JP2001046068A - 組換えハプトグロビンの製法 - Google Patents
組換えハプトグロビンの製法Info
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- JP2001046068A JP2001046068A JP11221761A JP22176199A JP2001046068A JP 2001046068 A JP2001046068 A JP 2001046068A JP 11221761 A JP11221761 A JP 11221761A JP 22176199 A JP22176199 A JP 22176199A JP 2001046068 A JP2001046068 A JP 2001046068A
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【目的】大腸菌を宿主とした遺伝子組換え技術に基づく
ハプトグロビン活性を有する組換えポリペプチドの製法
を提供する。 【構成】(ａ)ハプトグロビン活性を有する組換えポリペ
プチドをコードし、大腸菌中で複製、転写及び翻訳され
うるＤＮＡ配列を含む組換えプラスミド発現ベクター、
及び大腸菌よりなる宿主−ベクター発現系を準備し、
(ｂ)形質転換、形質導入及びトランスフェクションから
なる群から選択される方法により、組換えプラスミド発
現ベクターを大腸菌に導入し、(ｃ)導入された組換えプ
ラスミド発現ベクターを有する大腸菌を培養し、(ｄ)ハ
プトグロビン活性を有する組換えポリペプチドを発現さ
せる。
ハプトグロビン活性を有する組換えポリペプチドの製法
を提供する。 【構成】(ａ)ハプトグロビン活性を有する組換えポリペ
プチドをコードし、大腸菌中で複製、転写及び翻訳され
うるＤＮＡ配列を含む組換えプラスミド発現ベクター、
及び大腸菌よりなる宿主−ベクター発現系を準備し、
(ｂ)形質転換、形質導入及びトランスフェクションから
なる群から選択される方法により、組換えプラスミド発
現ベクターを大腸菌に導入し、(ｃ)導入された組換えプ
ラスミド発現ベクターを有する大腸菌を培養し、(ｄ)ハ
プトグロビン活性を有する組換えポリペプチドを発現さ
せる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本願発明は、血漿タンパク質に起
因する医療用薬剤に関し、詳細には、血漿タンパク質の
１つであるハプトグロビンに関し、さらに詳細には、大
腸菌を宿主とした遺伝子組換え技術に基づくハプトグロ
ビン活性を有する組換えポリペプチドの製法に関する。
さらに、本願発明は前記製法により産生されるハプトグ
ロビン活性を有する組換えポリペプチドを含有する医薬
組成物を提供する。
因する医療用薬剤に関し、詳細には、血漿タンパク質の
１つであるハプトグロビンに関し、さらに詳細には、大
腸菌を宿主とした遺伝子組換え技術に基づくハプトグロ
ビン活性を有する組換えポリペプチドの製法に関する。
さらに、本願発明は前記製法により産生されるハプトグ
ロビン活性を有する組換えポリペプチドを含有する医薬
組成物を提供する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】ハプト
グロビンは肝臓で合成され、８万５千〜４０万ダルトン
(Ｄａ)の分子量を有する血漿糖タンパク質で、生理的に
はヘモグロビンの代謝に関与する。即ち、ハプトグロビ
ンは、溶血によって生じたヘモグロビンと特異的に結合
して強固な複合体を形成しヘモグロビンを肝臓の細網内
皮系で代謝されるよう促すと同時に、腎糸球体からのヘ
モグロビンの漏出を防止して鉄の消耗、腎細尿管の障害
を防止する役割を担う。そのため、重度感染症、重度熱
傷、異型輸血、人工心肺を必要とする手術など多量の溶
血により生じたヘモグロビンの代謝のため血中のハプト
グロビンが高度に消費された場合、または低ないし無ハ
プトグロビン血漿患者にハプトグロビンを内科的に補充
することは、ヘモグロビンによる腎機能障害や貧血を防
止するという医療上の意義がある(大城孟、臨床ハプト
グロビン、永井書店、１９８７)。
グロビンは肝臓で合成され、８万５千〜４０万ダルトン
(Ｄａ)の分子量を有する血漿糖タンパク質で、生理的に
はヘモグロビンの代謝に関与する。即ち、ハプトグロビ
ンは、溶血によって生じたヘモグロビンと特異的に結合
して強固な複合体を形成しヘモグロビンを肝臓の細網内
皮系で代謝されるよう促すと同時に、腎糸球体からのヘ
モグロビンの漏出を防止して鉄の消耗、腎細尿管の障害
を防止する役割を担う。そのため、重度感染症、重度熱
傷、異型輸血、人工心肺を必要とする手術など多量の溶
血により生じたヘモグロビンの代謝のため血中のハプト
グロビンが高度に消費された場合、または低ないし無ハ
プトグロビン血漿患者にハプトグロビンを内科的に補充
することは、ヘモグロビンによる腎機能障害や貧血を防
止するという医療上の意義がある(大城孟、臨床ハプト
グロビン、永井書店、１９８７)。
【０００３】現在、ハプトグロビン製剤は、ヒト血漿か
ら分画精製されたものが用いられているが、原料血漿に
おいて各種肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、クロ
イツフェルト・ヤコブ病等の病原微生物汚染の可能性が
あり、血漿分画製剤としてのハプトグロビンを介したそ
れら病原微生物への感染の危険を完全に否定することは
困難である。また、製剤の安定供給のために原料血漿の
十分な確保は欠かせないが、少子化・高齢化に伴う輸血
可能人口の減少によりその確保が危惧される。
ら分画精製されたものが用いられているが、原料血漿に
おいて各種肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、クロ
イツフェルト・ヤコブ病等の病原微生物汚染の可能性が
あり、血漿分画製剤としてのハプトグロビンを介したそ
れら病原微生物への感染の危険を完全に否定することは
困難である。また、製剤の安定供給のために原料血漿の
十分な確保は欠かせないが、少子化・高齢化に伴う輸血
可能人口の減少によりその確保が危惧される。
【０００４】ハプトグロビンはα鎖とβ鎖とからなる
(αβ)２と表記される４量体ないし多量体であり、α鎖
はハプトグロビンの分子種の多様性を決定し、β鎖はヘ
モグロビンとの結合に関与する(Ｂｏｗｍａｎ Ｂ Ｈ,
ｅｔ ａｌ., Ａｄｖ. Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ., ｖｏｌ.
１２, ｐ.１８９〜２６１, １９８２)。塩基配列はＹａ
ｎｇ等によって最初に決定され、α鎖とβ鎖とは１つの
オープンリーディーングフレーム(ＯＲＦ)にコードされ
ていることが報告されている(Ｙａｎｇ Ｆ, ｅｔａｌ.,
Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ, ｖ
ｏｌ.８０, ｐ.５８７５〜５８７９, １９８３)。ハプ
トグロビン遺伝子が同定されたことから、遺伝子組換え
技術に基づくハプトグロビンの生産の研究が試みられて
いる。Ｓｔｒａｔｅｎ等は酵母(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｉ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)を宿主として、プレプロ
ハプトグロビン及びプロハプトグロビンの発現を試み弱
い発現を確認しているが、ヘモグロビンとの結合活性に
ついては言及していない(Ｓｔｒａｔｅｎ ｅｔ ａｌ.,
ＤＮＡ,ｖｏｌ.５, ｐ.１２９〜, １９８６)。また、Ｈ
ｅｉｎｄｅｒｙｃｋｘ等は昆虫細胞を宿主とした発現を
試み、糖鎖の付加したプロハプトグロビンの発現を認
め、ヘモグロビンとの結合活性を確認した(Ｈｅｉｎｄ
ｅｒｙｃｋｘ Ｍ ｅｔ ａｌ., Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ,ｖｏｌ.１３, ｐ.２２５
〜２３２, １９８９)。上述のごとく、組換えプレプロ
ハプトグロビン及びプロハプトグロビンの生産のいくつ
かは成功しているが、商業的には原核細胞を宿主として
用いた場合が安価で大量に生産できるので、それによる
生産が可能であることが一般的には好ましい。しかし、
今日まで原核細胞、特に大腸菌(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ)における活性型のプレプロハプトグロビン
及びプロハプトグロビンの生産は報告されていない。
(αβ)２と表記される４量体ないし多量体であり、α鎖
はハプトグロビンの分子種の多様性を決定し、β鎖はヘ
モグロビンとの結合に関与する(Ｂｏｗｍａｎ Ｂ Ｈ,
ｅｔ ａｌ., Ａｄｖ. Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ., ｖｏｌ.
１２, ｐ.１８９〜２６１, １９８２)。塩基配列はＹａ
ｎｇ等によって最初に決定され、α鎖とβ鎖とは１つの
オープンリーディーングフレーム(ＯＲＦ)にコードされ
ていることが報告されている(Ｙａｎｇ Ｆ, ｅｔａｌ.,
Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ, ｖ
ｏｌ.８０, ｐ.５８７５〜５８７９, １９８３)。ハプ
トグロビン遺伝子が同定されたことから、遺伝子組換え
技術に基づくハプトグロビンの生産の研究が試みられて
いる。Ｓｔｒａｔｅｎ等は酵母(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｉ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)を宿主として、プレプロ
ハプトグロビン及びプロハプトグロビンの発現を試み弱
い発現を確認しているが、ヘモグロビンとの結合活性に
ついては言及していない(Ｓｔｒａｔｅｎ ｅｔ ａｌ.,
ＤＮＡ,ｖｏｌ.５, ｐ.１２９〜, １９８６)。また、Ｈ
ｅｉｎｄｅｒｙｃｋｘ等は昆虫細胞を宿主とした発現を
試み、糖鎖の付加したプロハプトグロビンの発現を認
め、ヘモグロビンとの結合活性を確認した(Ｈｅｉｎｄ
ｅｒｙｃｋｘ Ｍ ｅｔ ａｌ., Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ,ｖｏｌ.１３, ｐ.２２５
〜２３２, １９８９)。上述のごとく、組換えプレプロ
ハプトグロビン及びプロハプトグロビンの生産のいくつ
かは成功しているが、商業的には原核細胞を宿主として
用いた場合が安価で大量に生産できるので、それによる
生産が可能であることが一般的には好ましい。しかし、
今日まで原核細胞、特に大腸菌(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ)における活性型のプレプロハプトグロビン
及びプロハプトグロビンの生産は報告されていない。
【０００５】先述のごとく、ヒト血漿を分画して得られ
るハプトグロビンは病原微生物の迷入、原料血漿の安定
確保という問題を抱える。また、ハプトグロビンは大量
の臨床投与量を必要とするため、遺伝子組換え技術によ
り酵母、昆虫細胞で発現されたプレプロハプトグロビン
及びプロハプトグロビンは需要を十分充たすことはでき
ず、原核細胞を宿主とした場合に比較して商業性も乏し
い。
るハプトグロビンは病原微生物の迷入、原料血漿の安定
確保という問題を抱える。また、ハプトグロビンは大量
の臨床投与量を必要とするため、遺伝子組換え技術によ
り酵母、昆虫細胞で発現されたプレプロハプトグロビン
及びプロハプトグロビンは需要を十分充たすことはでき
ず、原核細胞を宿主とした場合に比較して商業性も乏し
い。
【課題を解決するための手段】
【０００６】本願発明者らは、上記問題点を克服するた
めに鋭意研究を重ねた結果、大腸菌を宿主として用いた
場合ハプトグロビンの好適な発現が可能であること、発
現したハプトグロビンは特別な処理を施すことなく培養
の可溶性画分へ回収されること、また回収されたハプト
グロビンがヘモグロビンと結合する活性を有することを
見出し、本願発明を完成した。本願発明のハプトグロビ
ン活性を有する組換えポリペプチドの製法は、概略下記
のとおりである。 (ａ)ハプトグロビン活性を有する組換えポリペプチドを
コードし、大腸菌中で複製、転写及び翻訳されうるＤＮ
Ａ配列を含む組換えプラスミド発現ベクター、及び大腸
菌よりなる宿主−ベクター発現系を準備し、(ｂ)形質転
換、形質導入及びトランスフェクションからなる群から
選択される方法により、組換えプラスミド発現ベクター
を大腸菌に導入し、(ｃ)導入された組換えプラスミド発
現ベクターを有する大腸菌を培養し、(ｄ)ハプトグロビ
ン活性を有する組換えポリペプチドを発現させ、そして
(ｅ)上記ポリペプチドを培養物から単離する。
めに鋭意研究を重ねた結果、大腸菌を宿主として用いた
場合ハプトグロビンの好適な発現が可能であること、発
現したハプトグロビンは特別な処理を施すことなく培養
の可溶性画分へ回収されること、また回収されたハプト
グロビンがヘモグロビンと結合する活性を有することを
見出し、本願発明を完成した。本願発明のハプトグロビ
ン活性を有する組換えポリペプチドの製法は、概略下記
のとおりである。 (ａ)ハプトグロビン活性を有する組換えポリペプチドを
コードし、大腸菌中で複製、転写及び翻訳されうるＤＮ
Ａ配列を含む組換えプラスミド発現ベクター、及び大腸
菌よりなる宿主−ベクター発現系を準備し、(ｂ)形質転
換、形質導入及びトランスフェクションからなる群から
選択される方法により、組換えプラスミド発現ベクター
を大腸菌に導入し、(ｃ)導入された組換えプラスミド発
現ベクターを有する大腸菌を培養し、(ｄ)ハプトグロビ
ン活性を有する組換えポリペプチドを発現させ、そして
(ｅ)上記ポリペプチドを培養物から単離する。
【０００７】本願発明の製法は、ハプトグロビン活性を
有する組換えポリペプチドの製造に適しており、とりわ
けここに定めるプロハプトグロビンまたはプレプロハプ
トグロビンの製造に特に好適である。ここで、プロハプ
トグロビンとはα、β鎖が切断されていない未成熟のハ
プトグロビンであり、プレプロハプトグロビンとはシグ
ナル配列を有するプロハプトグロビンである。本願発明
の製法の工程(ａ)〜(ｅ)は周知の方法、例えば後記実施
例に記載されるものにより行なうことができる。本願発
明の所望のハプトグロビン活性を有するポリペプチド
は、ハプトグロビン活性を有するポリペプチドをコード
する遺伝子断片を含む組換えベクターを保持する大腸菌
からなる形質転換細胞を培養し、その培養物から採取す
ることができる。
有する組換えポリペプチドの製造に適しており、とりわ
けここに定めるプロハプトグロビンまたはプレプロハプ
トグロビンの製造に特に好適である。ここで、プロハプ
トグロビンとはα、β鎖が切断されていない未成熟のハ
プトグロビンであり、プレプロハプトグロビンとはシグ
ナル配列を有するプロハプトグロビンである。本願発明
の製法の工程(ａ)〜(ｅ)は周知の方法、例えば後記実施
例に記載されるものにより行なうことができる。本願発
明の所望のハプトグロビン活性を有するポリペプチド
は、ハプトグロビン活性を有するポリペプチドをコード
する遺伝子断片を含む組換えベクターを保持する大腸菌
からなる形質転換細胞を培養し、その培養物から採取す
ることができる。
【０００８】本願発明に用いられるハプトグロビン活性
を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ断片は、文献
既知のハプトグロビン活性を有するポリペプチドのアミ
ノ酸配列をコードする能力を有すれば、固有の塩基配列
には限定されるものではない。また、本願発明において
構築される組換えベクターも、前記アミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を有し、且つ複製可能であれば、特段の
制約を受けるものではない。本願発明の所望のハプトグ
ロビン活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子断
片を好適なベクターに組み込んで組換え発現用ベクター
を得る。このような組換え発現用ベクターを得るための
ベクターの宿主としては、大腸菌が好ましく、ベクター
として利用するＤＮＡはプラスミドが好ましい。プラス
ミドＤＮＡは、宿主細胞中にてプラスミドが増殖するた
めに必要なＤＮＡ配列、プロモーター、転写ターミネー
ター、さらに好ましくは形質転換体の選択マーカーとな
る遺伝子を含む。特に有用なベクターには、ｐＴｒｃ９
９Ａ、ｐｋｋ２２３−３、ｐＥＴ−１２、ｐＥＴ−２６
ｂ等が例示され、中でも大腸菌プラスミドベクターｐＴ
ｒｃ９９Ａは好適な態様として特記される。
を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ断片は、文献
既知のハプトグロビン活性を有するポリペプチドのアミ
ノ酸配列をコードする能力を有すれば、固有の塩基配列
には限定されるものではない。また、本願発明において
構築される組換えベクターも、前記アミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を有し、且つ複製可能であれば、特段の
制約を受けるものではない。本願発明の所望のハプトグ
ロビン活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子断
片を好適なベクターに組み込んで組換え発現用ベクター
を得る。このような組換え発現用ベクターを得るための
ベクターの宿主としては、大腸菌が好ましく、ベクター
として利用するＤＮＡはプラスミドが好ましい。プラス
ミドＤＮＡは、宿主細胞中にてプラスミドが増殖するた
めに必要なＤＮＡ配列、プロモーター、転写ターミネー
ター、さらに好ましくは形質転換体の選択マーカーとな
る遺伝子を含む。特に有用なベクターには、ｐＴｒｃ９
９Ａ、ｐｋｋ２２３−３、ｐＥＴ−１２、ｐＥＴ−２６
ｂ等が例示され、中でも大腸菌プラスミドベクターｐＴ
ｒｃ９９Ａは好適な態様として特記される。
【０００９】当該ベクターに本願発明のハプトグロビン
活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子断片を組
み込むには、これを含むＤＮＡを適当な制限酵素で切断
し、必要であれば適当なリンカーを付加した後、適当な
制限酵素で切断したベクターと結合させることにより行
なわれ、転写の下流方向へ順に、プロモーター、リ
ボソーム結合部位、開始コドン、本願発明の所望の
ハプトグロビン活性を有するポリペプチドをコードする
遺伝子断片、終始コドン及び転写ターミネーターを
含むように組換え発現用ベクターが構築される。本願発
明の製法に用いられる組換えプラスミド発現ベクター
は、後記の方法により調製される適切なベクターのいず
れであってもよい。
活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子断片を組
み込むには、これを含むＤＮＡを適当な制限酵素で切断
し、必要であれば適当なリンカーを付加した後、適当な
制限酵素で切断したベクターと結合させることにより行
なわれ、転写の下流方向へ順に、プロモーター、リ
ボソーム結合部位、開始コドン、本願発明の所望の
ハプトグロビン活性を有するポリペプチドをコードする
遺伝子断片、終始コドン及び転写ターミネーターを
含むように組換え発現用ベクターが構築される。本願発
明の製法に用いられる組換えプラスミド発現ベクター
は、後記の方法により調製される適切なベクターのいず
れであってもよい。
【００１０】得られた発現用組換えベクターを宿主細胞
に導入すれば、本願発明の所望のハプトグロビン活性を
有するポリペプチドを効率的に生産する能力を有する形
質転換体(細胞)が得られる。当該形質転換体を培養する
ことにより、細胞の内外にハプトグロビン活性を有する
ポリペプチドを発現・蓄積させることができ、当該ポリ
ペプチドを効率的に大量に調製することが可能である。
本願発明の製法において、宿主は大腸菌(Ｅ. ｃｏｌｉ)
が優先的に用いられる。用いられる菌株に特段の制約は
ないが、大腸菌ＪＭ１０９が特に好適な態様であり、Ｃ
ｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ Ｅ.ｃｏｌｉ ＪＭ１０９
(東洋紡績)として市販もされている。また、用いられる
菌株は、その変異体、組換え体及び遺伝子工学的手法に
よる誘導体等も用いられ得る。
に導入すれば、本願発明の所望のハプトグロビン活性を
有するポリペプチドを効率的に生産する能力を有する形
質転換体(細胞)が得られる。当該形質転換体を培養する
ことにより、細胞の内外にハプトグロビン活性を有する
ポリペプチドを発現・蓄積させることができ、当該ポリ
ペプチドを効率的に大量に調製することが可能である。
本願発明の製法において、宿主は大腸菌(Ｅ. ｃｏｌｉ)
が優先的に用いられる。用いられる菌株に特段の制約は
ないが、大腸菌ＪＭ１０９が特に好適な態様であり、Ｃ
ｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ Ｅ.ｃｏｌｉ ＪＭ１０９
(東洋紡績)として市販もされている。また、用いられる
菌株は、その変異体、組換え体及び遺伝子工学的手法に
よる誘導体等も用いられ得る。
【００１１】形質転換された宿主大腸菌の培養後、ポリ
ペプチド生成物を単離する場合も常法を採用することが
できる。例えば、必要に応じて細胞を破砕した後、例え
ばイオン交換、アフィニティーもしくはゲル濾過(分子
ふるい)を用いるクロマトグラフィーにより、及び／ま
たは沈降法、または他の既知のポリペプチドの精製法に
準じて所望のポリペプチドを単離することができる。な
お、組換えポリペプチドが不溶性凝集体(inclusion bod
y)として発現されている場合、及び／または変性されて
いる場合、常法により、例えば国際特許出願公報ＷＯ８
３／０４４１８号またはＥＰ特許第２２６４４８号公報
明細書の記載の方法により可溶化及び／または復元させ
ることができる。
ペプチド生成物を単離する場合も常法を採用することが
できる。例えば、必要に応じて細胞を破砕した後、例え
ばイオン交換、アフィニティーもしくはゲル濾過(分子
ふるい)を用いるクロマトグラフィーにより、及び／ま
たは沈降法、または他の既知のポリペプチドの精製法に
準じて所望のポリペプチドを単離することができる。な
お、組換えポリペプチドが不溶性凝集体(inclusion bod
y)として発現されている場合、及び／または変性されて
いる場合、常法により、例えば国際特許出願公報ＷＯ８
３／０４４１８号またはＥＰ特許第２２６４４８号公報
明細書の記載の方法により可溶化及び／または復元させ
ることができる。
【００１２】本願発明のハプトグロビン活性を有する組
換えポリペプチドを含有する組成物は、非経口用または
直腸用に適した形状を含めて、投与に適したいかなる形
状をも採用することができる。非経口用としては、組成
物は例えば注射に適した形状、例えば所望により調剤用
物質、例えば懸濁化剤、安定剤、可溶化剤、及び／また
は分散助剤を含有する水性または油性のビヒクル中の懸
濁剤、液剤または乳剤の形状をとることができる。本願
発明による組成物において、有効成分の濃度は例えば処
置される患者の老若、重症度及び目的とする効果に応じ
て異なるが、一般に２,０００〜４,０００単位／日の有
効成分量を投与するのに充分な量が用いられる。ここ
で、ハプトグロビン活性１単位とは１ｍｇのヘモグロビ
ンを結合し得る量である。
換えポリペプチドを含有する組成物は、非経口用または
直腸用に適した形状を含めて、投与に適したいかなる形
状をも採用することができる。非経口用としては、組成
物は例えば注射に適した形状、例えば所望により調剤用
物質、例えば懸濁化剤、安定剤、可溶化剤、及び／また
は分散助剤を含有する水性または油性のビヒクル中の懸
濁剤、液剤または乳剤の形状をとることができる。本願
発明による組成物において、有効成分の濃度は例えば処
置される患者の老若、重症度及び目的とする効果に応じ
て異なるが、一般に２,０００〜４,０００単位／日の有
効成分量を投与するのに充分な量が用いられる。ここ
で、ハプトグロビン活性１単位とは１ｍｇのヘモグロビ
ンを結合し得る量である。
【００１３】
【発明の効果】本願発明により、ヘモグロビンとの結合
活性を有しハプトグロビン活性を有する組換えポリペプ
チドを宿主として原核細胞を用いることにより安価で且
つ大量に提供することが可能となる。以下に、実施例を
挙げて本願発明を具体的に説明するが、本願発明はこれ
らの例に何ら限定されるものではない。
活性を有しハプトグロビン活性を有する組換えポリペプ
チドを宿主として原核細胞を用いることにより安価で且
つ大量に提供することが可能となる。以下に、実施例を
挙げて本願発明を具体的に説明するが、本願発明はこれ
らの例に何ら限定されるものではない。
【００１４】
【実施例】実施例 １ (発現プラスミドの構築)ヒト肝臓由来のｍＲＮＡプール
(Ｓａｗａｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ)より、Ｒｅａｄ
ｙ Ｔｏ Ｇｏ Ｙｏｕ−Ｐｒｉｍｅ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒ
ａｎｄ Ｂｅａｄｓ(Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ)を用いて逆転写反応を行ない、文献既知(Ｙａｎｇ
Ｆ, ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.
ＵＳＡ,ｖｏｌ.８０, ｐ.５８７５〜５８７９, １９８
３)のハプトグロビンのコード領域の３'末端プライマー
(５'−ＴＴＡＧＴＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＴ−
３')を用いてｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡを鋳型と
し、制限酵素ＮｃｏＩ認識部位を有するセンスプライマ
ー(配列番号１)と制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を有
するアンチセンスプライマー(配列番号２)のセットで、
プロハプトグロビンをコードする全長ＤＮＡをポリメラ
ーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により増幅した。２％アガー(Ｓ
ＩＧＭＡ)において電気泳動した結果、約１.０Ｋｂｐと
約１.２ＫｂｐのＤＮＡ断片が増幅されていることが確
認された(図１)。これら２本のバンドはアガーの切り出
しにより分離回収し、それぞれ制限酵素ＮｃｏＩ(宝酒
造)及びＨｉｎｄＩＩＩ(宝酒造)で同時処理した。
(Ｓａｗａｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ)より、Ｒｅａｄ
ｙ Ｔｏ Ｇｏ Ｙｏｕ−Ｐｒｉｍｅ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒ
ａｎｄ Ｂｅａｄｓ(Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ)を用いて逆転写反応を行ない、文献既知(Ｙａｎｇ
Ｆ, ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.
ＵＳＡ,ｖｏｌ.８０, ｐ.５８７５〜５８７９, １９８
３)のハプトグロビンのコード領域の３'末端プライマー
(５'−ＴＴＡＧＴＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＴ−
３')を用いてｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡを鋳型と
し、制限酵素ＮｃｏＩ認識部位を有するセンスプライマ
ー(配列番号１)と制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を有
するアンチセンスプライマー(配列番号２)のセットで、
プロハプトグロビンをコードする全長ＤＮＡをポリメラ
ーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により増幅した。２％アガー(Ｓ
ＩＧＭＡ)において電気泳動した結果、約１.０Ｋｂｐと
約１.２ＫｂｐのＤＮＡ断片が増幅されていることが確
認された(図１)。これら２本のバンドはアガーの切り出
しにより分離回収し、それぞれ制限酵素ＮｃｏＩ(宝酒
造)及びＨｉｎｄＩＩＩ(宝酒造)で同時処理した。
【００１５】大腸菌プラスミドベクターｐＴｒｃ９９Ａ
発現ベクター(Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ)もまたｔｒｃプロモーター下流を制限
酵素ＮｃｏＩ(宝酒造)及びＨｉｎｄＩＩＩ(宝酒造)で同
時処理して開裂させた。制限酵素処理したＤＮＡ断片と
ｐＴｒｃ９９Ａ発現ベクターとはＤＮＡライゲーション
キットＶｅｒ.２(宝酒造)で連結させてプロハプトグロ
ビン発現ベクターｐＴｒｃＨｐ−１.０とｐＴｒｃＨｐ
−１.２を構築した(図２)。構築したプロハプトグロビ
ン発現ベクターｐＴｒｃＨｐのプロハプトグロビンの遺
伝子配列は３７３ＡＤＮＡシークエンシングシステム
(Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ)によりダイデ
オキシ(Ｄｉｄｅｏｘｙ)法で決定し、遺伝子解析ソフト
Ｇｅｎｅｔｙｘ−ＭＡＣ ８.０(ソフトウェア開発株式
会社)によりアミノ酸配列へ変換し、既知のプロハプト
グロビンのアミノ酸配列と比較した。その結果、約１.
０Ｋｂｐの増幅断片はプロハプトグロビンα１β、約
１.２Ｋｂｐの増幅断片はプロハプトグロビンα２βで
あること、またそれらに変異のないことを確認した。
発現ベクター(Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ)もまたｔｒｃプロモーター下流を制限
酵素ＮｃｏＩ(宝酒造)及びＨｉｎｄＩＩＩ(宝酒造)で同
時処理して開裂させた。制限酵素処理したＤＮＡ断片と
ｐＴｒｃ９９Ａ発現ベクターとはＤＮＡライゲーション
キットＶｅｒ.２(宝酒造)で連結させてプロハプトグロ
ビン発現ベクターｐＴｒｃＨｐ−１.０とｐＴｒｃＨｐ
−１.２を構築した(図２)。構築したプロハプトグロビ
ン発現ベクターｐＴｒｃＨｐのプロハプトグロビンの遺
伝子配列は３７３ＡＤＮＡシークエンシングシステム
(Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ)によりダイデ
オキシ(Ｄｉｄｅｏｘｙ)法で決定し、遺伝子解析ソフト
Ｇｅｎｅｔｙｘ−ＭＡＣ ８.０(ソフトウェア開発株式
会社)によりアミノ酸配列へ変換し、既知のプロハプト
グロビンのアミノ酸配列と比較した。その結果、約１.
０Ｋｂｐの増幅断片はプロハプトグロビンα１β、約
１.２Ｋｂｐの増幅断片はプロハプトグロビンα２βで
あること、またそれらに変異のないことを確認した。
【００１６】実施例 ２ (形質転換細胞の調製)宿主大腸菌としてＣｏｍｐｅｔｅ
ｎｔ ｈｉｇｈ Ｅ.ｃｏｌｉ ＪＭ１０９(東洋紡績)を用
い、当該商品添付のプロトコールに従い形質転換を行な
った。当該大腸菌を氷上で融解して、Ｆａｌｃｏｎチュ
ーブ２０５９(ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ)に１
００μｌ移した。１００ｎｇのｐＴｒｃＨｐ−１.０ま
たはｐＴｒｃＨｐ−１.２を菌液に加えて氷中に３０分
間静置した。４２℃ヒートショックを３０秒間行ない、
直ちに氷中で２分間冷却した。添付のＳ.Ｏ.Ｃ.培地を
９００μｌ加え、３７℃で１時間振とう培養した。３,
０００ｒｍｐで５分間遠心処理してペレットにした形質
転換細胞は、Ｓ.Ｏ.Ｃ.培地を１００μｌで再浮遊し５
０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地プレート(ＢＩ
Ｏ １０１)へ塗布し、３７℃で一晩培養した。得られた
形質転換細胞コロニーは、配列番号１と配列番号２をプ
ライマーとするコロニーＰＣＲにより、プロハプトグロ
ビン遺伝子が大腸菌プラスミドベクターへ組み込まれて
いることの確認を行なった。
ｎｔ ｈｉｇｈ Ｅ.ｃｏｌｉ ＪＭ１０９(東洋紡績)を用
い、当該商品添付のプロトコールに従い形質転換を行な
った。当該大腸菌を氷上で融解して、Ｆａｌｃｏｎチュ
ーブ２０５９(ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ)に１
００μｌ移した。１００ｎｇのｐＴｒｃＨｐ−１.０ま
たはｐＴｒｃＨｐ−１.２を菌液に加えて氷中に３０分
間静置した。４２℃ヒートショックを３０秒間行ない、
直ちに氷中で２分間冷却した。添付のＳ.Ｏ.Ｃ.培地を
９００μｌ加え、３７℃で１時間振とう培養した。３,
０００ｒｍｐで５分間遠心処理してペレットにした形質
転換細胞は、Ｓ.Ｏ.Ｃ.培地を１００μｌで再浮遊し５
０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地プレート(ＢＩ
Ｏ １０１)へ塗布し、３７℃で一晩培養した。得られた
形質転換細胞コロニーは、配列番号１と配列番号２をプ
ライマーとするコロニーＰＣＲにより、プロハプトグロ
ビン遺伝子が大腸菌プラスミドベクターへ組み込まれて
いることの確認を行なった。
【００１７】実施例 ３ (発現タンパク質の確認)ＬＢ培地で一晩培養したｐＴｒ
ｃＨｐ−１.２で形質転換した細胞を、Ｌｕｒｉａ−Ｂ
ｒｏｔｈ(ＬＢ)培地(ＢＩＯ １０１)で希釈して０.１／
Ａ６００に調整した。３７℃で振とう培養して０.５／
Ａ６００に上昇した時点で３−インドールアクリル酸
(和光純薬工業)を終濃度５０μｇ／ｍｌになるように添
加して、さらに３時間培養した。細胞は１０,０００ｒ
ｐｍで１０分間遠心処理してペレットにし、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ含有リン酸緩衝化生理食塩水(ＰＢＳ)で２０／Ａ
６００に調整した後、ソニケーターで１.７アンペアの
条件下、１０分間菌体を破砕した。その後、１０,００
０ｒｐｍで１０分間遠心処理して上清のみを回収した。
上清は等容積の２Ｘサンプル処理バッファーと混和して
３分間ボイルし、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)でタンパク泳動を行なった。ま
た、同時に標準品としてｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ１−１
(ＳＩＧＭＡ)もタンパク泳動を行なった。電気泳動した
タンパク質は、ウェスタンブロッティングでイモビロン
トランスファーメンブレン(ミリポア)へ転写し、抗ヒト
ハプトグロビン抗血清・ＨＲＰ標識(ＥＹ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ,Ｉｎｃ.)により発現タンパク質の検出を
行なった(図３)。その結果、予想される分子量４３,５
００ダルトン(Ｄａ)に相当する特異バンドが検出され
た。
ｃＨｐ−１.２で形質転換した細胞を、Ｌｕｒｉａ−Ｂ
ｒｏｔｈ(ＬＢ)培地(ＢＩＯ １０１)で希釈して０.１／
Ａ６００に調整した。３７℃で振とう培養して０.５／
Ａ６００に上昇した時点で３−インドールアクリル酸
(和光純薬工業)を終濃度５０μｇ／ｍｌになるように添
加して、さらに３時間培養した。細胞は１０,０００ｒ
ｐｍで１０分間遠心処理してペレットにし、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ含有リン酸緩衝化生理食塩水(ＰＢＳ)で２０／Ａ
６００に調整した後、ソニケーターで１.７アンペアの
条件下、１０分間菌体を破砕した。その後、１０,００
０ｒｐｍで１０分間遠心処理して上清のみを回収した。
上清は等容積の２Ｘサンプル処理バッファーと混和して
３分間ボイルし、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)でタンパク泳動を行なった。ま
た、同時に標準品としてｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ１−１
(ＳＩＧＭＡ)もタンパク泳動を行なった。電気泳動した
タンパク質は、ウェスタンブロッティングでイモビロン
トランスファーメンブレン(ミリポア)へ転写し、抗ヒト
ハプトグロビン抗血清・ＨＲＰ標識(ＥＹ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ,Ｉｎｃ.)により発現タンパク質の検出を
行なった(図３)。その結果、予想される分子量４３,５
００ダルトン(Ｄａ)に相当する特異バンドが検出され
た。
【００１８】実施例 ４ (ヘモグロビン結合活性測定)実施例３で得た上清１００
μｌを５ｍｇ／ｍｌヘモグロビン−Ａ０(ＳＩＧＭＡ)固
相、スキムミルク(生化学工業)ブロッキング９６ウェル
マイクロプレート(Ｎｕｎｃ)へ加え、３７℃で１時間吸
着した。０.０５％ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ(ＰＢＳ−
Ｔ)でプレートを５回洗浄して５％スキムミルク加ＰＢ
Ｓ−Ｔで５,０００倍希釈した抗ヒトハプトグロビン抗
血清・ＨＲＰ標識を１００μｌ加え、室温で１時間吸着
した。ＰＢＳ−Ｔでプレートを５回洗浄し、ＴＭＢＺ発
色液(同仁化学)で呈色させた。吸光度は、Ｔｈｅｒｍｏ
ＭＡＸ(ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ)で測定した
(図４)。その結果、組換えプロハプトグロビンを含む上
清は対照の未形質転換細胞の上清に比べて明らかに吸光
度は高く、従って、本願発明で提供される組換えプロハ
プトグロビンはヘモグロビンとの結合活性を有すること
が確認された。
μｌを５ｍｇ／ｍｌヘモグロビン−Ａ０(ＳＩＧＭＡ)固
相、スキムミルク(生化学工業)ブロッキング９６ウェル
マイクロプレート(Ｎｕｎｃ)へ加え、３７℃で１時間吸
着した。０.０５％ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ(ＰＢＳ−
Ｔ)でプレートを５回洗浄して５％スキムミルク加ＰＢ
Ｓ−Ｔで５,０００倍希釈した抗ヒトハプトグロビン抗
血清・ＨＲＰ標識を１００μｌ加え、室温で１時間吸着
した。ＰＢＳ−Ｔでプレートを５回洗浄し、ＴＭＢＺ発
色液(同仁化学)で呈色させた。吸光度は、Ｔｈｅｒｍｏ
ＭＡＸ(ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ)で測定した
(図４)。その結果、組換えプロハプトグロビンを含む上
清は対照の未形質転換細胞の上清に比べて明らかに吸光
度は高く、従って、本願発明で提供される組換えプロハ
プトグロビンはヘモグロビンとの結合活性を有すること
が確認された。
【００１９】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110>JURIDICAL FOUNDATION THE CHEMO-SERO-THERAPEUTIC RESEARCH INSTITUTE <120> <130>P11-006 <160>2 <210>1 <211>30 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Antisense primer designed for preparation of haptoglobin by PCR amp lification <400>1 ccccccatggtggactcaggcaatgatgtc 30 <210>2 <211>30 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Antisense primer designed for preparation of haptoglobin by PCR amp lification <400>2 tttttaagcttagttctcagctatggtctt 30
【図１】ヒト肝臓ＲＮＡを鋳型として逆転写反応及びＰ
ＣＲによって増幅されたＤＮＡ断片の泳動パターンを示
す電気泳動図(図面代用写真)である。
ＣＲによって増幅されたＤＮＡ断片の泳動パターンを示
す電気泳動図(図面代用写真)である。
【図２】本願発明の発現プラスミドの構造模式図であ
る。
る。
【図３】ウェスタンブロッティングによる遺伝子組換え
ハプトグロビンの検出を示す電気泳動図(図面代用写真)
である。
ハプトグロビンの検出を示す電気泳動図(図面代用写真)
である。
【図４】本願発明の組換えプロハプトグロビンのヘモグ
ロビンに対する結合活性を示す図である。
ロビンに対する結合活性を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/04 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 野崎 周英 熊本県菊池郡旭志村川辺四の西沖1314−１ 財団法人化学及血清療法研究所菊池研究所 内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA63 BA80 CA04 DA06 EA04 GA11 GA19 HA01 HA14 HA15 4B064 AG01 CA02 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26X AA93Y AB01 AC14 BA02 BB01 BD01 BD15 CA24 CA44 4C084 AA01 AA06 BA34 BA44 CA53 DC50 MA17 MA22 MA23 MA60 MA66 4H045 AA20 AA30 CA40 DA65 EA24 EA26 FA74
Claims (4)
- 【請求項１】 以下の工程： (ａ)ハプトグロビン活性を有する組換えポリペプチドを
コードし、大腸菌中で複製、転写及び翻訳されうるＤＮ
Ａ配列を含む組換えプラスミド発現ベクター、及び大腸
菌よりなる宿主−ベクター発現系を準備し、(ｂ)形質転
換、形質導入及びトランスフェクションからなる群から
選択される方法により、組換えプラスミド発現ベクター
を大腸菌に導入し、(ｃ)導入された組換えプラスミド発
現ベクターを有する大腸菌を培養し、(ｄ)ハプトグロビ
ン活性を有する組換えポリペプチドを発現させ、そして
(ｅ)上記ポリペプチドを培養物から単離することからな
る、ハプトグロビン活性を有する組換えポリペプチドの
製法。 - 【請求項２】 ハプトグロビン活性を有する組換えポリ
ペプチドが、プロハプトグロビンである請求項１記載の
製法。 - 【請求項３】 ハプトグロビン活性を有する組換えポリ
ペプチドを含有する医薬組成物。 - 【請求項４】 ハプトグロビン活性を有する組換えポリ
ペプチドが請求項１または請求項２のいずれかに記載の
製法より得られるものである請求項３記載の医薬組成
物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11221761A JP2001046068A (ja) | 1999-08-04 | 1999-08-04 | 組換えハプトグロビンの製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11221761A JP2001046068A (ja) | 1999-08-04 | 1999-08-04 | 組換えハプトグロビンの製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001046068A true JP2001046068A (ja) | 2001-02-20 |
Family
ID=16771799
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11221761A Withdrawn JP2001046068A (ja) | 1999-08-04 | 1999-08-04 | 組換えハプトグロビンの製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001046068A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110724185A (zh) * | 2019-10-21 | 2020-01-24 | 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 | 重组人结合珠蛋白β亚基蛋白的表达和纯化方法 |
-
1999
- 1999-08-04 JP JP11221761A patent/JP2001046068A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110724185A (zh) * | 2019-10-21 | 2020-01-24 | 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 | 重组人结合珠蛋白β亚基蛋白的表达和纯化方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20061107 |