【発明の詳細な説明】
ライノウイルス感染症の治療方法
技術分野
本発明は、一般にウイルス感染症の治療法、より明確にはライノウイルス感染
症の治療方法に関する。
背景技術
しばしば「普通感冒」として臨床的に分類される、急性無熱性上気道疾患は、
最も高頻度に発生するヒトの疾患の1つである。本疾患は典型的には致命的では
ないが、米国だけで職場及び学校において毎年2億人日以上の損失を生じる程、
多大な被害を引き起こしている。B.D．Davis et al.，Microbiology，1114ペー
ジ(第三版、1980)。普通感冒の患者からウイルスが初めて分離された1956年以来
、113種類以上の免疫学的には異なるが、生物学的には関連性のあるウイルスが
分離されている。同上、1115ページ。これらのウイルスの化学および物理特性に
より、これらはピコルナウイルス科に属するものとして、より明確にはRhinovir
idiaeまたはライノウイルスとして公知の属に分類された。ライノウイルスは、
小さな(直径17-30nm)、エンベロープを持たないRNA含有ビリオンで、構造は立方
形でエーテル処理に抵抗性がある。現在、ライノウイルス感染症は、小児と成人
の全呼吸器疾患の約40％の原因と考えられている。V．Knight，Common Viral R
espiratory Illness，in Harrison's Principles of Internal Medicine,第8版
、988-990ページ(G.W．Thorn et al.編、1977)。
ライノウイルス感染症の治療法として、ワクチン接種、空気滅菌、種々の医薬
品投与等の幾つかの方法が提唱されてきたが、完全な有効性が証明されたものは
皆無である。有用なライノウイルスワクチンの開発の障害として、特異的感染型
に対する天然の免疫原性期間が短いこと、ライノウイルスの抗原型が非常に多数
であること、地域社会に存在する型が毎年変化することが挙げられる。J.L．Mel
nick et al.，McGraw-Hill Encyclopedia of Science and Technology，第7版15
、454ページ(1992)。現行の治療方法は、症状の改善に限定され、しばしば抗ヒ
スタミン薬およびその他の薬物の形態を取る。従って、有効かつ安全で実際的な
ライノウイルス感染症の治療方法の開発が望まれている。
発明の概要
前記の観点から、ライノウイルス感染症の有効かつ実際的な治療方法を提供す
ることが本発明の第一の目的である。
本発明の第二の目的は、ライノウイルス感染症の治療に有用な医薬処方を提供
することである。
2'-5'オリゴアデニレート（2'-5'−Ａ）とそれらの類似体がライノウイルス感
染症の治療に驚くほど有効であることが現在発見されている。従って、本発明の
第一の側面は、その様な治療が必要な被検対象におけるライノウイルス感染症の
治療方法である。本方法は、ライノウイルス感染症の治療有効量の下記の式Iの
化合物又は薬理学的に許容可能なその塩(以降、「活性化合物」と呼ぶ)を、被検対
象（患者）に投与することを含む。
式中、nは0、1、2または3であり、
各R1およびR2は水素、ハロゲン、N3から成るグループから独立して選択され、
各R5は独立して水素または-OHであり、
各R6は独立して水素または-OHであり、
R7はO-または-OHであり、
R9は水素または-OHであるが、但し、R9が-OHの場合、R5は水素であり、
Yは
であり、
（式中、mは1、2または3である）
Xは、-CHOHCH2OHであるか、または、
から成るグループから選択され、
（式中、R3およびR4はそれぞれ独立して、水素、-OHおよび-PO4 -2から成るグル
ープから選択され、あるいはR3およびR4は一緒になってシクロホスフェートを表
し、Aは
から成るグループから選択され、この場合R1およびR2は上記記載通りであり、R8
は水素、シアン、アミドから成るグループから選択される）
各Zは独立して0またはSであり、
各Z'は独立して0またはSである。
本発明の好ましい一実施例において、Yは-OHである。本発明の別の好ましい実
施例においてXはである。
ここで、Aは
である。
（式中、R1およびR2は水素であり、R3は-OHであり、かつ、R4は-PO4 -2であるか
、あるいは、
R3はPO4 -2であり、かつ、R4は-OHであるか、あるいは、
R3およびR4は共に-OHであるか、あるいは
R3およびR4は一緒になってシクロホスフェートを表し、
R5は-OHであり、
R9は水素であり、
ZおよびZ'は共に0である。
本発明の第二の側面は、薬理学的に許容可能な担体を組み合わせた、上記活性
化合物から成る、ライノウイルス感染症を治療するために医薬製剤である。
本発明の第三の側面は、上記の治療方法の実施に有用な薬物製造のための本明
細書に開示されている活性化合物の使用である。
発明の詳細な説明
上記の様に、本発明の方法は、ライノウイルスにより引き起こされる感染症の
治療に有用である。一般に、ライノウイルス感染症(「病態」)は、鼻閉および鼻
汁、くしゃみ、中等度の咽喉痛、通常は発熱を伴わない軽度の全身症状を特徴と
する。年少小児において、これらの病態は、咳、クルップ、肺炎により更に重症
化することがある。本発明の方法は、これらの病態の発症、進行、拡大を抑制し
、病態の緩解を引き起こし、病態を直し、あるいは病態に罹患した、あるいは病
態に罹患する危険性のある患者の全身状態を改善する点で、これらの病態の治療
に
有用である。
本発明の方法により治療される対象は、典型的には人間の被検対象（患者）で
あるが、本発明の方法は、獣医学を目的として、哺乳動物を含む本技術に精通す
る者にとって公知の適切な被検対象対象全てに有用と思われる(例、ウマ、イヌ
、ネコ)。例えば、本方法は、芸当ができる、あるいはレーシング用動物(例、グ
レーハウンド、競馬用ウマ、または馬術競技に使用されるウマ、およびサーカス
の動物)のライノウイルス感染症の治療に特に有用と思われる。
本明細書に使用されている様に、「ライノウイルス」という言葉は、ピコナウ
イルス科、より明確にはウイルスRhinoviridiae属に属するウイルスを指す。ラ
イノウイルスビリオンは、一本鎖RNAを含み、エンベロープを持たないキャプシ
ドを有し、立方体キャプシドが対称であることを特徴とする。上記Knight、988
ページ参照。ライノウイルスは、低いpHで不活化され、50℃でその感染力を維持
し、CsClにおいてより高い浮揚密度を有する点でその他のピコナウイルスとはっ
きり区別できる。上記Davis et al.，1115ページ。
上記の様に、113種類以上の免疫学的に区別されるライノウイルス(RV)が分離
されており、個々の血清型または「型」が数字により明示されている。従って、
ライノウイルス1型はRV-1と表示され、ライノウイルス1型B亜型はRV-1Bと表示さ
れる。本発明は、あらゆるライノウイルス型により引き起こされるライノウイル
ス感染症の治療に有用である。好ましい一実施例において、本発明の方法は、ラ
イノウイルス1型(A(RV-1A)およびB(RV-1B)亜型を含むRV-1)、ライノウイルス2型
(RV-2)、ライノウイルス14型(RV-14)、ライノウイルス39型(RV-39)から成るグル
ープから選択されるライノウイルス型により引き起こされるライノウイルス感染
症の治療に有用である。
本発明の活性化合物は、一般に抗ライノウイルス活性を有する2'-5'オリゴア
デニレートとそれらの類似体である。特に、本発明の活性化合物は、上記記載の
式
Iの化合物である。
本発明の特に好ましい一実施例において、上記式IのY基は-OHである。別の本
発明の特に好ましい一実施例において、Xは、
である。Aは、
R1およびR2は水素であり、
R3は-OHであり、かつ、R4は-PO4 -2であるか、あるいは、
R3はPO4 -2であり、かつ、R4は-OHであるか、あるいは
R3およびR4は共に-OHであるか、あるいは
R3およびR4は一緒になってシクロホスフェートを表し、
R5は-OHであり、
R9は水素であり、
ZおよびZ'は共に0である。
2'-5'オリゴアデニレート化合物とそれらの類似体は公知である。化合物の具
体例として、2'-5'オリゴアデニレート、Budowsky，et al.,のドイツ特許DE 42
11 237 A１に開示されている2'-5'オリゴアデニレート-2',3'シクロホスフェー
ト、Budowsky，et al.,のドイツ特許DE 42 11 238 C2に開示されている2'-5'オ
リゴアデニレートホスフェート含有誘導体、Suhadolnikの米国特許No.4,990,498
に開示
されている2'-アジド(2'-5')オリゴアデニレートおよび8-アジド(2'-5')オリゴ
アデニレート、Suhadolnikの米国特許No.5,188,897に開示されている2'-5'ホス
ホロチオエートオリゴアデニレート、Torrence et al.，の米国特許No.4,515,78
1に開示されている2'-5'リボアデニレートモルフォリノオリゴヌクレオチド、Su
hadolnikの米国特許No.4,464,359に開示されている(2'-5')-オリゴ(3'-デオキシ
アデニレート)とそれらの誘導体、Suhadolnikの米国特許No.4,859,768に開示さ
れている2'-5'オリゴアデニレートコルジセピン類似体、Imbach et al.の米国特
許No.4,476,301に開示されている2'-5'オリゴキシロアデニレート、Lebleu et a
l.の米国特許No.4,981,957に開示されている2'-5'オリゴアデニレートの8-アザ
アデノシンン、サギバマイシン、トヨカマイシン、ツベリシジン、8-ブロモ-ア
デノシン類似体が挙げられる。(出願人は、これらの特許引用文献と本明細書に
引用されているその他の全ての特許引用文献を、引用する事により完全に本明細
書の一部を成すこととすることを特に意図している。)
本発明の実施に有用な特定の化合物として、2',3'-シクロホスフェートアデニ
リル(2',5')アデニリル-(2',5')アデノシン(パピリンAIII)、2',3'-シクロホス
フェートアデニリル(2',5')アデニリル(2',5')アデニリル-(2',5')アデノシン(
パピリンAIV)、2',3'-シクロホスフェートアデニリル(2',5')アデノシン(パピリ
ンAII)、2'-ホスフェートアデニリル(2',5')アデニリル-(2',5')アデノシン(パ
ピリンBIII)、3'-ホスフェートアデニリル(2',5')アデニリル-(2',5')アデノシ
ン(パピリンBIII)、2'-ホスフェートアデニリル(2',5')アデニリル(2',5')アデ
ニリル-(2',5')アデノシン(パピリンBIV)、3'-ホスフェートアデニリル(2',5')
アデニリル(2',5')アデニリル-(2',5')アデノシン(パピリンBIV)、2'-ホスフェ
ートアデニリル(2',5')アデノシン(パピリンBII)、3'-ホスフェートアデニリル(
2',5')アデノシン(パピリンBII)、アデニリル(2',5')アデニリル(2',5')アデノ
シン(パピリンCIII)、アデニリル(2',5')アデニリル(2',5')アデニリル(2',5')
アデノシン(パピリ
ンCIV)、アデニリル(2',5')アデノシン(パピリンCII)、アデニリル(2',5')3'-デ
オキシアデニリル(2',5')3'-デオキシアデノシンおよびその5'モノホスフェート
、5'ジホスフェート、および5'トリホスフェート、3'-デオキシアデニリル(2',5
')3'-デオキシアデノシンおよびその5'モノホスフェート、5'ジホスフェート、
および5'トリホスフェート、アデニリル(2',5')アデニリル(2',5')ツベルシジン
およびその5'モノホスフェート、5'ジホスフェート、および5'トリホスフェート
、5'-0-p-メトキシトリチルアデニリル(2',5')アデニリル(2',5')アデノシン、
キシロアデニリル(2',5')キシロアデニリル(2',5')キシロアデノシン、(Rp)-P-
チオアデニリル-(2',5')-(Sp)-チオアデニリル(2',5')アデノシン、および(Sp)-
P-チオアデニリル-(2',5')-(Rp)-チオアデニリル(2',5')アデノシンが挙げられ
るが、これらに限定されない。
本発明の化合物は、本技術に精通する者にとって明らかな化学酵素合成法を用
いて調製できる。例えば、2'-5'オリゴアデニレート-2'3'-シクロホスフェート
は、2'(3')アデノシンモノホスフェートの化学的重合により、Michaelsonの手順
(A．M．Michaelson，The Chemistry of the Nucleosides and Nucleotides，418
-19(1963))を用いて、不規則な2',5'および3',5'ヌクレオチド間結合を有するポ
リアデニル酸を開始物質として調製される。その後リボヌクレアーゼによりこの
ポリマーの3'5'結合を切断し、2',3'シクロホスフェート基末端を含む混合物と
共にモノマーと種々の長さの2'-5'オリゴアデニレートが得られる。この混合物
のpHを低く保つことにより、シクロホスフェートを開環させ、本発明の方法にお
いて有用なその他の化合物を提供することができる。本発明において有用な化合
物を供給するのに有用な更なる合成経路が、Lebleu et alの米国特許No.4,981,9
57、Suhadolnik et al.の米国特許No.4,708,935、Suhadolnik et al.の米国特許
No.4,990,498、Torrence et al.の来国特許No.4,515,781、Imbach et al.の米国
特許No.4,476,301に開示されている。
本明細書に記載されている活性化合物は、上記の様にそれらの薬理学的に許容
可能な塩の形態で調製できる。薬理学的に許容可能な塩は、親化合物の所望の生
物活性を保持し、望ましくない毒性作用を発揮しない。この様な塩の具体例とし
て、アンモニウム塩のような塩基由来の塩、ナトリウムおよびカリウム塩の様な
アルカリ金属塩、カルシウムおよびマグネシウム塩の様なアルカリ土類金属塩、
トリエチルアミン、ジシクロヘキシルアミンなどの有機塩基を有する塩が挙げら
れる。
活性化合物の細胞内輸送を促進するために、Suhadolnik et al.の米国特許No.
5,405,939に記載されているように、化合物は高分子担体(例、ポリ(L-リジン))
と結合させることもできる。
特定の化合物の治療有効量は、その利用が本発明の範囲内である場合、化合物
によって、また患者によって多少異なり、患者の状態と投与経路によって異なる
。一般に、約100ng/kgから約1mg/kgの投与量が治療効果を有し、約10μｇ/kgか
ら100μｇ/kgが好ましく、塩が使用される場合も含めて、全重量は活性基剤の重
量に基づき計算される。経口投与には、約10μｇ/kgから約10mg/kgが用いられ、
約1mg/kgから約10mg/kgが好ましい。投与は1日1回または数回、1日から10日間ま
たはライノウイルス感染症が本質的に抑制されるまで投与できる。より少ない投
与量を回数を減らして投与する方法は、感染症の再発を予防または減少させるた
めに利用できる。
投与される活性化合物の特定の処方の溶解度により、1日量を1回で服用するか
、あるいは数回に分服できる。投与量は1回分の投与量にする事が可能で、例え
ば、1週間に数回、または１日に1回から3回投与できる。投与は必要に応じて慢
性的に数週間可能である(即ち、活性薬物は反復投与が可能である。)。活性化合
物の投与は治療または予防のために実施例できるが、好ましくは、化合はライノ
ウイルス感染症の症状が発現する前またはこの様な症状が最初に出現した時点で
、治療
のために投与される。
本法に従って、本明細書に記載されている活性化合物は、経口、非経口(皮下
、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内を含む)、吸入、直腸、局所(口内、舌下、皮膚
、眼内を含む)および経皮投与に適した薬剤として調製される。
本発明の薬物(「薬剤」)の製造において、活性薬物または薬理学的に許容可能
なその塩(「活性化合物」)は典型的には、とりわけ許容可能な担体と混合される
。勿論、担体は薬剤中の他の全ての成分と混合しても化学反応を起こさないとい
う意味で許容可能でなくてはならず、患者に有害であってはならない。担体は、
固体または液体、あるいはその両者が可能で、好ましくは、例えば、0.05から99
重量％の活性化合物を含有する錠剤の様な1回分の薬剤として化合物とともに処
方される。1種類以上の上記の活性化合物を本発明の薬剤に含めることができ(例
えば、薬剤は、1種類以上の更なる抗ウイルス薬を含んでよい)、これらの薬剤は
、調剤法が本質的に１種類以上の補助的治療成分を含む成分の混合によるもので
あれば、公知の技術のいずれによっても調製できる。
活性化合物またはそれらの塩に加えて、医薬組成物は、pH調製剤の様なその他
の添加物を含めることができる。特に、有用なpH調製剤として、塩酸のような酸
、乳酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、燐酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホ
ウ酸ナトリウムまたはグルコン酸ナトリウム等の塩基または緩衝液が挙げられる
。更に、組成物は殺菌防腐剤を含めることができる。有用な殺菌防腐剤として、
メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコールが挙げられる。典型的
には、殺菌防腐剤は、複数回使用用に考案されたバイアルに本処方が入っている
場合に使用される。勿論、表示されているように、本発明の医薬組成物は本技術
において公知の技術を用いて凍結乾燥できる。
本明細書に使用されている「水溶性」と言う言葉は、約50mg/mL以上水に溶解
する全ての組成物を定義している。本明細書に使用されている「非水溶性」とい
う
言葉は、水に対する溶解度が約1mg/mL未満である全ての組成物を定義している。
約1mg/mLから約60mg/mLの量が水に溶解する組成は、「部分的水溶性」と定義さ
れる。応用例によっては、水溶性化合物または塩が望ましい場合も、非水溶性化
合物または塩が望ましい場合もある。
医薬組成物は、水性基剤エマルジョンの様な、非水溶性活性化合物またはその
塩から調製される。この様な場合、組成物は、所望の量の活性化合物またはその
塩を乳化するために、十分量の薬理学的に許容可能な乳化剤を含む。
更に、本発明は、活性化合物およびその塩のリポソーム剤を提供する。リポソ
ーム懸濁液の形成技術は本技術において公知である。活性化合物またはその塩が
水溶性塩である場合、従来のリポソーム技術を用いて、同物質は脂質小胞内に組
み入れられる。この様な場合、化合物または塩の水溶性により、化合物または塩
は実質的にリポソームの親水性中心部またはコア内に入れられる。使用される脂
質層は、従来の組成物の全てが可能で、コレステロールを含んでも、含まなくて
もよい。目的の化合物または塩が非水溶性の場合、同様に従来のリポソーム形成
技術を使用し、塩はリポソームの構造を形成する疎水性脂質二重層内に入れられ
る。いずれの場合も、生成されるリポソームは標準超音波処理およびホモジナイ
ゼーションにより、大きさを縮小できる。
勿論、活性化合物またはその塩を含むリポソーム処方は、凍結乾燥物を生成す
るために凍結乾燥でき、これは水の様な薬理学的に許容可能な担体を用いて、再
構成し、リポソーム懸濁液を再生できる。
経口投与に適した薬剤は、予め決定された量の活性化合物をそれぞれ含むカプ
セル、カシエ、トローチ、または錠剤のような個別単位として、粉末または顆粒
として、水性または非水性溶液または懸濁液として、あるいは水中油または油中
水エマルジョンとして提供できる。この様な薬剤は、活性化合物と適切な担体を
混合する(１種類以上の上記補助成分を含んでよい。)工程を含む適切な調剤方法
の
いずれによっても調製できる。一般に、本発明の薬剤は、活性化合物を液体また
は微細に分割された固体担体、またはその両者と均質かつ完全に混合し、次に必
要な場合には得られた混合物を成形することにより調製される。例えば、錠剤は
、任意で1種類以上の補助成分と共に、活性化合物を含む粉末または顆粒を圧縮
または成形することにより調製される。圧縮錠剤は、適切な機械により、任意で
結合剤、潤滑剤、不活性の希釈剤、および/または表面活性剤/分散剤と混合した
粉末または顆粒の様な流動体の化合物を圧縮することにより調製される。好まし
くは、経口投与処方は、処方が胃の中で分解されるのを防止し、小腸内で薬物を
放出させるための本技術において公知の腸溶コーティングを含めることができる
。また、活性化合物の胃腸(GI)管における消化を克服するために処方の投与を多
少増加させることもできる。あるいは、胃腸管の酵素にとっての競合基質を提供
するために、「競合する化合物」(例えば、3'5'-オリゴアデニレート化合物)を
活性化合物と組み合わせて投与できる。
口内(舌下)投与に適した薬剤には、通常スクロース、アラビアゴム、トラガン
トゴム等の香料付き基剤に含めた活性化合物を含むトローチ、ゼラチン、グリセ
リンまたはスクロースおよびアラビアゴムなどの不活性基剤に含めた化合物から
成る菱形錠剤が挙げられる。
非経口投与に適した本発明の薬剤は、活性化合物の滅菌水性および非水性注入
製剤から成り、好ましくは、目的のレシピエントの血液と等張である。これらの
製剤は、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、処方を目的のレシピエントの血液と等張
にする溶質を含むことができる。水性および非水性滅菌懸濁液は、懸濁剤と濃厚
剤を含むことができる。薬剤は、例えば、密封アンプルおよびバイアルのような
単位投与用または複数回投与用容器に入れて提供でき、凍結乾燥状態で保存でき
、使用直前に滅菌液体担体、例えば、食塩水または注射用水を添加するだけでよ
い。既述の種類の滅菌粉末、顆粒、錠剤から、間に合わせの注射液および懸濁液
を調
製できる。
吸入によりエアゾールとして適切な医薬組成物も提供される。これらの薬剤は
、所望の活性化合物またはその塩または化合物または塩の複数の固体粒子の溶液
または懸濁液から成る。所望の薬剤を小さな容器に入れ、噴霧する。薬液噴霧は
、圧縮エアーまたは超音波エネルギにより複数の化合物または塩の液滴または固
体粒子を形成することにより行われる。液滴または固体粒子は、約0.5から約5ミ
クロンの大きさの粒子である。固体粒子は、微粉化の様な本技術において公知の
適切な方法のいずれによっても、固体活性化合物またはその塩を処理することに
より得ることができる。最も好ましくは、固体粒子または小滴の大きさは、約1
から約2ミクロンである。この観点から、市販ネブライザーをこの目的に利用で
きる。
好ましくは、エアゾールとして投与するのに適した医薬製剤は、液体であり、
本薬剤は、水から成る蛋白質に含めた本発明の水溶性活性化合物またはその塩を
含んでなる。薬液噴霧を行う際、所望の大きさの範囲内の薬剤の小滴が得られる
程十分に薬剤の表面張力を小さくするための表面活性剤を含めてよい。
直腸投与に適した薬剤は、好ましくは、単回投与用座薬として提供される。こ
れらは、ココアバターの様な1種類以上の従来の固体担体と活性化合物を混合し
、次いで、最終混合物に成形することにより調製される。
皮膚への局所塗布に適した薬剤は、好ましくは、軟膏、クリーム、ローション
、ペースト、ジェル、スプレー、エアゾール、またはオイルの形態を取る。使用
可能な担体として、グリコール、アルコール、経皮増強剤、および2種類以上の
それらの組み合わせが挙げられる。
経皮投与に適した薬剤は、長時間レシピエントの表皮に密着する様に調整され
たばらの小布として提供される。経皮投与に適した薬剤は、イオン導入法により
投与可能で(例えば、Pharmaceutical Research 3，318(1986)参照。)、典型的に
は、活性化合物の随意の緩衝液の形態を取る。
以下の具体例は、本発明を説明するためのもので、それを制限することを目的
とするものではない。これらの具体例において、Mはモルを意味し、mMはミリモ
ル、μＭはマイクロモル、nmはナノメーター、mlはミリリットル、μｌはマイク
ロリットル、℃は摂氏温度、gはグラム、μｇはマイクログラムを意味する。
例1
実験材料
細胞:A-549(ヒト肺癌)細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATC
C,ロックビル、メリーランド州)から入手した。これらを、10％牛胎児血清(FBS
、HyClone Laboratories、ローガン、ユタ州)を補足したダルベッコの最小必須
培地(DMEM、Gibco，ゲイサーズバーグ、メリーランド州)にて増殖させた。細胞
をウイルスに感染させた時点で、テスト培地は0.1％NaHCO3と50μｇ/mlゲンタマ
イシンと共に2％FBSを含んでいた。
ウイルス:ライノウイルス(RV)2型、GPH株はATCCから入手した。ウイルスは細
胞において継代し、プールを調製し、アンプルに詰め、-80℃で凍結した。以下
の実験で使用する前に、A-549細胞において凍結ウイルスのアリコートの力価を
測定した。
パピリン:パピリンAIIIは、デューク大学化学部(ダラム、ノースカロライナ州
)Dr．Edward I．Budowskyから7本のエッペンドルフ試験管に入った状態で入手し
た。試験管は、PS-1AからPS-1Gと表示された。1本の試験管の中身を3.75mlの滅
菌食塩水に溶解して、約10-3MパパリンAIII溶液を調製した。この溶液の20μＬ
を、滅菌注射用水に1:100の希釈率で希釈した。この溶液に関して波長260nm(OD2 60
)で確認された光学濃度は、0.462で測定された。標準比:比率式を用いて、OD2 60
の測定値0.370が10-5M(10μＭ)と等しいことから、最初の1:100パパリンA溶液
の濃度は12.49μＭと計算された。
最初の溶液の一部を、DMEMに1:3.95で希釈し、最終濃度632μＭとした。マイ
ク
ロプレートの個々のウェルに加える時、この溶液の2分の1log10希釈により、200
、63.2、20、6.3、2.0、0.63μＭの濃度の溶液を調製した(下記具体例2参照。)
。単独またはウイルスを含めて使用される等量の更なるテスト培地を各ウェルに
加えると、パパリンAIIIの最終濃度は316、100、31.6、10、3.16、1.0および0.3
16μＭとなった。
ポジティブコントロールとして以下の実験に使用される公知の抗ウイルス薬、
リバビリンは、ICN Pharmaceuticals，Inc．(コスタメサ、カリフォルニア州)か
ら入手した。この材料も、以下の実験に使用するために最初食塩水に溶解した。
その後のリバビリンの希釈は、上記のDMEMテスト培地を用いて行われた。
例2
細胞病原性作用(CPE)阻害分析
2つの処理方法を用いて、パピリンAIIIを、A549細胞においてライノウイルス2
型感染に対して評価した。いずれの処理方法においても、細胞は、DMEM増殖培地
において5X104細胞/ウェルで96-ウェル平底組織培養ミクロプレートにおいて平
板培養し、37℃で一晩インキュベーション、各ウェルに細胞単層を確立した。イ
ンキュベーション後、培地を除去し、テスト培地に希釈した種々の濃度の各薬物
(例、リババリン、パピリンAIII)を適当なウェルに加えた(0.1ml/ウェル)。約5
〜10分後、各薬物濃度の4つのウェルに、0.1mlのウイルスを含むテスト培地を作
用させ、2つの更なるウェルを0.1mlの滅菌培地単独と作用させた。後者は、毒性
対照として使用した。6つの感染ウェルから成る1群は、テスト化合物を作用させ
ず、ウイルス対照とし、更に6つのウェルは滅菌培地のみを加え、正常細胞対照
とした。
第一の処理方法においては、ウイルスを作用させる直前にテスト化合物を細胞
に加え、ウイルスの細胞病原性作用(CPE)が決定されるまで細胞に残した。第二
の処理方法においては、前の培地を除去後、CPEが測定される時まで、毎日新し
いテスト化合物(培地に希釈)を細胞に加えた。
2種類のパパリンAIII試料を比較するために、2つの実験を実施し、それぞれの
実験において2つの処理方法を用いた。第一の実験においては、「PS-1A」と表示
された試験管から取り出したパパリンAIIIをテスト化合物として使用した。顕微
鏡検査によりウイルス対照ウェルにおいてCPEが最大レベルに達した時点で(5日
目)、5％CO2と95％空気の雰囲気の加湿インキュベーターにおいて37℃でインキ
ュベーション後、ウイルスの細胞病原性作用(cytopathogenic effect;CPE)を測
定した。第二の実験においては、テスト化合物は「PS-1B」と表示された試験管
から取り出した。この第二の実験においては、CPEは3日目までに完全に発現され
た。両実験において、ポジティブコントロールとしてリバビリンを使用した。
各ウェルのCPEを0(正常細胞)から４(最大、100％、CPE)で評点した。細胞毒性
による形態変化は、顕微鏡により決定された。これはT(プレートからの細胞の完
全な剥離を特徴とする100％の毒性)、PVH(80％の細胞毒性)、PH(60％の細胞毒性
)、PSI(20％の細胞毒性)、０(正常細胞)として評価付けた。CPE阻害実験に関す
る回帰分析により、50％有効(ウイルス阻害)量(ED50)と50％細胞毒性量(CD50)を
計算した。治療指数(TI)も、最良適合ラインの回帰分析により決定され、このラ
インは、X軸の薬物濃度(log10)とy軸のウイルスのlog10減少により計算された。
両実験のCPE阻害データを表1に示す。
表１． ライノウイルス2型に対するパピリンAIIIの効果-A549細胞における誘導
されたCPEの発現
aCD50/ED50b
37℃で5日間インキュベーション後に測定c
37℃で3日間インキュベーション後に測定
パパリンAIIIの2つのロット、PS-1AとPS-1BはウイルスのCPEに対しほぼ同等の
阻害効果を示し、実験2において効果の軽度の減少が認められたが、これは実験
誤差として許容範囲内であった。2つの方法を用いて、ウイルスCPEの有意な阻害
作用が認められ、これは公知のポジティブ阻害剤、リバビリンの活性を上回って
いた。2つの方法と2つの実験において、本質的に同じ効力が観察された。更に、
いずれの実験においても細胞毒性は観察されなかった。
例3
ライノウイルス収率に対するパピリンAIIIの効果
第二の実験後、ミクロプレートを-70℃で凍結し、次いで解凍し、ウイルス感
染
ウェルから培地を除去し、新しい細胞の単層に0.2mlの連続10倍希釈液を加える
ことによりウイルスの力価を個々に分析した。6日後に読みとったウイルスCPEを
、感染力終点として用いた。表2にウイルス収率データを要約する。
表２． ライノウイルス2型のウイルス収率に対するパピリンAIIIの効果 aCD50/ED50 b
リバビリンの投与量は、式：
μｇ/mlからμＭに変換された。
結果が示す様に、ウイルスが細胞から採取された時、ED90濃度は8μＭだった
事から、パピリンAIIIはウイルスCPEの阻害よりも、ウイルス収率の減少におい
てより有効であった。ED90は、化合物を細胞に残した場合でも、毎日新しく加え
た場合でも変わらなかった。ウイルス収率を1log10減少させるのに有効であるこ
とが認められた投与量は、使用された方法により、8μＭと17μＭと決定された
。この活性により、この化合物の治療指数はかなりの大きさとなった。
毎日新しい薬物を使用することは、パピリンAIIIまたはリバビリンの抗ウイル
ス活性に影響を及ぼさなかった。リバビリンの活性は、培地の交換により多少減
少し、活性はやや低くなった。
これらの結果に基づき、パピリンAIIIは、ライノウイルス2型の重要な阻害剤
である。
前記具体例は、本発明を説明するものであり、これを限定することを意図する
ものではない。本発明は、以下の請求項により定義され、請求項の同等物はその
中に包含される。
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(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ０７Ｈ 21/00 Ｃ０７Ｈ 21/00
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ
Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ
，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ
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ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ
Ｅ，ＤＫ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ
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ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ
Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ
，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，
ＳＩ，ＳＫ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ
Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ
(72)発明者 ブドウスキー，エドワード・アイ
アメリカ合衆国、02146 マサチューセッ
ツ、ブルックライン、プレザント・ストリ
ート 80、アパートメント ２
(72)発明者 アッカーマン，サミュエル・ケイ
アメリカ合衆国、02193 マサチューセッ
ツ、ウェストン、キングズ・グラント・ロ
ード 175