JP2001120278A - 変異型カナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ及びこれを用いた好熱菌のスクリーニング方法 - Google Patents
変異型カナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ及びこれを用いた好熱菌のスクリーニング方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 極端な pH で安定であり、容易に結晶化し、
取り扱いやすいゆえに、酵素の構造と機能の相関を研究
する良い研究材料として有用であるThermus thermophil
us等の好熱菌において好適な選択マーカーを得る。 【解決手段】 熱安定性を顕著に向上させた新規なカナ
マイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ及びこれを
利用した選択マーカー、並びに該選択マーカーを用いた
好熱菌のスクリーニング方法を提供する。
取り扱いやすいゆえに、酵素の構造と機能の相関を研究
する良い研究材料として有用であるThermus thermophil
us等の好熱菌において好適な選択マーカーを得る。 【解決手段】 熱安定性を顕著に向上させた新規なカナ
マイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ及びこれを
利用した選択マーカー、並びに該選択マーカーを用いた
好熱菌のスクリーニング方法を提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、熱安定性を顕著に
向上させた新規なカナマイシンヌクレオチジルトランス
フェラーゼ及びこれを利用した選択マーカー、並びに該
選択マーカーを用いたThermus thermophilus等の好熱菌
のスクリーニング方法に関する。
向上させた新規なカナマイシンヌクレオチジルトランス
フェラーゼ及びこれを利用した選択マーカー、並びに該
選択マーカーを用いたThermus thermophilus等の好熱菌
のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】好熱菌は、そのタンパク質のバイオテク
ノロジーへの可能性ゆえに多くの関心を集めてきた。そ
のタンパク質は、極端な pH で安定であり、非好熱性タ
ンパク質と比較して容易に結晶化し、取り扱いやすいゆ
えに、酵素の構造と機能の相関を研究する良い研究材料
として有用である。しかしながら、好熱性のタンパク質
は、大腸菌（Escherichia coli）中で発現したときに天
然のコンフォーメーションを再現しないことがある。こ
れらのタンパク質は、標準の遺伝子工学ツールが利用で
きないため、好熱菌中で高温では発現されない。このこ
とは、ゲノムプロジェクトから得られる配列データから
推測できない機能の遺伝子をノックアウトし、次いで再
導入することによりタンパク質の生物学的役割を調査す
る試みを阻害する。真正細菌（Eubacterium）であるThe
rmus thermophilus はその分子生物学が研究されている
生物の中で最高温度（５０−８２℃）で生育できる魅力
ある生物である。
ノロジーへの可能性ゆえに多くの関心を集めてきた。そ
のタンパク質は、極端な pH で安定であり、非好熱性タ
ンパク質と比較して容易に結晶化し、取り扱いやすいゆ
えに、酵素の構造と機能の相関を研究する良い研究材料
として有用である。しかしながら、好熱性のタンパク質
は、大腸菌（Escherichia coli）中で発現したときに天
然のコンフォーメーションを再現しないことがある。こ
れらのタンパク質は、標準の遺伝子工学ツールが利用で
きないため、好熱菌中で高温では発現されない。このこ
とは、ゲノムプロジェクトから得られる配列データから
推測できない機能の遺伝子をノックアウトし、次いで再
導入することによりタンパク質の生物学的役割を調査す
る試みを阻害する。真正細菌（Eubacterium）であるThe
rmus thermophilus はその分子生物学が研究されている
生物の中で最高温度（５０−８２℃）で生育できる魅力
ある生物である。
【０００３】高度好熱菌Thermus thermophilusの全ゲノ
ムの配列解析は現在進行中である。全ゲノム配列研究
は、日本（HB8株）およびドイツ（HB27株）でまもなく
完了する。ほかのゲノムプロジェクト同様、主な関心は
配列そのものからポスト配列研究である機能あるいは構
造ゲノミクスへ移行しつつある。T.thermophilusのタン
パク質の構造と生物学的機能を組織的に研究する計画が
ある。それゆえ、遺伝子工学的ツールの開発が可及的速
やかに必要である。もっとも必須なツールは、使用が容
易な選択マーカーである。
ムの配列解析は現在進行中である。全ゲノム配列研究
は、日本（HB8株）およびドイツ（HB27株）でまもなく
完了する。ほかのゲノムプロジェクト同様、主な関心は
配列そのものからポスト配列研究である機能あるいは構
造ゲノミクスへ移行しつつある。T.thermophilusのタン
パク質の構造と生物学的機能を組織的に研究する計画が
ある。それゆえ、遺伝子工学的ツールの開発が可及的速
やかに必要である。もっとも必須なツールは、使用が容
易な選択マーカーである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】これまで、T.thermoph
ilusにはただ2つの選択システムが利用可能であった。1
つのシステムは、栄養要求性の宿主が、それに相当する
遺伝子を組み込んだプラスミドにより選択される方法で
ある。しかし、栄養要求性のマーカーは、日常の使用に
は便利ではない。なぜならば、選択培地の調製が厄介な
ことと、栄養的に制限されたプレート上での細胞の成育
は、至適生育温度に於いてさえ遅いことによる。もう１
つのシステムは、60℃以下でのみ使えるカナマイシンヌ
クレオチジルトランスフェラーゼ（KNT）遺伝子を利用
することである。T.thermophilusは一般の抗生物質に感
受性があるが、T.thermophilus に使える唯一の抗生物
質耐性マーカーとして、黄色ブドウ球菌（Staphylococc
us aureus）KNTの変異型遺伝子がある。しかしながら、
この変異型KNTは、60℃以上で使えないので、選択マー
カーとして理想から程遠いものである。至適生育温度
（７０−７５℃）からはるかに下のこの温度では、細胞
成長は、非常に遅い。そこで、われわれは、KNTの熱安
定性の改善に着手した。
ilusにはただ2つの選択システムが利用可能であった。1
つのシステムは、栄養要求性の宿主が、それに相当する
遺伝子を組み込んだプラスミドにより選択される方法で
ある。しかし、栄養要求性のマーカーは、日常の使用に
は便利ではない。なぜならば、選択培地の調製が厄介な
ことと、栄養的に制限されたプレート上での細胞の成育
は、至適生育温度に於いてさえ遅いことによる。もう１
つのシステムは、60℃以下でのみ使えるカナマイシンヌ
クレオチジルトランスフェラーゼ（KNT）遺伝子を利用
することである。T.thermophilusは一般の抗生物質に感
受性があるが、T.thermophilus に使える唯一の抗生物
質耐性マーカーとして、黄色ブドウ球菌（Staphylococc
us aureus）KNTの変異型遺伝子がある。しかしながら、
この変異型KNTは、60℃以上で使えないので、選択マー
カーとして理想から程遠いものである。至適生育温度
（７０−７５℃）からはるかに下のこの温度では、細胞
成長は、非常に遅い。そこで、われわれは、KNTの熱安
定性の改善に着手した。
【０００５】
【課題を解決するための手段】タンパク質の熱安定性改
善を目的に多くの試みがなされた。ほとんどの試みは、
タンパク質のフォールディングや構造形成の理解に基づ
く合理的デザインである。たとえば、ジスルフィド結合
の導入や疎水性中心のパッキングの再配列やプロリンへ
の置換である。アミノ酸を置換して熱安定性が確保でき
るかどうか調べるために、好熱菌と非好熱菌の相同タン
パク質の配列が比較された。他方では、タンパク質の熱
安定性増加を目的に理性的でない方法が適用された。こ
れらの研究のほとんどは、突然変異誘発、選択、選択し
た変異体の増幅、のラウンドを繰り返す、すなわち定方
向進化の代わりに、ランダムな突然変異及びスクリーニ
ングを1回行うものであった。僅か２〜３件の研究に於
いて、定方向進化により成功裡に熱安定性が強化された
ことが報告されている。本発明者等は、T. thermophilu
sを生育温度の上限にむけた定方向進化（directed evo
lution）に基づく戦略を用い、カナマイシン耐性遺伝子
産物の温度安定性を生育温度の上限まで上げることに成
功した。結果として得られたKNTは、T.thermophilus等
の好熱菌の便利な選択マーカーとなる。
善を目的に多くの試みがなされた。ほとんどの試みは、
タンパク質のフォールディングや構造形成の理解に基づ
く合理的デザインである。たとえば、ジスルフィド結合
の導入や疎水性中心のパッキングの再配列やプロリンへ
の置換である。アミノ酸を置換して熱安定性が確保でき
るかどうか調べるために、好熱菌と非好熱菌の相同タン
パク質の配列が比較された。他方では、タンパク質の熱
安定性増加を目的に理性的でない方法が適用された。こ
れらの研究のほとんどは、突然変異誘発、選択、選択し
た変異体の増幅、のラウンドを繰り返す、すなわち定方
向進化の代わりに、ランダムな突然変異及びスクリーニ
ングを1回行うものであった。僅か２〜３件の研究に於
いて、定方向進化により成功裡に熱安定性が強化された
ことが報告されている。本発明者等は、T. thermophilu
sを生育温度の上限にむけた定方向進化（directed evo
lution）に基づく戦略を用い、カナマイシン耐性遺伝子
産物の温度安定性を生育温度の上限まで上げることに成
功した。結果として得られたKNTは、T.thermophilus等
の好熱菌の便利な選択マーカーとなる。
【０００６】すなわち本発明は、以下の（１）〜（９）
を提供するものである。 （１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタン
パク質に対して、Met57Leu、Ala62Val、Ser94Pro、Ser2
03Pro、Asp206Val、His207Gln、Ser220Pro、Ile234Va
l、及びThr238Alaからなる群から選択される１以上の点
突然変異を有し、かつ熱安定性の向上した変異型カナマ
イシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ。 （２）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなること
を特徴とする、熱安定性の向上した変異型カナマイシン
ヌクレオチジルトランスフェラーゼ。 （３）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなること
を特徴とする、上記（１）に記載の変異型カナマイシン
ヌクレオチジルトランスフェラーゼ。 （４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のカナマイ
シンヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするカ
ナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子。
を提供するものである。 （１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタン
パク質に対して、Met57Leu、Ala62Val、Ser94Pro、Ser2
03Pro、Asp206Val、His207Gln、Ser220Pro、Ile234Va
l、及びThr238Alaからなる群から選択される１以上の点
突然変異を有し、かつ熱安定性の向上した変異型カナマ
イシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ。 （２）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなること
を特徴とする、熱安定性の向上した変異型カナマイシン
ヌクレオチジルトランスフェラーゼ。 （３）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなること
を特徴とする、上記（１）に記載の変異型カナマイシン
ヌクレオチジルトランスフェラーゼ。 （４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のカナマイ
シンヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするカ
ナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子。
【０００７】（５）上記（４）に記載の遺伝子を含有す
るプラスミド。 （６）上記（５）に記載のプラスミドを含有する形質転
換体。 （７）上記（４）に記載の遺伝子であることを特徴とす
る、好熱菌のための選択マーカー。 （８）上記（７）に記載の選択マーカーを使用すること
を特徴とする、好熱菌のスクリーニング方法。 （９）好熱菌がThermus thermophilusであることを特徴
とする、上記（８）に記載のスクリーニング方法。
るプラスミド。 （６）上記（５）に記載のプラスミドを含有する形質転
換体。 （７）上記（４）に記載の遺伝子であることを特徴とす
る、好熱菌のための選択マーカー。 （８）上記（７）に記載の選択マーカーを使用すること
を特徴とする、好熱菌のスクリーニング方法。 （９）好熱菌がThermus thermophilusであることを特徴
とする、上記（８）に記載のスクリーニング方法。
【０００８】本発明において、最も熱安定な変異株は、
変異前のものと比較して１９個のアミノ酸が置換してい
た。熱安定性は、２０℃上昇したが、酵素活性自体に大
きな変化は見られなかった。ほとんどの変異残基は、タ
ンパク質分子の表面に存在し、面白いことに１９置換の
うち５個はプロリン残基への置換であった。進化したカ
ナマイシン耐性遺伝子産物は、T.thermophilusの生育至
適温度に於いて、選択マーカーとなりうる。このような
便利な遺伝子工学ツールの開発は、T.thermophilusのポ
スト配列研究を促進するものとなろう。
変異前のものと比較して１９個のアミノ酸が置換してい
た。熱安定性は、２０℃上昇したが、酵素活性自体に大
きな変化は見られなかった。ほとんどの変異残基は、タ
ンパク質分子の表面に存在し、面白いことに１９置換の
うち５個はプロリン残基への置換であった。進化したカ
ナマイシン耐性遺伝子産物は、T.thermophilusの生育至
適温度に於いて、選択マーカーとなりうる。このような
便利な遺伝子工学ツールの開発は、T.thermophilusのポ
スト配列研究を促進するものとなろう。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を説明
するが、本発明は記載した形態のみに限定されるもので
はなく、本明細書の記載及び当分野で公知の技術に基づ
いて当業者が容易に修飾及び改変し得る技術については
本発明の範囲内に含まれるものである。尚、本明細書に
おいて、定方向進化とは、変異導入、選択、選択した変
異体の増幅と、その変異体への更なる変異導入を繰り返
し行うことにより、目的とする機能を向上させる手法を
いう。また、本明細書において、アミノ酸置換に対する
記載、例えば「Met57Leu」は、野生型（本明細書におい
てはWT*）の５７位のMetがLeuに置換していることを意
味する。更に、本明細書において「熱安定性の向上し
た」とは、野生型の酵素タンパク質が変性し、酵素活性
が消失する高温条件下において、酵素活性が残存してい
るものをいう。
するが、本発明は記載した形態のみに限定されるもので
はなく、本明細書の記載及び当分野で公知の技術に基づ
いて当業者が容易に修飾及び改変し得る技術については
本発明の範囲内に含まれるものである。尚、本明細書に
おいて、定方向進化とは、変異導入、選択、選択した変
異体の増幅と、その変異体への更なる変異導入を繰り返
し行うことにより、目的とする機能を向上させる手法を
いう。また、本明細書において、アミノ酸置換に対する
記載、例えば「Met57Leu」は、野生型（本明細書におい
てはWT*）の５７位のMetがLeuに置換していることを意
味する。更に、本明細書において「熱安定性の向上し
た」とは、野生型の酵素タンパク質が変性し、酵素活性
が消失する高温条件下において、酵素活性が残存してい
るものをいう。
【００１０】培地 T.thermophilus細胞は、好ましくは0.4%トリプトン、0.
2%酵母抽出物、0.1%NaCl(pH7.5)を含有する液体培地中
で培養する。T.thermophilus形質転換株の選択には、50
μg/mlカナマイシンを含む３％寒天培地（70℃以下の場
合）、500μg/mlカナマイシンを含む1.5%ゲランガム培
地（gellan gum plate）(70℃以上の場合)を使用する。
ゲランガムを固化させるために、２価の陽イオンである
1. 5mMのCaCl2と1.5mMのMgCl2を加える。これらのイオ
ンはカナマイシンと拮抗するので、ゲランガム培地中の
カナマイシン濃度は高くする。
2%酵母抽出物、0.1%NaCl(pH7.5)を含有する液体培地中
で培養する。T.thermophilus形質転換株の選択には、50
μg/mlカナマイシンを含む３％寒天培地（70℃以下の場
合）、500μg/mlカナマイシンを含む1.5%ゲランガム培
地（gellan gum plate）(70℃以上の場合)を使用する。
ゲランガムを固化させるために、２価の陽イオンである
1. 5mMのCaCl2と1.5mMのMgCl2を加える。これらのイオ
ンはカナマイシンと拮抗するので、ゲランガム培地中の
カナマイシン濃度は高くする。
【００１１】プラスミドpJHK1の構築 黄色ブドウ球菌の野生型KNTの塩基配列及びアミノ酸配
列(配列番号１０及び１１)は、Nakanishi,Kら, J. Fe
rment. Technol. 54:801-807(1976)等から公知であ
り、これをコードするプラスミドとしてpUB110（3,000k
Da、Lacey, R.W.及びI.Chopra, J. Med. Microbio
l., 7:285-297(1974)）等がある。この野生型KNTに対
し、２個の置換（Asp80TyrとThr130Lys）を有する変異
体（WT*と称する、配列番号１）から定方向進化を開始
する。WT*KNT遺伝子は、２つのプライマー（5'-プライ
マー、5'-GACTGTACGGGTACCCGTTGACGGCGGATATGGTA-3'
（下線部はKpnＩ部位、配列番号４）と3'-プライマー、
5'-GACTGTACGCTGCAGCGTAACCAACATGATTAACA-3'（下線部
はPstＩ部位、配列番号５））を用いてpYK134（12.3k
b、工業技術院生命工学研究所 小山芳典先生より）か
らPCRで増幅する。pYK134は、T.thermophilus HB8（東
京薬科大学 大島泰郎先生より）から分離されたプラス
ミドpTT8に由来するもので、そのoriはBcII部位の近傍
に位置している。pTT8（9.7kb）のサイズを小さくする
ために、BcII部位を含むKpnI-PstI断片（5.5kb）をゲル
によって精製し、増幅したWT*遺伝子とライゲートさせ
る。得られたプラスミド、pJHK１(6.5kb)を定方向進化
実験に用いる。上記pYK134、pTT8及びpJHK1の制限酵素
地図を図１に示す。
列(配列番号１０及び１１)は、Nakanishi,Kら, J. Fe
rment. Technol. 54:801-807(1976)等から公知であ
り、これをコードするプラスミドとしてpUB110（3,000k
Da、Lacey, R.W.及びI.Chopra, J. Med. Microbio
l., 7:285-297(1974)）等がある。この野生型KNTに対
し、２個の置換（Asp80TyrとThr130Lys）を有する変異
体（WT*と称する、配列番号１）から定方向進化を開始
する。WT*KNT遺伝子は、２つのプライマー（5'-プライ
マー、5'-GACTGTACGGGTACCCGTTGACGGCGGATATGGTA-3'
（下線部はKpnＩ部位、配列番号４）と3'-プライマー、
5'-GACTGTACGCTGCAGCGTAACCAACATGATTAACA-3'（下線部
はPstＩ部位、配列番号５））を用いてpYK134（12.3k
b、工業技術院生命工学研究所 小山芳典先生より）か
らPCRで増幅する。pYK134は、T.thermophilus HB8（東
京薬科大学 大島泰郎先生より）から分離されたプラス
ミドpTT8に由来するもので、そのoriはBcII部位の近傍
に位置している。pTT8（9.7kb）のサイズを小さくする
ために、BcII部位を含むKpnI-PstI断片（5.5kb）をゲル
によって精製し、増幅したWT*遺伝子とライゲートさせ
る。得られたプラスミド、pJHK１(6.5kb)を定方向進化
実験に用いる。上記pYK134、pTT8及びpJHK1の制限酵素
地図を図１に示す。
【００１２】T.thermophilus HB27の形質転換 T.thermophilusは、好ましくは以下のようにして形質転
換を行う。一夜培養したものを0.4mM CaCl2と0.4mM MgC
l2を含む新しい培地で100分の１に希釈し、70℃で２時
間振騰培養する。培養物（1×108cells/ml）をプラスミ
ド、例えばpJHK１と混合し、70℃で2時間、振騰しなが
らインキュベートし、カナマイシンを含む平板培地上に
撒く。
換を行う。一夜培養したものを0.4mM CaCl2と0.4mM MgC
l2を含む新しい培地で100分の１に希釈し、70℃で２時
間振騰培養する。培養物（1×108cells/ml）をプラスミ
ド、例えばpJHK１と混合し、70℃で2時間、振騰しなが
らインキュベートし、カナマイシンを含む平板培地上に
撒く。
【００１３】熱安定性KNT変異体の定方向進化 Stemmerらの論文（Stemmer, W.P.C.ら,Nature, 370, 38
9-391 (1994)）に記載されているようにして、ＤＮＡシ
ャフリングを実施する。実際には、目的とする遺伝子を
含むＤＮＡをDNaseIにより断片化し、100-300bpのＤＮ
Ａ断片を回収する。そのＤＮＡ断片の混合物をプライマ
ーなしでＰＣＲ増幅する。このとき、各断片間にオーバ
ーラップする配列が存在するので、DNaseI処理前の全長
ＤＮＡが再構成される。その全長ＤＮＡを5'と3'末端プ
ライマーを用いて更にＰＣＲ増幅する。
9-391 (1994)）に記載されているようにして、ＤＮＡシ
ャフリングを実施する。実際には、目的とする遺伝子を
含むＤＮＡをDNaseIにより断片化し、100-300bpのＤＮ
Ａ断片を回収する。そのＤＮＡ断片の混合物をプライマ
ーなしでＰＣＲ増幅する。このとき、各断片間にオーバ
ーラップする配列が存在するので、DNaseI処理前の全長
ＤＮＡが再構成される。その全長ＤＮＡを5'と3'末端プ
ライマーを用いて更にＰＣＲ増幅する。
【００１４】WT*遺伝子のコード領域は、上記で得られ
たpJHK1からPCRで増幅する。PCRに使用した5'-プライマ
ーは、5'-GACTGTACGGAATTCGAGCTCGAGCAAATCTAAAA-3'
（下線部はEcoRI部位、配列番号６）であり、3'-プライ
マーの配列は上記したとおりである（配列番号５）。シ
ャッフルした断片を、EcoRIとPstIで切断し、精製し、
同じ制限酵素で切断したpJHK1中に挿入する。それか
ら、T.thermophilus HB27（工業技術院生命工学研究所
小山芳典先生より）を、このpJHK1誘導体（シャッフ
ル断片挿入物）で形質転換する。形質転換体(ライブラ
リー）をカナマイシン含有プレート上で（64℃、36h）
スクリーニングし、陽性コロニーをとり、カナマイシン
プレート上に移し、64℃で40時間培養する。プレート上
から細胞を滅菌水で取り上げ、プラスミドの混合物、pK
T1 mixを作る。pKT1 mixから増幅した変異遺伝子をシ
ャッフルし、１回目と同じ方法で2回目のスクリーニン
グを行う。すなわちシャッフルして得られたライブラリ
ーを６９℃で40時間培養し、再度陽性のコロニーを選択
する。これをｐKT2 mixと名づける。ｐKT3は、3回目の
スクリーニングから得られた陽性コロニーから作成す
る。培養は79℃で20時間行う。T.thermophilus HB27を
pKT3 mixで形質転換し、81℃、40時間培養した後、大
きいほうから例えば20個のコロニーを取り上げ、培養
し、プラスミド（pKT3-1-3-20とする）を調製する。お
のおののプラスミドのコード領域を増幅し、pUC18（TAK
ARA）のKpnIおよびPstI部位にサブクローニングし、大
腸菌で発現させる。大腸菌の培養溶解液を70℃で10分間
加熱し、20個のKT3変異株間の残存KNT活性を比較する。
最も高い残存活性を有する10個の変異株を選び、それら
のコード領域の配列を決定する。
たpJHK1からPCRで増幅する。PCRに使用した5'-プライマ
ーは、5'-GACTGTACGGAATTCGAGCTCGAGCAAATCTAAAA-3'
（下線部はEcoRI部位、配列番号６）であり、3'-プライ
マーの配列は上記したとおりである（配列番号５）。シ
ャッフルした断片を、EcoRIとPstIで切断し、精製し、
同じ制限酵素で切断したpJHK1中に挿入する。それか
ら、T.thermophilus HB27（工業技術院生命工学研究所
小山芳典先生より）を、このpJHK1誘導体（シャッフ
ル断片挿入物）で形質転換する。形質転換体(ライブラ
リー）をカナマイシン含有プレート上で（64℃、36h）
スクリーニングし、陽性コロニーをとり、カナマイシン
プレート上に移し、64℃で40時間培養する。プレート上
から細胞を滅菌水で取り上げ、プラスミドの混合物、pK
T1 mixを作る。pKT1 mixから増幅した変異遺伝子をシ
ャッフルし、１回目と同じ方法で2回目のスクリーニン
グを行う。すなわちシャッフルして得られたライブラリ
ーを６９℃で40時間培養し、再度陽性のコロニーを選択
する。これをｐKT2 mixと名づける。ｐKT3は、3回目の
スクリーニングから得られた陽性コロニーから作成す
る。培養は79℃で20時間行う。T.thermophilus HB27を
pKT3 mixで形質転換し、81℃、40時間培養した後、大
きいほうから例えば20個のコロニーを取り上げ、培養
し、プラスミド（pKT3-1-3-20とする）を調製する。お
のおののプラスミドのコード領域を増幅し、pUC18（TAK
ARA）のKpnIおよびPstI部位にサブクローニングし、大
腸菌で発現させる。大腸菌の培養溶解液を70℃で10分間
加熱し、20個のKT3変異株間の残存KNT活性を比較する。
最も高い残存活性を有する10個の変異株を選び、それら
のコード領域の配列を決定する。
【００１５】KNTの発現と精製 発現プラスミドpUT7は、oriを含むpUC18のPvuII-ScaI断
片とT7プロモーターを含むpET21b（Novagen社）のBglII
-ScaI断片を結合して構築する。KNTの発現に適したプラ
スミドとしては、上記pUT7の他、宿主細胞中で自立複製
可能ないしは染色体中への組込みが可能で、KNT遺伝子
を転写できる位置にプロモーターを含有しているもので
あれば良く、特に限定されるものではない。PCRで増幅
した変異KNT遺伝子は、pUT7のNdeIとXhoI部位にサブク
ローニングする。ここで使用するプライマーは：5'-プ
ライマーは5'-GACTGTACGCATATGAATGGACCAATAATAATGAC-
3'(WT*用、下線部はNdeI部位、配列番号７)及び5'-GACT
GTACGCATATGAAAGGACCAATAATAATGAC-3'（KT3-11、HTK
用、下線部はNdeI部位、配列番号８）、3'-プライマー
は5'-GACTGTACGCTCGAGCGTAACCAACATGATTAACA-3'（下線
部はXhoI部位、配列番号９）である。ここで、KNTの開
始コドンは、GTGからATGに変わっている。
片とT7プロモーターを含むpET21b（Novagen社）のBglII
-ScaI断片を結合して構築する。KNTの発現に適したプラ
スミドとしては、上記pUT7の他、宿主細胞中で自立複製
可能ないしは染色体中への組込みが可能で、KNT遺伝子
を転写できる位置にプロモーターを含有しているもので
あれば良く、特に限定されるものではない。PCRで増幅
した変異KNT遺伝子は、pUT7のNdeIとXhoI部位にサブク
ローニングする。ここで使用するプライマーは：5'-プ
ライマーは5'-GACTGTACGCATATGAATGGACCAATAATAATGAC-
3'(WT*用、下線部はNdeI部位、配列番号７)及び5'-GACT
GTACGCATATGAAAGGACCAATAATAATGAC-3'（KT3-11、HTK
用、下線部はNdeI部位、配列番号８）、3'-プライマー
は5'-GACTGTACGCTCGAGCGTAACCAACATGATTAACA-3'（下線
部はXhoI部位、配列番号９）である。ここで、KNTの開
始コドンは、GTGからATGに変わっている。
【００１６】本発明において、KNT遺伝子を発現させる
ための宿主細胞としては、大腸菌等の細菌、酵母や動物
細胞、昆虫細胞等が挙げられ、特に限定されるものでは
ない。宿主細胞として大腸菌を使用する場合、得られる
発現プラスミドを有する大腸菌BL21(DE3,pLysS)細胞
は、1.0% ポリペプトン、0.5% 酵母抽出物、1.0% Na
Cl(pH7.0)、100μg/ml アンピシリン、1mM イソプロ
ピル-1-チオ-β-D-ガラクトシドを含む培地中で37℃、
一晩培養する。細胞を集め、50mM NaClと2mMのメルカプ
トエタノールを含む20mM Tris-HCl バッファー（pH7.
5）に再懸濁し、超音波破砕する。以下の操作はすべて
４℃で行う。遠心分離後の祖抽出液の上清を上記バッフ
ァーで平衡に達しているDEAE-トヨパールカラム（Toso
h）にかけ、50〜250ｍMのNaCl 線状勾配下で溶出させ
る。各フラクションは、KNTアッセイとSDS-PAGEでチェ
ックする。KNTを含むフラクションを集め、2mMの2-メル
カプトエタノールを含む5mMのリン酸カリウムバッファ
ー（ｐH7.0）に対して一晩透析した。透析液を、透析の
バッファーで平衡化したヒドロキシアパタイトカラムに
かけ、5〜100ｍMのリン酸カリウムの線状勾配で溶出さ
せた。KNTを含むフラクションを集め、限外濾過で濃縮
する。次に、濃縮した溶液を0.1M KClを含む20ｍMのリ
ン酸カリウムバッファー（ｐH7.0）で平衡化したセファ
クリルS-200カラム（Amersham Pharmacia Biotech
社）等にかけて酵素を精製する。酵素の純度は、SDS-PA
GEで90％より大きくなるまでにする。
ための宿主細胞としては、大腸菌等の細菌、酵母や動物
細胞、昆虫細胞等が挙げられ、特に限定されるものでは
ない。宿主細胞として大腸菌を使用する場合、得られる
発現プラスミドを有する大腸菌BL21(DE3,pLysS)細胞
は、1.0% ポリペプトン、0.5% 酵母抽出物、1.0% Na
Cl(pH7.0)、100μg/ml アンピシリン、1mM イソプロ
ピル-1-チオ-β-D-ガラクトシドを含む培地中で37℃、
一晩培養する。細胞を集め、50mM NaClと2mMのメルカプ
トエタノールを含む20mM Tris-HCl バッファー（pH7.
5）に再懸濁し、超音波破砕する。以下の操作はすべて
４℃で行う。遠心分離後の祖抽出液の上清を上記バッフ
ァーで平衡に達しているDEAE-トヨパールカラム（Toso
h）にかけ、50〜250ｍMのNaCl 線状勾配下で溶出させ
る。各フラクションは、KNTアッセイとSDS-PAGEでチェ
ックする。KNTを含むフラクションを集め、2mMの2-メル
カプトエタノールを含む5mMのリン酸カリウムバッファ
ー（ｐH7.0）に対して一晩透析した。透析液を、透析の
バッファーで平衡化したヒドロキシアパタイトカラムに
かけ、5〜100ｍMのリン酸カリウムの線状勾配で溶出さ
せた。KNTを含むフラクションを集め、限外濾過で濃縮
する。次に、濃縮した溶液を0.1M KClを含む20ｍMのリ
ン酸カリウムバッファー（ｐH7.0）で平衡化したセファ
クリルS-200カラム（Amersham Pharmacia Biotech
社）等にかけて酵素を精製する。酵素の純度は、SDS-PA
GEで90％より大きくなるまでにする。
【００１７】KNT アッセイ 黄色ブドウ球菌KNTは、AMPのATPからカナマイシンの4'-
ヒドロキシ基への転移を触媒する。酵素活性は、25℃
で、50mM MgCl2と0.1-2mMカナマイシン、0.4-5.4mM[８-
14C]ATP(0.4-4mCi/mmol)を含む50mM Na-MESバッファー
(pH6.0)中で測定する。反応は、半量の6N HClを加える
ことにより停止し、PEI-セルロースTLCプレート上にス
ポットする。プレートは、1-プロパノール/H2O/酢酸=6
0:39:1 からなる溶媒で45分間展開する。生成物であ
る、カナマイシン-[14C]AMPの放射能をFujifilm phosph
orimager BAS-2000（富士フィルム社）で測定する。こ
の系において、生成物のRF値は0.3である。
ヒドロキシ基への転移を触媒する。酵素活性は、25℃
で、50mM MgCl2と0.1-2mMカナマイシン、0.4-5.4mM[８-
14C]ATP(0.4-4mCi/mmol)を含む50mM Na-MESバッファー
(pH6.0)中で測定する。反応は、半量の6N HClを加える
ことにより停止し、PEI-セルロースTLCプレート上にス
ポットする。プレートは、1-プロパノール/H2O/酢酸=6
0:39:1 からなる溶媒で45分間展開する。生成物であ
る、カナマイシン-[14C]AMPの放射能をFujifilm phosph
orimager BAS-2000（富士フィルム社）で測定する。こ
の系において、生成物のRF値は0.3である。
【００１８】熱変性 熱変性曲線は、5mm長のキュベット中でPTC-348WI熱電温
度管理システムを有する Jasco J-720WI spectropol
arimeter（日本分光）にて30-90℃（HTKには30-95℃）
の温度範囲で記録する。タンパク質濃度は、0.8μM、バ
ッファーは、0.1M KClを含む50mMのリン酸カリウム、p
H7.0である。サンプルの温度は、222nmでモニターしな
がら毎分１℃の速さで上昇させた。
度管理システムを有する Jasco J-720WI spectropol
arimeter（日本分光）にて30-90℃（HTKには30-95℃）
の温度範囲で記録する。タンパク質濃度は、0.8μM、バ
ッファーは、0.1M KClを含む50mMのリン酸カリウム、p
H7.0である。サンプルの温度は、222nmでモニターしな
がら毎分１℃の速さで上昇させた。
【００１９】
【実施例】以下、本発明を実施例を挙げて更に説明する
が、本発明は下記実施例に限定されるものではない。実施例１ 定方向進化 最初のスクリーニングは下記のごとく行った。先に手順
を説明したＤＮＡシャフリングにより、WT*遺伝子に変
異が導入された。64℃にてスクリーニングされた3.2×1
06個の形質転換体から431個の陽性コロニーを取り上げ
た。最終的には、この陽性コロニーからプラスミドの混
合物pKT1 mixを調製した。ｐKT1 mixから増幅した変
異KNT遺伝子が、新たな点突然変異を受け入れながら変
異遺伝子を組み換えることを目的として、更にＤＮＡシ
ャフリングを行った。2回目のスクリーニングは69℃で
（ライブラリーサイズ4.8×106、109コロニーを選
択）、３回目は79℃で実施した。（ライブラリーサイズ
2.4×105、209コロニーを選択）ｐKT3 mixで形質転換
したT.thermophilus細胞は、81℃でカナマイシンを含む
プレート上でコロニーを形成した。しかし、宿主のT.th
ermophilusは81℃より上の温度ではコロニーを形成でき
ないので、4回目のスクリーニングは不可能であった。
が、本発明は下記実施例に限定されるものではない。実施例１ 定方向進化 最初のスクリーニングは下記のごとく行った。先に手順
を説明したＤＮＡシャフリングにより、WT*遺伝子に変
異が導入された。64℃にてスクリーニングされた3.2×1
06個の形質転換体から431個の陽性コロニーを取り上げ
た。最終的には、この陽性コロニーからプラスミドの混
合物pKT1 mixを調製した。ｐKT1 mixから増幅した変
異KNT遺伝子が、新たな点突然変異を受け入れながら変
異遺伝子を組み換えることを目的として、更にＤＮＡシ
ャフリングを行った。2回目のスクリーニングは69℃で
（ライブラリーサイズ4.8×106、109コロニーを選
択）、３回目は79℃で実施した。（ライブラリーサイズ
2.4×105、209コロニーを選択）ｐKT3 mixで形質転換
したT.thermophilus細胞は、81℃でカナマイシンを含む
プレート上でコロニーを形成した。しかし、宿主のT.th
ermophilusは81℃より上の温度ではコロニーを形成でき
ないので、4回目のスクリーニングは不可能であった。
【００２０】実施例２ KT3変異株 81℃のスクリーニングにおいて大きなコロニーから得ら
れた20株のKT3変異株の詳細を調べた。KT3変異株、KT3-
1-3-20を大腸菌にて発現し、各変異株の熱安定性を、溶
解液を70℃、10分加熱後の残存触媒活性から推定した。
この分析に基づき、最も安定なKT3の10株を選択し、DNA
の配列を決定した（KT3-1〜KT3-19、表１参照）。
れた20株のKT3変異株の詳細を調べた。KT3変異株、KT3-
1-3-20を大腸菌にて発現し、各変異株の熱安定性を、溶
解液を70℃、10分加熱後の残存触媒活性から推定した。
この分析に基づき、最も安定なKT3の10株を選択し、DNA
の配列を決定した（KT3-1〜KT3-19、表１参照）。
【００２１】
【表１】
【００２２】それぞれの変異株は約15個の点突然変異を
有し、そのうち4−5個はサイレント変異である。高温で
のスクリーニング後、KNT遺伝子のGC含量が増加する可
能性があるが、39個のサイレント変異では、G及びC等の
特定な傾向は見られなかった（データなし）。保存的置
換であるVal75Ala置換は10個のKT3全てに見られた(表
1)。別の保存的置換は、Glu61Glyが7変異株に、His66Ty
rが８株、Gln91Argが９株、Ser112Proが7株、Ser199Pro
が7株である。すべての調べたKT3において、Gln102は、
塩基性アミノ酸で置換されていた（７株はArgで、3株は
Lys）。興味深いことに、29置換のうち5個はプロリンへ
の置換であった。タンパク質の熱安定性を増加させるプ
ロリン置換の多くの例が知られている。10株のKT3の中
で最も熱安定であったKT3-11を大腸菌で発現させ、精製
した。精製したKT3-11（配列番号２）は、70℃、10分間
の処理後活性であったが、75℃で完全に失活した（デー
タ無し）。しかし、KT3-11を含有するプラスミドpKT3-1
1は、T.thermophilusの細胞を81℃で形質転換する。KT3
-11は、細胞質中ではより熱安定性であるか、または迅
速に発現してKNT活性を発揮する。
有し、そのうち4−5個はサイレント変異である。高温で
のスクリーニング後、KNT遺伝子のGC含量が増加する可
能性があるが、39個のサイレント変異では、G及びC等の
特定な傾向は見られなかった（データなし）。保存的置
換であるVal75Ala置換は10個のKT3全てに見られた(表
1)。別の保存的置換は、Glu61Glyが7変異株に、His66Ty
rが８株、Gln91Argが９株、Ser112Proが7株、Ser199Pro
が7株である。すべての調べたKT3において、Gln102は、
塩基性アミノ酸で置換されていた（７株はArgで、3株は
Lys）。興味深いことに、29置換のうち5個はプロリンへ
の置換であった。タンパク質の熱安定性を増加させるプ
ロリン置換の多くの例が知られている。10株のKT3の中
で最も熱安定であったKT3-11を大腸菌で発現させ、精製
した。精製したKT3-11（配列番号２）は、70℃、10分間
の処理後活性であったが、75℃で完全に失活した（デー
タ無し）。しかし、KT3-11を含有するプラスミドpKT3-1
1は、T.thermophilusの細胞を81℃で形質転換する。KT3
-11は、細胞質中ではより熱安定性であるか、または迅
速に発現してKNT活性を発揮する。
【００２３】実施例３ より熱安定な変異体の創作 実施例２の定方向進化は、3回のスクリーニングと選択
で終了した。更なるスクリーニングが可能であったな
ら、KT3変異間の組換えにより、より熱安定な変異体が
得られていたであろう。それゆえ、KT3-11の熱安定性を
さらに改善するためにこの戦略を使った。別の2以上のK
T3に保存された変異とプロリンへの変異を可能性ある変
異として選択した。KT3変異の中でKT3-3は独特なので
（表1）、KT3-11にはないが、KT3-3にある変異も選択し
た。これらの変異は、Amersham社のキット（Sculpter
(登録商標)）により、独立してKT3-11に付け加えられ
た。おのおののKT3-11の単一変異株を大腸菌で発現さ
せ、おのおのの変異株の粗溶解物の熱安定性を、KT3-11
と比較した。表２に結果を示すように、以下の9個の置
換がKT3-11の熱安定性を改善した。Met57Leu、Ala62Va
l、Ser94Pro、Ser203Pro、Asp206Val、His207Gln、Ser2
20Pro、Ile234Val、Thr238Ala.
で終了した。更なるスクリーニングが可能であったな
ら、KT3変異間の組換えにより、より熱安定な変異体が
得られていたであろう。それゆえ、KT3-11の熱安定性を
さらに改善するためにこの戦略を使った。別の2以上のK
T3に保存された変異とプロリンへの変異を可能性ある変
異として選択した。KT3変異の中でKT3-3は独特なので
（表1）、KT3-11にはないが、KT3-3にある変異も選択し
た。これらの変異は、Amersham社のキット（Sculpter
(登録商標)）により、独立してKT3-11に付け加えられ
た。おのおののKT3-11の単一変異株を大腸菌で発現さ
せ、おのおのの変異株の粗溶解物の熱安定性を、KT3-11
と比較した。表２に結果を示すように、以下の9個の置
換がKT3-11の熱安定性を改善した。Met57Leu、Ala62Va
l、Ser94Pro、Ser203Pro、Asp206Val、His207Gln、Ser2
20Pro、Ile234Val、Thr238Ala.
【００２４】
【表２】
【００２５】一方、KT3-3に独特の3個の変異であるAsp2
5Asn、Glu117Gly、Ser190Leuは、KT3-11の配列との関連
においては、少なくとも不安定化に働いている（表２参
照）。「高度に熱安定性なカナマイシンヌクレオチジル
トランスフェラーゼ」（highly thermostable kanamy
cin nucleotidyltransferase：HTK、配列番号３）は、
Amersham社のキット（Sculpter(登録商標)）により、す
べての9個の陽性変異をKT3-11に組み込むことにより作
られた（表1）。HTKはWT*と比較して19個のアミノ酸の
置換を有する。HTKを作成する途中に、これらの変異の
熱安定性への効果は、ほぼ付加的なものであることが観
察された（表２参照）。HTKのATP（2mMカナマイシン条
件下）に対するKcat、Km値は、WT*の約2倍であるが、HT
Kの触媒としての性質は変異によりほとんど変化してい
ない（表３）。
5Asn、Glu117Gly、Ser190Leuは、KT3-11の配列との関連
においては、少なくとも不安定化に働いている（表２参
照）。「高度に熱安定性なカナマイシンヌクレオチジル
トランスフェラーゼ」（highly thermostable kanamy
cin nucleotidyltransferase：HTK、配列番号３）は、
Amersham社のキット（Sculpter(登録商標)）により、す
べての9個の陽性変異をKT3-11に組み込むことにより作
られた（表1）。HTKはWT*と比較して19個のアミノ酸の
置換を有する。HTKを作成する途中に、これらの変異の
熱安定性への効果は、ほぼ付加的なものであることが観
察された（表２参照）。HTKのATP（2mMカナマイシン条
件下）に対するKcat、Km値は、WT*の約2倍であるが、HT
Kの触媒としての性質は変異によりほとんど変化してい
ない（表３）。
【００２６】
【表３】
【００２７】実施例４ 3種のKNTの熱安定性 WT*、KT3-11、HTKの熱安定性を評価するために、おのお
ののタンパク質の熱変性をCD spectroscopyで追跡した
（図２A）。WT*、KT3-11、HTKのみかけのTm値は、それ
ぞれ、61、73、84℃である。KNTの変性は非可逆であ
り、KT3-11とHTKは、変性後凝集するので、図２Aの変性
曲線は、ΔΔG値を計算するには使えない。3種のKNTの
相対的安定性を確かめるために、60、72、80℃で10分間
熱処理後、各KNTの残存活性を測定した（図２B）。60℃
では、WT*の活性は5%に低下したが、KT-3-11とHTKでは
変わらなかった。72℃では、WT*は完全に不活化した
が、KT3-11の活性は5%に下がり、HTKはまだ活性であっ
た。HTKは、80℃、10分間の熱処理後でさえも15%の活性
を保有した。この結果は、変性曲線から得られたTm値に
よく合致した。HTKの熱安定性は、WT*のそれと比較して
少なくとも20℃上昇したといっても良い。WT*は、上記
のように2個の変異を有し、野生型のKNTと比較して熱安
定性が約10℃上昇している。それゆえ、HTKの熱安定性
は、黄色ブドウ球菌の野生型酵素に２１個の置換を導入
することにより合計30℃上昇したこととなる。本発明者
等の知る限り、タンパク質の熱安定性を改善するプロジ
ェクトの中で、本発明はもっとも大きな成功例といえ
る。グルコースデヒドロゲナーゼとイソ-1-シトクロム
の熱安定性は、それぞれ20℃と17℃上昇したが（Makin
o,Y., J.Biol.Chem. 264,6381-6385(1989); Nagao,
T., FEBS Lett. 253,113-116(1989); Das,G., Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 86, 496-499(198
9)）、いずれの場合も1個のアミノ酸の置換によるもの
である。これらの2個の例は興味深いが、われわれのKNT
のアプローチがより一般的であるだろう。天然のタンパ
ク質の進化は、多くの変異の累積により進行すると思わ
れるが、それぞれの変異は全体の効果に小さな貢献を与
える。小さな効果の蓄積が重要であるという概念は、少
数の合理的に設計された置換が導入されている多くの研
究に於いて、ごく限られた成功に終わっているという事
実が支持している。ここに明記すべきことは、熱安定な
KNT変異株を1回のランダム変異とスクリーニングにより
分離する2個の独立した研究が、ただ2個の同一の安定変
異を見出したことである。
ののタンパク質の熱変性をCD spectroscopyで追跡した
（図２A）。WT*、KT3-11、HTKのみかけのTm値は、それ
ぞれ、61、73、84℃である。KNTの変性は非可逆であ
り、KT3-11とHTKは、変性後凝集するので、図２Aの変性
曲線は、ΔΔG値を計算するには使えない。3種のKNTの
相対的安定性を確かめるために、60、72、80℃で10分間
熱処理後、各KNTの残存活性を測定した（図２B）。60℃
では、WT*の活性は5%に低下したが、KT-3-11とHTKでは
変わらなかった。72℃では、WT*は完全に不活化した
が、KT3-11の活性は5%に下がり、HTKはまだ活性であっ
た。HTKは、80℃、10分間の熱処理後でさえも15%の活性
を保有した。この結果は、変性曲線から得られたTm値に
よく合致した。HTKの熱安定性は、WT*のそれと比較して
少なくとも20℃上昇したといっても良い。WT*は、上記
のように2個の変異を有し、野生型のKNTと比較して熱安
定性が約10℃上昇している。それゆえ、HTKの熱安定性
は、黄色ブドウ球菌の野生型酵素に２１個の置換を導入
することにより合計30℃上昇したこととなる。本発明者
等の知る限り、タンパク質の熱安定性を改善するプロジ
ェクトの中で、本発明はもっとも大きな成功例といえ
る。グルコースデヒドロゲナーゼとイソ-1-シトクロム
の熱安定性は、それぞれ20℃と17℃上昇したが（Makin
o,Y., J.Biol.Chem. 264,6381-6385(1989); Nagao,
T., FEBS Lett. 253,113-116(1989); Das,G., Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 86, 496-499(198
9)）、いずれの場合も1個のアミノ酸の置換によるもの
である。これらの2個の例は興味深いが、われわれのKNT
のアプローチがより一般的であるだろう。天然のタンパ
ク質の進化は、多くの変異の累積により進行すると思わ
れるが、それぞれの変異は全体の効果に小さな貢献を与
える。小さな効果の蓄積が重要であるという概念は、少
数の合理的に設計された置換が導入されている多くの研
究に於いて、ごく限られた成功に終わっているという事
実が支持している。ここに明記すべきことは、熱安定な
KNT変異株を1回のランダム変異とスクリーニングにより
分離する2個の独立した研究が、ただ2個の同一の安定変
異を見出したことである。
【００２８】実施例５ KNT構造における変異残基の分
布 疎水性コアに存在するVal75とIle234を除き、HTKのすべ
てのほかの変異は,分子の表面上に存在する(図３)。サ
ブユニットの界面には、変異残基はない。Gln91Arg置換
は、おそらくへリックス双極子を安定化している。タン
パク質の熱安定性は、プロリン置換により上昇すること
が報告されている。HTKでは、5個のプロリン置換があっ
た。Ser94とSer112は、β−ターンの第2部位にあり、Se
r199とSer203は、表面のループ上に、Ser220はα−ヘリ
ックスのN-末端cap構造にある。驚くべきことは、Ser94
側鎖の水酸基は、カナマイシンの１−アミド基から水素
結合の距離にあるにもかかわらず、HTKの触媒効率は、S
er94Proの変異にもかかわらず、ほとんど変化していな
い。
布 疎水性コアに存在するVal75とIle234を除き、HTKのすべ
てのほかの変異は,分子の表面上に存在する(図３)。サ
ブユニットの界面には、変異残基はない。Gln91Arg置換
は、おそらくへリックス双極子を安定化している。タン
パク質の熱安定性は、プロリン置換により上昇すること
が報告されている。HTKでは、5個のプロリン置換があっ
た。Ser94とSer112は、β−ターンの第2部位にあり、Se
r199とSer203は、表面のループ上に、Ser220はα−ヘリ
ックスのN-末端cap構造にある。驚くべきことは、Ser94
側鎖の水酸基は、カナマイシンの１−アミド基から水素
結合の距離にあるにもかかわらず、HTKの触媒効率は、S
er94Proの変異にもかかわらず、ほとんど変化していな
い。
【００２９】実施例６ T．thermophilus用の便利なベ
クターの創作 T.thermophilusの複製起源とHTK遺伝子を組み込んでい
るプラスミド、pJHK3（図４に制限酵素地図を示す）
は、T.thermophilusの分子生物学実験を行うのに便利な
ベクターである。ｐJHK3を使用すると、形質転換とコロ
ニー取り上げから液体培養までの標準操作を2日間で完
了することができるが、従来のWT*遺伝子を用いた同じ
プロトコールでは、4日間を必要とする。本発明に係る
この新しい選択マーカーにより、T.thermophilusや、Th
ermus aquaticus、Bacillus stearothermophilus等の
他の好熱細菌の将来の研究が大いに加速される。
クターの創作 T.thermophilusの複製起源とHTK遺伝子を組み込んでい
るプラスミド、pJHK3（図４に制限酵素地図を示す）
は、T.thermophilusの分子生物学実験を行うのに便利な
ベクターである。ｐJHK3を使用すると、形質転換とコロ
ニー取り上げから液体培養までの標準操作を2日間で完
了することができるが、従来のWT*遺伝子を用いた同じ
プロトコールでは、4日間を必要とする。本発明に係る
この新しい選択マーカーにより、T.thermophilusや、Th
ermus aquaticus、Bacillus stearothermophilus等の
他の好熱細菌の将来の研究が大いに加速される。
【００３０】
【発明の効果】以上詳述した如く、本発明によって、熱
安定性を顕著に向上させた新規なカナマイシンヌクレオ
チジルトランスフェラーゼ及びこれを利用した選択マー
カー、並びに該選択マーカーを用いたThermus thermoph
ilus等の好熱菌のスクリーニング方法が提供される。本
発明に係るこの新しい選択マーカーにより、T.thermoph
ilusや、Thermus aquaticus、Bacillus stearothermo
philus等の好熱細菌の将来の研究が大いに加速される。
安定性を顕著に向上させた新規なカナマイシンヌクレオ
チジルトランスフェラーゼ及びこれを利用した選択マー
カー、並びに該選択マーカーを用いたThermus thermoph
ilus等の好熱菌のスクリーニング方法が提供される。本
発明に係るこの新しい選択マーカーにより、T.thermoph
ilusや、Thermus aquaticus、Bacillus stearothermo
philus等の好熱細菌の将来の研究が大いに加速される。
【００３１】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> The Institute of Physical and Chemical Reserch <120> Thermostable kanamycin nucleotidyltransferase and screening method of thermophiles using thereof <130> RJH11-072T <160> 11 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant enzyme obtained by introduction of point mutation i nto wild type KNT gene and its expression <400> 1 Met Asn Gly Pro Ile Ile Met Thr Arg Glu Glu Arg Met Lys Ile Val 1 5 10 15 His Glu Ile Lys Glu Arg Ile Leu Asp Lys Tyr Gly Asp Asp Val Lys 20 25 30 Ala Ile Gly Val Tyr Gly Ser Leu Gly Arg Gln Thr Asp Gly Pro Tyr 35 40 45 Ser Asp Ile Glu Met Met Cys Val Met Ser Thr Glu Glu Ala Glu Phe 50 55 60 Ser His Glu Trp Thr Thr Gly Glu Trp Lys Val Glu Val Asn Phe Tyr 65 70 75 80 Ser Glu Glu Ile Leu Leu Asp Tyr Ala Ser Gln Val Glu Ser Asp Trp 85 90 95 Pro Leu Thr His Gly Gln Phe Phe Ser Ile Leu Pro Ile Tyr Asp Ser 100 105 110 Gly Gly Tyr Leu Glu Lys Val Tyr Gln Thr Ala Lys Ser Val Glu Ala 115 120 125 Gln Lys Phe His Asp Ala Ile Cys Ala Leu Ile Val Glu Glu Leu Phe 130 135 140 Glu Tyr Ala Gly Lys Trp Arg Asn Ile Arg Val Gln Gly Pro Thr Thr 145 150 155 160 Phe Leu Pro Ser Leu Thr Val Gln Val Ala Met Ala Gly Ala Met Leu 165 170 175 Ile Gly Leu His His Arg Ile Cys Tyr Thr Thr Ser Ala Ser Val Leu 180 185 190 Thr Glu Ala Val Lys Gln Ser Asp Leu Pro Ser Gly Tyr Asp His Leu 195 200 205 Cys Gln Phe Val Met Ser Gly Gln Leu Ser Asp Ser Glu Lys Leu Leu 210 215 220 Glu Ser Leu Glu Asn Phe Trp Asn Gly Ile Gln Glu Trp Thr Glu Arg 225 230 235 240 His Gly Tyr Ile Val Asp Val Ser Lys Arg Ile Pro Phe 245 250 <210> 2 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant enzyme obtained by introduction of point mutation i nto wild type KNT gene and its expression <400> 2 Met Lys Gly Pro Ile Ile Met Thr Arg Glu Glu Arg Met Lys Ile Val 1 5 10 15 His Glu Ile Lys Glu Arg Ile Leu Asp Lys Tyr Gly Asp Asp Val Lys 20 25 30 Ala Ile Gly Val Tyr Gly Ser Leu Gly Arg Gln Thr Asp Gly Pro Tyr 35 40 45 Ser Asp Ile Glu Met Met Cys Val Met Ser Thr Glu Gly Ala Glu Phe 50 55 60 Ser Tyr Glu Trp Thr Thr Gly Glu Trp Lys Ala Glu Val Asn Phe Tyr 65 70 75 80 Ser Glu Glu Ile Leu Leu Asp Tyr Ala Ser Arg Val Glu Ser Asp Trp 85 90 95 Pro Leu Thr His Gly Arg Phe Phe Ser Ile Leu Pro Ile Tyr Asp Pro 100 105 110 Gly Gly Tyr Phe Glu Lys Val Tyr Gln Thr Ala Lys Ser Val Glu Ala 115 120 125 Gln Lys Phe His Asp Ala Ile Cys Ala Leu Ile Val Glu Glu Leu Phe 130 135 140 Glu Tyr Ala Gly Lys Trp Arg Asn Ile Arg Val Gln Gly Pro Thr Thr 145 150 155 160 Phe Leu Pro Ser Leu Thr Val Gln Val Ala Met Ala Gly Ala Met Leu 165 170 175 Ile Gly Leu His His Arg Ile Cys Tyr Thr Thr Ser Ala Ser Val Leu 180 185 190 Thr Glu Ala Val Lys Gln Pro Asp Leu Pro Ser Gly Tyr Asp His Leu 195 200 205 Cys Gln Leu Val Met Ser Gly Gln Leu Ser Asp Ser Glu Lys Leu Leu 210 215 220 Glu Ser Leu Glu Asn Phe Trp Asn Gly Ile Gln Glu Trp Thr Glu Arg 225 230 235 240 His Gly Tyr Ile Val Asp Val Ser Lys Arg Ile Pro Phe 245 250 <210> 3 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant enzyme obtained by introduction of point mutation i nto wild type KNT gene and its expression <400> 3 Met Lys Gly Pro Ile Ile Met Thr Arg Glu Glu Arg Met Lys Ile Val 1 5 10 15 His Glu Ile Lys Glu Arg Ile Leu Asp Lys Tyr Gly Asp Asp Val Lys 20 25 30 Ala Ile Gly Val Tyr Gly Ser Leu Gly Arg Gln Thr Asp Gly Pro Tyr 35 40 45 Ser Asp Ile Glu Met Met Cys Val Leu Ser Thr Glu Gly Val Glu Phe 50 55 60 Ser Tyr Glu Trp Thr Thr Gly Glu Trp Lys Ala Glu Val Asn Phe Tyr 65 70 75 80 Ser Glu Glu Ile Leu Leu Asp Tyr Ala Ser Arg Val Glu Pro Asp Trp 85 90 95 Pro Leu Thr His Gly Arg Phe Phe Ser Ile Leu Pro Ile Tyr Asp Pro 100 105 110 Gly Gly Tyr Phe Glu Lys Val Tyr Gln Thr Ala Lys Ser Val Glu Ala 115 120 125 Gln Lys Phe His Asp Ala Ile Cys Ala Leu Ile Val Glu Glu Leu Phe 130 135 140 Glu Tyr Ala Gly Lys Trp Arg Asn Ile Arg Val Gln Gly Pro Thr Thr 145 150 155 160 Phe Leu Pro Ser Leu Thr Val Gln Val Ala Met Ala Gly Ala Met Leu 165 170 175 Ile Gly Leu His His Arg Ile Cys Tyr Thr Thr Ser Ala Ser Val Leu 180 185 190 Thr Glu Ala Val Lys Gln Pro Asp Leu Pro Pro Gly Tyr Val Gln Leu 195 200 205 Cys Gln Leu Val Met Ser Gly Gln Leu Ser Asp Pro Glu Lys Leu Leu 210 215 220 Glu Ser Leu Glu Asn Phe Trp Asn Gly Val Gln Glu Trp Ala Glu Arg 225 230 235 240 His Gly Tyr Ile Val Asp Val Ser Lys Arg Ile Pro Phe 245 250 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:5'-Primer for PCR amplificat ion <400> 4 gactgtacgg gtacccgttg acggcggata tggta 35 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 3'-Primer for PCR amplifica tion <400> 5 gactgtacgc tgcagcgtaa ccaacatgat taaca 35 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 5'-Primer for PCR amplifica tion <400> 6 gactgtacgg aattcgagct cgagcaaatc taaaa 35 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:5'-Primer for subcloning of WT* <400> 7 gactgtacgc atatgaatgg accaataata atgac 35 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:5'-Primer for subcloning of KT3-11 and HTK <400> 8 gactgtacgc atatgaaagg accaataata atgac 35 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:3'-Primer for subcloning <400> 9 gactgtacgc tcgagcgtaa ccaacatgat taaca 35 <210> 10 <211> 759 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <220> <221> CDS <222> (1)..(759) <400> 10 gtg aat gga cca ata ata atg act aga gaa gaa aga atg aag att gtt 48 Met Asn Gly Pro Ile Ile Met Thr Arg Glu Glu Arg Met Lys Ile Val 1 5 10 15 cat gaa att aag gaa cga ata ttg gat aaa tat ggg gat gat gtt aag 96 His Glu Ile Lys Glu Arg Ile Leu Asp Lys Tyr Gly Asp Asp Val Lys 20 25 30 gct att ggt gtt tat ggc tct ctt ggt cgt cag act gat ggg ccc tat 144 Ala Ile Gly Val Tyr Gly Ser Leu Gly Arg Gln Thr Asp Gly Pro Tyr 35 40 45 tcg gat att gag atg atg tgt gtc atg tca aca gag gaa gca gag ttc 192 Ser Asp Ile Glu Met Met Cys Val Met Ser Thr Glu Glu Ala Glu Phe 50 55 60 agc cat gaa tgg aca acc ggt gag tgg aag gtg gaa gtg aat ttt gat 240 Ser His Glu Trp Thr Thr Gly Glu Trp Lys Val Glu Val Asn Phe Asp 65 70 75 80 agc gaa gag att cta cta gat tat gca tct cag gtg gaa tca gat tgg 288 Ser Glu Glu Ile Leu Leu Asp Tyr Ala Ser Gln Val Glu Ser Asp Trp 85 90 95 ccg ctt aca cat ggt caa ttt ttc tct att ttg ccg att tat gat tca 336 Pro Leu Thr His Gly Gln Phe Phe Ser Ile Leu Pro Ile Tyr Asp Ser 100 105 110 ggt gga tac tta gag aaa gtg tat caa act gct aaa tcg gta gaa gcc 384 Gly Gly Tyr Leu Glu Lys Val Tyr Gln Thr Ala Lys Ser Val Glu Ala 115 120 125 caa acg ttc cac gat gcg att tgt gcc ctt atc gta gaa gag ctg ttt 432 Gln Thr Phe His Asp Ala Ile Cys Ala Leu Ile Val Glu Glu Leu Phe 130 135 140 gaa tat gca ggc aaa tgg cgt aat att cgt gtg caa gga ccg aca aca 480 Glu Tyr Ala Gly Lys Trp Arg Asn Ile Arg Val Gln Gly Pro Thr Thr 145 150 155 160 ttt cta cca tcc ttg act gta cag gta gca atg gca ggt gcc atg ttg 528 Phe Leu Pro Ser Leu Thr Val Gln Val Ala Met Ala Gly Ala Met Leu 165 170 175 att ggt ctg cat cat cgc atc tgt tat acg acg agc gct tcg gtc tta 576 Ile Gly Leu His His Arg Ile Cys Tyr Thr Thr Ser Ala Ser Val Leu 180 185 190 act gaa gca gtt aag caa tca gat ctt cct tca ggt tat gac cat ctg 624 Thr Glu Ala Val Lys Gln Ser Asp Leu Pro Ser Gly Tyr Asp His Leu 195 200 205 tgc cag ttc gta atg tct ggt caa ctt tcc gac tct gag aaa ctt ctg 672 Cys Gln Phe Val Met Ser Gly Gln Leu Ser Asp Ser Glu Lys Leu Leu 210 215 220 gaa tcg cta gag aat ttc tgg aat ggg att cag gag tgg aca gaa cga 720 Glu Ser Leu Glu Asn Phe Trp Asn Gly Ile Gln Glu Trp Thr Glu Arg 225 230 235 240 cac gga tat ata gtg gat gtg tca aaa cgc ata cca ttt 759 His Gly Tyr Ile Val Asp Val Ser Lys Arg Ile Pro Phe 245 250 <210> 11 <211> 253 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 11 Met Asn Gly Pro Ile Ile Met Thr Arg Glu Glu Arg Met Lys Ile Val 1 5 10 15 His Glu Ile Lys Glu Arg Ile Leu Asp Lys Tyr Gly Asp Asp Val Lys 20 25 30 Ala Ile Gly Val Tyr Gly Ser Leu Gly Arg Gln Thr Asp Gly Pro Tyr 35 40 45 Ser Asp Ile Glu Met Met Cys Val Met Ser Thr Glu Glu Ala Glu Phe 50 55 60 Ser His Glu Trp Thr Thr Gly Glu Trp Lys Val Glu Val Asn Phe Asp 65 70 75 80 Ser Glu Glu Ile Leu Leu Asp Tyr Ala Ser Gln Val Glu Ser Asp Trp 85 90 95 Pro Leu Thr His Gly Gln Phe Phe Ser Ile Leu Pro Ile Tyr Asp Ser 100 105 110 Gly Gly Tyr Leu Glu Lys Val Tyr Gln Thr Ala Lys Ser Val Glu Ala 115 120 125 Gln Thr Phe His Asp Ala Ile Cys Ala Leu Ile Val Glu Glu Leu Phe 130 135 140 Glu Tyr Ala Gly Lys Trp Arg Asn Ile Arg Val Gln Gly Pro Thr Thr 145 150 155 160 Phe Leu Pro Ser Leu Thr Val Gln Val Ala Met Ala Gly Ala Met Leu 165 170 175 Ile Gly Leu His His Arg Ile Cys Tyr Thr Thr Ser Ala Ser Val Leu 180 185 190 Thr Glu Ala Val Lys Gln Ser Asp Leu Pro Ser Gly Tyr Asp His Leu 195 200 205 Cys Gln Phe Val Met Ser Gly Gln Leu Ser Asp Ser Glu Lys Leu Leu 210 215 220 Glu Ser Leu Glu Asn Phe Trp Asn Gly Ile Gln Glu Trp Thr Glu Arg 225 230 235 240 His Gly Tyr Ile Val Asp Val Ser Lys Arg Ile Pro Phe 245 250
【００３２】
配列番号１：Staphylococcus aureusのKNT遺伝子に変
異を導入し、これを発現して得られた変異型酵素 配列番号２：Staphylococcus aureusのKNT遺伝子に変
異を導入し、これを発現して得られた変異型酵素 配列番号３：Staphylococcus aureusのKNT遺伝子に変
異を導入し、これを発現して得られた変異型酵素 配列番号４：ＰＣＲ増幅用５’−プライマー 配列番号５：ＰＣＲ増幅用３’−プライマー 配列番号６：ＰＣＲ増幅用５’−プライマー 配列番号７： WT*のサブクローニング用５’−プライマ
ー 配列番号８： KT3-11及びHTKのサブクローニング用５’
−プライマー 配列番号９：サブクローニング用３’−プライマー
異を導入し、これを発現して得られた変異型酵素 配列番号２：Staphylococcus aureusのKNT遺伝子に変
異を導入し、これを発現して得られた変異型酵素 配列番号３：Staphylococcus aureusのKNT遺伝子に変
異を導入し、これを発現して得られた変異型酵素 配列番号４：ＰＣＲ増幅用５’−プライマー 配列番号５：ＰＣＲ増幅用３’−プライマー 配列番号６：ＰＣＲ増幅用５’−プライマー 配列番号７： WT*のサブクローニング用５’−プライマ
ー 配列番号８： KT3-11及びHTKのサブクローニング用５’
−プライマー 配列番号９：サブクローニング用３’−プライマー
【図１】プラスミドpYK134（ａ）、pTT8（ｂ）、及びpJ
HK1（ｃ）の各制限酵素地図を示す図である。
HK1（ｃ）の各制限酵素地図を示す図である。
【図２】KNTの熱安定性を示す図である。 （Ａ）WT*（□）、KT3-11（△）、HTK（○）の熱変性
は、222nmのCDをモニターし、記録した。測定条件は、
蛋白濃度0.8μMで0.1M KClを含む50mM リン酸カリウ
ムバッファー pH7.0である。 変性度（％）＝（θT 222−θN 222）／（θD 222−
θN 222） （θT 222はT℃、222nmにおける平均残基分子楕円率、θ
N 222、θD 222はそれぞれ未変性及び変性酵素の222nmに
おける平均残基分子楕円率を示す。） （Ｂ）熱不活性化。酵素溶液は,指示温度で10分間加熱
される。冷却後、25℃で活性を測定する。熱処理は,タ
ンパク質濃度1.2μMでCD測定と同じバッファー中で行わ
れた。それぞれの酵素への値は、非加熱処理酵素と比較
した比活性で表した。それぞれの数値は、±10%の偏差
値を有する。
は、222nmのCDをモニターし、記録した。測定条件は、
蛋白濃度0.8μMで0.1M KClを含む50mM リン酸カリウ
ムバッファー pH7.0である。 変性度（％）＝（θT 222−θN 222）／（θD 222−
θN 222） （θT 222はT℃、222nmにおける平均残基分子楕円率、θ
N 222、θD 222はそれぞれ未変性及び変性酵素の222nmに
おける平均残基分子楕円率を示す。） （Ｂ）熱不活性化。酵素溶液は,指示温度で10分間加熱
される。冷却後、25℃で活性を測定する。熱処理は,タ
ンパク質濃度1.2μMでCD測定と同じバッファー中で行わ
れた。それぞれの酵素への値は、非加熱処理酵素と比較
した比活性で表した。それぞれの数値は、±10%の偏差
値を有する。
【図３】Asp80Tyr変異を有するKNT(KT3-11及びHTK）の
構造の３次元表示を示す図である。KNTは、ホモダイマ
ーであるが、変異残基の位置と残基番号は、一方のサブ
ユニットのためのみに示してある。KT3-11の変異残基、
HTKの追加９変異残基、カナマイシン、ATPアナログであ
るアデノシン5'-α,β-メチレントリホスフェートを表
示した。この図はMOLSCRIPT（Per Kraulis, Departme
nt of Molecular Biology, Uppsala University,
Sweden）を使って製作した。
構造の３次元表示を示す図である。KNTは、ホモダイマ
ーであるが、変異残基の位置と残基番号は、一方のサブ
ユニットのためのみに示してある。KT3-11の変異残基、
HTKの追加９変異残基、カナマイシン、ATPアナログであ
るアデノシン5'-α,β-メチレントリホスフェートを表
示した。この図はMOLSCRIPT（Per Kraulis, Departme
nt of Molecular Biology, Uppsala University,
Sweden）を使って製作した。
【図4】プラスミドpJHK3の制限酵素地図を示す図であ
る。
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/10 (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｃ１２Ｒ 1:01） //(Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） 5/00 Ａ (72)発明者 小山 芳典 茨城県つくば市吾妻１−402−1007 (72)発明者 倉光 成紀 大阪府豊中市宮山町２−16−41 (72)発明者 鏡山 博行 兵庫県西宮市甲子園口２−27−16 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA11 AA20 BA10 CA02 CA06 DA05 DA06 EA04 FA02 FA10 FA20 GA11 HA01 4B050 CC01 CC03 CC04 DD02 LL03 4B063 QA01 QA05 QA08 QQ06 QQ26 QR32 QR33 QR39 QR60 QR75 QR80 QS24 4B065 AA26X AA53Y AA54X AA72X AA90X AB01 AC02 AC10 AC14 BA02 BA25 BB37 CA29 CA46 CA60
Claims (9)
- 【請求項１】 配列番号１で表されるアミノ酸配列から
なるタンパク質に対して、Met57Leu、Ala62Val、Ser94P
ro、Ser203Pro、Asp206Val、His207Gln、Ser220Pro、Il
e234Val、及びThr238Alaからなる群から選択される１以
上の点突然変異を有し、かつ熱安定性の向上した変異型
カナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ。 - 【請求項２】 配列番号２で表されるアミノ酸配列から
なることを特徴とする、熱安定性の向上した変異型カナ
マイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ。 - 【請求項３】 配列番号３で表されるアミノ酸配列から
なることを特徴とする、請求項１に記載の変異型カナマ
イシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ。 - 【請求項４】 請求項１から３のいずれか１項に記載の
カナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼをコー
ドするカナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ
遺伝子。 - 【請求項５】 請求項４に記載の遺伝子を含有するプラ
スミド。 - 【請求項６】 請求項５に記載のプラスミドを含有する
形質転換体。 - 【請求項７】 請求項４に記載の遺伝子であることを特
徴とする、好熱菌のための選択マーカー。 - 【請求項８】 請求項７に記載の選択マーカーを使用す
ることを特徴とする、好熱菌のスクリーニング方法。 - 【請求項９】 好熱菌がThermus thermophilusであるこ
とを特徴とする、請求項８に記載のスクリーニング方
法。
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| DE60012451T DE60012451T2 (de) | 1999-10-29 | 2000-10-27 | Mutante Kanamycin-Nukleotidyltransferase und deren Verwendung zum screening thermophiler Bakterien |
| US09/697,186 US6723543B1 (en) | 1999-10-29 | 2000-10-27 | Mutant kanamycin nucleotidyltransferases from S. aureus |
| EP00309475A EP1097990B1 (en) | 1999-10-29 | 2000-10-27 | A mutant kanamycin nucleotidyltransferase and a method of screening thermophilic bacteria using the same |
| US10/718,628 US20040077016A1 (en) | 1999-10-29 | 2003-11-24 | Mutant kanamycin nucleotidyltransferase and a method of screening thermophilic bacteria using the same |
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|---|---|---|---|
| JP30961699A JP3536049B2 (ja) | 1999-10-29 | 1999-10-29 | 変異型カナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ及びこれを用いた好熱菌のスクリーニング方法 |
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| JP30961699A Expired - Fee Related JP3536049B2 (ja) | 1999-10-29 | 1999-10-29 | 変異型カナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ及びこれを用いた好熱菌のスクリーニング方法 |
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| EP (1) | EP1097990B1 (ja) |
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- 1999-10-29 JP JP30961699A patent/JP3536049B2/ja not_active Expired - Fee Related
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2003
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