JP2001174464A - 肝疾患を鑑別する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】バイオプシーなどの組織学的検査によらずに、
簡便に慢性肝炎と肝硬変の鑑別を行う方法を提供する。 【解決手段】試料をヒイロチャワンタケ・レクチンと反
応させ、次いでヒイロチャワンタケ・レクチンと結合し
ていないコリンエステラーゼを定量することにより、慢
性肝炎と肝硬変とを鑑別する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、コリンエステラー
ゼのうちヒイロチャワンタケ・レクチンに結合しないコ
リンエステラーゼの量を測定することにより、慢性肝炎
と肝硬変との鑑別をする方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】生体内には酵素学的性質、生理的機能お
よび体内分布を異にする２種類のコリンエステラーゼが
存在する。すなわち、一つはアセチルコリンエステラー
ゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．７）で、アセチルコリンを特
異的に分解し、赤血球・神経組織・筋肉などに多く存在
しその生理機能に関与して分布している。もう一つはコ
リンエステラーゼ（シュードコリンエステラーゼ）
（Ｅ．Ｃ．３．１．１．８）で、ベンゾイルコリン・ブ
チルコリンなどのアシルコリン類に作用し、血清・肝臓
に多く存在し、肝臓で生産され、その生理作用はおそら
く神経−筋肉系に関与しているのではないかと考えられ
ている。

【０００３】現在、臨床検査で頻繁に測定されるコリン
エステラーゼは血清内のコリンエステラーゼ（シュード
コリンエステラーゼ）である。本酵素は分子量約３２
万、同一の４つのサブユニットから成る糖タンパク質で
それぞれのサブユニットは５７４個のアミノ酸から成り
９つのアスパラギン結合糖鎖を持つ。臨床的には本酵素
の測定は肝疾患、特に慢性の肝実質障害、すなわち肝硬
変・慢性肝炎における肝実質の機能障害の程度を知る上
でその活性の低下が重要な意味を持つ。血清内コリンエ
ステラーゼは肝実質細胞で生産されるため、その低下は
肝細胞の慢性の機能低下を示す。この他に急性のコリン
エステラーゼ活性の低下は有機リン系農薬中毒の場合に
みられ、この場合の本酵素の活性測定は必要であり治療
にも関係してくる。また本酵素の活性の増加はネフロー
ゼ症候群で顕著に認められる。

【０００４】ヒイロチャワンタケ（Ａｌｅｕｒｉａ ａ
ｕｒａｎｔｉａ）・レクチンはヒイロチャワンタケから
調製された糖鎖を持たないタンパク質で、セリンとグリ
シンを多く含み、分子量は７２，０００で、３１，００
０のサブユニットを持ち、サブユニットあたり１つの糖
結合部位を有する。ヒイロチャワンタケ・レクチンは、
単糖ではＬ−フコースに対して親和性を持ち、またＬ−
フコースα１→２、Ｌ−フコースα１→３残基に対して
も結合性を有するが、Ｌ−フコースα１→６残基を有す
る糖鎖に対して特に強く結合する。

【０００５】オオクラらによれば、ヒイロチャワンタケ
・レクチンを固定化したアフィニティーカラムを用いた
クロマトグラフィーにより血清を処理し、カラムに保持
されたヒイロチャワンタケ・レクチン結合性コリンエス
テラーゼの酵素活性を測定し、もとの血清中に存在した
全コリンエステラーゼの酵素活性に対する割合を求めた
ところ、肝細胞癌と肝硬変の患者では慢性肝炎の患者と
健常人に比べその割合が優位に高いことが示された（Ｃ
ＡＮＣＥＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ、５４、５５〜６１、Ｊ
ａｎｕａｒｙ １、１９９４）。

【０００６】また、コリンエステラーゼに存在するヒイ
ロチャワンタケ・レクチン結合性糖鎖の量を、固定化し
た抗コリンエステラーゼ抗体と，標識したヒイロチャワ
ンタケ・レクチンを用いるサンドイッチ法で測定するこ
とで，慢性肝炎と肝硬変を鑑別する方法も報告されてい
る（コンドウら、Ｃｌｉｎｉｃａ ＣｈｉｍｉｃａＡｃ
ｔａ、２４３、１〜９、１９９５、特開平０８−２８５
８５３）。

【０００７】現在のところ、慢性肝炎と肝硬変の鑑別を
体外血清診断で行うための診断項目としては、コリンエ
ステラーゼ酵素活性、ヒアルロン酸、ＩＶ型コラーゲ
ン、ＰＩＩＩＰが実用化されているがいずれも十分な鑑
別性能を有していない。

【０００８】そのために現状では，肝硬変と慢性肝炎の
診断はバイオプシーあるいは手術により採取された肝組
織標本の組織学的検査でしかおこなえておらず患者に負
担の大きいものとなっている。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】従来行われてきたバイ
オプシーあるいは手術による肝組織標本の組織学的検査
による肝硬変と慢性肝炎の診断は患者に負担の大きいも
のであり、これを血清診断で行えれば非常に有意義なも
のとなる。

【００１０】オオクラらの論文に報告された、肝臓特異
的な蛋白質としてのコリンエステラーゼとヒイロチャワ
ンタケ・レクチン結合性糖鎖に着目した方法は非常に良
いものであるが、ヒイロチャワンタケ・レクチンを固定
化したアフィニティーカラムを用いたカラムクロマトグ
ラフィーで血清を処理し、カラムに保持されたヒイロチ
ャワンタケ・レクチン結合性コリンエステラーゼの酵素
活性を測定し、もとの血清中に存在した全コリンエステ
ラーゼの酵素活性に対する割合を求める方法は、カラム
を用いる吸着・溶出操作と、もとの血清中の酵素活性の
測定とカラムに保持された酵素活性の測定という２回の
測定が必要であり、操作工程が多く煩雑である。また肝
疾患の状態によっては血清中のコリンエステラーゼの絶
対量が著しく低下するために、カラムからの回収が不正
確になることもある。

【００１１】コリンエステラーゼに存在するヒイロチャ
ワンタケ・レクチン結合性糖鎖の量を、固定化した抗コ
リンエステラーゼ抗体と，標識したヒイロチャワンタケ
・レクチンを用いるサンドイッチ法で測定する方法で
は、慢性肝炎と肝硬変の鑑別効率を上げるためには、別の
方法で血清中の総コリンエステラーゼ量を測定するなど
して、ヒイロチャワンタケ・レクチン結合性糖鎖との量
比関係を求める必要がある（ハダら、Ｃｌｉｎｉｃａ
Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、２８１、３７〜４６、１９
９９）。

【００１２】一方、臨床検査で頻繁に行われるコリンエ
ステラーゼの酵素活性測定によれば、慢性の肝実質障
害、すなわち肝硬変・慢性肝炎における肝実質の機能障
害の程度を知ることができるが、その酵素活性の低下は
肝実質細胞の慢性的な機能低下を示すものであり、その
低下は連続的であるため慢性肝炎から肝硬変への移行を
示すものではない．そこでコリンエステラーゼ量あるい
は酵素活性の低下で示される肝実質細胞の慢性的な機能
低下と、慢性肝炎から肝硬変への移行を示すヒイロチャ
ワンタケ・レクチン結合性のコリンエステラーゼの増加
との両方の影響を反映する測定方法を考案すれば、慢性
肝疾患の進行状態の把握と、慢性肝炎と肝硬変の鑑別と
を同時に行うことができる。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の課題
に関し鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発
明は、ヒイロチャワンタケ・レクチンに結合しないコリ
ンエステラーゼを定量することを特徴とする、慢性肝炎
と肝硬変の鑑別方法である。以下、本発明を更に詳細に
説明する。

【００１４】本発明では、ヒイロチャワンタケ・レクチ
ンに結合しないコリンエステラーゼを定量するものであ
るが、ここでヒイロチャワンタケ・レクチンに結合しな
いコリンエステラーゼとは、ヒイロチャワンタケ・レク
チン結合性の糖鎖をもたないコリンエステラーゼであ
り、例えばＬ−フコースα１→６、Ｌ−フコースα１→
２またはＬ−フコースα１→３残基を持たないコリンエ
ステラーゼである。

【００１５】ヒイロチャワンタケ・レクチンに結合しな
いコリンエステラーゼの定量法については特に限定はな
いが、例えば試料をまずヒイロチャワンタケ・レクチン
と反応させ、次いでヒイロチャワンタケ・レクチンと結
合していないコリンエステラーゼを定量する方法が例示
できる。このとき、ヒイロチャワンタケ・レクチンとし
ては不溶性担体に固定化されているものを用い、これに
ヒイロチャワンタケ・レクチン結合性のコリンエステラ
ーゼを保持させ、保持されなかったコリンエステラーゼ
の定量を行うことが好ましく、これによりヒイロチャワ
ンタケ・レクチンと結合しないコリンエステラーゼを定
量することができる。

【００１６】ここで用いられるヒイロチャワンタケ・レ
クチンを固定化した不溶性担体に関しては、固定化の材
料および方法は、公知の方法を採用できる。

【００１７】例えば不溶性担体としては、ガラス、ポリ
エチレン、ポリ塩化ビニル、ラテックス、アガロース、
セルロース、メタアクリレート等を用いたビーズやゲル
若しくはマイクロプレート等が好ましく使用され、固定
化する方法としては架橋剤を用いた共有結合法や、疎水
結合などが好ましく使用される。また固定化したヒイロ
チャワンタケ・レクチンに結合しなかったコリンエステ
ラーゼの定量方法としては、コリンエステラーゼの基質
を用いてコリンエステラーゼの酵素活性を測定する方法
や、コリンエステラーゼに対する抗体を用いるイムノア
ッセイを使用することが出来る。

【００１８】しかしながら、ヒイロチャワンタケ・レク
チンを不溶性担体に固定する方法や手段、およびヒイロ
チャワンタケ・レクチン非結合性コリンエステラーゼの
定量方法や手段はなんら限定されるものではなく、公知
の方法や手段により行うことができる。

【００１９】このヒイロチャワンタケ・レクチンに結合
しないコリンエステラーゼの量によって、慢性肝疾患の
進行状態および慢性肝炎と肝硬変との鑑別を行うことが
できる。

【００２０】全体的な測定方法の流れとして一例を挙げ
れば、まずヒイロチャワンタケ・レクチンを不溶性担体
に固定したものを準備する。次に測定したい血清サンプ
ルを適当な緩衝液で希釈してから、ヒイロチャワンタケ
・レクチンを固定した担体と接触させヒイロチャワンタ
ケ・レクチン結合性成分を結合させる。ヒイロチャワン
タケ・レクチンに結合しなかったサンプル成分中のコリ
ンエステラーゼを定量する。定量されたヒイロチャワン
タケ・レクチン非結合性コリンエステラーゼの量から慢
性肝炎と肝硬変を鑑別する。

【００２１】

【実施例】以下、実施例により本発明を説明する。しか
し、本発明はこの実施例のみに限定されるものではな
い。

【００２２】（実施例１）慢性肝炎患者、肝硬変患者の
各１０検体の血清を測定した。まず血清を０.１５Ｍの
ＮａＣｌを含む０.１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．２）で１０分の１に希釈してサンプルとした。希釈
した血清サンプル１ｍｌを、予め０.１５ＭのＮａＣｌを
含む０.１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）１０
ｍｌを流して平衡化したヒイロチャワンタケ・レクチン
固定化アガロース（ホーネン社製品）をつめたカラム
（ベッド容量１ｍｌ）にアプライした。続いて０.１５
ＭのＮａＣｌを含む０.１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．２）を４ｍｌ流し、サンプルのアプライから数え
て、流出した緩衝液の最初から４ｍｌ分を集めて次のコ
リンエステラーゼの定量の工程にまわした。５ｍｌ目は
廃棄した。２０ｍＭフコースを含む０.１５ＭのＮａＣ
ｌを含む０.１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）
を４ｍｌ流して、カラムに結合保持されたヒイロチャワ
ンタケ・レクチン結合成分を溶出させカラムの再生を行
い、０.１５ＭのＮａＣｌを含む０.１Ｍ燐酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７．２）１０ｍｌを流して平衡化して次の
サンプルを同様に操作した。

【００２３】希釈した血清をアプライしてから０.１５
ＭのＮａＣｌを含む０.１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．２）を流して集めた４ｍｌ分をヒイロチャワンタ
ケ・レクチンに結合しなかった成分として、ここに存在
するヒイロチャワンタケ・レクチン非結合性コリンエス
テラーゼを定量した。

【００２４】コリンエステラーゼの定量はＣｌｉｎｉｃ
ａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、２４３、１〜９、１９
９５に示された方法に従ったＥＩＡを行った。すなわち
抗コリンエステラーゼモノクローナル抗体を固定した９
６ウエルプレートとアルカリフォスファターゼ標識した
もうひとつの抗コリンエステラーゼモノクローナル抗体
を用いるサンドイッチアッセイで、標準品で作製した検
量線を用いて、サンプル中のコリンエステラーゼ濃度を
定量した。

【００２５】定量したコリンエステラーゼの濃度に容量
４ｍｌを掛けてカラムから素通りしたヒイロチャワンタ
ケ・レクチン非結合性コリンエステラーゼの絶対量を算
出し、希釈する前の血清中の濃度に換算した。結果を表
１および図１に示した。

【００２６】

【表１】

【００２７】表１および図１で示すように、肝硬変患者
では血清中のヒイロチャワンタケ・レクチン非結合性コ
リンエステラーゼ濃度が慢性肝炎患者のそれに対して明
らかに低い値を示す。

【００２８】

【発明の効果】本発明の方法によれば、慢性肝疾患の進
行に伴う肝実質細胞の機能低下を示す血清中のコリンエ
ステラーゼ量の低下と、慢性肝炎から肝硬変に移行する
際のコリンエステラーゼに存在するヒイロチャワンタケ
・レクチン結合性糖鎖すなわちＬ−フコースα１→６、
Ｌ−フコースα１→２またはＬ−フコースα１→３残基
の増加との両方を反映した測定を行うことができる。さ
らにそのことにより従来行われてきたバイオプシーある
いは手術による肝組織標本の組織学的検査によることの
ない、患者の負担の少ない、血清診断による簡便な慢性
肝炎と肝硬変の鑑別法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で測定した患者血清中のヒイロチャワ
ンタケ・レクチン非結合性コリンエステラーゼ濃度と肝
疾患との相関を表す図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒイロチャワンタケ・レクチンに結合しな
   いコリンエステラーゼを定量することを特徴とする、慢
   性肝炎と肝硬変の鑑別方法。
2. 【請求項２】請求項１に記載の方法において、試料をヒ
   イロチャワンタケ・レクチンと反応させ、次いでヒイロ
   チャワンタケ・レクチンと結合していないコリンエステ
   ラーゼを定量することを特徴とする方法。