。クローニングベクターは、あらかじめEcoRI
で処理しアルカリホスファターゼで脱リン酸化したpBlu
escripts SK-（あるいはKS-）ベクターを用いcDNA断片
と組換え体を作製し大腸菌の形質転換に用いた。大腸菌
の形質転換の方法は、Hanahanの方法（Hanahan,D.(198
3):Studies on transformation of Escherichia coli w
ith plasmids,J.Mol.Biol.,166,557-580）により行っ
た。

【００２２】d）組換えcDNAクローンのスクリーニング組換え大腸菌クローンを、アンピシリン耐性遺伝子獲得
の有無、lacZ領域内のDNA挿入の有無およびプラスミドD
NAの制限酵素処理でスクリーニングした。最終的にはス
クリーニングで得られた挿入cDNA断片を標識しプローブ
としてノーザンブロット法により外被タンパク質遺伝子
（RNA2）との相補性の確認を行うか、一旦RNA2のcDNAク
ローンが得られてからはこれを標識し、プローブとして
サザンブロット法でクローンの相補性の確認を行った。

【００２３】3）外被タンパク質遺伝子cDNAクローンの
塩基配列の決定 RNA2のcDNAクローンの塩基配列決定のために、その全長
が長いものに関してはデリーションクローンを作製する
か、あるいは適当な制限酵素を用いサブクローニングを
行った。シークエンスプライマーは、プラスミドのクロ
ーニングサイトの両端にあるユニバーサルシークエンス
プライマーを用いた。塩基配列決定法は、蛍光標識プラ
イマーを用いた標識法およびTaq DNAポリメラーゼによ
る方法で、ジデオキシ法により行った。すなわち、PEG
沈澱で回収したプラスミドクローンを鋳型にし、Dye pr
imer thermal cycle sequence kit（ABI）およびT3/T7
dye primer（ABI）を用いて常法に従いシークエンシン
グ反応を行った。反応産物の電気泳動および塩基配列の
解読は自動シークエンサー（373A DNA シークエンサー;
ABI）を用いた。

【００２４】4）塩基配列データの解析とプライマー部
位の設定以上の方法で決定した塩基配列は、Genetyx（SDCソフト
ウエア開発）で配列の結合、翻訳領域の推定等の解析を
行ったのち、外被タンパク質遺伝子の両端に位置し、PC
Rプライマーとして適当な配列を検索した。その結果、
上流プライマーとしたプライマーNNV F-5（配列番号
３）は、RNA2の塩基番号17-33に一致する17塩基とNcoI
認識配列を付加するために設けた5'末端側の5'-GACTCC-
3'配列を合わせた23塩基を設定した。下流プライマーと
したプライマーNNV R-3（配列番号４）は、RNA2の塩基
番号1387-1403に相補的な17塩基とXhoI認識配列を付加
するために設けた5'末端側の5'-CAGCTCGA-3'配列を合わ
せた25塩基を設定した（表1及び図１）。

【００２５】

【表１】

【００２６】実施例2 1. 組み換え外被タンパク質の作製 1）ウイルス株ウイルス株は、クエのウイルス株として、1997年長崎
株、1998年大分a株、1998大分b株を、マハタのウイルス
株として1997年三重株を用いた。なお何れの株について
も予めPCR-RFLP法によりRGタイプであることを確認し
た。

【００２７】2)全長の外被タンパク質遺伝子cDNAのクロ
ーニングと組換え体大腸菌の作製 a）外被タンパク質遺伝子cDNAの合成外被タンパク質遺伝子cDNAは、前述の2種類のPCRプライ
マーを用い、PCRによりRNA2からオープンリーディング
フレームを含む領域を増幅したものを用いた。即ち、ウ
イルス核酸試料を90℃で5分間加熱後氷中で急冷し、10
μLの反応液中で42℃、30分間逆転写反応を行った後、9
9℃で10分間加熱した。この反応液に対し4倍容のPCR溶
液を加え、サーマルサイクラーGeneAmp PCR system9600
（PE Applied Bio systems）を用いて、95℃・2分間反
応後、95℃・40秒間、55℃・40秒間および72℃・40秒間
の一連の反応を30サイクル行った後、72℃・5分間反応
させPCR反応を行った。この際、プライマー濃度は0.2μ
mol/Lに設定し、逆転写酵素にはSuperScript IIRT（GIB
CO BRL）を40U、RNase阻害剤にはRNase Inhibiter（宝
酒造）を12.7U、PCR反応にはEXTaq DNAポリメラーゼ
（宝酒造）を2.5Uを反応系に加えた。なお反応は各酵素
附属の緩衝液中で行った。PCRにより得られた増幅産物
は、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈
澱により濃縮、1％アガロース（TAE緩衝液）ゲル電気泳
動後NaIとガラスビーズを用いた方法で目的のDNA断片を
回収した。回収したDNA断片を、NcoIおよびXhoIで切断
後、フェノール／クロロホルム抽出およびガラスビーズ
法で回収し、TE緩衝液に溶解してcDNA溶液とした。発現
用ベクターはpET-16b（Novagen）を用い、プロモーター
の下流の翻訳開始コドンが位置するNcoI認識部位をクロ
ーニング使用した。pET-16bベクターDNAはNcoIおよびXh
oIで切断後、CIAP（宝酒造）で50℃・30分間脱リン酸化
処理し、フェノール／クロロホルム抽出およびガラスビ
ーズ法で回収し、TE緩衝液に溶解した。ライゲーション
は、ライゲーションキット（宝酒造）のプロトコールに
従い、ベクターDNA溶液、cDNA溶液、ライゲーションA液
およびライゲーションB液を混合し、16℃で1晩反応させ
行った。組換えプラスミドは、まず大腸菌DH5αコンピ
テント細胞に導入してクローニングし、次にプラスミド
クローンを大腸菌DH5αと同様の方法で調製した発現用
の大腸菌BL21(DE3)のコンピテント細胞に導入した。形
質転換菌はLMA寒天培地で培養後、ディスラプション法
によるDNA断片挿入の有無の確認をするとともに、スモ
ールスケール法でプラスミドDNAを回収後、制限酵素処
理で解析しスクリーニングを行った（図１、配列番号１
及び配列番号２）。

【００２８】b）電気泳動およびウェスタンブロット法
による外被タンパク質の発現確認得られた組換え体大腸菌は、LMA寒天培地で1晩培養後、
その単一コロニーを50ng/mLのアンピシリンを含むLB培
地に接種し、37℃で対数増殖期前期（OD₆₆₀=0.6）まで
培養後、終濃度1mMになるようにイヒプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトシド（IPTG）を加え、さらに3時間培養
し組換えタンパク質の発現誘導を行った。発現の誘導を
行った菌体を遠心回収し、TE緩衝液に懸濁後1/3容の4×
クラッキングバッファーを混合した後、3 分間煮沸し泳
動サンプルとした。電気泳動には12.5％ポリアクリルア
ミドゲルを用い、解析には抗SJNNVウサギ血清を用い、
その検出にはアルカリフォスファターゼ標識ブタ抗体
（DAKO）と発色液にアルカリフォスファターゼ発色用緩
衝液にX-リン酸溶液、NBT溶液を添加したものを用い
た。

【００２９】電気泳動の結果、供試した4株のRGタイプ
ウイルスすべての株で、ウイルス外被タンパク質と同じ
大きさのタンパク質が発現が確認され（図２）、またこ
の組換えタンパク質はウエスタンブロットの結果、抗SJ
NNVウサギ抗体（Gyobyo Kenkyu,27(4),191-195）と反応
した（図３）ことから発現したウイルス外被タンパク質
であることが再確認された。作製した組換え大腸菌は、
クエ病魚のうち1997年長崎株から作製したものをKG-0
5、1998年大分a株から作製したものをKG-04、1998大分b
株から作製したものをKG-20とし、マハタ病魚の1995年
三重株から作製したものをSG-05とした。

【００３０】3）免疫抗原の調製作製した組換え体大腸菌を用い、上記と同様の操作で発
現誘導をおこなった後、遠心回収した菌体を溶菌用緩衝
液（50mM TrisHCl pH8.0,2mM EDTA,0.1％ TritonX-10
0）に懸濁した。得られた菌体を超音波処理によりを完
全に破壊した。発現した組み換え外被タンパク質は大腸
菌中で高度凝集物である封入体として不溶性画分に現れ
るたことから、遠心分離（12,000×g・15分間）により3
回遠心洗浄して得られた沈殿を組み換え外被タンパク質
の精製品とした。

【００３１】実施例3 1. マハタを用いた組み換え外被タンパク質によるワク
チン試験 1) 供試魚マハタ（試験1では平均全長11.4cm,平均体重28.1g，試
験2では平均全長11.8cm,平均体重26.7g）を各試験区に
つき20尾ずつ供試した。

【００３２】2) 免疫抗原の調製および免疫スケジュー
ル免疫抗原には、前述の組換え大腸菌SG-04から調製した
組み換え外被タンパク質を用いた。初回の接種は、組み
換え外被タンパク質の精製品をPBSで250μg/mLに希釈し
たものを、1尾当たりに200μLずつ筋肉内接種した。対
照区には発現用の大腸菌BL21(DE3）を同様に処理し回収
した不溶性画分をPBSで15μg/mLに希釈したものを、１
尾当たりに200μLずつ筋肉内接種した。二回目の接種も
同様に行った。免疫スケジュールは、初回の接種から10
日後に2回目の接種を行った。効果判定のためのウイル
ス攻撃試験は、初回の接種から20日後に行った。

【００３３】3）ウイルス攻撃試験 a)攻撃用ウイルス攻撃用ウイルスにはマハタ病魚（1995年，三重株）の磨
砕濾液を用いた。まず、病魚の頭部に等量のPBSを加え
磨砕後、1/4容のクロロホルムを添加し混合した。これ
を遠心分離（8,000×g・30分間）し上清を回収後、0.45
μmのフイルターで濾過し、1/2倍希釈ウイルス液として
使用まで冷蔵保存（-80℃）した。

【００３４】b）攻撃と観察攻撃試験は、試験1では10^-1、10^-2、10^-3倍希釈ウイル
ス液攻撃区の3区を設け、試験2では10^-2、10^-3倍希釈ウ
イルス液攻撃区の2区を設け、それぞれの希釈段階のウ
イルス液を1尾当たり200μL筋肉内注射した。攻撃から1
4日間、死亡個体数を観察した。

【００３５】4）ウイルス攻撃による有効性の確認発現させたウイルス外被タンパク質を接種し攻撃試験を
行った結果、２回の試験の死亡率はワクチン区で10〜65
％、対照区で65〜100％となり、いずれの濃度のウイル
ス液接種群でもワクチン区の死亡率は対照区より有意に
低かった（p＜0.01）。特に最低濃度のウイルス液接種
群では、有効率（ＲＰＳ）が88％および69％と高いワク
チン効果が得られた（図4、表2）。

【００３６】

【表２】

【００３７】

【発明の効果】本発明によれば、魚類に病原性を有する
ウイルス性神経壊死症原因ウイルスの4つの異なる遺伝
子型のウイルスうち、RGタイプについての組換え外被タ
ンパク質が得られた。さらに、本タンパク質はハタ類に
感染するRGタイプのウイルスに対する感染防止用ワクチ
ンとして有用である。

【００３８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 水産庁長官（Director-General of Fisheries Agency） <120> Recombinant coat proteins of nerrous necrosis viruses infecting gr oupen <130> P01381203 <160> 4 <210> 1 <211> 1403 <212> DNA <213> redspotted grouper nervous necrosis virus RGtype <400> 1 cgctttgcaa tcacaaatgg tacgcaaagg tgagaagaaa ttggcaaaac ccgcgaccac 60 caaggccgcg aatccgcaac cccgccggcg tgctaacaat cgtcggcgta gtaatcgcac 120 tgacgcacct gtagctaagg cctcgactgt nactggattt ggacgtggga ccaatgacgt 180 ccatctctca ggtatgtcga gaatctccca ggccgtnctc ccagccggga caggaacaga 240 cggatacgtt gttgttgacg caaccatcgt ccccgacctc ctgccacgac tgggacacgc 300 tgctagaatc ttccagcgat acgctgttga aacactggag tttgaaattc agccaatgtg 360 ccccgcaaac acgggcggtg gttacgttgc tggcttcctg cctgatccaa ctgacaacgt 420 tcacaccttc gacgngcttc aagcaactcg tggtgcagtc gttgccaaat ggtgggaaag 480 cagaacagtc cgacctcagt acaaccgcac gctcctctgg acctcgtcgg gaaaggagca 540 gcgtctcacg tcacctggtc ggntgatact cctgtgtgtt ggcaacaaca gngatgtggt 600 caacgtgtca gtcatgtgtc gctggagtgt tcgattaagc gttccatctc ttgagacacc 660 tgaagagacc accgctccca tcatgacaca aggttccctg tacaacgatt ccctttccac 720 aaatgacttc aagtccatcc tcctaggatc cacaccactg gacattgccc ctgatggagc 780 agtcttccag ctggaccgtc cgctgtccat tgactacagc cttggaactg gagatgttga 840 ccgtgctgtt tattggcaca tcaagaagtt tgctggaaat gctggcacac ctgcaggctg 900 gtttcgctgg ggcatctggg acaacttcaa caagacgttc acagatggcg ttgcctacta 960 ctctgatgag cagcctcgtc aaatcctgct gcctgttggc actgtcttca cccgtgttga 1020 ctcggaaaaa ctaaaccggg tcatncggtt ccctaantnc gtatcgntga tgaccaattt 1080 tgaacaattg attaaagcac taacaaatta taaataaaga aatacaaaca aacaaaactg 1140 aaattggaaa gaatagaagc gaaattgaat cactcgctag caaattaaac gacaaagcac 1200 ccaaggaggg tgcgattgct attgttggta cccttgacgg cgtaccgcta cgcttgaagg 1260 cctatacacg gctggaagcc gccgcgtgct taattgggtg ccagtggtac nagtcgtatc 1320 caacgccgag gaagtccctc tttgggctgt tgggttaccg ttactccgcg caatgagcac 1380 caccgccatg tggttaaatg gcc 1403

【００３９】 <210> 2 <211> 366 <212> PRT <213> redspotted grouper nervous necrosis virus <400> 2 Met Val Arg Lys Gly Glu Lys Lys Leu Ala Lys Pro Ala Thr Thr Lys 5 10 15 Ala Ala Asn Pro Gln Pro Arg Arg Arg Ala Asn Asn Arg Arg Arg Ser 20 25 30 Asn Arg Thr Asp Ala Pro Val Ala Lys Ala Ser Thr Xaa Thr Gly Phe 35 40 45 Gly Arg Gly Thr Asn Asp Val His Leu Ser Gly Met Ser Arg Ile Ser 50 55 60 Gln Ala Xaa Leu Pro Ala Gly Thr Gly Thr Asp Gly Tyr Val Val Val 65 70 75 80 Asp Ala Thr Ile Val Pro Asp Leu Leu Pro Arg Leu Gly His Ala Ala 85 90 95 Arg Ile Phe Gln Arg Tyr Ala Val Glu Thr Leu Glu Phe Glu Ile Gln 100 105 110 Pro Met Cys Pro Ala Asn Thr Gly Gly Gly Tyr Val Ala Gly Phe Leu 115 120 125 Pro Asp Pro Thr Asp Asn Val His Thr Phe Asp Xaa Leu Gln Ala Thr 130 135 140 Arg Gly Ala Val Val Ala Lys Trp Trp Glu Ser Arg Thr Val Arg Pro 145 150 155 160 Gln Tyr Asn Arg Thr Leu Leu Trp Thr Ser Ser Gly Lys Glu Gln Arg 165 170 175 Leu Thr Ser Pro Gly Arg Xaa Ile Leu Leu Cys Val Gly Asn Asn Xaa 180 185 190 Asp Val Val Asn Val Ser Val Met Cys Arg Trp Ser Val Arg Leu Ser 195 200 205 Val Pro Ser Leu Glu Thr Pro Glu Glu Thr Thr Ala Pro Ile Met Thr 210 215 220 Gln Gly Ser Leu Tyr Asn Asp Ser Leu Ser Thr Asn Asp Phe Lys Ser 225 230 235 240 Ile Leu Leu Gly Ser Thr Pro Leu Asp Ile Ala Pro Asp Gly Ala Val 245 250 255 Phe Gln Leu Asp Arg Pro Leu Ser Ile Asp Tyr Ser Leu Gly Thr Gly 260 265 270 Asp Val Asp Arg Ala Val Tyr Trp His Ile Lys Lys Phe Ala Gly Asn 275 280 285 Ala Gly Thr Pro Ala Gly Trp Phe Arg Trp Gly Ile Trp Asp Asn Phe 290 295 300 Asn Lys Thr Phe Thr Asp Gly Val Ala Tyr Tyr Ser Asp Glu Gln Pro 305 310 315 320 Arg Gln Ile Leu Leu Pro Val Gly Thr Val Phe Thr Arg Val Asp Ser 325 330 335 Glu Lys Leu Asn Arg Val Xaa Arg Phe Pro Xaa Xaa Val Ser Xaa Met 340 345 350 Thr Asn Phe Glu Gln Leu Ile Lys Ala Leu Thr Asn Tyr Lys 355 360 365

【００４０】 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed DNA based on RGNNV <400> 3 gactccatgg tacgcaaagg tga 23

【００４１】 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed DNA based on RGNNV <400> 4 cagctcgagg ccatttaacc acatg 25

【図面の簡単な説明】

【図１】RGタイプのウイルスの外被タンパク質遺伝子塩
基配列上に設計したプライマー結合部位を示す図であ
る。

【図２】大腸菌で発現させた組換えタンパク質の電気泳
動による解析像を示す図である［レーン１：純化SJNN
V，レーン２：組換えヒラメNNV外被タンパク質（岩手
株），レーン３：組換えクエNNV外被タンパク質（長崎
株），レーン４：組換えマハタNNV外被タンパク質（三
重株），レーン５：組換えクエNNV外被タンパク質（大
分ａ株），レーン６：組換えクエNNV外被タンパク質
（大分ｂ株）］。

【図３】大腸菌で発現させた組換えタンパク質のウエス
タンブロットによる解析像を示す図である（各レーンは
図２と同じ）

【図４】試験1の10^-3倍希釈ウイルス液攻撃区のワクチ
ン接種魚と非接種魚のウイルス攻撃試験時の死亡率の推
移を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ４Ｈ０４５Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＦターム(参考） 2B104 AA01 BA14 4B024 AA10 BA32 CA04 EA04 GA11 4B064 AG31 CA02 CA19 CC24 DA04 4B065 AA26X AA95Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA43 4C085 AA03 BA51 CC07 DD23 DD43 EE01 GG01 4H045 AA10 AA11 BA10 CA01 DA86 EA31 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ハタ類のウイルス性神経壊死症原因ウイ
ルスの組換え外被タンパク質。
【請求項２】配列番号２記載のアミノ酸配列、又は該
アミノ酸配列に対して１個若しくは複数個のアミノ酸配
列が置換、欠失又は付加されているアミノ酸配列を有す
るものである請求項１記載の組換え外被タンパク質。
【請求項３】請求項１又は２記載の組換え外被タンパ
ク質を含有するハタ類のウイルス性神経壊死症用ワクチ
ン。